Summary
Questo protocollo descrive una tecnica usando splenocytes del topo per scoprire pattern molecolari associati che alterano l'espressione genica di orologio molecolare.
Abstract
Dal comportamento di espressione genica, i ritmi circadiani regolano quasi tutti gli aspetti della fisiologia. Qui, presentiamo una metodologia per sfidare splenocytes del topo con il pattern molecolari associati (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), il ODN1826 e il calore-ucciso Listeria monocytogenes ed esaminare il loro effetto su molecolare circadiano orologio. In precedenza, studi si sono concentrati sull'esame l'influenza di LPS sull'orologio molecolare usando una varietà di approcci in vivo ed ex vivo da un assortimento di modelli (ad es., topo, ratto e umani). Questo protocollo descrive l'isolamento e la sfida di splenocytes, nonché la metodologia per valutare la post-sfida espressione di gene di orologio tramite PCR quantitativa. Questo approccio può essere utilizzato per valutare non solo l'influenza di componenti microbiche sull'orologio molecolare ma anche altre molecole che può alterare l'espressione dell'orologio. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per prendere in giro a pezzi il meccanismo molecolare di come l'interazione di PAMP-Toll-like receptor influenza espressione dell'orologio.
Introduction
Il master clock nei mammiferi, che orchestra oscillazioni 24h per quasi tutti gli aspetti della fisiologia e del comportamento, si trova all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo1,2. Oltre alla regolazione di processi biologici a livello organico, il master clock sincronizza anche periferici Orologi Cellulari in tutto il corpo3,4,5. Mentre il macchinario di orologio molecolare è costituito da almeno tre cicli di feedback trascrizionale traslazionale ad incastro, il nucleo è composto il periodo (Per1-3), crittocromo (Cry1-2), Bmal1, e orologio geni6,7. Oltre a mantenere la tempistica accurata dell'orologio molecolare core, anche alcuni prodotti del gene orologio accessorie (ad es., Rev-erbα e Dbp) regolano l'espressione dei geni dell'orologio non, cioè, orologio geni controllati (GCC)6 , 7.
Orologi molecolari funzionali sono state descritte in vari tessuti immuni (ad es., milza e linfonodi)8 e cellule (ad es., B cellule, cellule dendritiche, macrofagi)8,9. Queste cellule rilevare e rispondere ai pattern molecolari associati (PAMPs), conservati componenti microbici, attraverso recettori di riconoscimento immune innata come recettori Toll-like (TLR)10. Ad oggi, sono stati descritti 13 funzionale TLR, che riconoscono costituenti microbici quali componenti della parete cellulare batterica, proteina fustigatrice e acidi nucleici microbici10. La PAMP, lipopolisaccaride (LPS), un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, riconosciuto da TLR4, è stato indicato per alterare i ritmi circadiani a livello sia organismica e molecolare. Ad esempio, in vivo sfida di LPS indotto da ritardi di fase fotica-come misurata dall'attività in topi11 e portato a orologio ridotta espressione genica nel SCN e nel fegato come determinato mediante ibridazione in situ e PCR quantitativa, rispettivamente, in ratti12. Dopo una sfida in vivo con LPS, analisi del sangue periferico umano leucociti13 e tessuto adiposo sottocutaneo14 ha rivelato alterata espressione di diversi geni dell'orologio come misurato tramite qPCR. Infine, ex vivo sfide LPS di macrofagi umani e macrofagi peritoneali del topo, inoltre ha condotto ad alterata espressione dell'orologio come misurato da qPCR14.
Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'influenza dei LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucleotidi sintetici contenenti unmethylated CpG motivi) e calore-ucciso Listeria monocytogenes (HKLM), riconosciuto da TLR4, TLR9 e TLR2, rispettivamente, il espressione genica di orologio molecolare negli splenocytes del topo. Il protocollo comprende lo splenectomy mouse, isolamento splenocyte e sfida, RNA estrazione, sintesi del cDNA e qPCR per valutare l'espressione di diversi geni dell'orologio. Questo protocollo permette l'acquisizione tempestiva di un gran numero di cellule del sistema immunitario con molto piccolo animale o manipolazione cellulare, che può quindi essere contestato ex vivo con vari PAMPs. L'orologio molecolare è stato indicato per modulare i vari aspetti della risposta immunitaria8,15,16, pertanto, rottura dell'orologio molecolare molto probabilmente potrebbe compromettere la corretta variazione dipendente dal tempo della risposta immunitaria. Inoltre, poiché le interruzioni dei ritmi circadiani possono portare a gravi patologie17,18,19,20, può essere di interesse per i ricercatori di sfidare gli splenocytes con una vasta gamma di molecole e valutare la loro influenza sull'orologio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Durante lo studio, trattamento e cura degli animali in osservanza politica National Institutes of Health, erano in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e cura animali istituzionale degli animali Università di Hartford.
1. trascinamento degli animali
Nota: Venti settimana-vecchio maschio B6129SF2/J topi sono usati nello studio.
- Salire sul treno topi per una 12 ore di luce (luce standard testa bianca) / 12h scuro ciclo per 2 settimane prima dell'esperimento.
Nota: Qui tempo zeitgeber (ZT) 0 corrisponde a luci su e ZT12 a luci spente, mantenendo tutti gli altri fattori ambientali (cioè, alimento, acqua e temperatura ambiente) costante 21.
2. preparazione di strumenti, terreno di coltura e sfida Medium
- Autoclave pinze e le forbici per dissezione. Avvolgere le coppie di vetrini da microscopio smerigliato in foglio di alluminio e autoclave.
- Preparare mezzo di coltura con l'aggiunta di siero bovino fetale (FBS) di RPMI 1640 a una concentrazione finale di 10%. Preparare 10 mL di terreno di sfida in provette da 50 mL aggiungendo il seguente PAMPs al terreno di coltura (RPMI con 10% FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), calore-ucciso Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), o un altro PAMP nella sua concentrazione suggeriti.
- Caldo terreno di coltura e sfida medio a 37 ° C in un bagno d'acqua e tenere circa 70 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS, pH 7,2) a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 mL di terreno di coltura utilizzando una pipetta da 10 mL e pipetta aiuti per un tubo da 50 mL e posto sul ghiaccio.
- Aggiungere circa 30 mL di etanolo al 70% a un'estremità di Becher e posto di 100ml di forbici e forcipe di dissezione nel bicchiere graduato per evitare la contaminazione microbica.
- Preparare il tampone di lisi per isolamento del RNA aggiungendo 10 µ l di β-mercaptoetanolo (sotto cappa aspirante) per ogni 1 mL di Buffer RLT in una provetta da 50 mL. Fare solo l'importo che sarà necessario (600 µ l per campione, che consiste di circa 1 x 106 cellule).
Nota: Il Buffer RLT è un componente del kit di estrazione di RNA che supporta l'associazione di RNA per la membrana di silice.
3. Splenocyte isolamento e sfida
- Eutanasia topi in un momento di particolare zeitgeber tramite narcosi mantenendoli nella loro gabbia originale e aggiungendo CO2 alla gabbia ad una portata di 3 L/min continua fornitura di CO2 per 1 min dopo l'arresto della respirazione.
- Confermare la morte tramite dislocazione cervicale posizionando il pollice e il dito indice su entrambi i lati del collo alla base del cranio. In alternativa, premere una canna alla base del cranio mentre si tira rapidamente (con l'altra mano) la base della coda o le zampe per causare la separazione delle vertebre cervicali dal cranio22.
- Spruzzare il tronco del mouse con etanolo al 70% e asciugare con un tovagliolo di carta. Posizionare il mouse sulla sua schiena e leggermente inclinata sul fianco destro. Tagliare via la pelliccia, mediante dissezione Forbici, lato sinistro del mouse, circa a metà strada tra la parte anteriore e le zampe posteriori.
- Usando il forcipe, afferrare il peritoneo e incidete con attenzione per non danneggiare la milza. Rimuovere la milza con le pinzette e posto in una provetta sterile da 50 mL contenente circa 10 mL di terreno di coltura su ghiaccio. Ripetere per gli altri animali.
Nota: La milza è il colore di un fagiolo, ed è più lungo e più piatta rispetto il rene. -
Trasferire una milza con 2 mL di terreno di coltura per un piccolo piatto di Petri sterile.
- Omogeneizzare la milza di macinandolo fra la parte glassata di due diapositive smerigliati sterile. Se possibile, mantenere il problema e le cellule nel medium durante il processo di omogeneizzazione.
- Una volta accuratamente omogeneizzato, pipettare 2 mL di terreno di coltura contenente gli splenocytes attraverso un colino di cella di 40 µm in nylon in una provetta da 50 mL.
- Ripetere i passaggi sopra riportati per le milze rimanenti utilizzando nuove coppie di diapositive smerigliati, provette da 50 mL con terreno di coltura e filtri di cella.
- Aggiungere 8 mL di terreno di coltura fredda a ciascuna delle provette 50ml contenente gli splenocytes per un volume totale di 10 mL/tubo. Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro.
- Aggiungere circa 1 x 106 cellule/pozzetto in piastre di coltura 6 pozzetti. Aggiungere celle per il numero di pozzetti che corrispondono al numero di diversi PAMPs viene utilizzato per l'esperimento e includere un controllo bene. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura o 3 mL di terreno di sfida a tutti i pozzetti.
- Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO2 per 3 h.
- Raschiare le cellule dal fondo del bene usando un puntale da 1.000 µ l collegato a una micropipetta P1000. Trasferire il supporto che contiene le celle utilizzando la stessa punta di dispensare 1.000 µ l in una provetta da 15 mL.
- Agglomerare le cellule tramite centrifugazione a 167 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 5 mL di PBS.
- Agglomerare le cellule una seconda volta a 167 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e aggiungere 600 µ l di tampone di lisi per il pellet cellulare per lisare le cellule. Procedere all'isolamento del RNA.
4. isolamento RNA e la sintesi del cDNA
- Isolare il RNA da splenocytes utilizzando il kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore ed eseguire la digestione di DNA in colonna 'optional'.
- Prima sintesi del cDNA, calcolare la concentrazione di RNA mediante uno spettrofotometro di microvolume per verificare che la concentrazione sia all'interno della gamma ottima di RNA (fino a 2 µ g) di kit di sintesi di cDNA.
- Synthesize cDNA per ciascuno dei campioni utilizzando il kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 10 µ l di RNA per ognuno dei campioni in un volume di reazione totale di 20 µ l. Al completamento della trascrizione inversa (thermocycler esegue) aggiungere 20 μL H2O ad ogni reazione.
- Costruire la curva standard utilizzando una micropipetta P10 o P20 per piscina mRNA da alcuni campioni di controllo (ad esempio, 5 µ l da 2 campioni per un totale di 10 µ l) in una provetta 0,5 mL per preparare il cDNA.
- Aggiungere 10 µ l 2 x mix master della trascrittasi inversa.
- Al completamento della trascrizione inversa, aggiungere 10 µ l di H2O al tubo di reazione, che servirà come la concentrazione iniziale ("1") della serie di diluizione per la curva standard.
- Eseguire una serie di diluizioni 10 volte (da 1 a 10-4) con l'aggiunta di 45 µ l di acqua utilizzando una micropipetta P100 o P200 nelle quattro provette 0,5 mL indicate 10-1, 10-2, 10-3e 10-4.
- Aggiungere 5 µ l di concentrazione iniziale "1" nel primo tubo (10-1) usando una micropipetta P20, mix pipettando su e giù parecchie volte, quindi trasferire 5 µ l dalla provetta 10-1 nel tubo indicato 10-2 e mix.
- Trasferire 5 µ l utilizzando una micropipetta P20 dal 10-2 tubo nel tubo indicato 10-3 e mescolare. Trasferire 5 µ l usando una micropipetta P20 dal 10-3 tubo nel tubo indicato 10-4 e mescolare.
5. quantitativo reazione a catena della polimerasi (qPCR)
- Determinare la quantificazione relativa dei livelli di mRNA di qPCR. All'interno l'allestimento sperimentale, selezionare "Quantificazione – relativa curva Standard" e "TaqMan" chimica. Cambiare il volume di reazione a 10 µ l. Immettere le informazioni rilevanti nel layout del piatto (ad es., gene bersaglio, curva standard, giornalista, ecc.).
- Preparare la reazione, in modo che esso contiene 0,5 µ l del dosaggio primer/sonda, 5 µ l di mix master di espressione genica, 2 µ l di H2O e 2,5 µ l di cDNA (10 – 100 ng).
- Preparare un mix master moltiplicando ciascuno dei reagenti precedenti (tranne il cDNA) per il numero di reazioni, assicurandosi di includere quelli dalla curva standard, controlli negativi, esibendosi ogni reazione in duplicato e 2 reazioni supplementare che rappresenteranno per variazione di pipettaggio.
- Dispensare 7,5 µ l del mix master preparati in pre-determinati pozzetti in una piastra di reazione a 96 pozzetti con una micropipetta o una pipetta multicanale. Dispensare 2,5 µ l di cDNA nel pozzo appropriato per le incognite e gli standard e 2,5 µ l di H2O nei pozzetti di controllo negativo.
- Sono saggi di primer/sonda per vari geni orologio molecolare e includono un'analisi per un controllo endogeno (ad es., β-actina).
- Al fine di determinare i valori relativi di espressione, calcolare la quantità relativa media per ogni replica, quindi, per ogni campione, dividere la quantità relativa media per il gene dell'obiettivo di quantità relativa media per β-actina.
6. elaborazione statistica
- Utilizzando software di analisi statistica, inserire i dati nel programma sotto l'opzione di statistiche di colonna. Selezionare un one-way ANOVA con il test post-hoc di Dunnett per valutare le differenze tra i valori medi di espressione del gene dell'orologio dopo la sfida PAMP contro il controllo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Topi sono stati sacrificati a ZT13, splenocytes sono stati isolati e contestato ex vivo con il LPS PAMPs, ODN1826 o HKLM. Dopo 3 h, RNA è stato isolato e qPCR è stato utilizzato per valutare i livelli di espressione relativa dei geni orologio molecolare orologio, Per2, Dbp e Rev-erbα rispetto alle cellule di controllo incontrastato. Dopo la sfida PAMP, i livelli di espressione di Clock non erano significativamente differenti che l'espressione in cellule di controllo (Figura 1A). I livelli di espressione di PER2 sono stati elevati significativamente in cellule sfidate con LPS e ODN1826 rispetto ai controlli incontrastati (Figura 1B). LPS è stato l'unico PAMP per alterare l'espressione di Rev-erbα , come i livelli del mRNA erano significativamente più bassi nei controlli incontrastati (Figura 1C). Infine, significativamente più bassi livelli di mRNA sono stati osservati per il Dbp dopo la sfida con ciascuno dei PAMPs rispetto ai controlli (Figura 1D). Coerente con ciò che è stato precedentemente dimostrato, fuori di tutti i geni orologio associato esaminati, Dbp espressione tende ad essere più colpiti dalla PAMP sfida23.
Figura 1 : Orologio alterata espressione genica negli splenocytes del topo dopo ex vivo sfida PAMP. Splenocytes sono stati isolati a ZT13 e sfidati con LPS, ODN1826 o HKLM. I livelli di mRNA di orologio relativo (normalizzati per β-actina) sono stati determinati qPCR 3 h dopo la sfida. Ogni punto di dati rappresenta il livello di espressione per 1 animale. Sono dati sperimentale media + SEM. p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. Le sfide indicate erano significativamente differenti dal controllo (cellule incontrastate) secondo One-way ANOVA con test post-hoc di Dunnett. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
All'interno di questo protocollo, uno spettrofotometro di microvolume può essere utilizzato per quantificare e valutare la purezza del RNA utilizzato nel determinare l'espressione genica. Acidi nucleici assorbono UV luce a 260 nm, proteine in genere assorbono la luce a 280 nm, mentre altri potenziali contaminanti utilizzati durante una procedura di estrazione di RNA (ad es., fenolo) sono rilevabili a 230 nm. Pertanto, valutando l'assorbanza (A) rapporto a 260/280 nm (RNA alla proteina) e 260/230 nm (RNA a proteine contaminanti) può essere valutata la qualità del RNA. RNA di alta qualità ha un rapporto A260/280 tra 1.8-2.1, come i rapporti più bassi indicano contaminazione della proteina. Un campione di RNA puro avrà un rapporto A260/230 di 2.0.
Quando si determina l'espressione relativa di un determinato gene (cioè, Per2, orologio, Rev-erbα e Dbp), un gene di controllo endogeno (un gene in cui l'espressione livelli non differiscono tra i campioni) deve essere selezionato anche. Relativa espressione del gene dell'obiettivo allora è normalizzato per l'espressione del gene di controllo endogeno. Differenze nel materiale di partenza (numero degli splenocytes), variazione dell'efficienza della trascrittasi inversa, tassi variabili di degradazione del RNA, ecc., saranno corretti dal gene controllo endogeno (β-actina in questo protocollo). Tuttavia, si consiglia di verificare che il trattamento in esame non alterare l'espressione del gene di controllo endogeno. È possibile valutare i livelli β-actina da diverse repliche di un numero uguale di cellule (trattamento vs non-trattamento). In teoria, i loro livelli β-actina devono essere identici. Un altro approccio a guardia contro variazione di controllo endogeno sarebbe quella di utilizzare un pannello di controlli endogeni (ad esempio, β-actina, Gapdh e 18S gene del rRNA).
Quando si esamina l'impatto di PAMPs sull'orologio molecolare, l'ora del giorno quando sono euthanized topi e splenocytes sono successivamente impugnati deve tener conto. L'espressione dei TLR e reattività precedentemente è stato indicato per dimostrare la variazione dipendente time-of-day8,15, pertanto, un momento della giornata quando la reattività TLR è al suo apice, potrebbe comportare una maggiore influenza sulla orologio. Inoltre, espressione dei geni dell'orologio molecolare oscillerà anche tutto il giorno negli splenocytes, quindi, una riduzione dell'espressione del gene dell'orologio a causa della sfida PAMP sarebbe più significativa se esaminati durante il tempo di picco espressione9. Poiché Dbp e Rev-erbα sono stati indicati per dimostrare picchi di espressione significativa negli splenocytes e spleniche cellule immunitarie intorno il chiaro-scuro interfase 8,9,23, 24 (ZT12), nel metodo corrente, le cellule sono state isolate e sfidate a ZT13 al fine di avere una maggiore possibilità a rilevare una riduzione in questi geni. Al contrario, un PAMP che potrebbero aumentare l'espressione dell'orologio, sarebbe molto probabilmente essere osservata se cerca in un momento della giornata quando espressione dell'orologio è al suo minimo.
Poiché i topi sono animali notturni, la loro fase di riposo è durante il periodo di luce, che corrisponde all'attività umana. Quindi, idealmente, topi saranno ospitati in una camera con un traffico minimo e uno che contiene una macchina bianco-rumore per ridurre i disturbi durante il giorno come ciò potrebbe interferire con i ritmi circadiani dei topi. Inoltre, modifiche di gabbia dovrebbero essere fatto in anticipo la data di esperimento. Qualsiasi lavoro in camera animali (compreso l'eutanasia degli animali) durante il periodo scuro, dovrebbe essere condotta sotto la luce rossa al fine di evitare di interrompere i ritmi dei topi.
Ritmi diurni sono sottoposti a stimoli ambientali (ad es., luce o cibo), che sono chiamati zeitgebers. Nel caso di un 12 h luce/12 h scuro ciclo, zeitgeber (cioè, luce) Reimposta l'orologio per un periodo di 24 ore. Mentre la maggior parte dei ritmi diurni sono circadiani (cioè, ritmi giornalieri che si verificano in assenza di un'indicazione esterna), non sono veri ritmi circadiani finché non sono stati indicati ad oscillare con un periodo di circa 24 h in condizioni ambientali costanti . Pertanto, questa procedura può essere eseguita utilizzando topi in condizioni costanti, che comporterebbero spingimento topi per il ciclo luce-buio come descritto sopra, ma poi tenendo gli animali in costante oscurità per 3 giorni prima del campionamento. Questo tipo di esperimento è definito come esperimento di un buio-buio (DD) e il punto del tempo di campionamento dovrebbe essere indicato come CT (circadiana di tempo), non ZT.
Mentre questo metodo può identificare PAMPs che alterano l'espressione genica dell'orologio all'interno splenocytes, non prendere in considerazione come queste PAMPs influenzano il clock master o periferici orologi in tutto il corpo. Poiché la milza è composto da una popolazione eterogenea di cellule, PAMPs individuali potrebbe influire in modo diverso ogni tipo di cellula. Ad esempio, ritmi di espressione Tlr9 nella milza del mouse differiscono tra gli splenocytes, macrofagi, linfociti B e DCs15. Inoltre, Tlr1 Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7, visualizzatie Tlr8 significative oscillazioni giornaliere in una popolazione di splenocyte aderente ma solo Tlr2 e Tlr6 esperienza ogni giorno oscillazioni in macrofagi splenici arricchita24. Pertanto, al fine di studiare il risultato di una sfida su tipi di singole cellule, cellule potrebbero essere isolate tramite ordinamento delle cellule magnetiche, come precedentemente descritto9,15 e poi successivamente impugnato. Inoltre, la popolazione delle cellule spleniche fluttua sopra il ciclo quotidiano, che potrebbe anche svolgere un ruolo nella sensibilità ad un particolare PAMP e il conseguente impatto sul orologio8.
Questo metodo permette l'isolamento di un gran numero di cellule immunitarie che consistono prevalentemente di cellule (~ 58%) B, (~ 21%) di cellule T, cellule dendritiche (~ 5%) e macrofagi (~ 4%)25. Il numero elevato di celle offre l'opportunità di sfidare gli splenocytes con una varietà di PAMPs in un singolo esperimento. La procedura di isolamento di splenocyte è molto facile da eseguire, può essere completato in pochi minuti (a seconda del numero di animali) e con minima manipolazione animale o cellulare, che è essenziale quando si esamina l'orologio molecolare perché come accennato in precedenza, Queste azioni possono interferire con la sincronizzazione dell'orologio così come i geni orologio-controllato. I risultati per questa procedura sono stati altamente riproducibile, come significato tra sfidato e cellule incontrastate è stato realizzato con soli tre animali e i risultati erano costanti con lavoro precedentemente pubblicato23 (Figura 1). Dovrebbe essere notato che aumentando il numero di animali per gruppo potrebbe hanno rivelato differenze statisticamente significative fra un gruppo di sfida e di controllo (ad es., 1826 ODN e Rev-erbα).
Andando avanti, mentre il presente protocollo si rivolge soltanto gli effetti acuti sull'espressione del gene dell'orologio dopo la sfida PAMP, potrebbe fornire prova di principio per ulteriori indagini. Ad esempio, questa analisi potrebbe essere usata come modello per decifrare i meccanismi molecolari riguardanti TLR - PAMP interazione e come influenza l'orologio molecolare. Potrebbe anche essere utilizzato per determinare la lunghezza del tempo che necessario per l'orologio molecolare recuperare dopo una sfida PAMP, che potrebbe essere determinata da un esperimento di corso di tempo (cioè, valutare espressione dopo diversi tempi post sfida). Come accennato in precedenza, esperimenti successivi possono essere eseguiti per esaminare la sfida PAMP su popolazioni cellulari specifici splenocyte. Poiché molti patogeni stimolano più TLRs dopo l'infezione, sarebbe interessante utilizzare questo protocollo per indagare se impegnativo con PAMPs multipli hanno un effetto sinergico sull'espressione del gene dell'orologio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da assegni di ricerca di facoltà dall'ufficio il College delle arti e del preside di Scienze presso l'Università di Hartford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
