Summary
Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.
Abstract
Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile, wie z. B. Zugriff auf zahlreiche bildgebende Ansätze, elektrophysiologische Techniken und Verhaltens-Assays. Das Xenopus Kaulquappe olfaktorische System eignet sich besonders gut zu untersuchen, die Funktion der Synapsen gegründet während der normalen Entwicklung oder nach einer Verletzung reformiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven. Wir skizzieren eine Kombination aus in-vivo Messungen der präsynaptischen Kalzium Antworten in Glomeruli den Riechkolben mit olfaktorischen geführte Verhalten Assays. Methoden können mit der Durchtrennung der Geruchsnerven, studieren die Neuverkabelung der synaptischen Konnektivität kombiniert werden. Experimente werden vorgestellt mit Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere mit dem Ausdruck GFP-Reporter in den Zellen des zentralen Nervensystems. Anwendung der Ansätze beschrieben, gentechnisch veränderten Kaulquappen ist nützlich für die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen, die vertebrate Verhalten definieren.
Introduction
Xenopus Kaulquappen bilden ein ausgezeichnetes Tiermodell um die normale Funktion des Nervensystems zu studieren. Transparenz, ein vollständig sequenzierte Genom1,2und Zugänglichkeit zu chirurgischen, elektrophysiologische und bildgebende Techniken sind einzigartige Eigenschaften des Xenopus -Larven, die es ermöglichen, Untersuchung neuronale Funktionen in-vivo3 . Einige der mehrere experimentelle Möglichkeiten dieses Tiermodell werden durch gründliche Studien am Kaulquappe sensorischen und motorischen Systeme4,5,6dargestellt. Eine besonders gut geeignet neuronale Schaltung, viele Aspekte der Informationsverarbeitung auf der Ebene der Synapsen ist Xenopus Kaulquappe olfaktorischen System7. Erstens die synaptische Konnektivität ist klar definiert: olfaktorische Rezeptor Neuronen (ORNs) Projekt auf den Riechkolben und synaptischen Kontakte mit Dendriten Mitral-/getuftet Zellen innerhalb von Glomeruli Geruch Karten zu generieren. Zweitens entstehen seine ORNs kontinuierlich durch Neurogenese während des gesamten Lebens die Funktionalität von olfaktorische Bahnen8zu erhalten. Und drittens, weil des olfaktorischen Systems eine große regenerative Fähigkeit zeigt, Xenopus Kaulquappen können ihre Riechkolben ganz nach Ablation9zu reformieren.
In diesem Artikel beschreiben wir Ansätze, die Darstellung der olfaktorischen Glomeruli in lebenden Kaulquappen mit Verhaltensexperimente, die Funktionalität der olfaktorische Bahnen zu studieren. Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um die funktionelle Wiederherstellung der glomerulären Konnektivität in den Riechkolben nach Riechnerv Durchtrennung10zu studieren. In Xenopus Kaulquappen gewonnenen Daten sind Vertreter der Wirbeltiere, da olfaktorische Verarbeitung evolutionär ist konserviert.
Die beschriebenen Methoden sind beispielhaft dargestellt, mit X. tropicalis , aber sie können leicht in Xumgesetzt werden. Laevis. Trotz der größeren Größe des Erwachsenen laevissind beide Arten in Kaulquappe Phasen bemerkenswert ähnlich. Die Hauptunterschiede liegen auf Genomebene. Laevis zeigt schlechte genetische Lenkbarkeit, vor allem durch seine Allotetraploid Genom und lange Generationszeit (ca. 1 Jahr) bestimmt. X. Tropicalis ist dagegen besser geeignet, um genetische Veränderungen aufgrund der kürzeren Generationszeit (5 – 8 Monate) und diploiden Genom. Die repräsentative Experimente sind für Wildtyp Tiere und drei verschiedenen transgenen Linien dargestellt: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) und Tubb2:GFP (laevis).
Die in die aktuelle Arbeit beschriebenen Methoden sollte neben der genetischen fortschreitet im Feld Xenopus betrachtet werden. Die Einfachheit und die einfache Umsetzung der vorgestellten Techniken macht sie besonders nützlich für die Bewertung der bereits beschriebenen Mutanten11sowie Xenopus Linien von CRISPR-Cas9 Technologie12generiert. Wir beschreiben auch einen chirurgischen Eingriff zur Geruchsnerven Transekt, die in jedem Labor Zugang zu Xenopus Kaulquappen umgesetzt werden können. Die Ansätze für die Bewertung der präsynaptischen Kalzium Antworten verwendet und olfaktorischen geführte Verhalten erfordern spezielle Ausrüstung, wenn auch auf einem moderaten Kosten zur Verfügung. Methoden sind in einer einfachen Form zur Förderung ihrer Verwendung in Forschungsgruppen vorgestellt und konnte die Grundlagen von komplexeren Assays festgelegt, durch die Implementierung von Verbesserungen oder durch den Verein zu anderen Techniken, d.h., histologische oder genetische Ansätze.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Tierforschung an Universität von Barcelona genehmigt.
Hinweis: X. tropicalis und laevis Kaulquappen werden nach Standardmethoden13,14aufgezogen. Kaulquappe Wasser wird vorbereitet, indem man kommerzielle Salze (siehe Tabelle der Materialien) zu Wasser durch Umkehrosmose gewonnen. Leitfähigkeit wird ∼700 µS und ∼1, 400 µS für X. tropicalis und laevis Kaulquappen, bzw. angepasst. Larven können entweder durch natürliche Paarung oder Befruchtung14einzuholen. Embryonen werden mit 2 % dejellied, die L-Cystein in 0,1 X Marc geändert Klingeltöne (MMR) vorbereitet. 1 X MMR enthält (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0,1 EDTA, pH 7,8. Larven sind nach 2 – 3 Tagen (Stufe 25) auf 2 L Tanks mit Kaulquappe Wasser übertragen. Wenn Kaulquappen Stufe 40 von Nieuwkoop-Faber (NF) Kriterien15erreichen, sind sie in 5 L Behälter gelegt und gewartet in einer Dichte von 10 Tiere/L. Temperatur bleibt konstant bei 23-25 ° C und 18 – 20 ° C für X. tropicalis und laevis Kaulquappen, beziehungsweise. Tiere in Phasen 48 – 52 der NF Kriterien gefunden werden für Experimente verwendet.
(1) Durchtrennung der Geruchsnerven
- Bereiten Sie eine betäubende Lösung von 0,02 % MS-222 in 50 mL Kaulquappe Wasser bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie einen kleinen Tank (1 – 2 L) mit Kaulquappe Wasser Erholung der Tiere nach der Operation zu ermöglichen.
- Rechteckige Zuschnitte von Zellulose qualitative Filterpapier (4 cm x 3 cm, siehe Tabelle of Materials).
- Wet 2 Stück Zellulose qualitative Filterpapier in 0,02 % MS-222 Lösung und legen Sie sie in den sezierenden Anwendungsbereich.
- Wählen Sie eine Kaulquappe aus dem Tank und Tauchen sie in die betäubende Lösung. Das Tier hält Schwimmen innerhalb von 2 – 4 min und reagiert nicht auf mechanische Reize auf die Rute mit einer Pinzette angewendet.
-
Platzieren Sie den narkotisierten Kaulquappe auf das rechteckige Stück Filterpapier. Positionieren Sie das Tier mit seiner dorsalen Seite nach oben zeigt, so Hirnstrukturen visualisiert werden können.
- Mit Vannas Schere (siehe Tabelle der Materialien), Schnitt eine oder beide Geruchsnerven (je nach Test durchgeführt werden). Transekt einen einzelnen Nerv für Experimente, die interne Kontrolle der Nervenverletzung erfordern.
- Für Verhaltensexperimente Transekt beide Nerven um alle Duftstoff-Informationen, die Ankunft in den Riechkolben zu unterdrücken. Die Effizienz der Schnitt der Geruchsnerven kann leicht in den sezierenden Anwendungsbereich beobachtet werden; jedoch kann Pigmentierung oder Tier Position Faktoren begrenzt werden.
Hinweis: (Optional) Der beste Weg, um die Gültigkeit des Verfahrens zertifizieren nutzt transgenen Kaulquappen, die fluoreszierende Reporter auf ihr Nervensystem ausdrücken (siehe repräsentative Ergebnisse). Zu diesem Zweck ist es notwendig, eine Dissektion Rahmen ausgestattet mit Fluoreszenz (Abbildung 1) zu verwenden. Wenn nur Wildtyp Tiere zur Verfügung stehen, kann Ablaufverfolgung mit CM-DiI eingesetzt werden. Folgen Sie Protokoll Nr. 2 (siehe unten), um eine 0,5 mg/mL Lösung von CM-DiI in 0,3 M Saccharose in der nasalen Kapsel vorbereitet zu injizieren. Zubereitung und Lagerung von CM-DiI 16 Einzelheiten entnehmen. Auslaufen der Farbstoff aus den wichtigsten Hohlraum muss zu minimieren. Zu diesem Zweck ist es erforderlich, den Druck der Injektion und der Öffnung der Mikropipetten zu ändern. Fluoreszenz auf der Ebene der glomerulären Schicht an den Riechkolben wird offensichtlich 24 h nach dem Auftragen der CM-DiI. Das vorliegende Werk nutzt Etikettierung mit CM-DiI, nur um die Durchtrennung Verfahren zertifizieren; jedoch kann diese Methode auch, morphologische Informationen der olfaktorischen Glomeruli mit konventionellen histologischen Verfahren verwendet werden.
- Übertragen Sie Tiere auf der Schmutzwassertank. Kaulquappen sollte normal schwimmen innerhalb von ~ 10 min. Perform erholen, eine sorgfältige Prüfung auf das Vorhandensein von Blutungen, die in ~ 1 % der Tiere dürften Operation unterzogen.
- Verletzte Tiere in einer MS-222-Lösung 0,2 % einschläfern.
2. Kennzeichnung der olfaktorischen Rezeptor Neuronen mit fluoreszierenden Calcium Indikatoren
- Bereiten Sie eine Lösung mit 12 % Calcium grün-1-Dextran (siehe Tabelle der Materialien), 0,1 % Triton X-100 und 1 mM NaCl17. Die Lösung bei-20 ° C oder bei-80 ° C zu speichern, wenn es nicht innerhalb eines Monats verwendet werden soll.
- Mikroinjektion mit einer Mikropipette Puller Glaspipetten mit Tipp Öffnungen ~ 1 – 2 µm (ähnlich wie Durchmesser, Mikroelektroden zur Patch-Clamp-Experimenten) vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien).
- Kalibrieren Sie das Volumen der Mikroinjektionen. Verwendung von destilliertem Wasser anpassen Druck und Einspritzzeitpunkt Erlangung Einspritzmengen von 0,15-0,3 µL.
Hinweis: Ein einfaches Verfahren besteht darin, das zählen der Impulse erforderlich, um einer Pipette gefüllt mit 1 µL Wasser entleeren. Typische Kennwerte sind ein Druck von 30 Psi und 50 ms Einspritzzeit. - Legen Sie eine Pipette in den Microinjector und laden Sie es mit ~ 2 µL der Kalzium-grün-1 Dextran-Lösung.
- Bereiten Sie eine Kaulquappe, die folgenden Schritte 1.1 bis 1.6.
- Bewegen Sie die Spitze der Pipette in den wichtigsten Hohlraum der nasalen Kapsel.
Hinweis: Siehe Abbildung 2A beschreibt die Lage der olfaktorische Bahnen in einer Xenopus Kaulquappe. - Einstellungen in 2.3 erhalten, ein paar Züge zu liefern. Beschränken Sie Farbstoff-Präsenz auf die nasale Kapsel.
- Lassen Sie die Kaulquappe für 2 – 3 min. mit einer Pasteurpipette ruhen, Tropfen 0,02 % MS-222-Lösung auf die mehr kaudalen Teile des Tieres zu vermeiden, trocknen.
- Übertragen Sie das Tier auf der Schmutzwassertank.
Hinweis: Es sollte normal schwimmen erholen innerhalb von ~ 10 min. Manipulation von Tieren könnte zu Verletzungen führen. - Einschläfern Sie Kaulquappen, die nicht normal schwimmen Verhalten 15 min nach der Injektion mit einer 0,2 % MS-222-Lösung wieder.
- Fluoreszenz auf der Ebene der glomerulären Schicht an den Riechkolben am Tag nach der Injektion zu beobachten.
3. Vorbereitung der Kaulquappen für Live Aufnahmen von präsynaptischen Antworten
- 24 – 48 h vor der Durchführung des Experiments Mantel 4 – 6 Petrischalen mit 35 mm Durchmesser mit Silikon-Elastomer (z. B. Sylgard). Sobald das Elastomer polymerisiert hat, fertigen Sie eine rechteckige gut um die Kaulquappe zu passen.
Hinweis: Typische Abmessungen für X. tropicalis Kaulquappen gefunden auf NF Stufen 48 – 52 sind 10 x 4 mm. - Bereiten Sie 100 mL von 160 µM bis 1 mM Aminosäurelösung als einen Geruchsstoff Anreiz für Kaulquappen vor. Die Lösung kann enthalten eine Mischung aus mehreren Aminosäuren: Histidin, Arginin, Methionin, Leucin und Lysin. Verdünnen Sie Aminosäuren in Xenopus Ringer-Lösung, bestehend aus (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 Glukose, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Sicherzustellen Sie, dass dieser pH-Wert auf 7,8 gehalten wird.
- Füllen Sie ein erhöhter Tank mit 20 mL der Aminosäure-Lösung. Schließen Sie den Behälter mit Polyethylen Schläuche zu einem Kapillarrohr 28 G (siehe Tabelle der Materialien) über die nasale Kapsel platziert.
Hinweis: Das Kapillarrohr ist auf einem Mikromanipulator montiert (siehe Tabelle der Materialien). Luftblasen müssen nicht vorhanden sein von der Perfusion System. - Erzielen Sie zeitliche Präzision bei der Anwendung der Aminosäure-Lösung unter Verwendung der Transistor-Transistor-Logik (TTL) seitens Prise Magnetventile (siehe Tabelle der Materialien). Eine Stimulator wird verwendet, um TTL-Impulse erzeugen (siehe Tabelle der Materialien). Überprüfen Sie die zeitliche Präzision um die Duftstoff-Lösung zu liefern, durch eine Änderung der Dauer der TTL-Impulse, dh., 0,1 bis 1 s.
- Füllen Sie ein weiterer erhöhter Tank mit 100 mL Xenopus Ringer-Lösung.
- Betäuben Sie eine Kaulquappe zu, und legen Sie sie in den sezierenden Geltungsbereich (Schritte 1.1 bis 1.6).
- Bildgebung eine Kaulquappe vorbereiten. Wenn Albino Kaulquappen verfügbar sind fahren Sie mit Schritt 3,9, ansonsten entfernen Sie die Haut über den Riechkolben zu, denn es enthält Melanozyten, die Bildgebung (Schritt 3,8) beeinträchtigen.
Hinweis: Es gibt zwei Möglichkeiten, um das Experiment abhängig von der Pigmentierung des Tieres durchzuführen. Es empfiehlt sich, Albino Tiere zu nutzen. Albino-Sorten stehen für laevis und Albino X. tropicalis Linien vor kurzem von CRISPR-Cas9 12 oder TALENs18erzeugt wurden. - Mit Vannas Schere, machen Sie einen seitlichen Schnitt auf der Kaulquappe Haut am Rande des zentralen Nervensystems. Machen den Schnitt sollte erfolgen, auf der Ebene der den Riechkolben und nie erreichte die Position des Tectum, die durch die Position des Sehnervs leicht identifiziert werden können.
- Drücken Sie die geschnittenen Haut mit einer Pinzette und ziehen Sie ihn über das Nervensystem. Überprüfen Sie die Abwahl durch das Fehlen von Melanozyten über den Riechkolben. Halten Sie das Tier durch strömenden Tropfen 0,02 % MS-222-Lösung mit einer Pasteurpipette feucht.
- Legen Sie die Kaulquappen in den Brunnen der beschichteten Schale (siehe Tabelle der Materialien). Setzen Sie ein Glas Deckglas beschichtet mit hohem Vakuum Fett über das Tier. Positionieren Sie das Deckglas um die Tectum bis zum Ende der Rute bedecken.
- Sicherstellen Sie, dass die Riechkolben und Plakoden der extrazellulären Medium ausgesetzt bleiben. Halten Sie die Kaulquappe unbeweglich, während der Bildgebung. Füllen Sie die Petrischale mit Xenopus Ringerlösung Solutioncontaining 100 µM Tubocurarin (siehe Tabelle der Materialien), Muskelkontraktionen zu verhindern.
Hinweis: Tubocurarin wird in Aliquote bei-80 ° C nicht mehr als 6 Monate gespeichert. - Das Gericht hält die Kaulquappe unter einem aufrechten Mikroskop zu platzieren. Schließen Sie den Behälter mit Xenopus Ringer-Lösung mit der Schale mit Polyethylen Schläuche (siehe Tabelle der Materialien) für kontinuierliche Perfusion der Xenopus Ringer-Lösung, um das Tier am Leben zu halten > 1 h.
Hinweis: Mini magnetischen Klemmen (siehe Tabelle der Materialien) sind sehr nützlich für Schläuche in die Schale stabil zu verbinden. Perfusion und Saug-Rohre müssen in ~ 180 °-Winkel befinden. - Starten Sie die Vorrichtung Xenopus Ringer-Lösung. Das Niveau der Lösung in der Schale konstant während des Experiments zu halten. Kontinuierlich bewerten Sie Kaulquappe Lebensfähigkeit durch die Beobachtung der Durchblutung durch die Gefäße.
4. live Imaging von präsynaptischen Ca2 + Veränderungen im olfaktorischen Glomeruli
Hinweis: Die bildgebende Verfahren wird für die Weitfeld-Mikroskopie beschrieben aber könnte leicht an einem confocal Mikroskop durch Anpassung der Erwerb Einstellungen angepasst werden. Bildgebung werden in einem aufrechten Mikroskop montiert auf einer Anti-Vibrations-Tabelle durchgeführt.
- Visualisieren der Kaulquappe mit geringer Vergrößerung Zielsetzung, z. B. 5 X.
- Verschieben der Mikromanipulator Achsen, die Kapillare, die Bereitstellung der Duftstoff-Lösung auf der Oberseite eine nasale Kapsel bilden einen 90 ° Winkel mit den Riechnerv zu platzieren. Der Fluss der Geruchsstoff Lösung über den Riechkolben sollte vermieden werden, da es Turbulenzen verursachen könnte, die Bildgebung zu verzerren.
- Finden Sie den Riechkolben befindet sich ipsilaterally der nasalen Kapsel (je nach Stimulation) mit einer hohen Vergrößerung, langem Arbeitsabstand, Wasser eintauchen Ziel: 60Xx, 0,9 N.A
- Überprüfen Sie die Fluoreszenzemission von Auge. Glomeruläre Strukturen sollte offensichtlich (Abbildung 2B).
- Führen Sie live Akquisition mit einer Kamera geeignet für Kalzium Imaging. Definieren Sie ein Feld mit den gesamten Riechkolben, in der Regel von 256 x 256 oder 512 x 512 Pixel. Satz der Erwerb Frame Rate Erwerb um 20 – 40 Hz. die Verstärkung so einstellen, dass die Werte der basalen Fluoreszenz ~ 20 % Sättigung sind. Erwerben Sie ein 5 s-Video.
- Visualisieren Sie den Film. Bildschärfe, die Abwesenheit von Bewegungsartefakten und Regionen mit gesättigten Pixel zu überprüfen. Typische Fluoreszenz Werte der glomerulären Regionen sollte von 5.000 – 20.000 a.u sein, wenn eine 16-Bit-Kamera verwenden. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn bildgebende Bedingungen optimal sind. Wiederholen Sie Schritt 4.6, bei Bedarf zur Verbesserung der Bildqualität oder Gain-Einstellungen anpassen.
- Starten Sie eine Zeitraffer-Akquisition um Reaktionen hervorgerufen durch olfaktorische Reize aufzunehmen.
Hinweis: Präzise Anwendung der Geruchsstoff Lösung wird durch TTL Reize gesteuert. Ein typisches Experiment enthält eine Basisperiode von 4 s, gefolgt von Stimulation Zeiten zwischen 0,1 bis 0,5 s und eine Erholungszeit von 6 – 10 s. - Führen Sie sich wiederholende Stimulationen der Geruchsstoffe für Zeitintervalle > 2 min. die Durchflussmenge auf 1 – 1,5 mL·min-1gesetzt. Da die globale Perfusion während alle Experimente aktiviert ist, werden lokal applizierten Aminosäuren ausgewaschen.
Hinweis: Das Volumen der Lösung in der Schale beträgt ~ 3 mL. -
Bildanalyse
- Erkennung von Antworten
- Exportieren Sie Filme in ImageJ.
Hinweis: Das Ziel ist die Anwesenheit der glomerulären Regionen reagieren auf Reize erkennen. - Die rohe Bildsequenz Fluoreszenz zu einem ΔF/F0 Film zu verwandeln. Relative Änderung in basalen Fluoreszenz nach der folgenden Beziehung zu messen: (F-F0) / f0, wo F0 Fluoreszenz Ausgangswerte zeigt.
- Regionen von Interesse (ROI) um Bereiche mit vermeintlichen Fluoreszenz steigt während der Stimulation zu ziehen und ihre Stellung in der ROI-Manager (Abbildung 2E) aufnehmen. Zeichnen Sie einen ROI um Fluoreszenz Hintergrundwerte in einem Gebiet glomerulären Strukturen zu erkennen.
- Exportieren Sie Filme in ImageJ.
- Quantifizierung der Antworten.
- Legen Sie die definierten ROIs in der rohen Reihenfolge der Fluoreszenzbilder. Erhalten Sie den grauen Mittelwert der ausgewählten ROIs für jeden Frame. Die Reihenfolge der Werte, die ein Analyse-Programm zu übertragen (z. B.., Igor Pro).
- Subtrahieren Sie Hintergrundfluoreszenz, und berechnen Sie ΔF/F0 Änderungen für jede ROI (Abb. 2F). Plot der Anstieg der ΔF/F0 jeweils die ROIs ausgewählt. Berechnen Sie die Standardabweichung der basalen ΔF/F0 (vor-Stimulation).
Hinweis: Eine positive Reaktion gilt bei Erhöhungen der ΔF/F0 während der Stimulation sind größer als 2 Standardabweichungen der basalen Werte.
- Erkennung von Antworten
(5) olfaktorische-geführte Verhalten Assay
Hinweis: Eine schematische Darstellung des Setups für die Durchführung des Tests ist in Abbildung 3dargestellt.
- Machen Sie kleine Löcher um 1,57 mm Außendurchmesser X 1,14 mm I.D. Schlauch im oberen Teil von jedem Bohrloch der 6-Well Platte passen. Legen Sie den Schlauch und Dichtung mit einem Epoxy-Kleber (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Die modifizierten Schale kann viele Male nach dem gründlichen waschen mit destilliertem Wasser wiederverwendbar. - Bereiten Sie 50 mL einer Aminosäure-Lösung mit Methionin, Leucin, Histidin, Arginin und Lysin (siehe Schritt 3.2 für Details). Die Konzentrationen reichen von 160 µM bis 1 mM. 20 mL der Lösung in einem erhöhten Reservoir zu platzieren.
- Füttern Sie Kaulquappen für mindestens 12 Stunden vor dem Test nicht. Nehmen Sie 6 Kaulquappen aus ihrem Gehäuse Tank und legen Sie sie in 2 L Wasser sauber Kaulquappe, die Exposition gegenüber Geruchsstoffen zu minimieren.
- Legen Sie die modifizierte 6 Brunnen Schale auf eine weiße LED-Transilluminator (Abbildung 3).
- Paar der Perfusion Buchten in den Behälter mit der Aminosäure-Lösung mit einem Verteiler (siehe Tabelle der Materialien). Die Perfusion System überprüfen und Luftblasen zu beseitigen. Füllen Sie die 6 Brunnen gleichzeitig. Passen Sie die Höhe des Behälters ermöglicht die Lieferung von ≥5 mL Geruchsstoff Lösung innerhalb von ~ 30 s.
Hinweis: Waschen Sie jede gut 4 Mal mit doppelt destilliertem Wasser nach Exposition gegenüber den Duftstoff-Lösung. - Füllen Sie jeweils gut mit 10 mL Wasser Kaulquappe. Platz 1 Kaulquappe/gut. Ruhen lassen > 3 min.
- Bildaufnahme eingerichtet. Verwenden einer herkömmlichen CCD-Kamera, die Bilder an ≥5 Hz. Anschließen der Kamera an einen Computer erwerben kann. Hier, eine Zeiss MRC5 Kamera Zen Software gesteuert aber andere gleichwertigen Konfigurationen können verwendet werden. Ist es notwendig, Frame-Rate zu erhöhen, gelten Sie Pixel binning. Bilder sollten die ganze 6-Well Schale zeigen.
- Bildaufnahme Filme enthalten basale starten (30 s), Stimulus (25 – 35 s) und Erholungsphasen (30 – 60 s).
- Tiere aus der Schale 6 Brunnen Panzer nach Bildgebung zurück.
- Analysieren Sie Filme in ImageJ mit Plugins wie WrMTrck19,20 , die mehrere Parameter an Beweglichkeit zu bieten.
- Um Bilder für die Analyse vorbereiten, wählen Sie zuerst eine gut durch zeichnen ein rechteckigen ROI von 35 mm x 35 mm (Abb. 4A). Erhalten Sie ein Hintergrundbild durch die Berechnung der maximale Projektion der gesamten Sequenz. Es sollte ein Bild des Brunnens ohne die Kaulquappe anzuzeigen.
- Subtrahieren Sie die maximale Projektion aus dem rohen Film. Führen Sie Schnittstellenüberwachung auf dem generierten 32-Bit-Film und wenden Sie das WrMTrck-Plugin. WrMTrck Parameter, um zuverlässig tierische Bewegungen zu verfolgen. Übertragen der erhaltenen X, Y-Koordinaten in ein Analyseprogramm.
- Verwendung von X / Y-Koordinaten berechnen der euklidische Abstand zur Geruchsstoff (Perfusion Einlass in den Brunnen), durch die Anwendung der folgenden Gleichung:
wo Os zeigt die Position der Quelle Geruch und Tad gibt der Tadpole-Position zu einem bestimmten Zeitpunkt. Siehe Abbildung 4A für Details.
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Representative Results
In diesem Beitrag präsentieren wir eine Kombination aus zwei komplementäre Ansätze in Vivo Studie über die Funktionalität des Xenopus Kaulquappe olfaktorischen Systems ausführen: ich) ein Verfahren zur Bildgebung präsynaptischen Ca2 + ändert in den Glomeruli des Lebens Kaulquappen mit einem fluoreszierenden Kalzium Indikator und Ii) geführte ein Geruch Verhaltens Assay, die verwendet werden, um die Reaktion auf bestimmte wasserbasierte Geruchsstoffe zu untersuchen. Da diese Ansätze eingesetzt worden, haben um die Erholung der olfaktorischen Verarbeitung nach Verletzungen10zu bewerten, ist eine einfache Methode für die Geruchsnerven zu auch beschrieben.
Durchtrennung der olfaktorische Bahnen in Xenopus Kaulquappen
Es gibt zwei Möglichkeiten, um die Gültigkeit des Verfahrens zu zertifizieren. Beide setzen auf die Visualisierung der Geruchsnerven mit fluoreszierenden Reporter. Eine Methode basiert auf transgene Kaulquappen, die fluoreszierende Proteine auf ihr Nervensystem ausdrücken. Empfohlene zweizeilig, die GFP unter einem neuronalen β-Tubulin-Promotor Ausdrücken sind laevis tubb2b-GFP und X. tropicalis NBT-GLP (Abbildung 1, siehe Tabelle der Materialien). Wenn nur Wildtyp Tiere zur Verfügung stehen, kann die CM-DiI verwendet werden (siehe Punkt 1.8). Abbildung 1 zeigt Bilder von tubb2-GFP laevis Kaulquappen. Bilder sind von vier verschiedenen Tieren, wo eine einzelne Riechnerv durchtrennten war. Der Schnitt sollte im Rahmen der Dissektion offensichtlich sein. Der Vorteil der Verwendung transgener Linien ist, dass die Reformation von den Riechnerv über einen bestimmten Zeitraum hinweg verfolgt werden kann. Bei sequenziellen Beobachtungen, empfiehlt es sich, fluoreszierendes Licht, lichtbedingten zu verhindern minimieren. Schnitt von einem einzigen Riechnerv ist nützlich, wenn eine interne Kontrolle erforderlich, wie zum Beispiel normal entwickelten Vs verkabelt glomerulären Einheiten zu vergleichen ist. Schnitt der beiden Geruchsnerven sollte angewendet werden, wenn das Ziel vollständig die Übermittlung von Informationen unterdrückt.
Live-imaging der präsynaptischen Antworten auf olfaktorische Reize
Die korrekte Beschriftung von ORNs mit Kalzium grün-1 Dextran kann auf der Ebene der Riechkolben (Abb. 2A) mit Weitfeld-Mikroskopie beobachtet werden. Glomeruli sind offensichtlich (Abbildung 2B) und durch Verschieben der Fokusebene in verschiedenen Schichten verteilt erscheinen soll. Die Morphologie der glomerulären Strukturen kann besser gelöst werden wenn ein confocal Mikroskop stattdessen verwendet wird (Abbildung 2C). Die Anzahl der beschrifteten Glomeruli hängt Farbstoff Aufnahme auf der Ebene der olfaktorischen Epithel. Dieses Verfahren erlaubt daher nicht die Visualisierung aller glomerulären Einheiten. Tieren, die eine intensivere Fluoreszenz Anfärbung der glomerulären Region sollte ausgewählt werden, bevor bildgebende experimentieren, da sie mehr ORNs mit der Bezeichnung enthalten. Dieses Manöver wird dringend empfohlen, um experimentelle Durchsatz zu erhöhen und einen sezierenden Rahmen ausgestattet mit einer Fluoreszenz Lampe durchgeführt werden. Lehnen Sie Tiere ab, die nicht beschriftete glomeruläre Einheiten zeigen oder zeigen, dass Fluoreszenz beschränkt auf bestimmte Bereiche der glomerulären Schicht. Präsynaptischen Ca2 + Antworten können, sobald 1 Tag nach dem Farbstoff Laden beobachtet werden. Zur Durchführung von Experimenten imaging ist es wünschenswert, Ziele von hoher numerischer Apertur, in der Regel ≥0.9 zu verwenden.
Erhöhungen der präsynaptischen Kalziumspiegel können aussetzen dendritischen Knöpfe von ORNs an Aminosäuren hervorgerufen werden. Es ist wichtig, die Kapillare, die Bereitstellung der Duftstoff-Lösung über die nasale Kapsel zu positionieren. Darauf sollte geachtet werden, um Kontakt zu vermeiden, weil es könnte die Spitze der Kapillare verstopfen und/oder mechanische Reizung der ORNs bewirken. Vorübergehender Anstieg der präsynaptischen Kalziumspiegel für Reize ≥0.1 s (Abb. 2D) beobachtet werden und sind bezeichnend für eine korrekte olfaktorischen Signaltransduktion. Es ist auch wichtig, basale Kalziumspiegel mit niedrigen Kameraverstärkung zu visualisieren. Präsynaptischen Klemmen des ORNs werden hohe fluoreszierende erhöht und es ist wichtig, Signalsättigung zu vermeiden. Hoher zeitlicher Auflösung lässt sich mit Weitfeld-Mikroskopie. Beispielsweise ist mit einem Elektron multipliziert CCD-Kamera, es möglich, Frame-Raten von 50 Hz oder höher. Verwendung der konfokalen Mikroskopie zeitlichen Auflösung reduziert sondern ermöglicht eine bessere Definition der glomerulären Strukturen.
Die hohe Affinität von Kalzium Grün zum binden Kalzium (190 nM) ist besonders nützlich, um kleine Antworten zu erkennen. Transiente intrazellulären Calcium erhöht in der glomerulären Schicht erkannt sind variabel. Einige glomerulären Regionen zeigen Veränderungen im ΔF/F0 ≥0.2, während benachbarte Prozesse (Abbildung 2D) nicht einmal reagieren könnte. Die folgenden Faktoren dazu beitragen, die Variabilität der Reaktion des glomerulären Einheiten: (i) die Gesamtzahl der beschrifteten Glomeruli, (Ii) die intrazelluläre Konzentration von Kalzium grün und (Iii) die Selektivität der ORNs Aminosäuren zu erkennen. Da eine zu geringe Zahl von beschrifteten Glomeruli Antworten zu beobachten entgegenstehen könnte, ist es unbedingt notwendig, diese Experimente mit Tieren mit wie viele ORNs wie möglich mit der Bezeichnung durchzuführen.
Olfaktorischen geführte Verhalten
Datenanalyse
Olfaktorischen geführte Verhalten wird mit einem speziell angefertigten System untersucht. Abbildung 3 zeigt eine schematische Zeichnung von Geräten verwendet, um den Test durchzuführen. Der Test beruht in der Fähigkeit der Kaulquappen zum Nachweis von Aminosäuren, die als Riechstoffe fungieren. Eine Lösung aus fünf verschiedenen Aminosäuren (Methionin, Leucin, Histidin, Arginin und Lysin) ist zur Stimulation verwendet. Die Lösung wird vor Ort geliefert, während 30 s mit einem 35 mm, enthält auch eine freischwimmende Kaulquappe. Die unmittelbare Reaktion der Kaulquappen auf die eingehenden Lösung ist eine Zunahme der Beweglichkeit. Zufällige Bewegungen, die während des ersten ∼5 – 10 s Lösung Anwendung folgt eine direkte schwimmen in Richtung der Quelle von Geruchsstoffen. Kaulquappen bleiben für einige Sekunden in der Nähe der Düse bei der Auslieferung von Aminosäuren und allmählich erholen Motilität in zufällige Richtungen (siehe Ergänzende Videos 1, 2).
Die experimentellen Bedingungen beschrieben ermöglichen das normale schwimmen X. tropicalis Kaulquappen Stufen 48-52; Allerdings muss berücksichtigt werden, dass die Motilität des größeren Tieren in 35 mm Brunnen eingeschränkt werden könnte. Kaulquappe Bewegungen sind mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Attraktion für die Duftstoff-Lösung kann als eine Reduktion der euklidischen Distanz trennt Perfusion Einlass von Kaulquappe Position (Abbildung 4) erkannt werden. Tracking der Kaulquappe Kopf Positionen innerhalb eines Bereichs von 35 x 35 mm (oder vergleichbarer Größe in Pixel) ermöglicht eine Quantitative Analyse der olfaktorischen geführte Verhalten (Abb. 4A) zu erhalten. Einzelne Parzellen der Kaulquappe Bewegungen entstehen mit X / Y-Koordinaten durch Bildanalyse (Abbildung 4B) erhalten. Die extrahierten Motilität Grundstücke müssen Videobilder originalgetreu wiederzugeben.
Es gibt zwei mögliche Methoden olfaktorische geführte Verhalten Experimente zu interpretieren. Der erste Ansatz orientiert sich an einer früheren Studie mit Zebrafishes21. Maß für die Zeit, in der Nähe der Düse, die Bereitstellung von Geruchsstoffen beweist das Vorhandensein von positiven Tropismus. Eine Region of Interest von 8,75 mm Radius (entspricht ¼ der gut Durchmesser) zentriert auf die Lösung, die es verwendet, um die Nähe der Tiere, die Duftstoff-Quelle (Abbildung 4A, 4 C) zu klassifizieren. Binning die Verweildauer der Kaulquappen in der Nähe der Düse definierten Zeiten, d. h. 15 s Intervallen kann identifizieren die Fähigkeit zu Aminosäuren-Lösungen (Abbildung 4D) zu erkennen. Das allgemeine Verhalten einer Population von Kaulquappen erhalten Sie durch die Verteilung der einzelnen Daten (Abb. 5A) auftragen. Einen positiven Tropismus kann erkannt werden, wenn die Lösung von Methionin, Leucin, Histidin, Arginin und Lysin entweder bei 1 mM oder 160 μM (Abbildung 5A und 5 b) vorbereitet ist. Tiere reagieren nicht auf Wasseranwendung (Abbildung 5C), so verwerfen die Teilnahme von Mechanosensitive Mechanismen. Testen Sie Unterschiede zwischen Zeit, die in jede experimentelle Gruppe definierten Abständen Dunns Mehrfachvergleiche nichtparametrische Messwiederholungen ANOVA mit hergestellt werden können. Der Nachteil der binning Daten in Zeitabständen von 15 s ist eine reduzierte zeitliche Auflösung.
Zeitinformation die Verhaltensreaktion zu erhöhen ist durch durchschnittliche Grundstücke der euklidischen Abstände von der Geruch-Quelle. Obwohl Kaulquappe Bewegungen eine intrinsische Variabilität zeigen, zeigt die durchschnittliche Motilität von Tieren (in der Regel ≥40) das olfaktorische geführte Verhalten. Um diese Analyse durchzuführen ist es notwendig, tierische Gruppenpositionen vor dem Beginn der Stimulation. Da Kaulquappen an verschiedenen Standorten befinden, die Duftstoff-Lösung in den Brunnen betritt ist es erforderlich, legen Sie die euklidische Entfernung auf 0 kurz vor Stimulation (Abbildung 6A, siehe auch die Einschlusskriterien in Abbildung 7). Negative und positive Werte bedeuten daher eine Anziehung oder Abstoßung von der Quelle Geruch bzw.. Eine Attraktion für Gerüche wird durch eine lineare Anpassung mit Regression Koeffizienten ≥0.9 gut beschrieben. Wenn Wasser geliefert wird, die Nettoänderungen der euklidischen Distanz um 0 verteilt sind und es ist nicht möglich, eine Linie bei Geruchsstoff Stimulation, was darauf hindeutet das Fehlen einer olfaktorischen geführte Verhalten (Abb. 6B). Vergleich der durchschnittlichen Grundstücke euklidische Distanzen für die Aminosäure-Lösungen vorbereitet bei 1 mM und 160 µM empfehlen verschiedene Verzögerungen in der olfaktorischen geführte Antwort (Vergleiche Abbildung 6A und C). Der zeitliche Abstand erforderlich, um die Bewegung in Richtung der Quelle von Geruchsstoffen zu initiieren ist kürzer, wenn Aminosäuren in einer höheren Konzentration angewendet werden. Ein Mangel an olfaktorischen geführte Verhalten wird bei Kaulquappen mit beiden Geruchsnerven durchtrennten (Abbildung 6D) beobachtet.
Eine Einschränkung des beschriebenen olfaktorischen geführte Verhaltens Assays ist die Errichtung von komplexen Flüssigkeit Federn. Dies kann gesehen werden, wenn die Aminosäure-Lösung durch einen Farbstoff wie schnell grün, substituiert wird, bei der Einrichtung des Systems. Die Verwendung von farbigen Lösungen überprüft die Bildung von Federn und zeigt, die dass wasserbasierte Geruchsstoffe jede Region des Brunnens innerhalb 5 S. Turbulenzen verursacht durch die Bereitstellung der Lösung erreichen werden wahrscheinlich von der Seitenlinie der Kaulquappen erkannt und wahrscheinlich dazu beitragen die Variabilität in tierischen Motilität beobachtet aber olfaktorische geführte Verhalten nicht stören. Experimente durchgeführt, indem Wasser anstelle von Aminosäure-Lösungen zeigen, dass Kaulquappen in der Lage, olfaktorische von mechanischen Reizen zu unterscheiden sind. Die Schätzung der Zeit in einer Region of Interest (Abbildung 5) und die durchschnittliche Handlung des euklidischen Abstände (Abbildung 6) sind zwei komplementäre Methoden zu beschreiben, die olfaktorische geführte Reaktion der Kaulquappen.
Einschlusskriterien
Einschlusskriterien sind, müssen für die Datenanalyse auch berücksichtigt werden. Einige Kaulquappen zeigen eine resonante Bewegung, die durch den Anbau der Handlung des euklidischen Abstände einer sinusförmigen Funktion (Abb. 7A) dargestellt ist. Kaulquappen Anzeigen dieses Verhalten müssen von allen Analyse entsorgt werden.
Der Ausschluss von Tieren, die zu Beginn der Anwendung der Geruchsstoff Lösungen bei maximaler sind (> 30 mm Abbildung 7B) oder eine minimale euklidische Entfernung (< 5 mm, Abbildung 7C) aus der Düse ermöglicht die Verringerung der Variabilität der durchschnittliche Grundstücke. Das Beispiel in Abbildung 7B zeigt einen positiven Tropismus für die Aminosäure-Lösung. Die Kaulquappe befindet sich in einem maximalen Abstand von der Lösung Einlass zu Beginn der Stimulation. Daher kann diese relative Position nur eine Attraktion für die Geruch-Quelle offenbaren. Abbildung 7 C zeigt das Gegenteil der Fall. Hier befindet sich eine Kaulquappe in der Nähe der Düse die Aminosäure-Lösung zu liefern. Quantifizierung von die Zeit, in der Nähe der Geruch zeigt eine Antwort (in Abbildung 5verwendete Methode); Es kann nicht jedoch eine Nettobewegung in Richtung Einlass zeigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen definiert die vorgeschlagenen Assay der olfaktorischen geführte Verhalten einen binäre Test. Diese Methode kann verwendet werden, um die Möglichkeit einer experimentellen Gruppe von Kaulquappen zur Beantwortung Geruchsstoffe zu erkennen. Weitere Verbesserungen sind erforderlich, wenn das Ziel Unterschiede zwischen komplexe olfaktorische geführte Antworten, wie zum Beispiel zur Gründung ist Bestimmung Präferenzen für bestimmte Gerüche.
Abbildung 1: Durchtrennung der Geruchsnerven. Repräsentative Bilder von tubb2-GFP laevis Kaulquappen nach Durchtrennung von einem einzigen Riechnerv (Pfeile) erhalten. Nerven der tubb2-GFP Kaulquappen zeigen starke Fluoreszenz. Durchtrennung des Nerven ist offensichtlich unmittelbar nach der Operation (D0). Nachwachsen der Riechnerv ist offensichtlich 4 Tage nach dem Schnitt (D4). Acht Tage nach der Operation ist (D8) kaum einen Unterschied zwischen Steuerung und reformierten Nerven. Kaulquappen wurden betäubt in 0,02 % MS-222, Bilder zu sammeln. Riechkolben (O.B.), Riechnerv (O.N), nasale Kapsel (N.C.), Tectum (Tec), Sehnerv (Op.N.). Pfeile zeigen die Lage der durchtrennten Nerven. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Kennzeichnung von olfaktorischen Rezeptor Neuronen mit Kalzium grüne Dextran und Visualisierung von präsynaptischen Kalzium Zustrom nach Stimulation mit Aminosäuren. (A) übertragbare Lichtbild von einer Kaulquappe zeigt den Standort der olfaktorischen Epithel, Geruchsnerven und der glomerulären Schicht aus den Riechkolben. (B) Bild von einer Riechkolben visualisiert (wf) Weitfeld-Mikroskopie. Neuronen wurden durch Anwendung von Kalzium grün-1 Dextran bei der nasalen Kapsel bezeichnet. Die Fluoreszenz beobachtet entspricht präsynaptischen Klemmen von olfaktorischen Rezeptor Neuronen bilden Glomeruli. O.N: Riechnerv; Tamponmarke: Riechkolben. (C) konfokale Abschnitt liegt dorsal aus dem Eintrag der Riechnerv der Lampe. Die präsynaptischen Komponente des olfaktorischen Glomeruli war beschriftet mit Kalzium grün-1 Dextran, wie in B). (D) präsynaptischen Terminals erhöhen vorübergehend ihren Kalziumspiegel unter Einwirkung der olfaktorischen Epithel zu einer Lösung, die fünf verschiedenen Aminosäuren enthalten. Relative Änderung in Kalzium Fluoreszenz vor, während und nach 1 s Stimulation. (E) Verteilung von 10 verschiedenen Regionen von Interesse (ROIs) verwendet, um ΔF/F0 Änderungen zu quantifizieren. ROI11 liegt außerhalb der glomerulären Schicht und wird verwendet, um natürliche Grundbelastung der Fluoreszenz zu definieren. (F) individuelle ΔF/F0 Antworten für ROIs in E definiert). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Olfaktorischen geführte Verhalten Assay. (A) schematische Darstellung zeigt das Gerät im Test verwendet. (B) Beispiel der Motilität Tracks aufgezeichnet über 90 s. Jeder Kreis stellt eine gut, enthält ein einziges Tier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Tracking der olfaktorischen geführte Verhalten. (A) Beispiel für einen Brunnen für die Verhaltens-Assay verwendet. Blaue gepunktete Linien zeigen die Position der X-und Y-Koordinaten (in mm) Kaulquappe Bewegungen zu verfolgen (siehe auch ergänzende Video 1) verwendet. Die grüne Ellipse stellt die Position des Einlasses Lösung. Die gestrichelte schwarze Linie zeigt den proximalen Bereich der Röhre liefert die Aminosäure-Lösung (siehe Text für Details). (B) Motilität von der Kaulquappe in A gezeigt) während der Verhaltens-Test. Farbcodierte Spuren geben die Position des Tieres vor (grau) und nach der olfaktorische Stimulation (violett). Bewegungen während des Auftragens der Geruchsstoff Lösung werden in einen zeitlichen Farbverlauf (30 s, rot, blau) dargestellt. (C) Verwendung von X, Y Kaulquappe Positionen ist es möglich, Veränderungen in der euklidische Abstand von der Kaulquappe-Kopf mit dem Perfusion Einlass zu berechnen. Entfernungen kürzer als 8,75 mm entsprechen den proximalen Bereich der Düse. (D) Grundstück der Zeitaufwand von Kaulquappen in der Region durch die gestrichelte Linie in A definiert). Jeder Punkt zeigt maximal 15 s. Das Tier wird von der Geruchsstoff Lösung angezogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Kaulquappen von Aminosäuren angezogen werden. (A) Zeitaufwand von Kaulquappen in der Nähe der Geruch-Quelle. Jeder Container umfasst maximal 15 s. Box-Plots repräsentiert den Median (schwarze horizontale Linie), 25 bis 75 % Quartile (Boxen) und Datenbereiche (Schnurrhaare). Lieferung von einem 1 mM Aminosäurelösung angezogen Kaulquappen, die Geruch-Quelle. (B) Kaulquappen wurden von der Geruchsstoff Lösung angezogen, wenn die Konzentration von Aminosäuren auf 160 μM reduziert wurde. (C) Lieferung von Wasser das Verhalten der Tiere nicht geändert werden. Messwiederholungen ANOVA mit Dunn's multiple Vergleiche-Test, p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Zeitliche Reaktion der Kaulquappen auf Geruchsstoffe. (A) Handlung des Durchschnitts euklidische Entfernung zur Quelle Geruch als Funktion der Zeit. Der euklidische Abstand wurde auf 0 vor Stimulation in jede einzelne Spur gesetzt. Negative und positive Werte zeigen eine Abnahme und Zunahme der Entfernung zur Quelle Geruch bzw.. Anziehungskraft auf die Geruch-Quelle kann beschrieben werden, durch eine lineare Anpassung (R2= 0,98). (B) Lieferung von Wasser verändert nicht die Entfernung zur Quelle Geruch. (C) Kaulquappen reagieren Sie auf die Anwendung einer 160 μM-Lösung von Aminosäuren wie durch eine lineare Anpassung offenbart (R2= 0,96). (D) Kaulquappen mit beiden durchtrennten Geruchsnerven reagieren nicht auf Aminosäuren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Einschlusskriterien für die olfaktorischen geführte Verhalten Assay. (A) einige Kaulquappen zeigen eine resonante Bewegung. Dieses Verhalten wird durch erfolgreiche Sitz einer sinusförmigen Funktion für die Handlung der euklidischen Distanz zur Geruch Quelle offenbart. Kaulquappen anzeigen diese Aktivität sollte vom Test ausgeschlossen werden. (B, C) Eine Möglichkeit zur Reduzierung der Variabilität in der durchschnittliche zeitliche Reaktion auf Geruchsstoffe (Abbildung 6) wird durch den Ausschluss der Tiere liegt bei maximal (B) oder (C) euklidische Mindestabstand zu Beginn der Stimulation. Roten gepunkteten Linien zeigen den Schwellenwert (30 mm und 5 mm). Der euklidische Abstand vor der Beginn der Stimulation (Pfeil, Grundstücke links) auf "0" zu berichten Werte anziehend oder abstoßend Verhaltensweisen als negativ oder positiv (richtige Grundstücke), beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Video 1: olfaktorische geführte Verhalten ausgelöst durch Übergabe einer Aminosäurelösung. Der Film zeigt eine Kaulquappe schwimmen frei auf einem 35 mm gut. Die blaue Ellipse gibt die Position der Düse, die Duftstoff-Lösung zu liefern. Den Beginn und das Ende der Stimulation sind durch grüne und rote Punkte angezeigt. Abbildung 4 zeigt die Analyse des Verhaltens zu beobachten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Ergänzende Video 2: Kaulquappe Motilität bei der Lieferung von Wasser. Der Film zeigt eine Kaulquappe schwimmen frei auf einem 35 mm gut. Die blaue Ellipse gibt die Position der Düse Freisetzung von MQ Wasser. Den Beginn und das Ende der Wasserabgabe sind durch grüne und rote Punkte angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Dieses Papier beschreibt Techniken, die sinnvoll, die Funktionalität der olfaktorische Wege im Leben zu untersuchen sind Xenopus Kaulquappen. Das aktuelle Protokoll eignet sich besonders für die Laboratorien, die funktionieren, oder haben Zugang zu Xenopus; Allerdings ist es auch interessant für jene Forscher studieren die zellulären und molekularen Grundlagen der neuronale Regeneration und Reparatur. Ergebnisse im Xenopus kombinierbar mit Daten aus anderen vertebrate Modelle, konservierte Mechanismen zu identifizieren. Die beschriebenen Methoden profitieren von der Entwicklung von gentechnisch veränderten Xenopus18,22,23 und gelten für experimentelle Modelle der Krankheiten des Nervensystems bei Kaulquappen24, 25.
Um reproduzierbare in-vivo-Daten zu erhalten, ist es Schlüssel, Xenopus Kaulquappen richtig zu erziehen. Insbesondere ist die X.tropicalis sehr empfindlich auf schlechte Haltungsbedingungen. Zum Beispiel, sie dulden keine Temperaturen unter 20 ° C und in Tanks oder Wasser-Systeme im Bereich von 24 bis 28 ° c aufbewahrt werden Es ist auch wichtig, nicht Viehdichte oben festgelegten Grenzen zu erhöhen, regelmäßig füttern Kaulquappen und eine optimale Wasser-Qualität-13. Management der tierischen Kolonien nach standardisierten Bedingungen ist zwingend notwendig für die Gewinnung von Reproduzierbarkeit von in-vivo Experimenten.
Das beschriebene Verfahren der Kalzium-Bildgebung ist nützlich, um eine korrekte olfaktorischen Signaltransduktion ORNs erkennen in-vivo. Laden von ORNs mit Kalzium grün-1 Dextran wird durch transiente Permeabilisierung der Plasmamembran mit einer niedrigen Konzentration von Triton x-100, wie bereits berichtet17erreicht. Der Hauptvorteil dieser Methode laden ist Einfachheit, weil es nur eine Microinjector erfordert. Ein großer Nachteil ist, dass Triton x-100 die vorübergehende Beseitigung der olfaktorischen Zilien und Mikrovilli verursacht. Das olfaktorische Epithel Zebrafisch regeneriert innerhalb von 48 h nach Behandlung17. Regeneration im Xenopus Kaulquappen könnte noch schneller sein, da Antworten auf Geruchsstoffe 1 Tag nach Farbstoff beladen (Abbildung 2D) beobachtet werden können. Eine detaillierte morphologische Analyse ist jedoch erforderlich, um genau zu schätzen, die Regenerationszeit der olfaktorischen Epithel nach Triton x-100-Behandlung.
Kennzeichnung von ORNs mit Kalzium grün-1 Dextran wirkt sich nur in einer Population von Neuronen, ermöglicht die Visualisierung der präsynaptischen Terminals mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis (Abb. 2 b und 2 C). Das fast völlige Fehlen von Hintergrund ist vorteilhaft, wenn im Vergleich zum Laden der gesamten Riechkolben mit AM Esterformen von Kalzium Farbstoffe. Die Anzahl der fluoreszierenden ORNs unterscheidet sich von Tier zu Tier. Es muß also einen breiten olfaktorischen Reiz von mehreren Aminosäuren zu verwenden. Wir haben erfolgreich mit einer Lösung von Methionin, Leucin, Histidin, Arginin und Lysin Ergebnisse. Andere Kombinationen verschiedener Aminosäuren können auch wirksam sein. Eine alternative Methode zur ORNs mit Kalzium Indikatoren zu laden ist Elektroporation26, die weit verbreitet ist, genetisch codierte fluoreszierende Reportern in Kaulquappe Neuronen27zum Ausdruck bringen. Elektroporation kann erfolgen mit kaufmännischer oder maßgefertigte Ausrüstungen und ermöglicht die Visualisierung von neuronalen Strukturen mit ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis-28. Ähnlich wie die beschriebene Vorgehensweise Zellpopulationen beschriftet sind heterogen und unterscheiden sich von Tier zu Tier. Transgenese ist wünschenswert, wenn das Ziel eine definierte Population von Neuronen22untersucht. Zum Beispiel könnte den Ausdruck der genetisch codierten Kalzium Indikatoren wie GCaMPs in einer eingeschränkten Gruppe von ORNs fahren, sehr nützlich, um die Beantwortung einer definierten Gruppe von präsynaptischen Klemmen Geruchsstoffe untersuchen.
Die beschriebene Methode mit Kalzium-grün 1 Dextran berichtet präsynaptischen Terminalfunktion in-vivo. Die Beobachtung der intrazellulären Kalzium erhöht ist bezeichnend für einen richtigen olfaktorischen Signaltransduktion und Freisetzung von Glutamat auf der Ebene der Glomeruli. Quantitative Analyse der Veränderungen in Fluoreszenz ist jedoch begrenzt. Stimulation des präsynaptischen Klemmen erhöht intrazellulären Calciumspiegel im mikromolaren Sortiment und Sättigung eine hohe Affinität Kalzium Indikator wie Calcium Grün muss Rechnung getragen werden. In Figur 2 dargestellten Ergebnisse mit Weitfeld-Mikroskopie. Dies ist der einfachste Ansatz und in den meisten Labors umgesetzt werden kann. Verbesserung durch den Einsatz von zwei-Photonen-Mikroskopie oder genetisch codierte fluoreszierende Reporter können weitere quantitativen Schätzungen der präsynaptischen Funktion zu erhalten.
Für live Aufnahmen von Kalzium Antworten ist es wichtig, gibt es entsprechende Positionierung der Kapillare, die Duftstoff-Lösung zu liefern. Es sollte über die nasale Kapsel befinden und immer vermeiden Sie direkten Kontakt mit Gewebe. Sowohl die korrekte Zustellung der Duftstoff-Lösung und den Fluss der Durchblutung sollte überprüft werden, bevor Sie platzieren die Kaulquappe unter die Lupe genommen. Alle Schläuche für die Perfusion verwendet muss auf Luftblasen geprüft werden. Durchfluss Änderungen der Aminosäure-Lösung haben sofortige Reaktion auf aufeinander folgenden öffnen und Schließen des Magnetventils. Verzögerungen sind kennzeichnend für die Anwesenheit von Luft. Es ist auch wünschenswert, check für korrekte Volumen steigt oder sinkt der Lösung geliefert nach der Änderung der Öffnungszeit dh., von 0,1 s bis 1 s oder umgekehrt. Verwenden Sie eine geringe Lichtintensität während der Einstellung Versuchsparameter (Schritt 4.6) um Immunofluoreszenz zu minimieren.
Zwar die Bedeutung der Geruchssinn in der Biologie von Kaulquappen etablierten29, gibt es ein Mangel an Tests zur Bewertung direkt olfaktorische geführte Verhalten in Xenopus Larven. In diesem Artikel beschriebene Methode ist ein einfacher Test, der den Nachweis einer Reaktion auf einen Reiz der Geruch in einer großen Population von Tieren erlaubt. Die aktuelle Beschreibung der Geruchsstoff Empfindlichkeit der Kaulquappen der Rana Catesbeiana auf das Vorhandensein von Chemikalien im Wasser veranschaulicht die komplexen Mechanismen Geruchssinn an motorischen Verhalten30ankuppeln. Der in diesem Dokument beschriebenen Test berücksichtigt die intrinsische Variabilität der olfaktorischen geführte Verhalten in Kaulquappen. Die Verwendung der 6-Well Platte anstelle von einzelnen Brunnen erhöht experimentelle Durchsatz. Faktoren, die Variabilität werden von durchschnittlich viele Kaulquappen überwunden, solche basalen Motilität, relative Position zum Perfusion zu- und Federn durch die Duftstoff-Lösung generiert. Rund 40 unabhängige Messungen sind erforderlich, um attraktive Regelverhalten für Aminosäuren zu beschreiben.
Wir bieten zwei Arten der Analyse für den Geruchssinn-Test. Der erste Ansatz wird die Verweildauer in der Nähe der Geruch-Quelle über einen definierten Zeitraum quantifiziert. Es ist besonders gut geeignet für statistische Analysen. Der zweite Ansatz basiert auf der durchschnittlichen Plot euklidischen Abstände von der Geruch Quelle und ist nützlich, um die zeitliche Reaktion auf Geruchsstoffe zu beschreiben. Beide Arten der Analyse ergänzen sich gegenseitig und kommen durch die gleichen Daten erzeugt. Interpretation ist binär und erlaubt Unterscheidung Tieren dieser Sinn Geruchsstoffe von denen, die nicht10zu tun.
Wie die beschriebenen Methoden könnte nützlich sein, die Xenopus -Gemeinschaft? Obwohl die Methoden im Wesentlichen für Wildtyp Tiere abgebildet sind, sollten sie berücksichtigt werden, die genetischen Möglichkeiten im Feld Xenopus kontinuierlich erweitert werden. Die kombinierte Untersuchung der in-vivo ORN Antworten und das Vorhandensein von olfaktorischen geführte Verhalten können auch sehr nützlich, um die korrekte Verarbeitung der Geruchsinformation im Xenopus Mutanten erstellt entweder vorwärts oder rückwärts genetische Bildschirme untersuchen werden. 11. die Angaben von Kalzium Imaging und Verhaltens-Assay kann kombiniert werden. Beispielsweise eine Mutation gezielt beeinflussen Granulat Zellen von den Riechkolben würde die präsynaptischen Reaktion des ORNs nicht ändern aber würde wahrscheinlich olfaktorische geführte Verhalten beeinträchtigen.
Zuordnen von zellulären und Verhaltensstörungen Antworten in-vivo Methoden sind besonders relevant für die genetische Zerlegung des neuronalen Schaltkreise. Die Interpretation der Ergebnisse kann von früheren morphologischen arbeiten, unterstützt werden, die eine anatomische Karte der glomerulären Schicht Kaulquappen31zur Verfügung gestellt haben. Informationen, die von Riechkolben Scheiben von Xenopus Kaulquappen32 ist auch sehr wertvoll. Kalzium-Bildgebung der Mitral-/getuftet Zellen im Riechkolben Scheiben ergab Grundzüge des olfaktorischen Verarbeitung in Xenopus Kaulquappen, wie zum Beispiel die Empfindlichkeit des ORNs auf verschiedene Aminosäuren33 oder die Relevanz der Antwort Latenzen bei der Codierung von Geruchsinformationen7. Gehirnscheiben zeigen jedoch eine begrenzte Kapazität, die komplexen integrative Mechanismen verknüpfen unterschiedliche neuronale Schaltkreise durch den Schnitt der zahlreichen neuronalen Projektionen zu reproduzieren. Außerdem ist eine Charakterisierung der Eigenschaften der einzelnen glomerulären Einheiten noch schwer mit Ausnahme der γ-Glomerulus-34. Die Frage, ob einzelne glomeruläre Einheiten bestimmte Verhaltensweisen in Kaulquappen bestimmen werden nur durch die Kombination von genetischen Werkzeuge, in Vivo imaging Ansätze und Verhaltensstörungen Assays beantwortet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) mitfinanziert von European Regional Development Fonds (EFRE), durch wettbewerbsfähige Forschungspreise aus der M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Stipendium Fonds, Laura und Arthur Colwin ausgestattet Sommer Research Fellowship Fund , das Fischbach Fellowship und der große Generation Fund der Marine Biological Laboratory und der nationalen Xenopus Ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts) wo ein Teil dieser Arbeit wurde durchgeführt. Wir danken auch CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung. A.L. ist Serra Húnter Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
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