Summary
Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso in vivo. Descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione di informazioni olfattive in vita Xenopus larve in normali condizioni di allevamento o dopo la ferita.
Abstract
Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso. Essi forniscono molteplici vantaggi sperimentali, quali l'accessibilità a numerosi approcci di imaging, tecniche elettrofisiologiche e comportamentali saggi. Il sistema olfattivo di Xenopus girino è particolarmente adatto per studiare la funzione delle sinapsi stabilito durante lo sviluppo normale o riformato dopo la ferita. Qui, descriviamo le metodologie per valutare l'elaborazione delle informazioni olfattive nella vita di larve di Xenopus . Descriviamo una combinazione di misurazioni in vivo delle risposte del calcio presinaptico in glomeruli del bulbo olfattivo con dosaggi comportamento olfattivo-guida. Metodi possono essere combinati con il transection dei nervi olfattivi per studiare il riavvolgimento delle connessioni sinaptiche. Gli esperimenti sono presentati utilizzando animali wild-type e geneticamente modificati che esprimono i reporter GFP in cellule del sistema nervoso centrale. Applicazione degli approcci descritti a girini geneticamente modificati può essere utile per svelare le basi molecolari che definiscono il comportamento dei vertebrati.
Introduction
Girini di Xenopus costituiscono un eccellente modello animale per studiare la funzione normale del sistema nervoso. Trasparenza, un genoma sequenziato completamente1,2e accessibilità alle tecniche chirurgiche, elettrofisiologiche e imaging sono proprietà uniche delle larve di Xenopus che consentono di indagare funzioni neuronali in vivo3 . Alcune delle possibilità più sperimentale di questo modello animale sono illustrate da studi approfonditi su girino sistemi sensoriali e motori4,5,6. Un circuito neuronale particolarmente adatto per studiare molti aspetti di elaborazione a livello delle sinapsi delle informazioni è il sistema olfattivo girino di Xenopus 7. In primo luogo, la sua connettività sinaptica è ben definita: neuroni olfattivi (ORNs) del progetto al bulbo olfattivo e stabilire contatti sinaptici con dendriti delle cellule mitrali/trapuntato all'interno dei glomeruli per generare mappe di odore. In secondo luogo, sua ORNs vengono continuamente generati da neurogenesi per tutta la vita per mantenere la funzionalità delle vie olfattive8. E in terzo luogo, perché il sistema olfattivo Mostra una grande capacità rigenerativa, girini di Xenopus sono in grado di riformare completamente il loro bulbo olfattivo dopo ablazione9.
In questo articolo, descriviamo gli approcci che combinano formazione immagine dei glomeruli olfattivi in girini vivente con esperimenti comportamentali per studiare la funzionalità delle vie olfattive. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare il recupero funzionale di connettività glomerulare nel bulbo olfattivo dopo nervo olfattivo transection10. I dati ottenuti in girini di Xenopus sono rappresentativi dei vertebrati poiché l'elaborazione olfattiva evolutivo conservato.
I metodi descritti sono esemplificati utilizzando X. tropicalis ma può essere facilmente implementati in X. laevis. Nonostante le dimensioni dell'adulto X. laevis, entrambe le specie sono notevolmente simili durante le fasi di girino. Le principali differenze risiedono a livello genomico. X. laevis Visualizza scarsa trattabilità genetico, determinato prevalentemente dalla sua allotetraploide genoma e tempo di lunga generazione (circa 1 anno). Al contrario, x. tropicalis è più suscettibili di modificazioni genetiche, grazie alla sua più breve tempo di generazione (5 – 8 mesi) e il genoma diploide. Gli esperimenti rappresentativi sono illustrati per animali di selvaggio-tipo e tre diverse linee transgeniche: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).
Le metodologie descritte nel lavoro attuale dovrebbero essere considerate a fianco la genetica progredisce nel campo di Xenopus . La semplicità e la facile implementazione di tecniche presentate li rende particolarmente utili per la valutazione già descritto mutanti11, nonché linee di Xenopus generati da CRISPR-Cas9 tecnologia12. Inoltre descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per transetto nervi olfattivi che può essere implementati in qualsiasi laboratorio avendo accesso a girini di Xenopus . Gli approcci utilizzati per la valutazione delle risposte del calcio presinaptico e olfattivo-Guida di comportamento richiedono attrezzature specifiche, seppur disponibile ad un costo moderato. Metodologie sono presentati in una forma semplice per promuovere il loro uso in gruppi di ricerca e potrebbero porre le basi di analisi più complesse sia implementando miglioramenti o l'associazione ad altre tecniche, ossia approcci di genetica o istologici, .
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca animale all'Università di Barcellona.
Nota: X. tropicalis e X. laevis girini sono allevati secondo metodi standard13,14. Acqua di girino è preparato aggiungendo sali commerciali (Vedi Tabella materiali) all'acqua da osmosi inversa. Conducibilità è regolato in µS ∼700 e ∼1, 400 µS per girini X. tropicalis e X. laevis , rispettivamente. Le larve possono essere ottenute mediante accoppiamento naturale o fecondazione in vitro14. Gli embrioni sono dejellied con 2% di che l-cisteina preparata in di 0,1 x Marc Modified Ringers (MMR). 1 x MMR contiene (in mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0,1 EDTA, pH 7,8. Le larve sono trasferite dopo 2 – 3 giorni (fase 25) L 2 serbatoi con acqua girino. Quando girini raggiungono fase 40 del Nieuwkoop-Faber (NF) criteri15, sono posizionati in serbatoi di 5L e mantenuti ad una densità di 10 animali/L. temperatura viene mantenuta costante a 23 – 25 ° C e 18 – 20 ° C per X. tropicalis e X. laevis girini, rispettivamente. Animali che si trovano in fasi 48 – 52 dei criteri NF sono utilizzati per esperimenti.
1. transection dei nervi olfattivi
- Preparare una soluzione anestetizzante dello 0,02% MS-222 in 50 mL di acqua di girino a temperatura ambiente.
- Preparare un piccolo serbatoio (1 – 2 L) con girino acqua per permettere il recupero di animali dopo l'intervento chirurgico.
- Tagliare le parti rettangolari di carta da filtro qualitativa cellulosa (4 cm x 3 cm, Vedi Tabella materiali).
- Bagnato 2 pezzi di carta da filtro qualitativa cellulosa in una soluzione 0,02% MS-222 e metterli nell'ambito di dissezione.
- Scegli un girino dal serbatoio e immergerlo nella soluzione anestetizzante. L'animale smette di nuotare all'interno di 2 – 4 min e non reagisce agli stimoli meccanici applicati a livello di coda con una pinzetta.
-
Posto il girino anestetizzato sui pezzi rettangolari di carta da filtro. Posizionare l'animale con la parte dorsale è rivolta verso l'alto, in modo che strutture cerebrali possono essere visualizzati.
- Utilizzando le forbici di Allerød (Vedi Tabella materiali) tagliare uno o entrambi i nervi olfattivi (a seconda del tipo di test da effettuare). Transetto un singolo nervo per esperimenti che richiedono un controllo interno della ferita del nervo.
- Per gli esperimenti comportamentali, transetto entrambi i nervi al fine di sopprimere tutte le informazioni di odorizzante che arrivano al bulbo olfattivo. L'efficienza di sezionamento dei nervi olfattivi possa essere facilmente osservata nell'ambito di dissezione; Tuttavia, posizione di pigmentazione o animale possa essere fattori limitanti.
Nota: (Opzionale) Il modo migliore per certificare la validità della procedura utilizza girini transgenici che esprimono reporter fluorescenti sul loro sistema nervoso (Vedi risultati rappresentativi). A questo scopo, è necessario utilizzare un ambito di dissezione dotato di fluorescenza (Figura 1). Se solo animali di selvaggio-tipo sono disponibili, può essere impiegato l'analisi con CM-diI. Seguire il protocollo 2 (Vedi sotto) per iniettare una soluzione di 0,5 mg/mL di CM-diI preparato in 0,3 M saccarosio nella capsula nasale. Vedi 16 per informazioni dettagliate sulla preparazione e deposito di CM-diI. Perdita della tintura fuori della cavità principale deve essere minimizzare. A questo scopo, è necessario modificare la pressione di iniezione e l'apertura di micropipette. Fluorescenza a livello dello strato glomerulare del bulbo olfattivo diventa ovvio 24 h dopo l'applicazione di CM-diI. Il presente lavoro utilizza un'etichettatura con CM-diI solo per certificare la procedura transection; Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato anche per ottenere informazioni morfologiche dei glomeruli olfattivi utilizzando procedure istologiche convenzionali.
- Trasferire gli animali per il serbatoio di recupero. Girini dovrebbero recuperare normale di nuoto all'interno ~ 10 min. eseguire un controllo attento per la presenza di emorragie, che sono attesi in ~ 1% di animali sottoposti ad intervento chirurgico.
- Eutanasia animali feriti in una soluzione di 0,2% MS-222.
2. etichettatura dei neuroni olfattivi con indicatori fluorescenti calcio
- Preparare una soluzione contenente 12% calcio verde-1-destrano (Vedi Tabella materiali), 0,1% Triton X-100 e 1 mM NaCl17. Conservare la soluzione a-20 ° C o a-80 ° C se non deve essere utilizzato entro un mese.
- Pipette di vetro con punta aperture ~ 1-2 µm (diametro simile a microelettrodi utilizzato per esperimenti di patch-clamp) prepararsi microinjection usando un estrattore micropipetta (Vedi Tabella materiali).
- Calibrare il volume di microiniezioni. Usando acqua distillata, regolare il tempo di pressione e l'iniezione al fine di ottenere volumi di iniezione di 0,15-0,3 µ l.
Nota: Una procedura semplice consiste nel contare il numero di impulsi per svuotare una pipetta riempita con 1 µ l di acqua necessaria. Parametri tipici sono una pressione di 30 psi e 50 ms tempo di iniezione. - Posizionare una pipetta nella microinjector e caricarlo con ~ 2 µ l di soluzione di calcio verde-1 destrano.
- Preparare un girino come segue 1.1 a 1.6.
- Spostare la punta della pipetta nella cavità principale della capsula nasale.
Nota: Vedere la Figura 2A che descrive la posizione di vie olfattive in un girino di Xenopus. - Utilizzando impostazioni ottenute al punto 2.3, consegnare un paio di soffi. Limitare la presenza di colorante alla capsula nasale.
- Lasciate che il girino riposare per 2 – 3 minuti utilizzando una pipetta Pasteur, versare gocce di soluzione di MS-222 0,02% sulle parti più caudale dell'animale per evitare l'essiccazione.
- Trasferire l'animale per il serbatoio di recupero.
Nota: Si dovrebbe recuperare il normale di nuoto all'interno ~ 10 min manipolazione degli animali potrebbe causare lesioni. - Eutanasia girini che non recuperano comportamento normale di nuoto 15 min dopo l'iniezione usando una soluzione di 0,2% MS-222.
- Osservare la fluorescenza a livello dello strato glomerulare del bulbo olfattivo il giorno dopo l'iniezione.
3. preparazione dei girini per Live Imaging delle risposte presinaptiche
- 24 – 48 h prima di condurre l'esperimento, cappotto 4 – 6 capsule di Petri di 35 mm di diametro con elastomero di silicone (ad es., Sylgard). Una volta che l'elastomero ha polimerizzato, fabbricare un pozzo rettangolare per adattare il girino.
Nota: Dimensioni tipiche per girini X. tropicalis trovati in fasi NF 48 – 52 sono 10 x 4 mm. - Preparare 100 mL di un 160 µM a soluzione di 1 mM dell'aminoacido che agisce come uno stimolo di odorizzante per girini. La soluzione può contenere una miscela di parecchi aminoacidi: leucina, istidina, arginina, metionina e lisina. Diluire gli amminoacidi in soluzione di Ringer lattato Xenopus , composta da (in mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, glucosio 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Assicurarsi che il pH è mantenuto a 7,8.
- Riempire un serbatoio elevato con 20 mL della soluzione dell'aminoacido. Collegare il serbatoio con polietilene tubi ad un tubo capillare di 28 G (Vedi Tabella materiali) posto sopra la capsula nasale.
Nota: Il tubo capillare è montato su un micromanipolatore (Vedi Tabella materiali). Bolle d'aria devono essere assenti dal sistema di perfusione. - Ottenere la precisione temporale nell'applicare la soluzione di aminoacidi utilizzando il transistor-transistor logic (TTL) controllo delle elettrovalvole a solenoide pizzico (Vedi Tabella materiali). Uno stimolatore viene utilizzato per generare impulsi TTL (Vedi Tabella materiali). Verifica la precisione temporale per fornire la soluzione odorant modificando la durata degli impulsi TTL, cioè., 0,1-1 s.
- Riempire un altro serbatoio elevato con 100 mL di soluzione di Ringer lattato Xenopus .
- Anestetizzare un girino e posizionarlo sotto l'ambito per dissezione (punti 1.1-1.6).
- Preparare un girino per l'imaging. Se girini albino sono disponibili, procedere al passaggio 3.9, altrimenti togliere la pelle sopra il bulbo olfattivo, perché contiene i melanociti che compromettere imaging (punto 3.8).
Nota: Ci sono due modi per eseguire l'esperimento a seconda la pigmentazione dell'animale. È preferibile utilizzare animali albini. Albino ceppi sono disponibili per X. laevis e linee di albino X. tropicalis recentemente sono stati generati da CRISPR-Cas9 12 o TALENs18. - Utilizzando le forbici Allerød, fare un'incisione laterale sulla pelle girino sul bordo del sistema nervoso centrale. Fare il taglio dovrebbe essere fatto a livello del bulbo olfattivo e mai raggiungere la posizione di tectum, che può essere facilmente identificato dalla posizione del nervo ottico.
- Pizzicare la pelle tagliata con una pinzetta e tirare sul sistema nervoso. Verificare la riuscita rimozione dall'assenza di melanociti sopra il bulbo olfattivo. Mantenere umido l'animale da versare gocce di soluzione di MS-222 0,02% utilizzando una pipetta Pasteur.
- Posizionare il girino nel pozzetto del piatto rivestito (Vedi Tabella materiali). Mettere un coprioggetto in vetro rivestito con grasso per vuoto alta sopra l'animale. Posizionare il vetrino coprioggetto per coprire la parte superiore di tectum fino alla fine della coda.
- Verificare che il bulbo olfattivo e placodi rimangano esposti al medium extracellulare. Mantenere immobile il girino durante la formazione immagine. Riempire la capsula di Petri con tubocurarina di Xenopus Ringer solutioncontaining 100 µM (Vedi Tabella materiali) per prevenire le contrazioni muscolari.
Nota: Tubocurarina è memorizzato in aliquote a-80 ° C non più di 6 mesi. - Mettere il piatto che tiene il girino sotto un microscopio in posizione verticale. Collegare il serbatoio contenente la soluzione di Ringer lattato Xenopus con il piatto utilizzando tubi di polietilene (Vedi Tabella materiali) per aspersione continua di lattato Xenopus Ringer per mantenere l'animale vivo per > 1 h.
Nota: Mini pinze magnetiche (Vedi Tabella materiali) sono molto utili per collegare stabilmente tubi al piatto. Tubi di aspirazione e di perfusione devono trovarsi in angolo ~ 180°. - Avviare che irrora lattato Xenopus Ringer. Mantenere il livello della soluzione nella costante piatto in tutto l'esperimento. Valutazione continua vitalità girino osservando la circolazione del sangue attraverso i vasi.
4. live Imaging presinaptici Ca2 + modifiche in Glomeruli olfattivi
Nota: La procedura di imaging è descritto per microscopia grandangolari, ma potrebbe essere facilmente adattata ad un microscopio confocale regolando le impostazioni di acquisizione. La formazione immagine dovrebbe essere effettuata in un microscopio verticale montato su un tavolo antivibrazione.
- Visualizzare il girino con un obiettivo di ingrandimento basso, ad esempio 5x.
- Spostare gli assi del micromanipolatore per posizionare il capillare offrendo la soluzione odorant sulla cima di una capsula nasale formando un angolo di 90 ° con il nervo olfattivo. Il flusso della soluzione odorant sopra il bulbo olfattivo dovrebbe essere evitato perché potrebbe causare turbolenze che distorcono la formazione immagine.
- Trovare il bulbo olfattivo situato ipsilaterally alla capsula nasale (soggette a stimolazione) utilizzando un alto ingrandimento, distanza di funzionamento lunga, acqua obiettivo a immersione: 60Xx, 0,9 N.A.
- Controllare l'emissione di fluorescenza ad occhio. Strutture glomerulari dovrebbero essere ovvio (Figura 2B).
- Effettuare l'acquisizione dal vivo con una fotocamera adatta per l'imaging del calcio. Definire una scatola contenente l'intero bulbo olfattivo, in genere di 256 x 256 o 512 x 512 pixel. Insieme all'acquisizione di tasso cornice di acquisizione a 20 – 40 Hz. regolare il guadagno, in modo che i valori di fluorescenza basale sono ~ 20% di saturazione. Acquisire un video s 5.
- Visualizzare il filmato. Verifica immagine messa a fuoco, l'assenza di artefatti di movimento e regioni che contengono pixel saturi. I valori di fluorescenza tipico delle regioni glomerulare dovrebbero essere di 5.000 – 20.000 a.u. se utilizza una fotocamera di 16 bit. Procedere al passaggio successivo se imaging le condizioni sono ottimali. Ripetere il passaggio 4.6 se necessario per migliorare la qualità dell'immagine o regolare le impostazioni di guadagno.
- Avviare un'acquisizione di time-lapse per registrare risposte evocate da stimoli olfattivi.
Nota: Applicazione precisa della soluzione odorant è controllata da stimoli TTL. Un tipico esperimento contiene un periodo basale di 4 s, seguita da stimolazione tempi che vanno da 0,1 a 0,5 s e un periodo di recupero di 6 – 10 s. - Eseguire stimolazioni ripetitive di odorizzazione per intervalli di tempo > 2 minuti impostare la portata di 1 – 1,5 ml · min-1. Poiché l'aspersione globale è il durante tutti gli esperimenti, applicati localmente gli aminoacidi sono sbiaditi.
Nota: Il volume di soluzione nel piatto è ~ 3 mL. -
Analisi dell'immagine
- Rilevazione delle risposte
- Esportazione di filmati ImageJ.
Nota: L'obiettivo è individuare la presenza delle regioni glomerulare risponde agli stimoli. - Trasformare la prime sequenze di immagini di fluorescenza da un film di0 ΔF/F. Misurare le variazioni relative a fluorescenza basale secondo la seguente relazione: (F-F0) / f0, dove F0 indica livelli basali di fluorescenza.
- Disegnare le regioni di interesse (ROI) nei dintorni di zone che mostrano fluorescenza presunti aumenti durante la stimolazione e registrare la loro posizione in gestione ROI (Figura 2E). Disegnare un ROI per rilevare livelli di fluorescenza di fondo in un'area priva di strutture glomerulari.
- Esportazione di filmati ImageJ.
- Quantificazione delle risposte.
- Posto il ROIs definiti nella sequenza raw delle immagini di fluorescenza. Ottenere il valore di grigio medio di ROIs selezionato per ogni fotogramma. Trasferire la sequenza di valori ottenuti ad un programma di analisi (ad es.., Igor Pro).
- Sottrarre la fluorescenza di fondo e quindi calcolare le modifiche ΔF/F0 per ogni ROI (Figura 2F). Tracciare gli aumenti in ΔF/F0 per ciascuna delle ROIs selezionato. Calcolare la deviazione standard di ΔF basale/F0 (prima di stimolazione).
Nota: Una risposta positiva è considerata se aumenti in ΔF/F0 ottenuti durante la stimolazione sono più grandi di 2 deviazioni standard dei valori basali.
- Rilevazione delle risposte
5. analisi di comportamento olfattivo-Guida
Nota: Un diagramma schematico del setup per eseguire il dosaggio è illustrato nella Figura 3.
- Fare piccoli fori per adattarsi a tubi di 1.57 mm O.D. x 1,14 mm di diametro nella parte superiore di ciascun pozzetto di un piatto 6 pozzetti. Inserire il tubo e guarnizione utilizzando un adesivo epossidico (Vedi Tabella materiali).
Nota: Il piatto modificato può essere riutilizzato molte volte dopo accurato lavaggio con acqua distillata. - Preparare 50 mL di una soluzione dell'aminoacido che contiene metionina, leucina, istidina, arginina e lisina (Vedi punto 3.2 per dettagli). Le concentrazioni possono variare da 160 µM a 1 mM. Posto 20 mL della soluzione in un serbatoio con privilegi elevato.
- Non si nutrono di girini per almeno 12 ore prima del dosaggio. Prendere 6 girini da loro serbatoio di alloggiamento e metterli in 2 L di acqua pulita girino per ridurre al minimo l'esposizione a odoranti.
- Mettere il piatto 6 pozzi modificate su un bianco LED-transilluminatore (Figura 3).
- Coppie le insenature di aspersione al serbatoio contenente la soluzione di aminoacidi utilizzando un collettore (Vedi Tabella materiali). Controllare il sistema di perfusione ed eliminare bolle d'aria. Riempire i 6 pozzetti contemporaneamente. Regolare l'altezza del serbatoio per consentire la consegna di ≥ 5 mL di soluzione di odorizzante entro ~ 30 s.
Nota: Lavare ogni ben 4 volte con acqua distillata doppia dopo l'esposizione alla soluzione di odorizzante. - Riempire ogni bene con 10 mL di acqua girino. 1 posto girino/pozzetto. Lasciare riposare per > 3 min.
- Impostare acquisizione immagine. Utilizzare una telecamera CCD convenzionale che può acquisire immagini a ≥ 5 Hz. Connetti la fotocamera al computer. Qui, usare una macchina fotografica Zeiss MRC5 controllata dal software Zen ma altre configurazioni equivalente possono essere utilizzati. Se è necessario aumentare la frequenza dei fotogrammi, applicare Pixelbinning. Immagini dovrebbero mostrare il piatto intero 6-pozzetti.
- Avvia acquisizione immagine tale che contengono film basale (30 s), stimolo (25 – 35 s) e periodi di recupero (30 – 60 s).
- Restituire gli animali dal piatto 6 pozzi ai serbatoi dopo formazione immagine.
- Analizzare il film in ImageJ utilizzando plugin come wrMTrck19,20 che forniscono più parametri associati a motilità.
- Per preparare le immagini per l'analisi, selezionare prima un pozzo disegnando un ROI rettangolare di 35 x 35 mm (Figura 4A). Ottenere un'immagine di sfondo calcolando la massima sporgenza dell'intera sequenza. Si dovrebbe visualizzare un'immagine del pozzo senza il girino.
- Sottrarre la massima proiezione del film crudo. Eseguire la soglia sul film 32 bit generato e applicare il plugin wrMTrck. Regolare i parametri di WrMTrck per tenere traccia dei movimenti degli animali in modo affidabile. Trasferire l'ottenuti coordinate X, Y in un programma di analisi.
- Le coordinate utilizzando X-Y, calcolare la distanza euclidea all'origine odorant (ingresso di aspersione nel pozzo), applicando l'equazione seguente:
dove il sistema operativo indica la posizione della fonte di odore e tad indica la posizione di girino in un dato momento. Vedi Figura 4A per i dettagli.
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Representative Results
In questa carta, presentiamo una combinazione di due approcci complementari per eseguire in vivo studio della funzionalità del sistema olfattivo girino Xenopus : ho) un metodo per l'imaging presinaptici Ca2 + cambia nei glomeruli dei viventi girini utilizzando un indicatore fluorescente del calcio e ii) un odore guidata analisi comportamentale che può essere utilizzato per studiare la risposta a specifici odoranti a base acquosa. Dal momento che questi approcci sono stati impiegati per valutare la ripresa del trattamento olfattivo dopo lesioni10, è anche descritto un metodo semplice per sezionare i nervi olfattivi.
Transection del vie olfattive in Xenopus girini
Ci sono due modi per certificare la validità della procedura. Entrambi si basano sulla visualizzazione di nervi olfattivi usando reporter fluorescenti. Un metodo si basa su girini transgenici che esprimono le proteine fluorescenti sul loro sistema nervoso. Due linee consigliati che esprimono GFP sotto un promotore di un neurone β-tubulina sono X. laevis tubb2b-GFP e X. tropicalis NBT-GFP (Figura 1, Vedi Tabella materiali). Se solo gli animali di selvaggio-tipo sono disponibili, può essere utilizzato CM-diI (Vedi punto 1.8). La figura 1 Mostra immagini dei girini X. laevis tubb2-GFP. Le immagini sono da quattro diversi animali dove un singolo nervo olfattivo transected. Il taglio dovrebbe essere ovvio nell'ambito di dissezione. Il vantaggio dell'utilizzo di linee transgeniche è che la riforma del nervo olfattivo possa essere seguito per un periodo di tempo. Quando facendo osservazioni sequenziale, è consigliabile ridurre al minimo l'esposizione a luce fluorescente per impedire il photodamage. Sezionamento di un singolo nervo olfattivo è utile quando un controllo interno è necessario, come per esempio, per confrontare unità glomerulare normalmente sviluppato vs ricablato. Sezionamento di entrambi i nervi olfattivi dovrebbe essere applicato quando l'obiettivo è completamente sopprimendo la trasmissione di informazioni.
Live imaging di presinaptiche risposte a stimoli olfattivi
L'etichettatura corretta di ORNs con destrano di calcio verde-1 può essere osservata a livello del bulbo olfattivo (Figura 2A) usando la microscopia widefield. Glomeruli sono evidenti (Figura 2B) e dovrebbero apparire distribuiti in diversi strati spostando il piano di messa a fuoco. La morfologia delle strutture glomerulari possa essere meglio risolta se viene invece utilizzato un microscopio confocale (Figura 2C). Il numero dei glomeruli con etichettati dipende l'assorbimento della tintura a livello dell'epitelio olfattivo. Pertanto, questa procedura non consente la visualizzazione di tutte le unità glomerulare. Gli animali che presentano una colorazione più intensa di fluorescenza della regione glomerulare devono essere selezionati prima di eseguire esperimenti di imaging, poiché contengono più ORNs etichettati. Questa manovra è altamente raccomandata per aumentare la velocità di trasmissione sperimentale e dovrebbe essere effettuata in un ambito di dissezione dotato di una lampada a fluorescenza. Respingere gli animali che non presentano con etichetta unità glomerulare o che mostrano fluorescenza limitato a particolari aree del livello glomerulare. Presinaptici Ca2 + risposte possono essere osservate appena 1 giorno dopo il caricamento di tintura. Per lo svolgimento di esperimenti di imaging è auspicabile utilizzare obiettivi di apertura numerica elevata, in genere ≥ 0.9.
Aumenti dei livelli del calcio presinaptico possono essere evocati esponendo manopole dendritiche di ORNs agli aminoacidi. È importante posizionare il capillare offrendo la soluzione odorant sopra la capsula nasale. Prestare la massima attenzione per evitare il contatto perché esso potrebbe intasare la punta del capillare e/o causare stimolazione meccanica di ORNs. Aumenti transitori della calcemia presinaptica possono essere osservati per stimoli ≥ 0,1 s (Figura 2D) e sono indicativi di un corretto trasduzione olfattiva. Inoltre è importante visualizzare i livelli di calcio basali con fotocamera basso guadagno. Terminali presinaptici di ORNs display fluorescente alta aumenta ed è essenziale per evitare la saturazione del segnale. Elevata risoluzione temporale può essere realizzato con widefield microscopia. Ad esempio, utilizzando una telecamera CCD elettrone-moltiplicato, è possibile ottenere frame rate di 50 Hz o superiore. Uso della microscopia confocale riduce la risoluzione temporale ma permette una migliore definizione delle strutture glomerulari.
L'alta affinità di calcio verde per l'associazione di calcio (190 nM) è particolarmente utile per rilevare le risposte piccole. Aumenti transitori del calcio intracellulare rilevati nel livello glomerulare sono variabili. Alcune regioni glomerulare mostrano cambiamenti in ΔF/F ≥ 0.20 , mentre processi vicini anche potrebbero non rispondere (Figura 2D). I seguenti fattori contribuiscono alla variabilità della risposta delle unità glomerulari: i) il numero complessivo dei glomeruli con etichettati, ii) la concentrazione intracellulare di calcio verde e iii) la selettività di ORNs per rilevare gli aminoacidi. Poiché un numero troppo basso di glomeruli con etichettati potrebbe precludere osservando le risposte, è assolutamente necessario effettuare questi esperimenti con animali contenenti come molti etichettati ORNs come possibile.
Olfattivo-Guida di comportamento
Analisi dei dati
Olfattivo-Guida di comportamento è studiato utilizzando un sistema costruito su misura. La figura 3 Mostra un disegno schematico di attrezzature utilizzate per svolgere il test. Il test si basa nella capacità dei girini per rilevare la presenza di aminoacidi, che agiscono come odoranti. Una soluzione che combina cinque diversi aminoacidi (metionina, leucina, istidina, arginina e lisina) viene utilizzata per la stimolazione. La soluzione viene recapitata localmente durante 30 s a un 35 mm ben contenente un girino liberamente natante. La risposta immediata dei girini alla soluzione in arrivo è un aumento della motilità. Movimenti casuali che si verificano durante l'iniziale ∼5 – 10 s di applicazione di soluzione sono seguiti da una nuotata diretta verso la fonte di odorizzazione. Girini rimangono per alcuni secondi in prossimità dell'ugello durante il parto di aminoacidi e recupero gradualmente la motilità in direzioni casuali (Vedi supplementare video 1, 2).
Le condizioni sperimentali descritte consentono la nuotata normale delle fasi di girini X. tropicalis 48-52; Tuttavia, si deve tener conto che la motilità degli animali più grandi può essere limitata in pozzi di 35 mm. Girino i movimenti sono registrati con una telecamera CCD. Attrazione per la soluzione di odorizzante può essere rilevata come una riduzione della distanza euclidea che separa ingresso di aspersione della posizione girino (Figura 4). Rilevamento delle posizioni di testa girino all'interno di un'area di 35 x 35 mm (o l'equivalente dimensione in pixel) permette di ottenere un'analisi quantitativa di comportamento olfattivo-guida (Figura 4A). Piazzole individuali dei movimenti girino sono costruiti utilizzando le coordinate X-Y ottenute da analisi dell'immagine (Figura 4B). Le trame di motilità estratti devono riprodurre fedelmente immagini video.
Ci sono due possibili metodi di interpretare esperimenti olfattivi-Guida di comportamento. Il primo approccio si ispira uno studio precedente utilizzando zebrafishes21. Misurazione del tempo trascorso in prossimità dell'ugello offrendo odoranti evidenzia la presenza di un tropismo positivo. Una regione di interesse di 8,75 mm di raggio (pari a ¼ del diametro del pozzo) centrato in ingresso alla soluzione che viene utilizzato per classificare la vicinanza degli animali all'origine odorant (Figura 4A, 4C). Binning il tempo trascorso da girini in prossimità dell'ugello durante periodi definiti, vale a dire, 15 s, gli intervalli, permette di identificare la capacità di individuare soluzioni dell'amminoacido (Figura 4D). Il comportamento generale di una popolazione di girini possa essere ottenuto tracciando la distribuzione dei dati individuali (Figura 5A). Un tropismo positivo può essere rilevato durante la soluzione di leucina, istidina, arginina, metionina e lisina è preparata a 1 mM o 160 μM (Figura 5A e 5B). Gli animali non rispondono all'applicazione di acqua (Figura 5C), eliminando così la partecipazione dei meccanismi mechanosensitive. Differenze tra tempo intervalli definiti in ogni gruppo sperimentale possono essere stabiliti utilizzando non parametriche misure ripetute ANOVA con i confronti multipli di Dunn test. Lo svantaggio di binning dati in intervalli di tempo di 15 s è una risoluzione temporale ridotta.
Un modo per aumentare le informazioni temporali della risposta comportamentale è facendo media appezzamenti di distanze euclidee dalla fonte degli odori. Anche se i movimenti girino mostrano una variabilità intrinseca, la motilità media di una popolazione di animali (in genere ≥ 40) viene illustrato il comportamento olfattivo-guida. Per realizzare questa analisi è necessario posizioni degli animali del gruppo prima dell'inizio della stimolazione. Poiché girini si trovano in posizioni diverse quando la soluzione odorant entra nel pozzo è necessario impostare la distanza euclidea su 0 appena prima di stimolazione (Figura 6A, vedi anche i criteri di inclusione nella Figura 7). Valori positivi e negativi indicano pertanto un'attrazione o una repulsione dalla fonte degli odori, rispettivamente. Un'attrazione per gli odori è ben descritto da una misura lineare con ≥ 0.9 di coefficienti di regressione. Se l'acqua viene erogata, i netti cambiamenti di distanza euclidea sono distribuiti intorno a 0 e non è possibile montare una linea durante la stimolazione odorant, così indicando l'assenza di un comportamento olfattivo-guida (Figura 6B). Confronto tra media appezzamenti di distanze euclidee per aminoacido soluzioni preparate a 1 mM e 160 µM suggeriscono diversi ritardi nella risposta olfattiva-guida (confronta Figura 6A e C). L'intervallo di tempo necessario per avviare il movimento verso la fonte di odorizzazione è più breve quando gli aminoacidi vengono applicati a una maggiore concentrazione. Una mancanza di comportamento olfattivo-guida è osservata in girini con entrambi i nervi olfattivi transected (Figura 6D).
Una limitazione dell'analisi comportamentale olfattivo-guida descritto è la creazione di complessi fluidi pennacchi. Questo può essere visto se la soluzione dell'aminoacido è sostituita da un colorante, come Fast Green, durante la configurazione del sistema. L'uso di soluzioni colorate verifica la formazione di pennacchi e dimostra che a base acquosa odoranti raggiungono qualsiasi regione del pozzo entro 5 s. turbolenze causate dalla consegna della soluzione è probabilmente rilevato dalla linea laterale dei girini e probabilmente contribuisce alla la variabilità osservata nella motilità degli animali ma non interferiscono con il comportamento guidato olfattiva. Esperimenti di controllo effettuati utilizzando acqua invece di soluzioni dell'amminoacido rivelano che i girini sono in grado di discriminare olfattivo da stimoli meccanici. La stima del tempo trascorso in una regione di interesse (Figura 5) e la trama media delle distanze euclidee (Figura 6) sono due metodi complementari per descrivere la risposta olfattiva-guida dei girini.
Criteri di inclusione
Criteri di inclusione devono anche tener conto per l'analisi dei dati. Alcuni girini mostrano un movimento risonante, che è illustrato dal montaggio della trama di una funzione sinusoidale (Figura 7A) la distanza euclidea. Girini manifesta questo comportamento devono essere scartati da tutte le analisi.
L'esclusione di animali che all'inizio dell'applicazione della odorant soluzioni sono al massimo (> 30 mm Figura 7B) o a una minima distanza euclidea (< 5 mm, Figura 7C) dall'ugello permette di diminuire la variabilità degli appezzamenti medio. L'esempio illustrato nella Figura 7B Mostra un tropismo positivo per la soluzione dell'aminoacido. Il girino si trova a una distanza massima di ingresso soluzione all'inizio della stimolazione. Pertanto, la posizione relativa è in grado di rivelare solo un'attrazione per la fonte degli odori. Figura 7 C indica la situazione opposta. Qui, un girino è situato nelle vicinanze dell'ugello offrendo la soluzione dell'aminoacido. Quantificazione del tempo trascorso vicino alla fonte di odore Mostra una risposta (metodo utilizzato nella Figura 5); Tuttavia, non può visualizzare un movimento netto verso l'ingresso.
In sintesi, l'analisi proposta di comportamento olfattivo-guida definisce un test binario. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare la capacità di un gruppo sperimentale di girini di rispondere agli odoranti. Ulteriori miglioramenti sono necessari se l'obiettivo è stabilire differenze tra complesse olfattivo-guida risposte, come ad esempio, determinare le preferenze per dato gli odori.
Figura 1: Transection dei nervi olfattivi. Immagini rappresentative dei girini X. laevis tubb2-GFP ottenuti dopo il transection di un singolo nervo olfattivo (frecce). I nervi dei girini tubb2-GFP visualizzano forte fluorescenza. Transection del nervo è evidente subito dopo della chirurgia (D0). Ricrescita del nervo olfattivo è evidente 4 giorni dopo il taglio (D4). Otto giorni dopo la chirurgia (D8) c'è poca differenza tra controllo e nervi riformati. Girini sono stati anestetizzati in 0.02% MS-222 per raccogliere immagini. Bulbo olfattivo (O.B.), nervo olfattivo (O.N.), capsula nasale (N.C.), tectum (Tec), del nervo ottico (Op.N.). Le frecce indicano la posizione del nervo transected. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Etichettatura dei neuroni olfattivi con destrano calcio verde e la visualizzazione di afflusso del calcio presinaptico dopo stimolazione con aminoacidi. (A) luce trasmessa l'immagine di un girino che mostra la posizione dell'epitelio olfattivo, nervi olfattivi e lo strato glomerulare del bulbo olfattivo. (B) immagine di un bulbo olfattivo visualizzato da microscopia di widefield (wf). I neuroni sono stati etichettati con applicazione di destrano verde-1 calcio presso la capsula nasale. La fluorescenza osservata corrisponde a terminali presinaptici da neuroni olfattivi che formano dei glomeruli. N: nervo olfattivo; Okazaki: bulbo olfattivo. (C) sezione confocale situato dorsalmente dall'entrata del nervo olfattivo al bulbo. Il componente presinaptico dei glomeruli olfattivi è stato etichettato con destrano verde-1 di calcio, come in B). (D) terminali presinaptici aumentano transitoriamente i livelli di calcio sopra l'esposizione dell'epitelio olfattivo di una soluzione contenente cinque diversi amminoacidi. Variazioni relative a fluorescenza di calcio ottenute prima, durante e dopo 1 s stimolo. (E) distribuzione di 10 diverse regioni di interesse (ROI) utilizzato per quantificare i cambiamenti0 ΔF/F. ROI11 è di fuori del livello glomerulare e viene utilizzato per definire i livelli di fondo di fluorescenza. (F) individuali ΔF/F0 risposte Rois sensi E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Saggio olfattivo-guida comportamento. (A) diagramma schematico mostrando l'apparecchiatura utilizzata nel test. (B) esempio di motilità tracce registrate oltre 90 s. Ogni cerchio rappresenta un bene contenente un singolo animale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Monitoraggio del comportamento olfattivo-guida. (A) esempio di un bene usato per l'analisi comportamentale. Linee blu tratteggiate indicano la posizione delle coordinate X e Y (in mm) utilizzata per tenere traccia dei movimenti di girino (veda inoltre complementari Video 1). L'ellisse verde rappresenta la posizione dell'ingresso soluzione. La linea nera tratteggiata indica l'area prossimale al tubo offrendo la soluzione dell'aminoacido (Vedi testo per maggiori dettagli). (B) motilità di girino mostrato nella A) durante l'analisi comportamentale. Color-coded tracce indicano la posizione dell'animale prima (grigio) e dopo stimolazione olfattiva (viola). Movimenti durante l'applicazione della soluzione odorant sono illustrati in una sfumatura di colore temporale (30 s, rosso al blu). (C) utilizzando X, Y posizioni di girino è possibile calcolare i cambiamenti nella distanza euclidea dalla testa girino verso l'ingresso di aspersione. Distanze inferiori a 8,75 mm corrispondono alla zona prossimale dell'ugello. (D) trama del tempo trascorso di girini nell'area definita dalla linea tratteggiata nella A). Ogni punto indica un periodo di 15 s. L'animale è attratto dalla soluzione odorant. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Girini sono attratti dagli amminoacidi. (A) tempo trascorso dai girini nelle vicinanze la fonte degli odori. Ogni cestino è formato da un periodo di 15 s. Trame di casella rappresenta la mediana (linea orizzontale nera), 25-75% quartili (scatole) e intervalli (baffi) di dati. Fornitura di una soluzione di aminoacidi di 1 mM ha attirato girini per la fonte degli odori. (B) girini sono stati attratti dalla soluzione odorant quando la concentrazione di aminoacidi è stata ridotta a 160 μM. (C) fornitura di acqua non ha modificato il comportamento animale. Misure ripetute ANOVA con Dunn s prova multipla di confronti, p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Risposta temporale dei girini a odoranti. (A) trama della media distanza euclidea per la fonte degli odori come funzione del tempo. La distanza euclidea è stata impostata a 0 prima di stimolazione in ogni singola traccia. Valori positivi e negativi indicano una diminuzione e un aumento della distanza dalla sorgente di odore, rispettivamente. Attrazione per la fonte degli odori può essere descritto da una misura lineare (r2= 0.98). (B) consegna di acqua non modificare la distanza per la fonte degli odori. Girini (C) rispondono all'applicazione di una soluzione di 160 μM di aminoacidi, come rivelato dalla vestibilità lineare (r2= 0,96). Girini (D) con entrambi i nervi olfattivi transected non rispondono agli aminoacidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Criteri di inclusione per l'analisi olfattiva-guida comportamento. (A) alcuni girini mostrano un risonante movimento. Questo comportamento si rivela di successo vestibilità di una funzione sinusoidale per la trama della distanza euclidea per la fonte degli odori. Girini visualizzati da questa attività dovrebbero escludersi dal test. (B, C) Un modo per ridurre la variabilità nella risposta temporale media di odorizzazione (Figura 6) è escludendo animali situati presso un massimo (B) o una distanza minima (C) euclidee all'inizio della stimolazione. Linee rosse tratteggiate indicano il valore di soglia (30 mm e 5 mm). La distanza euclidea prima l'inizio della stimolazione (freccia, trame a sinistra) è impostato su "0" alla relazione attrattiva o repulsivi comportamenti come negativo o positivo valori (giusti piazzole), rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Video 1: olfattivo-guida comportamento attivato con la consegna di una soluzione dell'aminoacido. Il filmato mostra un girino liberamente nuoto su un 35mm bene. L'ellisse blu indica la posizione dell'ugello offrendo la soluzione di odorizzante. L'inizio e la fine della stimolazione sono indicati da punti verdi e rossi, rispettivamente. La figura 4 Mostra l'analisi del comportamento osservato. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Supplementare Video 2: motilità girino durante l'erogazione dell'acqua. Il filmato mostra un girino liberamente nuoto su un 35mm bene. L'ellisse blu indica la posizione dell'ugello rilasciando acqua MQ. L'inizio e la fine dell'erogazione dell'acqua sono indicati da punti verdi e rossi, rispettivamente. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Questo documento vengono descritte le tecniche che sono utili per analizzare la funzionalità delle vie olfattive in vita girini di Xenopus . Il protocollo attuale è particolarmente utile per i laboratori che lavorano, o hanno accesso a Xenopus; Tuttavia, è anche interessante per quei ricercatori che studiano le basi cellulari e molecolari di riparazione e rigenerazione neuronale. Risultati ottenuti in Xenopus possono essere combinati con dati raccolti in altri modelli vertebrati per identificare meccanismi conservati. I metodi descritti in particolare lo sviluppo di geneticamente Xenopus18,22,23 e sono applicabili ai modelli sperimentali di malattie del sistema nervoso in girini24, 25.
Al fine di ottenere dati riproducibili in vivo, è chiave per correttamente posteriore girini di Xenopus . In particolare, X.tropicalis è molto sensibile alle condizioni abitative disagiate. Ad esempio, essi non tollerano temperature inferiori ai 20 ° C e deve essere conservati in serbatoi o sistemi di acqua nella gamma di 24 e 28 ° C. È anche importante non aumentare la densità degli animali sopra i limiti stabiliti, regolarmente feed girini e mantenere un ottimale dell'acqua qualità13. Gestione delle colonie di animali alle seguenti condizioni standardizzate è assolutamente necessaria per ottenere la riproducibilità di esperimenti in vivo.
Il metodo descritto di formazione immagine del calcio è utile per rilevare una corretta trasduzione olfattiva di ORNs in vivo. Caricamento di ORNs con destrano verde-1 calcio avviene mediante transitoria permeabilizzazione della membrana del plasma utilizzando una bassa concentrazione di Triton X-100, come precedentemente segnalato17. Il principale vantaggio di questo metodo di caricamento è la semplicità, perché richiede solo un microinjector. Uno svantaggio importante è che X-100 Triton provoca l'eliminazione transitoria delle ciglia olfattive e microvilli. L'epitelio olfattivo di zebrafish Rigenera entro 48h dopo trattamento17. Rigenerazione in girini di Xenopus potrebbe essere ancora più veloce poiché le risposte di odorizzazione possono essere osservate 1 giorno dopo tintura caricamento (Figura 2D). Tuttavia, un'analisi morfologica dettagliata è necessaria per stimare con precisione il tempo di rigenerazione dell'epitelio olfattivo dopo trattamento di Triton X-100.
Etichettatura ORNs con destrano verde-1 calcio è efficace solo in una popolazione di neuroni, permettendo la visualizzazione di terminali presinaptici con un elevato rapporto segnale-rumore (Figura 2B e 2C). La quasi completa assenza di sfondo è vantaggiosa rispetto al caricamento del bulbo olfattivo intero con AM estere forme di calcio coloranti. Il numero di fluorescente ORNs differisce da animale ad animale. Pertanto è necessario utilizzare uno stimolo olfattivo ampio di parecchi aminoacidi. Abbiamo ottenuto risultati di successo usando una soluzione di leucina, istidina, arginina, metionina e lisina. Altre combinazioni di diversi aminoacidi potrebbero anche essere efficace. Un metodo alternativo per caricare ORNs con indicatori di calcio è elettroporazione26, che è ampiamente usato per esprimere reporter fluorescenti geneticamente codificato in girino neuroni27. Elettroporazione può essere fatto utilizzando attrezzature commerciali o su misura e permette la visualizzazione delle strutture di un neurone con un eccellente rapporto segnale-rumore28. Allo stesso modo l'approccio descritto, popolazioni di cellule con l'etichetta sono eterogenee e differiscono da animale ad animale. Transgenesi sono auspicabile se l'obiettivo sta indagando su un gruppo ben definito di neuroni22. Ad esempio, guida l'espressione degli indicatori di calcio geneticamente codificato come GCaMPs in un gruppo ristretto di ORNs, potrebbe essere molto utile per studiare la risposta di un insieme definito di terminali presinaptici di odoranti.
Il metodo descritto utilizzando calcio-verde 1 destrano report funzione terminale presinaptico in vivo. L'osservazione del calcio intracellulare aumenta è indicativo di una corretta trasduzione olfattiva e la liberazione di glutammato a livello dei glomeruli. Analisi quantitativa dei cambiamenti in fluorescenza è, tuttavia, limitata. Stimolazione dei terminali presinaptici aumenta i livelli di calcio intracellulare alla gamma micromolar e saturazione di un indicatore di alta affinità del calcio come il calcio verde dovrà essere presi in considerazione. Risultati illustrati nella Figura 2 sono ottenuti usando la microscopia widefield. Questo è l'approccio più semplice e può essere implementato nella maggior parte dei laboratori. Miglioramento tramite microscopia del due-fotone o reporter fluorescenti geneticamente codificato potrebbe consentire di ottenere ulteriori stime quantitative della funzione presinaptica.
Per l'acquisizione diretta delle risposte calcio, è fondamentale che ci sia appropriato posizionamento del capillare offrendo la soluzione di odorizzante. Esso deve essere situato sopra la capsula nasale ed evitare sempre il contatto diretto con il tessuto. Sia la corretta consegna della soluzione odorant e il flusso della perfusione devono essere controllati prima di mettere il girino sotto il microscopio. Tutti i tubi utilizzati per la perfusione devono essere ispezionato per bolle d'aria. Cambiamenti di flusso della soluzione dell'aminoacido necessario rispondere immediatamente alle successiva apertura e la chiusura dell'elettrovalvola. Ritardi sono indicativi della presenza di aria. È anche auspicabile per verificare il corretto volume aumenta o diminuisce di soluzione consegnato dopo aver cambiato l'orario di apertura, vale a dire., da 0.1 s a 1 s o viceversa. Utilizzare una bassa intensità di luce durante l'impostazione parametri sperimentali (punto 4.6) al fine di ridurre al minimo il photobleaching.
Anche se l'importanza dell'olfatto nella biologia dei girini è consolidata29, c'è una mancanza di prove che valutano direttamente olfattivo-Guida di comportamento nelle larve di Xenopus . Il metodo descritto in questo documento è un semplice test che permette la rilevazione di una risposta ad uno stimolo di odore in una grande popolazione degli animali. La recente descrizione della sensibilità odorant dei girini di Rana catesbeiana per la presenza di sostanze chimiche in acqua illustra i complessi meccanismi dell'olfatto di accoppiamento a comportamento motorio30. Il test descritto in questo documento prende in considerazione la variabilità intrinseca del comportamento più olfattivo-Guida di girini. L'uso di un piatto 6 pozzetti invece di pozzetti singoli aumenta il throughput sperimentale. Fattori che contribuiscono alla variabilità tale motilità basale, la posizione relativa per l'ingresso di aspersione e pennacchi generati dalla soluzione odorant sono superate da una media di molti girini. Circa 40 misurazioni indipendenti sono necessari per descrivere la risposta attraente di controllo per gli amminoacidi.
Vi proponiamo due tipi di analisi per il test dell'olfatto. Il primo approccio quantifica il tempo trascorso vicino la fonte degli odori per un periodo definito. È particolarmente adatto per l'analisi statistica. Il secondo approccio è basato sulla trama media delle distanze euclidee dalla fonte degli odori ed è utile per descrivere la risposta temporale odoranti. Entrambi i tipi di analisi sono complementari e vengono generati dagli stessi dati. Interpretazione è binario e permette animali distintivi che odoranti di senso da quelli che lo fanno non10.
Come i metodi descritti essere utile alla comunità di Xenopus ? Anche se i metodi sono essenzialmente illustrati per animali di selvaggio-tipo, si dovrebbe tener conto che possibilità genetica sono in continua espansione nel campo di Xenopus . Lo studio combinato di risposte ORN in vivo e la presenza di comportamento olfattivo-guida può anche essere molto utile per studiare la corretta elaborazione delle informazioni olfattive in Xenopus mutanti create in avanti o indietro genetici schermi 11. le informazioni fornite da formazione immagine del calcio e l'analisi del comportamento possono essere combinate. Ad esempio, una mutazione in modo selettivo che colpisce le cellule del granello del bulbo olfattivo non modificherebbe la risposta presinaptica del ORNs ma probabilmente altererebbero olfattivo-Guida di comportamento.
Metodi associando i risposte cellulari e del comportamento in vivo sono particolarmente rilevanti per l'analisi genetica dei circuiti neuronali. L'interpretazione dei risultati può essere aiutata da precedenti lavori morfologica, che hanno fornito una mappa anatomica dello strato glomerulare in girini31. Informazioni ottenute dalle fette di bulbo olfattivo di Xenopus girini32 sono anche molto preziose. Formazione immagine del calcio delle cellule mitrale/trapuntati in fette di bulbo olfattivo ha rivelato le caratteristiche fondamentali di elaborazione olfattiva in girini di Xenopus , come per esempio la sensibilità di ORNs a diversi aminoacidi33 o la rilevanza di latenza di risposta nella codificazione di informazioni olfattive7. Tuttavia, fettine di cervello mostrano una capacità limitata a riprodurre i complessi meccanismi integrativi associando i circuiti neuronali differenti dovuto il sezionamento di numerose proiezioni neuronali. Inoltre, una caratterizzazione delle proprietà delle singole unità glomerulare è ancora sfuggente ad eccezione del γ-glomerulo34. La domanda di se singole unità glomerulare determinare comportamenti specifici in girini risponderà solo combinando strumenti genetici, in vivo imaging approcci e analisi comportamentale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), di premi di ricerca competitivo dalla M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura e Arthur Colwin dotato estate Research Fellowship Fund , la compagnia di Fischbach e il grande fondo di generazione il Marine Biological Laboratory e la nazionale RRID:SCR_013731 di risorsa di Xenopus (Woods Hole, MA) dove una parte di questo lavoro è stato condotto. Ringraziamo anche il programma CERCA / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale. A.L. è un collega di Serra Húnter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
