Summary
ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים ויוו. אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים בתנאים נורמליים לגידול או לאחר פגיעה.
Abstract
ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים. הם מספקים יתרונות ניסיוני מרובים, כגון נגישות רבות הדמיה גישות, שיטות אלקטרופיזיולוגיות של מבחני התנהגות. מערכת הריח של ראשן צפרדע רפואית מתאימה במיוחד כדי לחקור את הפונקציה של הסינפסות הוקמה במהלך התפתחות נורמלית או רפורמה לאחר פציעה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים. אנחנו חלוקה לרמות בשילוב של מדידות ויוו של סידן presynaptic תגובות ב glomeruli של הנורה הריח עם מבחני התנהגות מונחות על חוש הריח. ניתן לשלב שיטות חיתוך של הריח עצבים לומד הטיפולי של קישוריות סינפטית. ניסויים מוצגים באמצעות בעלי חיים פראי-סוג והן מהונדס גנטית, המבטאת GFP כתבים תאי מערכת העצבים המרכזית. יישום גישות תיאר ראשנים מהונדסים יכול להיות שימושי עבור להתיר היסודות המולקולריים המגדירים את התנהגות חוליות.
Introduction
צפרדע רפואית ראשנים מהווים מודל חיה מצוינת ללמוד על תפקוד תקין של מערכת העצבים. שקיפות, הגנום במלואו ברצף1,2וכן נגישות כירורגי, אלקטרופיזיולוגיות טכניקות הדמיה הם מאפיינים ייחודיים של הזחלים צפרדע רפואית לאפשר חקירת עצביים פונקציות ויוו3 . חלק מהאפשרויות ניסיוני מרובים של מודל זה בעל חיים מומחשים על ידי מחקרים יסודיים מתבצע על ראשן ורפלקסי מערכות4,5,6. מעגל עצביים במיוחד מתאים היטב ללמוד היבטים רבים של מידע עיבוד ברמה של הסינפסות היא מערכת הריח ראשן צפרדע רפואית 7. ראשית, קישוריות סינפטית שלה היא מוגדרת היטב: קולטני ריח נוירונים (ORNs) פרוייקט הנורה הריח ולבסס קשרים סינפטיים עם דנדריטים של המסתם הדו-צניפי/מצויץ תאים בתוך glomeruli ליצירת מפות ריח. שנית, ORNs שלה ברציפות מופקים על ידי נוירוג'נסיס לאורך החיים כדי לשמור את הפונקציונליות של מסלולים חוש הריח8. שלישית, כי מערכת הריח מראה יכולת ההתחדשות הגדול, ראשנים של צפרדע רפואית הם מסוגלים לחלוטין רפורמה הנורה הריח שלהם אחרי אבלציה9.
בנייר זה, אנו מתארים גישות לשלב הדמיה של חוש הריח glomeruli ב ראשנים חיים עם ניסויים התנהגותיים ללמוד את הפונקציונליות של מסלולים חוש הריח. השיטות שתוארו כאן שימשו כדי ללמוד התאוששות פונקציונליות של קישוריות glomerular בהנורה הריח אחרי חיתוך עצב הריח10. נתונים שהושגו ב ראשנים של צפרדע רפואית הם נציג של חולייתנים מאז עיבוד חוש הריח הוא אבולוציוני והתפאורה.
בשיטות המתוארות הן ביטוי באמצעות X. tropicalis , אבל הם בקלות ניתן ליישם ב- X. זריזה. למרות גודל גדול יותר מבוגר X. laevis, שני המינים דומים בשלבים ראשן. ההבדלים העיקריים לשכון באותה רמת גנומית. X. laevis מציג ללקוחות שלנו גנטי המסכן, נקבע בעיקר על ידי הגנום allotetraploid שלה ואת משך זמן דור (כ- 1 שנה). לעומת זאת, X. tropicalis הוא נוטה יותר שינויים גנטיים בשל זמן דור קצר (5-8 חודשים) שלה הגנום דיפלואידי. הניסויים נציג מומחשים חיות פראי-סוג, שלושה קווים הטרנסגניים שונים: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis), tubb2:GFP (X. laevis).
למתודולוגיות המתוארים העבודה הנוכחית להתייחס לצד התקדמות גנטי בתחום צפרדע רפואית . הפשטות ואת יישום קל של טכניקות הציג הופך אותם שימושי במיוחד להערכת מוטציות שתואר כבר11, כמו גם קווי צפרדע רפואית שנוצרו על-ידי טכנולוגיית CRISPR-Cas912. אנו מתארים גם הליך כירורגי נהגה transect עצבי הריח זה יכול להיות מיושם במעבדה כל גישה ראשנים של צפרדע רפואית . הגישות המשמש להערכת תגובות סידן presynaptic, התנהגות מונחות על חוש הריח דורשת ציוד ספציפי, אמנם לרשותכם קו מתון עלתה. מתודולוגיות מוצגים בצורה פשוטה על מנת לקדם את השימוש בקבוצות מחקר, אפשר להגדיר הבסיסים של מבחני מורכב יותר או על-ידי הטמעת שיפורים או על ידי האגודה טכניקות אחרות, קרי, היסטולוגית או מחלה גנטית גישות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר בבעלי חיים ב אוניברסיטה של ברצלונה.
הערה: הראשנים X. tropicalis ו- X. laevis גדלים לפי בשיטות הרגילות13,14. ראשן מים מוגש על-ידי הוספת מלחי המסחרי (ראה טבלה של חומרים) מים שהושג באמצעות אוסמוזה הפוכה. מוליכות מותאמת ∼700 µS, ∼1, 400 µS על ראשנים X. tropicalis ו- X. laevis , בהתאמה. ניתן להשיג את הזחלים לטבעי להזדווגות או הפריה חוץ גופית14. העוברים הם dejellied עם 2% L-ציסטאין שהוכנו בבית ששינה רינגר (MMR של מארק x 0.1). 1 x MMR מכיל (במ מ): 100 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7.8. הזחלים מועברים לאחר 2-3 ימים (שלב 25) 2 L מיכלי מים ראשן. כאשר ראשנים מגיע שלב 40 של קריטריונים Nieuwkoop-פייבר (NF)15, הם יכניסו טנקים 5 L, ומתוחזק על צפיפות של 10 חיות/ל' החום נשמר קבוע ב- 23-25 ° C ו- 18 – 20 ° C עבור X. tropicalis ו- X. laevis ראשנים, בהתאמה. בעלי חיים שנמצאו בשלבים 48-52 של הקריטריונים NF משמשים לניסויים.
1. חיתוך של עצבי הריח
- להכין פתרון בהרדמת של 0.02% MS-222 ב 50 מ של ראשן מים בטמפרטורת החדר.
- הכינו טנק קטן (1-2 L) עם ראשן מים כדי לאפשר התאוששות של בעלי חיים לאחר הניתוח.
- חותכים חתיכות מלבני של נייר סינון איכותי תאית (4 ס מ x 3 ס"מ, ראה טבלה של חומרים).
- רטוב 2 חתיכות נייר סינון איכותי תאית בפתרון MS-222 0.02% ולמקם אותם מתחת למיקרוסקופ ויבתר.
- להרים ראשן ממיכל, לטבול אותו לתוך הפתרון בהרדמת. החיה העוצר שחייה בתוך 2-4 דקות, אינו מגיב לגירויים מכני חלה באותה רמת הזנב באמצעות פינצטה.
-
במקום הראשן anesthetized על החלקים מלבני של נייר סינון. מקם את החיה עם הצד הגבי שלו פונה כלפי מעלה, כך ניתן לאבחן מבנים במוח.
- באמצעות מספריים vannas (ראה טבלה של חומרים) חותכים עצבי הריח אחת או את שתיהן (בהתאם לסוג assay לפועל). Transect עצב יחיד לניסויים הדורשים בקרה פנימית של עצב פציעה.
- לניסויים התנהגותיים, transect שני עצבים במטרה לדכא כל המידע odorant להגיע אל הנורה הריח. היעילות של חלוקתה של עצבים הריח יכול להיות שנצפו בקלות מתחת למיקרוסקופ ויבתר; אולם, עמדה פיגמנטציה או בעל חיים יכול להיות הגבלת גורמים.
הערה: (אופציונלי) הדרך הטובה ביותר כדי לאשר את החוקיות של ההליך משתמש ראשנים הטרנסגניים המבטאים פלורסנט כתבים על מערכת העצבים שלהם (ראה תוצאות נציג). לכוונה זו, יש צורך להשתמש טווח לנתיחה מצויד קרינה פלואורסצנטית (איור 1). אם רק חיות פראי-סוג זמינים, יכול להיות מועסק העקיבה עם ס מ- diI. פעלתי לפי הנהלים 2 (ראה להלן) כדי להזריק פתרון 0.5 מ"ג/מ"ל של ס מ- diI המבושלות 0.3 M סוכרוז בטיל האף לראות 16 לקבלת פרטים על אופן ההכנה ואחסון של ס"מ-diI. דליפה של צבע מתוך החלל העיקרי חייב להיות מזער. לכוונה זו, יש צורך לשנות את הלחץ של הזרקה של הפתח של micropipettes. קרינה פלואורסצנטית ברמה של השכבה glomerular של הנורה הריח הופך ברור 24 שעות לאחר היישום של ס מ- diI. העבודה הנוכחית משתמשת תיוג עם ס מ- diI רק כדי לאשר את ההליך חיתוך; עם זאת, שיטה זו יכול לשמש גם כדי להשיג מידע מורפולוגי של חוש הריח glomeruli באמצעות הליכים היסטולוגית קונבנציונלי.
- העברת בעלי חיים למיכל השחזור. ראשנים יחלים שחייה רגילה בתוך ~ 10 דק. ביצוע חקירה מעמיקה לנוכחות של שטפי דם, אשר צפויים ~ 1% של בעלי חיים נתון לניתוח.
- המתת חסד בעלי חיים פצועים בפתרון MS-222 0.2%.
2. תיוג של קולטני ריח נוירונים עם סידן פלורסנט אינדיקטורים
- להכין פתרון המכיל 12% סידן ירוק-1-לתוספי (ראה טבלה של חומרים), 0.1% טריטון X-100, ו- 1 מ מ NaCl17. אחסן את הפתרון ב-20 ° C או ב- 80 ° C אם זה לא נועד לשמש בתוך חודש.
- להתכונן פיפטות זכוכית עם עצה פתחים ~ 1-2 מיקרומטר (דומה קוטר כדי microelectrodes המשמש עבור תיקון-קלאמפ ניסויים) microinjection באמצעות של פולר micropipette (ראה טבלה של חומרים).
- כיילו את עוצמת הקול של microinjections. באמצעות מים מזוקקים, להתאים לחץ וזמן הזרקת על מנת לקבל זריקה כרכים של 0.15 – 0.3 µL.
הערה: הליך פשוט מורכב ב ספירת מספר פולסים הנדרש כדי לרוקן פיפטה מלא 1 µL של מים. פרמטרים טיפוסי הם בלחץ של זמן הזרקת 30 psi ו 50 מילישניות. - מניחים על פיפטה microinjector, לטעון אותו עם ~ 2 µL של פתרון ירוק-1 לתוספי סידן.
- להכין את ראשן ביצוע השלבים 1.1 ל 1.6.
- להעביר את קצה פיפטה לתוך חלל העיקרי של הקפסולה האף.
הערה: ראה איור 2A המתארת את המיקום של חוש הריח מסלולים ב ראשן צפרדע רפואית. - באמצעות הגדרות שהושג ב- 2.3, לספק כמה פחזניות. להגביל את צבען נוכחות הקפסולה האף.
- תן הראשן לנוח במשך 2-3 דקות באמצעות פיפטה של פסטר, למזוג טיפות של 0.02% פתרון MS-222 על החלקים יותר סימטרית של החיה כדי למנוע ייבוש.
- העברת החיה למיכל השחזור.
הערה: זה אמור להחלים שחייה רגילה בתוך ~ 10 דק מניפולציה של בעלי החיים עלול לגרום לפציעות. - המתת חסד ראשנים לא לשחזר שחייה רגילה התנהגות 15 דקות לאחר ההזרקה באמצעות פתרון MS-222 0.2%.
- להתבונן פלורסצנטיות ברמה של השכבה glomerular של הנורה הריח ביום לאחר ההזרקה.
3. הכנה של ראשנים חיים הדמיה של תגובות Presynaptic
- 24-48 שעות לפני ביצוע הניסוי, מעיל 4-6 צלחות פטרי של 35 מ מ קוטר עם סיליקון אלסטומר (למשל, Sylgard). ברגע אלסטומר יש polymerized, לפברק לבאר מלבני כדי להתאים את הראשן.
הערה: ממדים אופייני עבור ראשנים X. tropicalis נמצאו בשלבים NF 48-52 הם 10 מ מ x 4 מ מ. - הכן 100 מ של 160 מיקרומטר לפתרון חומצת אמינו 1 מ מ, מתנהג כמו הגירוי odorant על ראשנים. הפתרון יכול להכיל תערובת של מספר חומצות אמינו: מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין. לדלל חומצות אמינו בפתרון צפרדע רפואית רינגר, המורכב (במ מ): 100 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 1 CaCl2, 2 MgCl2, גלוקוז 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7.8. ודא שכי ה-pH נשמר ב- 7.8.
- למלא מאגר מוגברות של 20 מ"ל של הפתרון חומצת אמינו. להתחבר למאגר פוליאתילן אבובים על צינור קפילרי 28 גרם (ראה טבלה של חומרים) הממוקמת מעל הקפסולה האף.
הערה: צינור קפילרי מותקן על micromanipulator (ראה טבלה של חומרים). בועות האוויר חייב להיות נעדר מן המערכת זלוף. - להשיג דיוק טמפורלית ביישום הפתרון חומצת אמינו באמצעות הפקד לוגיקה (TTL) טרנזיסטור-טרנזיסטור של ברזים צביטה (ראה טבלה של חומרים). ממריץ משמש להפקת פולסים TTL (ראה טבלה של חומרים). בדוק את הדיוק הטמפורלי כדי לספק את הפתרון odorant על-ידי שינוי משך הזמן של פולסים TTL, כלומר., 0.1 עד 1 s.
- למלא אחר מאגר מוגבה עם 100 מ של תמיסת רינגר צפרדע רפואית .
- עזים ומתנגד ראשן והצב אותה מתחת למיקרוסקופ ויבתר (שלבים 1.1 ל 1.6).
- היכונו ראשן הדמיה. אם לבקן ראשנים זמינים והמשך לשלב 3.9, אחרת הסרת העור מעל הנורה הריח מכיוון שהוא מכיל מלנוציטים שפוגעים הדמיה (שלב 3.8).
הערה: קיימות שתי דרכים לביצוע הניסוי בהתאם הפיגמנטציה של החיה. עדיף להשתמש בבעלי חיים לבקנים. הלבקן זנים הינם זמינים עבור X. laevis , קווים X. tropicalis הלבקן לאחרונה נוצרו על-ידי CRISPR-Cas9 12 או TALENs18. - באמצעות מספריים vannas, עושים חתך לרוחב על העור ראשן בקצה של מערכת העצבים המרכזית. להפוך החתך צריכה להיעשות ברמה של הנורה הריח, מגיעים לעולם את המיקום של tectum, אשר ניתן לזהות בקלות לפי המיקום של עצב הראייה.
- צובטים את העור לחתוך באמצעות פינצטה ותעביר אותו מעל מערכת העצבים. ודא הסרה מוצלחת בהעדרה של מלנוציטים מעל הנורה הריח. לשמור על לחות החיה על ידי שפיכת טיפות של 0.02% MS-222 הפתרון באמצעות פיפטה של פסטר.
- מקם את הראשן לתוך הבאר של המנה מצופה (ראה טבלה של חומרים). לשים על coverslip הזכוכית מצופה עם גריז ואקום גבוה מעל בעל החיים. מקם את coverslip כדי לכסות את החלק העליון של tectum עד הסוף של הזנב.
- להבטיח הריח הנורה ואת placodes יישארו חשופים המדיום חוץ-תאית. שמור את הראשן משותק במהלך דימות. למלא את צלחת פטרי עם solutioncontaining 100 מיקרומטר tubocurarine צפרדע רפואית רינגר (ראה טבלה של חומרים) כדי למנוע התכווצות שרירים.
הערה: Tubocurarine מאוחסן ב- aliquots ב- 80 ° C יותר מאשר 6 חודשים. - מקם את המנה מחזיקה הראשן תחת מיקרוסקופ זקוף. להתחבר למאגר המכיל תמיסת רינגר צפרדע רפואית עם המנה באמצעות צינורות פוליאתילן (ראה טבלה של חומרים) עבור זלוף רציפה של תמיסת רינגר צפרדע רפואית כדי לשמור את החיה בחיים זמן > 1 h.
הערה: מיני סוגרים מגנטיים (ראה טבלה של חומרים) שימושיות מאוד להתחבר לצנרת stably למנה. צינורות זלוף, שאיבה חייבת להיות ממוקמת בזווית ~ ב- 180°. - התחל פרפוזיה תמיסת רינגר צפרדע רפואית . לשמור על הרמה של הפתרון בקבוע המנה לאורך כל הניסוי. להעריך ללא הפסקה ראשן הכדאיות על ידי התבוננות דרך כלי הדם.
4. חיים הדמיה של Presynaptic Ca2 + שינויים Glomeruli חוש הריח
הערה: ההליך הדמיה מתואר עבור מיקרוסקופיית שדה רחב אבל יכול בקלות להתאים מיקרוסקופ קונפוקלי על-ידי התאמת ההגדרות רכישה. הדמיה צריכה להתבצע במיקרוסקופ זקוף רכוב על טבלת אנטי רטט.
- דמיינו את הראשן עם יעד הגדלה נמוכה, למשל 5 x.
- הזז את הצירים micromanipulator כדי למקם את נימי אספקת הפתרון odorant בראש כמוסה באף אחת ויוצרים זווית 90 מעלות עם עצב הריח. יש להימנע הזרימה של פתרון odorant מעל הנורה הריח כי זה יכול לגרום turbulences המטים הדמיה.
- למצוא הנורה הריח ממוקם ipsilaterally הקפסולה האף (בכפוף גירוי) שימוש בהגדלה גדולה, זמן ומרחק עבודה, מים טבילה המטרה: 60Xx, 0.9 נ. א
- בדוק את פליטת קרינה פלואורסצנטית לפי העין. מבנים glomerular צריך להיות ברור (איור 2B).
- לבצע רכישה בשידור חי עם מצלמה מתאימה עבור הדמיה סידן. להגדיר תיבה המכילה את הנורה הריח כולה, בדרך כלל של 256 x 256 או 512 x 512 פיקסלים. קבוצת הרכישה קצב רכישת מסגרת ל 20 – 40 הרץ. להתאים את הרווח, כך שהערכים של זריחה הבזליים הם ~ 20% של רוויה. רוכשים וידיאו s 5.
- דמיינו את הסרט. בדוק המוקד תמונה, העדר תנועה חפצים ואזורים הכוללת פיקסלים רוויים. קרינה פלואורסצנטית טיפוסי ערכים של אזורים glomerular צריך להיות של 5,000-20,000 א"א אם בעזרת מצלמה 16 סיביות. המשך לשלב הבא אם תנאי ההדמיה הם אופטימליים. חזור על שלב 4.6 במידת הצורך כדי לשפר את איכות התמונה או לכוונן הגדרות רווח.
- להתחיל עם רכישת זמן לשגות לרשום תגובות עורר על ידי גירויים חוש הריח.
הערה: יישום מדויק של הפתרון odorant נשלטת על ידי גירויים TTL. ניסוי טיפוסי מכיל נקודה בסיסית של 4 s, ולאחריו גירוי פעמים ועד 0.1 0.5 s ותקופת ההתאוששות של ש' 6-10. - בצע stimulations חוזרות של odorants עבור מרווחי זמן > 2 דק להגדיר קצב הזרימה 1 – 1.5 mL·min-1. מאז זלוף העולמי נמצא במהלך כל ניסויים, חומצות אמינו מקומית יישומית נשטפים.
הערה: אמצעי האחסון של פתרון בצלחת נמצא ~ 3 מ. -
ניתוח תמונות
- זיהוי של תגובות
- לייצא סרטים ImageJ.
הערה: המטרה היא גילוי הנוכחות של אזורים glomerular להגיב לגירויים. - להפוך את רצף תמונות פלורסצנטיות לסרט ΔF/F0 raw. למדוד את השינויים בזריחה הבזליים לפי היחס הבא: (F-F0) /F0, איפה F0 מציין רמות קרינה פלואורסצנטית הבסיס.
- לצייר אזורים מעניינים (ROI) מסביב לאזורים מציג בשם זריחה עולה במהלך גירוי ולהקליט את עמדתם במנהל ROI (איור 2E). ציירו רועי כדי לזהות רמות קרינה פלואורסצנטית רקע באזור נטול glomerular מבנים.
- לייצא סרטים ImageJ.
- כימות של תגובות.
- המקום ROIs מוגדרים ברצף פלורסצנטיות תמונות raw. להשיג ערך האפור אכזרי של ROIs שנבחר לכל מסגרת. להעביר את הרצף של הערכים שהתקבלו לתכנית ניתוח (למשל., איגור Pro).
- להחסיר רקע זריחה ולאחר מכן לחשב ΔF/F0 שינויים עבור כל רועי (איור 2F). להתוות את העליות ΔF/F0 עבור כל אחד ROIs שנבחרו. חישוב סטיית התקן של ΔF הבסיס/F0 (לפני גירוי).
הערה: תגובה חיובית נחשבת אם העלאות ΔF/F0 שהתקבל במהלך גירוי הם גדולים יותר מאשר 2 סטיות תקן של ערכי הבסיס.
- זיהוי של תגובות
5. חוש הריח מונחה התנהגות Assay
הערה: תרשים סכימטי של ההתקנה עבור ביצוע וזמינותו מוצג באיור3.
- לעשות חורים קטנים כדי להתאים מ"מ 1.57 יתר x מ מ 1.14 זהות אבובים בחלק העליון של כל טוב של מנה 6-. טוב. הוסף את הצנרור. ואחתום באמצעות דבק אפוקסי (ראה טבלה של חומרים).
הערה: המנה שונה יכול להיות שימוש חוזר פעמים רבות לאחר שטיפה יסודית במים מזוקקים. - להכין 50 מ של פתרון חומצת אמינו המכילה מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין (ראה שלב 3.2 לפרטים). ריכוז יכול לנוע בין 160 מיקרומטר עד 1 מ מ. מקום 20 מ"ל של הפתרון מאגר מוגברות.
- אל תאכילו ראשנים במשך לפחות 12 שעות לפני וזמינותו. לקחת את הראשנים 6 ממיכל הדיור שלהם ולמקם אותם ב 2 ל' מים נקיים ראשן כדי למזער את החשיפה odorants.
- במקום המנה המתוקנת 6 בארות על לבן LED-transilluminator (איור 3).
- כמה את אינלטס זלוף למאגר המים המכיל את הפתרון חומצת אמינו באמצעות יריעה של (ראה טבלה של חומרים). בדוק את מערכת זלוף, לחסל בועות אוויר. למלא את הבארות 6 בו זמנית. להתאים את הגובה של המאגר כדי לאפשר מסירת מ ≥5 ל odorant פתרון בתוך ~ 30 s.
הערה: לשטוף היטב 4 פעמים עם מים מזוקקים זוגי לאחר חשיפה הפתרון odorant. - למלא כל אחד עם 10 מ"ל מים ראשן. 1 מקום ראשן/טוב. חופשה לנוח > 3 דקות.
- להגדיר ייבוא תמונות. השתמש מצלמת CCD קונבנציונלי כי ניתן לרכוש תמונות ב ≥5 הרץ. לחבר המצלמה למחשב. . הנה, תשתמש מצלמה Zeiss MRC5 נשלט על ידי זן תוכנה אבל תצורות אחרות שוות ערך יכול לשמש. אם יש צורך להגביר את קצב המסגרות, להחיל פיקסל binning. תמונות צריך להראות המנה כל 6-ובכן.
- התחל ייבוא תמונות כאלה מכילים סרטים הבזליים (30 s), גירוי (25 – 35 s) ותקופות התאוששות (30 – 60 s).
- להחזיר חיות מתוך קערה בארות 6 טנקים לאחר דימות.
- לנתח סרטים ImageJ באמצעות תוספים כגון wrMTrck19,20 המספקים פרמטרים מרובים משויך תנועתיות.
- כדי להכין תמונות לניתוח, בחר תחילה לבאר על ידי ציור של רועי מלבני של 35 מ"מ x 35 מ"מ (איור 4א). להשיג תמונת רקע על-ידי חישוב של תמונה מוקרנת מרבי של כל רצף. הוא צריך להציג תמונה של הבאר ללא הראשן.
- להחסיר את תמונה מוקרנת מרבי מהסרט raw. לבצע קביעת סף על הסרט 32 סיביות שנוצר ולהחיל את התוסף wrMTrck. להתאים את הפרמטרים WrMTrck לעקוב בצורה אמינה תנועות בעלי חיים. להעביר את שהושג X, Y מרכזת לתוך תוכנית ניתוח.
- X-Y באמצעות קואורדינטות, לחשב את המרחק אוקלידי למקור odorant (כניסת זלוף הבאר), על-ידי החלת המשוואה הבאה:
כאשר מערכת ההפעלה מציין את המיקום של מקור ריח ו טד מציין המיקום ראשן בזמן נתון. ראה איור 4A לפרטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בנייר זה, אנו מציגים שילוב של שתי גישות משלימות לבצע מחקר ויוו של הפונקציונליות של מערכת הריח של ראשן צפרדע רפואית : אני) שיטת הדמיה Ca presynaptic2 + שינויים glomeruli של החיים ראשנים באמצעות מחוון סידן פלורסנט, ii) ריח מודרכים assay התנהגותית יכול לשמש כדי לחקור את התגובה odorants waterborne ספציפיים. מאז יש כבר מועסקים גישות אלה כדי להעריך את ההתאוששות של עיבוד חוש הריח אחרי פציעה10, שיטה פשוטה עבור transecting עצבי הריח מתואר גם.
חיתוך של חוש הריח מסלולים ב צפרדע רפואית ראשנים
קיימות שתי דרכים כדי לאשר את החוקיות של ההליך. שניהם להסתמך על הפריט החזותי של עצבים הריח באמצעות עיתונאים פלורסנט. שיטה אחת מבוססת על ראשנים הטרנסגניים המבטאים חלבונים פלורסנט על מערכת העצבים שלהם. שתי שורות מומלץ לבטא GFP תחת מקדם β עצביים-טובולין X. laevis tubb2b-GFP הינם X. tropicalis NBT-GFP (איור 1, ראה טבלה של חומרים). אם רק חיות פראי-סוג זמינים, ניתן להשתמש diI ס מ (ראה שלב 1.8). איור 1 מציג תמונות של הראשנים X. laevis tubb2-GFP. התמונות הן של ארבע חיות שונות בו עצב הריח יחיד היה transected. החתך צריך להיות ברור מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. היתרון של שימוש קווים הטרנסגניים היא כי ניתן בעקבות הרפורמציה של עצב הריח על פני תקופה של זמן. כאשר עושים תצפיות רציפים, מומלץ למזער חשיפה לאור הניאון למניעת נזקי. חלוקתה של עצב הריח יחיד זה שימושי כאשר נדרשת בקרה פנימית, לדוגמה, כדי להשוות בין יחידות glomerular בדרך כלל מפותח לעומת rewired. חלוקתה של שני עצבים הריח צריך להיות מיושם כאשר המטרה היא דיכוי לחלוטין העברת מידע.
חיים הדמיה של presynaptic תגובות לגירויים חוש הריח
תיוג נכון של ORNs עם סידן לתוספי ירוק-1 יכול להיות שנצפו ברמה של הנורה הריח (איור 2א) באמצעות מיקרוסקופ widefield. Glomeruli ברור (איור 2B), אמור להופיע מבוזרת בשכבות שונות על-ידי הזזת את המטוס המוקד. המורפולוגיה של מבנים glomerular ניתן כדאי לפתור אם מיקרוסקופ קונפוקלי משמש במקום (איור 2C). מספר glomeruli שכותרתו תלויה ספיגת צבע ברמה של האפיתל חוש הריח. לכן, הליך זה אינו מאפשר את החזיית כל היחידות glomerular. בעלי מראה של צביעת פלורסצנטיות יותר אינטנסיבי של האזור glomerular צריך להיבחר לפני ביצוע ניסויים הדמיה, משום שהם מכילים יותר ORNs עם התווית. זה תמרון מומלץ מאוד על מנת להגביר את התפוקה ניסיוני ואני צריכה להתבצע תחת טווח ויבתר מצויד עם מנורה זריחה. דוחים בעלי חיים אשר אינם מראים יחידות glomerular שכותרתו או ומראים פלורסצנטיות מוגבל לאזורים מסוימים של השכבה glomerular. יכול להיות שנצפו Ca presynaptic2 + תגובות בהקדם 1 יום לאחר טעינה לצבוע. עבור ביצוע הדמיה ניסויים, רצוי להשתמש מטרות מפתח נומרי גבוהה, בדרך כלל ≥0.9.
עליות של רמות הסידן presynaptic יכול להיות עורר חשיפת ידיות דנדריטים של ORNs כדי חומצות אמינו. חשוב למקם את נימי אספקת הפתרון odorant מעל הקפסולה האף. כדאי לשים לב להימנע ממגע כי זה יכול לסתום את קצה נים ו/או לגרום גירוי מכני של ORNs. ארעי העלאות רמות הסידן presynaptic יכול להיות שנצפו עבור גירויים ≥0.1 s (איור 2D), מעידה על התמרה חושית הנכון חוש הריח. חשוב גם לדמיין את רמות הסידן הבזליים עם המצלמה נמוכה רווח. מסופי presynaptic של ORNs להציג עליות פלורסנט גבוהה, והיא חיונית כדי למנוע אות רוויה. רזולוציה טמפורלית גבוהה ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ widefield. לדוגמה, באמצעות מצלמת CCD כפול-אלקטרון, זה אפשרי להשיג קצב של 50 הרץ ומעלה. השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית מפחיתה רזולוציה טמפורלית אך מאפשר הגדרה טובה יותר של מבנים glomerular.
בזיקה גבוהה של סידן ירוק עבור קישור סידן (190 ננומטר) שימושי במיוחד לזהות תגובות קטן. עליות סידן תאיים ארעי זוהה לשכבת glomerular הן משתנה. באזורים מסוימים glomerular מציגים שינויים ב≥0.20 ΔF/F, בעוד תהליכים השכן אולי אפילו אינם מגיבים (איור 2D). הגורמים הבאים לתרום ההשתנות של התגובה של יחידות glomerular: i) המספר הכולל של glomeruli שכותרתו, ii) הריכוז תאיים של סידן ירוק ו- iii) את מידת הבררנות של ORNs כדי לזהות חומצות אמינו. מאז מספר glomeruli שכותרתו נמוך מדי עלול למנוע התבוננות תגובות, זה הכרחי לבצע את הניסויים בחיות המכיל כפי שכותרתו רבים ORNs ככל האפשר.
התנהגות מונחה הריח
ניתוח נתונים
מונחה הריח התנהגות נלמדת באמצעות מערכת לפי הזמנה. איור 3 מראה סכימטי ציור של ציוד המשמש כדי לבצע את הבדיקה. המבדק מבוסס ביכולתו של ראשנים כדי לזהות הנוכחות של חומצות אמינו, אשר odorants. פתרון המשלב חמש חומצות אמינו שונות (מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין) משמש לגירוי. הפתרון מועבר מקומית במהלך 30 s כדי 35 מ מ, טוב המכיל ראשן free-swimming. התגובה המיידית של ראשנים אל הפתרון נכנסות היא עלייה תנועתיות. תנועות אקראיות המתרחשים במהלך ה-s ∼5 – 10 הראשונית של יישום פתרון ולאחריו משחייה ישירה כלפי המקור של odorants. ראשנים להישאר למשך מספר שניות בקרבת הזרבובית במהלך הלידה של חומצות אמינו ולשחזר בהדרגה תנועתיות בכיוונים אקראיים (ראה משלים קטעי וידאו 1, 2).
ניסיוני בתנאים המתוארים לאפשר השחייה נורמלי של השלבים הראשנים X. tropicalis 48-52; עם זאת, אותו יש לקחת בחשבון כי ייתכן מוגבלת על תנועתיות של חיות גדולות בבארות 35 מ מ. ראשן התנועות נרשמות עם מצלמת CCD. אטרקציה עבור הפתרון odorant ניתן יהיה מזוהה כמו הקטנת המרחק אוקלידי המפריד זלוף כניסת מהמיקום ראשן (איור 4). מעקב של עמדות ראש ראשן בתוך שטח של 35 מ"מ x 35 מ"מ (או את גודל שווה ערך בפיקסלים) מאפשר קבלת ניתוח כמותי של התנהגות מונחות על חוש הריח (איור 4א). מגרשים בודדים של תנועות ראשן נבנות באמצעות קואורדינטות X-Y מתקבל על ידי ניתוח תמונות (איור 4B). החלקות תנועתיות שחולצו עליך לשחזר בנאמנות תמונות וידאו.
ישנן שתי שיטות אפשריות לפרש התנהגות מונחות על חוש הריח ניסויים. הגישה הראשונה היא השראה על מחקר קודם באמצעות zebrafishes21. מדידת הזמן המושקע בקרבת הזרבובית אספקת odorants evidences לנוכחות tropism חיובי. אזור עניין של רדיוס 8.75 מ מ (תואם ל- ¼ מקוטר טוב) מתמקדת לים הפתרון שהוא משמש כדי לסווג את הקרבה של החיות אל המקור odorant (איור 4A, 4 C). Binning הזמן המושקע על ידי ראשנים בקרבת הזרבובית בתקופות מוגדר, דהיינו, 15 s במרווחים, מאפשר לזהות את היכולת לזהות פתרונות חומצת אמינו (איור 4D). ניתן להשיג את ההתנהגות הכללית של אוכלוסיה של ראשנים ידי חלוקת נתונים נפרדים (איור 5א). ניתן להבחין tropism חיובית כאשר הפתרון של מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין מוכן 1 מ"מ או μM 160 (איור 5 א ו- 5B). בעלי חיים אינם מגיבים ליישום המים (איור 5C), ובכך ביטול ההשתתפות של מנגנונים mechanosensitive. הבדלים בין זמן במרווחי זמן מוגדרים בכל קבוצה ניסיוני יכול להתבסס באמצעות אמצעים nonparametric חוזרות ונשנות ANOVA עם השוואות מרובות של דאן מבחן. החיסרון של binning נתונים בבמרווחי זמן של 15 s הוא רזולוציה טמפורלית מופחת.
דרך להגדיל את המידע הטמפורלי של התגובה ההתנהגותית היא על-ידי הפיכת חלקות הממוצע של מרחקים אוקלידי מן המקור ריח. אף כי תנועות ראשן מראות של השתנות מהותי, תנועתיות ממוצע אוכלוסיה של בעלי חיים (בדרך כלל ≥40) מציג את ההתנהגות מונחות על חוש הריח. כדי לבצע ניתוח זה יש צורך קבוצת תפקידים בעלי חיים לפני תחילת גירוי. מאז ראשנים נמצאים במקומות שונים כאשר הפתרון odorant נכנס לתוך הבאר זה נדרש כדי להגדיר את המרחק אוקלידי 0 לפני גירוי (איור 6א, ראה גם לקריטריוני ההכללה איור7). ערכים שליליים וחיוביים ולכן מציינים מוקד משיכה ודחייה מן המקור ריח, בהתאמה. אטרקציה עבור ריחות מתוארת היטב על ידי התאמה לינארית עם ≥0.9 מקדמי הרגרסיה. אם המים תימסר, השינויים נטו של מרחק אוקלידי מופצים סביב 0, אין אפשרות להתאמת קו במהלך גירוי odorant, שמעיד העדר התנהגות מונחות על חוש הריח (איור 6B). השוואה של חלקות הממוצע של מרחקים אוקלידי לפתרונות חומצת אמינו מוכן-1 מ מ ו- 160 מיקרומטר מראים עיכובים שונים בתגובה מונחות על חוש הריח (השווה איור 6A ו- C). מרווח הזמן הנדרש כדי ליזום את התנועה כלפי המקור של odorants הוא קצר יותר כאשר חומצות אמינו מוחלים על ריכוז גבוה יותר. חוסר חוש הריח מונחה התנהגות נצפית ב ראשנים עם שני הריח העצבים transected (איור 6יח)
מגבלה של וזמינותו לתאר התנהגות מונחות על חוש הריח הוא הקמתה של נוצות נוזלים מורכבים. ניתן לראות זאת אם הפתרון חומצת אמינו מוחלף על-ידי צבע, כגון מהר ירוק, בעת הגדרת המערכת. השימוש של פתרונות צבעוניים מאמת את היווצרות של נוצות, מראה כי waterborne odorants להגיע בכל אזור הבאר בתוך Turbulences ס' 5 הנגרמת על ידי המסירה של הפתרון סביר מזוהים על ידי הקו לרוחב של ראשנים ולתרום כנראה ההשתנות שנצפתה תנועתיות בבעלי חיים אבל לא יפריעו התנהגות מודרכים חוש הריח. בקרת ניסויים שבוצעו באמצעות מים במקום פתרונות חומצת אמינו חושפים ראשנים. מסוגלים להפלות חוש הריח של גירויים מכניים. הערכת הזמן המושקע אזור בעל עניין (איור 5), העלילה הממוצע של מרחקים אוקלידי (איור 6) הן שתי שיטות משלימות כדי לתאר את התגובה מונחות על חוש הריח של ראשנים.
קריטריוני ההכללה
קריטריוני ההכללה חייבים גם לקחת בחשבון לניתוח נתונים. ראשנים קצת להראות תנועה תהודה, המומחש באמצעות ההתאמה של העלילה של מרחקים אוקלידי לפונקציה sinusoidal (איור 7א). חייב להיות מושלך ראשנים הצגת התנהגות זו של כל ניתוח.
החרגה של חיות הנמצאות מיד עם תחילת היישום של odorant פתרונות לכל היותר (> 30 מ מ איור 7B) או מרחק אוקלידי מינימלי (< 5 מ מ, איור 7C) של הצינור מאפשר הפחתת מידת ההשתנות המגרשים הממוצע. הדוגמה מאויר ב איור 7B מראה של tropism חיובי עבור הפתרון חומצת אמינו. הראשן ממוקם במרחק מרבי של הים פתרון מיד עם תחילת גירוי. לכן, זה המיקום היחסי יכול לחשוף רק אטרקציה עבור מקור הריח. איור 7 ג מציג את המצב ההפוך. כאן, ראשן הינו ממוקם בקרבת הזרבובית אספקת הפתרון חומצת אמינו. כימות של הזמן המושקע ליד מקור ריח מראה תגובה (שיטת באיור5); עם זאת, זה לא יכול להראות תנועה נטו לכיוון הים.
לסיכום, וזמינותו המוצע של התנהגות מונחות על חוש הריח מגדיר מבחן בינארי. שיטה זו ניתן לזהות את היכולת של קבוצת הניסוי של ראשנים להגיב odorants. שיפורים נוספים נדרשים אם המטרה מקימה הבדלים בין תגובות מונחות על חוש הריח מורכבות, כמו למשל, קביעת העדפות כי נתנו ריחות.
איור 1: חיתוך של הריח עצבים. תמונות נציג של הראשנים X. laevis tubb2-GFP שהושג לאחר חיתוך של עצב הריח יחיד (חיצים). עצבים של tubb2-GFP ראשנים להציג פלורסצנטיות חזקה. חיתוך העצב ברור מיד לאחר הניתוח (D0). לצמיחה מחודשת של עצב הריח הוא ניכר 4 ימים לאחר חתך (D4). שמונה ימים לאחר הניתוח (D8) יש הבדל קטן בין שליטה ועצבים שחזר בתשובה. ראשנים היו מרדימים ב- 0.02% MS-222 לאסוף תמונות. הריח הנורה (משנה), עצב הריח (O.N.), כמוסה האף (לא מחובר), tectum (Tec), עצב הראייה (Op.N.). חיצים מציינים את המיקום של העצב transected. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תיוג של קולטני ריח נוירונים עם סידן ירוק לתוספי והדמיה של סידן presynaptic זרם על גירוי עם חומצות אמינו. (א) דימוי אור מין ראשן המציג את המיקום של האפיתל חוש הריח, הריח העצבים השכבה glomerular של הנורה הריח. (B) תמונה של נורת הריח דמיינו ידי מיקרוסקופ widefield (wf). נוירונים הודבקו תוויות על-ידי יישום של סידן לתוספי ירוק-1-הקפסולה האף. ידי קרינה פלואורסצנטית נצפתה מקביל מסופי presynaptic של הנוירונים קולטני ריח ויוצרים glomeruli. O.N: עצב הריח; O.B: הריח הנורה. (ג) סעיף קונאפוקלית הממוקם dorsally מהערך של עצב הריח הנורה. הרכיב presynaptic של חוש הריח glomeruli סומן באמצעות לתוספי ירוק-1 סידן, כמו B). מסופי Presynaptic (D) transiently להגדיל את רמות הסידן שלהם עם חשיפה של האפיתל חוש הריח את הפתרון המכיל חמש חומצות אמינו שונות. שינויים יחסית פלורסצנטיות סידן שהושגו לפני, במהלך ואחרי גירוי s 1. הפצה (E) של 10 אזורים שונים עניין (ROIs) משמש לכמת ΔF/F0 שינויים. ROI11 מחוץ השכבה glomerular ומשמשת להגדרת רקע רמות של זריחה. (F) ΔF בודדים/F0 תגובות עבור ROIs המוגדרים ב- E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Assay התנהגות מונחה הריח. (א) תרשים סכמטי מציג את הציוד המשמש את הבדיקה. (B) דוגמה של תנועתיות רצועות מוקלט על 90 s. כל עיגול מייצג של טוב המכיל בעל חיים בודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : מעקב אחר התנהגות מונחות על חוש הריח. דוגמה (A) מציג גם משמש וזמינותו התנהגותית. קווים מנוקדים כחולים מציינים את המיקום של X, Y קואורדינטות (במ מ) המשמש למעקב אחר תנועות ראשן (ראה גם משלים Video 1). האליפסה ירוק מייצג את המיקום של הים פתרון. קו שחור מנוקד מציין את האזור proximal צינור אספקת הפתרון חומצת אמינו (ראה טקסט לפרטים). (B) תנועתיות הראשן המוצגים ב A) במהלך וזמינותו התנהגותית. עקבות בצבעים מציינים את המיקום של החיה לפני (אפור), לאחר גירוי חוש הריח (סגול). תנועות במהלך היישום של הפתרון odorant מומחשים טמפורלית צבע מדורג (30 s, אדום לכחול). (ג) באמצעות X, Y ראשן עמדות ניתן לחישוב שינויים בתיבה מרחק אוקלידי בראש ראשן לים זלוף. מרחקים קצרים יותר מאשר 8.75 מ מ יתאימו לאזור הפרוקסימלית של הצינור. (ד) העלילה של הזמן המושקע על ידי ראשנים באזור המוגדר על-ידי הקו המקווקו א'). כל נקודה מציין תקופה s 15. החיה נמשכת לפי הפתרון odorant. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : הראשנים נמשכים על ידי חומצות אמינו. (א) הזמן המושקע על ידי ראשנים בקרבת מקור הריח. לכל סל, כוללת תקופה s 15. תיבת חלקות מייצגת את חציון (קו אופקי שחור), 25 ל-75% רביעונים (תיבות) ואת טווחי נתונים (שפם). משלוח של פתרון חומצה אמינית 1 מ מ משך ראשנים אל מקור הריח. ראשנים (B) נמשכו לפי הפתרון odorant כאשר ריכוז חומצות אמינו נתקף 160 μM. (ג) מסירת מים אין לשנות התנהגות בעלי חיים. אמצעים חוזרות ANOVA עם דאן הוא מבחן השוואות מרובות, p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : תגובת טמפורלית ראשנים odorants. (א) חלקת הממוצע מרחק אוקלידי למקור הריח כפונקציה של הזמן. מרחק אוקלידי הוגדר 0 לפני גירוי כל המחלקה בודדים. ערכים שליליים וחיוביים מציינים ירידה ועלייה מרחק למקור הריח, בהתאמה. המשיכה אל מקור הריח יכול להיות מתואר על ידי התאמה לינארית (r2= 0.98). (B) אספקה של מים לא לשנות את המרחק אל מקור הריח. (ג) ראשנים להגיב על היישום של פתרון 160 μM של חומצות אמינו כפי התאמה לינארית (r2= 0.96). ראשנים (D) עם שני עצבי הריח transected אינם מגיבים חומצות אמינו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : הכללה לקריטריונים וזמינותו התנהגות מונחות על חוש הריח. (א) לאיזה מופע ראשנים תהודה תנועה. התנהגות זו מתגלה על ידי התאמה מוצלחת של פונקציה sinusoidal, העלילה של מרחק אוקלידי למקור הריח. לא להיות כלולים ראשנים הצגת פעילות זו הבדיקה. (ב, ג) דרך להפחית את השתנות זמני התגובה הממוצע odorants (איור 6) היא על ידי למעט חיות הממוקם מקסימום (B) או מרחק אוקלידי (ג) מינימלי עם תחילת גירוי. קווים מנוקדים אדומים מציינים את ערך הסף (30 מ מ ו- 5 מ מ). מרחק אוקלידי לפני תחילתה של גירוי (חץ, נשארו מגרשים) מוגדר כ- "0" לדווח התנהגויות מושך או דוחה כמו שלילי או חיובי ערכי (נכון חלקות), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
1 וידאו משלימים: התנהגות מונחות על חוש הריח, המופעלות על-ידי אספקת פתרון חומצת אמינו. הסרט מציג את ראשן בחופשיות שחייה על 35 מ מ טוב. האליפסה כחול מציין המיקום של הצינור אספקת הפתרון odorant. תחילת והסוף של גירוי מסומנים באמצעות ירוקות ואדומות, בהתאמה. איור 4 מציגה הניתוח של הפעולה שנצפו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
2 וידאו משלימים: ראשן תנועתיות במהלך הלידה של מים- הסרט מציג את ראשן בחופשיות שחייה על 35 מ מ טוב. האליפסה כחול מציין המיקום של הצינור שחרור מים MQ. תחילת והסוף של אספקת מים מסומנים באמצעות ירוקות ואדומות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר טכניקות שימושיות לחקור את הפונקציונליות של חוש הריח מסלולים חי ראשנים של צפרדע רפואית . בפרוטוקול הנוכחי שימושי במיוחד עבור מעבדות האלה לעבוד, או גישה צפרדע רפואית; עם זאת, זה גם מעניין עבור אלה החוקרים ללמוד הבסיסים תאית ומולקולרית של התחדשות עצביים ותיקון. התוצאות המתקבלות צפרדע רפואית יכול להיות משולב עם הנתונים שנאספו במודלים חוליות אחרים כדי לזהות מנגנון ההכפלה. בשיטות המתוארות יהנה התפתחות מהונדסים צפרדע רפואית18,22,23 , חלים ניסיוניות של מחלות מערכת העצבים ראשנים24, 25.
על מנת לקבל לשחזור נתונים ויוו, זה המפתח כראוי אחורי ראשנים של צפרדע רפואית . בפרט, X.tropicalis הוא מאוד רגיש לתנאי דיור המסכן. לדוגמה, הם לא סובלים טמפרטורות מתחת 20 ° C, יש לשמור במקום טנקים או מערכות מים בטווח של 24-28 מעלות צלזיוס. חשוב גם לא להגדיל את צפיפות בעלי חיים מעל מגבלות הוקמה, באופן קבוע להאכיל ראשנים ולשמור על איכות מים אופטימלית13. ניהול של בעלי חיים במושבות בעקבות תנאים סטנדרטיים נדרש לחלוטין להשגת הפארמצבטית מהניסויים ויוו.
השיטה המתוארת של סידן הדמיה שימושית לזיהוי של התמרה חושית חוש הריח הנכון של ORNs ויוו. טעינה של ORNs עם סידן ירוק-1 לתוספי מושגת על ידי permeabilization ארעי של קרום פלזמה באמצעות ריכוז נמוך של טריטון X-100, כפי שדווחה בעבר17. היתרון העיקרי של שיטת ההעמסה הוא פשטות, מכיוון שהיא דורשת רק עם microinjector. חסרון חשוב הוא כי טריטון X-100 גורמת חיסול ארעית של cilia חוש הריח, microvilli. האפיתל חוש הריח של דג זברה מחדש בתוך 48 שעות לאחר הטיפול17. התחדשות ב ראשנים של צפרדע רפואית עשוי להיות אפילו מהר יותר כיוון התגובות odorants יכול להיות שנצפו 1 יום לאחר צבע טעינה (איור 2D). עם זאת, ניתוח מורפולוגי מפורט נדרש כדי לאמוד במדויק את הזמן התחדשות של האפיתל חוש הריח לאחר טיפול X-100 טריטון.
תיוג ORNs עם סידן ירוק-1 לתוספי יעיל רק בקרב אוכלוסיה של נוירונים, המאפשר את החזיית מסופי presynaptic עם יחס אות לרעש גבוה (איור 2B ו- 2 C). העדר כמעט מוחלט של הרקע יש יתרון אם בהשוואה הטעינה של הנורה הריח כל עם צורות אסתר AM של צבעי סידן. מספר ORNs פלורסנט שונה חיה חיה. ולכן יש צורך להשתמש גירוי חוש הריח רחבה של מספר חומצות אמינו. לנו יש להשיג תוצאות מוצלחות באמצעות פתרון של מתיונין, לאוצין, היסטידין, ארגינין, ליזין. שילובים אחרים של חומצות אמינו שונות יכול להיות גם יעיל. שיטה חלופית כדי לטעון ORNs עם אינדיקטורים סידן הוא אלקטרופורציה26, אשר נמצא בשימוש נפוץ לבטא מקודדים גנטית כתבים פלורסנט ראשן נוירונים27. אלקטרופורציה יכול להיעשות באמצעות ציוד מסחרי או בהזמנה אישית ומאפשר הדמיה של מבנים עצביים עם יחס אות לרעש מעולה28. באופן דומה לגישה המתואר, אוכלוסיות תאים עם תוויות הטרוגנית, נבדלים חיה חיה. Transgenesis רצוי אם המטרה היא חוקרת אוכלוסיה מוגדרים של נוירונים22. לדוגמה, שנסע הביטוי של סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים כגון GCaMPs קבוצה מוגבלת של ORNs, יכול להיות מאוד שימושי לחקור את התגובה של ערכה מוגדרת של מסופי presynaptic כדי odorants.
השיטה המתוארת באמצעות לתוספי 1 סידן-ירוק דוחות פונקציה מסוף presynaptic ויוו. התצפית של סידן תאיים גדל הוא מעיד על התמרה חושית חוש הריח הנכון ועל שחרור גלוטמט ברמה של glomeruli. ניתוח כמותי של שינויים פלורסצנטיות, אולם הוא מוגבל. גירוי של מסופי presynaptic מגביר את רמות הסידן תאיים על הטווח micromolar, הרוויה של מחוון סידן זיקה גבוהה כגון סידן הירוק חייבים להילקח בחשבון. התוצאות הדגימו באיור 2 מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ widefield. הגישה הפשוטה ביותר, יכול להיות מיושם במעבדות רוב. שיפור באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים או כתבים פלורסנט מקודדים גנטית שעלולה לאפשר קבלת הערכות כמותיות יותר של פונקציה presynaptic.
עבור הדמיה חיה של סידן תגובות, זה קריטי כי יש מיקום מתאים נימי אספקת הפתרון odorant. זה צריך להיות ממוקם מעל הקפסולה האף, תמיד להימנע ממגע ישיר עם רקמה. הן את המשלוח הנכון של הפתרון odorant והן את הזרימה של זלוף צריך להיבדק לפני הצבת הראשן מתחת למיקרוסקופ. יש לבדוק כל צינורות המשמשים את זלוף בועות אוויר. שינויי זרימה של הפתרון חומצת אמינו חייב להגיב מיד רצופים פתיחה וסגירה של ברז חשמלי. עיכובים מעידים על הנוכחות של אוויר. רצוי גם לבדוק אם אמצעי האחסון הנכון גדל או ירידות של פתרון נמסר לאחר שינוי הזמן הפתיחה, כלומר., מ- 0.1 s כדי 1 s או סגן ולהפך. השתמש עוצמת האור נמוכה בעת הגדרת פרמטרים ניסיוני (שלב 4.6) על מנת לצמצם photobleaching.
למרות החשיבות של חוש הריח בביולוגיה של ראשנים ומבוססת29, יש חוסר של בדיקות ישירות הערכת התנהגות מונחות על חוש הריח הזחלים צפרדע רפואית . השיטה המתוארת במאמר זה היא בדיקה פשוטה המאפשרת הזיהוי בתגובה גירוי הריח אוכלוסיה גדולה של בעלי חיים. התיאור האחרונות של רגישות odorant של רנא catesbeiana ראשנים לנוכחות של כימיקלים במים ממחישה את המנגנונים מורכבת מצמד חוש הריח התנהגות מוטורית30. וזמינותו המתוארים במאמר זה לוקח בחשבון ההשתנות מהותי של התנהגות מונחות על חוש הריח ראשנים. השימוש של מנה 6-ובכן במקום יחיד בארות מגדיל את התפוקה ניסיוני. גורמים התורמים השתנות כזה תנועתיות הבזליים, המיקום היחסי כניסת זלוף, נוצות שנוצרו על-ידי הפתרון odorant הם להתגבר על ידי חישוב ממוצע ראשנים רבים. כ-40 מדידות עצמאי נדרשים כדי לתאר את התגובה שליטה אטרקטיבי עבור חומצות אמינו.
אנו מציעים שני סוגים של ניתוח עבור הבדיקה חוש הריח. הגישה הראשונה מכמת את הזמן ליד מקור ריח במשך פרק זמן מוגדר. . זה מתאים במיוחד עבור ניתוח סטטיסטי. הגישה השניה מבוססת על העלילה הממוצע של מרחקים אוקלידי מן המקור ריח והיא שימושית לתאר את זמני בתגובה odorants. שני סוגי ניתוח הם משלימים ובאים שנוצר על ידי אותם נתונים. פרשנות היא בינארית ומאפשר הבחנה חיות זה הגיוני odorants מאלו שעושים לא10.
איך אפשר בשיטות המתוארות להועיל לקהילה צפרדע רפואית ? למרות השיטות מומחשים למעשה לבעלי חיים פראי-סוג, יש לקחת בחשבון אפשרויות גנטית ללא הרף מתרחבים בשטח צפרדע רפואית . המחקר משולב של תגובות ולהתמכר ויוו ואת נוכחותם של התנהגות מונחות על חוש הריח יכול להיות גם מאוד שימושי לחקור את עיבוד תקין של חוש הריח מידע בצפרדע רפואית המוטנטים שנוצרו על-ידי רשתות גנטיות, קדימה או אחורה 11. ניתן לשלב את המידע שסופק על-ידי הדמיה סידן ואת וזמינותו התנהגותית. לדוגמה, מוטציה באופן סלקטיבי להשפיע על התאים גרגר של הנורה הריח לא לשנות את התגובה presynaptic של ORNs, אך כנראה לפגום בהתנהגות מונחות על חוש הריח.
שיטות שיוך ויוו הסלולר והתנהגותיים תגובות רלוונטיות בעיקר רוברט גנטי של מעגלים עצביים. הפרשנות של תוצאות יכול להיות בעזרת עבודות קודמות מורפולוגי, אשר סיפקו במפת האנטומי של השכבה glomerular ב ראשנים31. מידע המתקבל פרוסות נורת הריח של ראשנים של צפרדע רפואית 32 הוא גם מאוד יקר. סידן הדמיה של המסתם הדו-צניפי/מצויץ תאים בפרוסות הריח הנורה חשפה את התכונות הבסיסיות של חוש הריח עיבוד ראשנים של צפרדע רפואית , לדוגמה את הרגישות של ORNs חומצות אמינו שונות33 או את הרלוונטיות של השהיות ארוכות יותר תגובה בקידוד של מידע חוש הריח7. עם זאת, פרוסות המוח מראים קיבולת מוגבלת לשחזר את המנגנונים אינטגרטיבית מורכבים שיוך מעגלים עצביים שונים בעקבות חלוקתה של תחזיות עצביים רבים. גם, אפיון של המאפיינים של יחידות נפרדות glomerular הוא עדיין חמקמק למעט γ-פקעית34. השאלה אם יחידות glomerular יחיד לקבוע התנהגויות ספציפיות ב ראשנים ייענו רק על ידי שילוב של כלים גנטיים, ויוו גישות הדמיה, מבחני התנהגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים y El Ministerio de Economía Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofunded על ידי אירופה אזורי פיתוח קרן (ERDF), על ידי פרסי מחקר תחרותיים מן האחווה מ ג פ Fuortes ממוריאל, סטיבן. וו קופלר במלגת הקרן, לורה ו ארתור Colwin ניחן הקיץ מלגת קרן מחקרים , המשפחה Fischbach, קרן דור גדול של מעבדה ביולוגית ימית, את נבחרת צפרדע רפואית משאבים RRID:SCR_013731 (חור ביער, MA) שבו נערך חלק של עבודה זו. אנו מודים גם תוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה לתמיכה מוסדית. א. ל הוא עמית Húnter סרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
