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Neuroscience

लिविंग Xenopus Tadpoles में घ्राण मार्ग का कार्यात्मक मूल्यांकन

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus tadpoles vivo में नर्वस सिस् टम के फंक्शन की जांच के लिए एक अनोखा प् लेटफॉर्म पेश करते हैं । हम सामान्य पालन स्थितियों में या चोट के बाद रहने वाले Xenopus लार्वा में घ्राण जानकारी के प्रसंस्करण का मूल्यांकन करने के तरीके का वर्णन करते हैं ।

Abstract

Xenopus tadpoles तंत्रिका तंत्र के समारोह की जांच करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करते हैं । वे कई इमेजिंग दृष्टिकोण, electrophysiological तकनीक और व्यवहार परख के लिए पहुंच के रूप में कई प्रयोगात्मक लाभ, प्रदान करते हैं । Xenopus टैडपोल घ्राण प्रणाली विशेष रूप से अच्छी तरह से सामांय विकास के दौरान स्थापित synapses के समारोह की जांच या चोट के बाद सुधार के लिए अनुकूल है । यहां, हम Xenopus लार्वा रहने में घ्राण जानकारी के प्रसंस्करण का मूल्यांकन करने के तरीके का वर्णन करते हैं । हम घ्राण के साथ घ्राण बल्ब के glomeruli में presynaptic कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के vivo माप में का एक संयोजन रूपरेखा-निर्देशित व्यवहार परख । तरीकों घ्राण नसों के transection के साथ synaptic कनेक्टिविटी के rewiring का अध्ययन करने के लिए जोड़ा जा सकता है । प्रयोगों दोनों जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र कोशिकाओं में GFP पत्रकारों को व्यक्त पशुओं का उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे हैं । आनुवंशिक रूप से संशोधित tadpoles के लिए वर्णित दृष्टिकोण के आवेदन आणविक आधार है कि हड्डीवाला व्यवहार को परिभाषित करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

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Xenopus tadpoles तंत्रिका तंत्र के सामांय समारोह का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट पशु मॉडल का गठन । पारदर्शिता, एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम1,2, और शल्य चिकित्सा के लिए पहुंच, electrophysiological और इमेजिंग तकनीक Xenopus लार्वा के अद्वितीय गुण है कि vivo 3 में ंयूरॉन कार्यों की जांच की अनुमति . इस पशु मॉडल की कई प्रयोगात्मक संभावनाओं में से कुछ टैडपोल संवेदी और मोटर सिस्टम4,5,6पर प्रदर्शन पूरी तरह से अध्ययन से सचित्र हैं । synapses के स्तर पर सूचना संसाधन के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल न्यूरॉन सर्किट Xenopus टैडपोल घ्राण प्रणाली7है. सबसे पहले, अपनी synaptic कनेक्टिविटी अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है: घ्राण बल्ब के लिए घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) परियोजना और synaptic के dendrites के साथ mitral संपर्क स्थापित/glomeruli के भीतर के लिए गंध नक्शे उत्पन्न दूसरे, इसके ORNs लगातार8घ्राण रास्ते की कार्यक्षमता बनाए रखने के लिए जीवन भर neurogenesis द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । और तीसरे, क्योंकि घ्राण प्रणाली एक महान अपक्षयी क्षमता से पता चलता है, Xenopus tadpoles9पृथक के बाद अपने घ्राण बल्ब पूरी तरह से सुधार करने में सक्षम हैं ।

इस पत्र में, हम दृष्टिकोण है कि व्यवहार प्रयोगों के साथ tadpoles रहने में घ्राण glomeruli के इमेजिंग गठबंधन का वर्णन करने के लिए घ्राण रास्ते की कार्यक्षमता का अध्ययन । यहां विस्तृत तरीकों घ्राण तंत्रिका transection10के बाद घ्राण बल्ब में glomerular कनेक्टिविटी के कार्यात्मक वसूली अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । Xenopus tadpoles में प्राप्त डेटा रीढ़ के प्रतिनिधि के बाद से घ्राण प्रसंस्करण है विकासवादी संरक्षित है ।

वर्णित विधियाँ x. tropicalis का उपयोग कर उदाहरण हैं, लेकिन वे आसानी से xमें कार्यान्वित किया जा सकता है । laevis। वयस्क एक्स laevisके बड़े आकार के बावजूद, दोनों प्रजातियों टैडपोल चरणों के दौरान उल्लेखनीय समान हैं । मुख्य अंतर जीनोमिक स्तर पर रहते हैं । X. laevis ज्यादातर अपने allotetraploid जीनोम और लंबी पीढ़ी के समय (लगभग 1 वर्ष) द्वारा निर्धारित गरीब आनुवंशिक पथ, प्रदर्शित करता है । इसके विपरीत, एक्स tropicalis अधिक आनुवंशिक अपनी छोटी पीढ़ी के समय (5-8 महीने) और द्विगुणित जीनोम के कारण संशोधनों के लिए उत्तरदाई है । प्रतिनिधि प्रयोग जंगली प्रकार के जानवरों और तीन अलग ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए सचित्र हैं: Hb9: GFP (x. tropicalis), एनबीटी: GFP (एक्स.tropicalis) और tubb2: GFP (एक्स. laevis) ।

मौजूदा काम में उल्लिखित के तरीके आनुवंशिक Xenopus क्षेत्र में प्रगति के साथ विचार किया जाना चाहिए । सादगी और प्रस्तुत तकनीक के आसान कार्यांवयन उंहें पहले से ही वर्णित मूल्यांकन के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाता है11म्यूटेंट, साथ ही साथ Xenopus CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी12द्वारा उत्पंन लाइनें । हम भी एक शल्य घ्राण नसों कि किसी भी Xenopus tadpoles के लिए उपयोग कर प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है transect के लिए इस्तेमाल की प्रक्रिया का वर्णन । presynaptic कैल्शियम प्रतिक्रियाओं और घ्राण निर्देशित व्यवहार के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण विशिष्ट उपकरण की आवश्यकता है, हालांकि एक उदारवादी कीमत पर उपलब्ध है । के तरीके एक साधारण रूप में प्रस्तुत कर रहे है अनुसंधान समूहों में उनके उपयोग को बढ़ावा देने और अधिक जटिल परख के आधार या तो सुधार लागू करने या अंय तकनीकों, यानी, ऊतकवैज्ञानिक या आनुवंशिक दृष्टिकोण से संघ द्वारा निर्धारित सकता है ।

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Protocol

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सभी प्रक्रियाओं पशु अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा बार्सिलोना के विश्वविद्यालय में अनुमोदित किया गया ।

नोट: x. tropicalis और x. laevis tadpoles मानक विधियों के अनुसार13,14का पालन कर रहे हैं । टैडपोल पानी रिवर्स असमस द्वारा प्राप्त पानी के लिए वाणिज्यिक लवण ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़कर तैयार किया जाता है । चालकता ∼ ७०० µS और ∼ १,४०० µS एक्स tropicalis और एक्स laevis tadpoles, क्रमशः के लिए समायोजित किया जाता है । लार्वा या तो प्राकृतिक सहवास या इन विट्रो निषेचन14से प्राप्त किया जा सकता है । भ्रूण 2% एल के साथ dejellied-cysteine 0.1 x है मार्क संशोधित रिंगों (एमएमआर) में तैयार कर रहे हैं । 1x एमएमआर में शामिल है (मिमी में): १०० NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, ०.१ EDTA, पीएच ७.८ । लार्वा 2-3 दिन (स्टेज 25) टैडपोल पानी के साथ 2 एल टैंक के बाद स्थानांतरित कर रहे हैं । जब tadpoles Nieuwkoop-फेबर (NF) मानदंड15के चरण ४०, वे 5 एल टैंक में रखा जाता है और 10 पशुओं के घनत्व पर बनाए रखा है/तापमान लगातार 23-25 ° c और 18 – 20 x. tropicalis और x. laevis के लिए ° c पर रखा जाता है tadpoles, क्रमशः । 48 चरणों में पाया जानवरों-NF मानदंडों के 52 प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है ।

1. घ्राण नसों का Transection

  1. कमरे के तापमान पर टैडपोल पानी की ५० मिलीलीटर में ०.०२% MS-२२२ का एक anesthetizing समाधान तैयार करें ।
  2. सर्जरी के बाद पशुओं की वसूली की अनुमति के लिए टैडपोल पानी के साथ एक छोटा टैंक (1-2 L) तैयार करें ।
  3. फाइबर गुणात्मक फिल्टर कागज के आयताकार टुकड़े काट (4 सेमी x 3 सेमी, सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. गीला 2 टुकड़े में फाइबर गुणात्मक फ़िल्टर कागज ०.०२% MS-२२२ समाधान और उन्हें विदारक गुंजाइश के तहत जगह.
  5. टैंक से एक टैडपोल उठाओ और anesthetizing समाधान में विसर्जित कर दिया । पशु 2 – 4 मिनट के भीतर तैराकी बंद हो जाता है और चिमटी का उपयोग पूंछ स्तर पर लागू यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रिया नहीं करता है ।
  6. anesthetized टैडपोल को फ़िल्टर काग़ज़ के आयताकार टुकड़ों पर रखें । अपने पृष्ठीय पक्ष के साथ पशु की स्थिति ऊपर की ओर का सामना करना पड़, तो मस्तिष्क संरचनाओं visualized किया जा सकता है ।
    1. vannas कैंची का प्रयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) एक या दोनों घ्राण नसों में कटौती (परख के प्रकार पर निर्भर करता है बाहर किया जाएगा) । Transect प्रयोग है कि तंत्रिका चोट के एक आंतरिक नियंत्रण की आवश्यकता के लिए एक एकल तंत्रिका ।
    2. व्यवहार प्रयोगों के लिए, दोनों नसों transect क्रम में सभी गंध घ्राण बल्ब तक पहुंचने की जानकारी को दबाने के लिए । घ्राण नसों की धारा की क्षमता को आसानी से विदारक गुंजाइश के तहत देखा जा सकता है; हालांकि, रंजकता या जानवर की स्थिति कारकों सीमित किया जा सकता है ।
      नोट: वैकल्पिक सबसे अच्छा तरीका प्रक्रिया की वैधता प्रमाणित करने के लिए ट्रांसजेनिक tadpoles का उपयोग कर रहा है कि उनके तंत्रिका तंत्र पर फ्लोरोसेंट पत्रकारों एक्सप्रेस (प्रतिनिधि परिणाम देखें) । इस उद्देश्य के लिए, यह प्रतिदीप्ति (चित्रा 1) से सुसज्जित एक विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । केवल जंगली प्रकार के जानवर उपलब्ध हैं, तो मुख्यमंत्री-दिी के साथ अनुरेखण नियोजित किया जा सकता है । 2 प्रोटोकॉल का पालन करें (नीचे देखें) के लिए एक ०.५ मिलीग्राम/एमएल दिी में ०.३ मीटर सुक्रोज में तैयार की नेज़ल कैप्सूल । सेमी-दिी की तैयारी और संग्रहण पर विवरण के लिए 16 देखें । मुख्य गुहा से बाहर डाई के रिसाव को कम करना होगा । इस उद्देश्य के लिए, यह इंजेक्शन और micropipettes के खोलने के दबाव को संशोधित करने के लिए आवश्यक है । घ्राण बल्ब की glomerular परत के स्तर पर प्रतिदीप्ति सेमी-दिी के आवेदन के बाद 24 एच स्पष्ट हो जाता है । वर्तमान काम सेमी-दिी के साथ लेबलिंग का उपयोग करता है सिर्फ transection प्रक्रिया को प्रमाणित करने के लिए; हालांकि, इस विधि भी पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं का उपयोग कर घ्राण glomeruli की रूपात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  7. वसूली टैंक में पशुओं का स्थानांतरण । Tadpoles के भीतर सामांय तैराकी ठीक हो जाना चाहिए ~ 10 मिनट । नकसीर की उपस्थिति के लिए एक सावधान निरीक्षण प्रदर्शन, जो ~ शल्य चिकित्सा के अधीन पशुओं के 1% में उंमीद कर रहे हैं ।
  8. Euthanize एक ०.२% MS-२२२ समाधान में घायल पशुओं ।

2. घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स की फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतकों के साथ लेबलिंग

  1. एक 12% कैल्शियम ग्रीन-1-dextran ( सामग्री की तालिकादेखें), ०.१% ट्राइटन X-१००, और 1 मिमी NaCl17युक्त समाधान तैयार करें । अगर यह एक महीने के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं है-20 ° c या पर-८० ° c समाधान स्टोर ।
  2. टिप के उद्घाटन के साथ ग्लास पिपेट तैयार ~ 1-2 µm (समान व्यास microelectrodes पैच के लिए इस्तेमाल किया-क्लैंप प्रयोगों के लिए) microinjection के लिए एक micropipette खींचने का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. microinjections की मात्रा जांचना । आसुत जल का उपयोग करना, दबाव और इंजेक्शन समय को समायोजित करने के लिए 0.15-0.3 µ एल के इंजेक्शन संस्करणों को प्राप्त करने के लिए
    नोट: एक सरल प्रक्रिया एक पानी की 1 µ l से भरा पिपेट खाली करने के लिए आवश्यक दालों की संख्या की गिनती में होते हैं. ठेठ मापदंडों 30 साई और ५० एमएस इंजेक्शन समय का दबाव है ।
  4. microinjector में एक पिपेट प्लेस और कैल्शियम ग्रीन-1 dextran समाधान के ~ 2 µ एल के साथ लोड ।
  5. एक टैडपोल निंन चरण १.१ से १.६ के लिए तैयार करें ।
  6. पिपेट की नोक नाक कैप्सूल के प्रमुख गुहा में ले जाएं ।
    नोट: एक Xenopus टैडपोल में घ्राण रास्ते के स्थान का वर्णनएक चित्र 2देखें.
  7. २.३ में प्राप्त सेटिंग्स का उपयोग करना, कश के एक जोड़े उद्धार । डाई उपस्थिति नाक कैप्सूल को प्रतिबंधित ।
  8. 2 के लिए टैडपोल आराम दो-3 मिनट । एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, सुखाने से बचने के लिए पशु के अधिक caudal भागों पर ०.०२% MS-२२२ समाधान की बूंदें डालो ।
  9. पशु को रिकवरी टैंक में ट्रांसफर करें ।
    नोट: यह सामांय तैराकी ~ 10 मिनट के भीतर ठीक हो जाना चाहिए । पशुओं के हेरफेर चोटों के कारण हो सकता है ।
  10. Euthanize tadpoles कि सामांय तैराकी व्यवहार ठीक नहीं ०.२% MS-२२२ समाधान का उपयोग इंजेक्शन के बाद 15 मिनट ।
  11. निरीक्षण प्रतिदीप्ति इंजेक्शन के बाद दिन पर घ्राण बल्ब की glomerular परत के स्तर पर ।

3. Presynaptic प्रतिक्रियाओं के लाइव इमेजिंग के लिए Tadpoles की तैयारी

  1. 24-48 एच प्रयोग, कोट 4-6 सिलिकॉन elastomer (जैसे, Sylgard) के साथ ३५ mm व्यास के पेट्री व्यंजन आयोजित करने से पहले । एक बार elastomer बहुलक है, एक आयताकार अच्छी तरह से बनाना टैडपोल फिट ।
    नोट: x. tropicalis tadpoles के लिए विशिष्ट आयाम NF चरणों में पाया 48-52 10 मिमी X 4 मिमी कर रहे हैं ।
  2. tadpoles के लिए एक गंध उत्तेजना के रूप में अभिनय 1 मिमी एमिनो एसिड समाधान के लिए एक १६० µ मीटर की १०० मिलीलीटर तैयार करें । समाधान कई अमीनो एसिड का मिश्रण हो सकता है: methionine, leucine, histidine, arginine और lysine । Xenopus रिंगर समाधान में एमिनो एसिड पतला, (मिमी में) से बना: १०० NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, २४० mOsm/ सुनिश्चित करें कि पीएच ७.८ पर बनाए रखा है ।
  3. एमिनो एसिड समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ एक ऊंचा जलाशय भरें । एक 28 ग्राम केशिका ट्यूब ( सामग्री की तालिकादेखें) नाक कैप्सूल के ऊपर रखा करने के लिए पॉलीथीन टयूबिंग के साथ जलाशय कनेक्ट ।
    नोट: केशिका ट्यूब एक micromanipulator पर मुहिम शुरू की है ( सामग्री की तालिकादेखें) । एयर बुलबुले छिड़काव प्रणाली से अनुपस्थित होना चाहिए ।
  4. solenoid चुटकी वाल्व (देखें सामग्री की तालिका) के ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क (TTL) नियंत्रण का उपयोग अमीनो एसिड समाधान लागू करने में अस्थायी परिशुद्धता प्राप्त करना. एक उत्तेजित करने के लिए TTL दालों ( सामग्री की तालिकादेखें) उत्पंन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । TTL दालों की अवधि बदलकर, यानी, 1 एस ०.१ करने के लिए लौकिक शुद्धता की जांच करें...
  5. Xenopus घंटी के समाधान के १०० मिलीलीटर के साथ एक और ऊंचा जलाशय भरें ।
  6. Anesthetize एक टैडपोल और इसे विदारक कार्यक्षेत्र (स्टेप्स १.१ से १.६) के तहत रखें ।
  7. इमेजिंग के लिए एक टैडपोल तैयार करें । यदि albino tadpoles कदम ३.९ के लिए उपलब्ध हैं, अंयथा घ्राण बल्ब के ऊपर त्वचा को दूर क्योंकि यह melanocytes कि इमेजिंग ख़राब होता है (३.८ कदम) ।
    नोट: पशु की रंजकता के आधार पर प्रयोग करने के दो तरीके हैं । यह albino जानवरों का उपयोग करने के लिए बेहतर है । Albino उपभेदों एक्स laevis और Albino एक्स tropicalis लाइनों के लिए उपलब्ध है हाल ही में CRISPR द्वारा उत्पंन किया गया है-Cas9 12 या TALENs18
  8. vannas कैंची का प्रयोग, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के किनारे पर टैडपोल त्वचा पर एक पार्श्व चीरा बनाते हैं । बनाओ कटौती घ्राण बल्ब के स्तर पर किया जाना चाहिए और कभी नहीं पहुंच tectum की स्थिति है, जो आसानी से ऑप्टिक तंत्रिका के स्थान से पहचाना जा सकता है ।
  9. चिमटी का उपयोग काट त्वचा चुटकी और तंत्रिका तंत्र पर इसे खींच । घ्राण बल्ब के ऊपर melanocytes के अभाव द्वारा सफल हटाने की पुष्टि करें । एक पाश्चर पिपेट का उपयोग ०.०२% MS-२२२ समाधान की बूंदें डालने से जानवर नम रखें ।
  10. लेपित पकवान की अच्छी तरह से में टैडपोल प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक गिलास coverslip पशु के ऊपर उच्च वैक्यूम तेल के साथ लेपित रखो । coverslip को टेल के अंत तक tectum के ऊपर कवर करने के लिए पोजिशन करें ।
  11. सुनिश्चित करें कि घ्राण बल्ब और placodes extracellular माध्यम के संपर्क में रहते हैं । इमेजिंग के दौरान टैडपोल को रखें । मांसपेशी संकुचन को रोकने के लिए Xenopus रिंगर के solutioncontaining १०० µ m tubocurarine ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पेट्री डिश भरें ।
    नोट: Tubocurarine पर aliquots में संग्रहित किया जाता है-८० ° c 6 महीने से अधिक नहीं ।
  12. एक ईमानदार खुर्दबीन के नीचे टैडपोल धारण पकवान रखें । पॉलीथीन टयूबिंग का उपयोग कर पकवान के साथ Xenopus है घंटी समाधान युक्त जलाशय कनेक्ट ( सामग्री की मेजदेखें) Xenopus है घंटी समाधान के निरंतर छिड़काव के लिए > 1 एच के लिए पशु जीवित रखने के लिए ।
    नोट: मिनी चुंबकीय clamps ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए बहुत ही छुरा से पकवान कनेक्ट टयूबिंग उपयोगी होते हैं । छिड़काव और सक्शन ट्यूबों ~ १८० ° कोण में स्थित होना चाहिए ।
  13. सुरु perfusing Xenopus घंटी का समाधान । प्रयोग के दौरान डिश स्थिरांक में समाधान के स्तर को बनाए रखें । लगातार जहाजों के माध्यम से रक्त परिसंचरण देख द्वारा टैडपोल व्यवहार्यता का मूल्यांकन ।

4. Presynaptic Ca के लाइव इमेजिंग2 + घ्राण Glomeruli में परिवर्तन

नोट: इमेजिंग प्रक्रिया व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए वर्णित है, लेकिन आसानी से अधिग्रहण सेटिंग्स का समायोजन करके एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इमेजिंग एक विरोधी कंपन मेज पर घुड़सवार एक ईमानदार खुर्दबीन में किया जाना चाहिए ।

  1. एक कम आवर्धन उद्देश्य के साथ टैडपोल कल्पना, उदाहरण के लिए 5x ।
  2. घ्राण तंत्रिका के साथ एक ९० डिग्री कोण बनाने के एक नाक कैप्सूल के शीर्ष पर सुगंधित समाधान देने केशिका जगह करने के लिए micromanipulator अक्षों हटो । क्योंकि यह अशांति है कि इमेजिंग विकृत कारण हो सकता है घ्राण बल्ब ऊपर गंध समाधान के प्रवाह से बचा जाना चाहिए ।
  3. नाक कैप्सूल के लिए ipsilaterally स्थित घ्राण बल्ब का पता लगाएं (उत्तेजना के अधीन) एक उच्च आवर्धन का उपयोग करना, लंबी काम की दूरी, जल विसर्जन उद्देश्य: 60Xx, ०.९ एनए
  4. आंख से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की जांच करें । Glomerular संरचनाओं (चित्रा 2बी) स्पष्ट किया जाना चाहिए ।
  5. एक कैमरा कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयुक्त के साथ रहते अधिग्रहण प्रदर्शन । एक पूरे घ्राण बल्ब युक्त बॉक्स को परिभाषित, आम तौर पर २५६ x २५६ या ५१२ x ५१२ पिक्सल के । 20 के लिए अधिग्रहण फ्रेम दर अधिग्रहण सेट-40 हर्ट्ज. लाभ को समायोजित करें, ताकि बेसल प्रतिदीप्ति के मूल्यों ~ संतृप्ति के 20% हैं । एक 5 एस वीडियो मोल ।
  6. फिल्म कल्पना । छवि फोकस, आंदोलन कलाकृतियों और संतृप्त पिक्सल युक्त क्षेत्रों के अभाव की जांच करें । glomerular क्षेत्रों के विशिष्ट प्रतिदीप्ति मूल्यों 5000 – 20000 a.u. का होना चाहिए अगर एक 16-bit कैमरा का उपयोग कर । यदि इमेजिंग शर्तें इष्टतम हैं, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें । छवि गुणवत्ता में सुधार या लाभ सेटिंग्स समायोजित करने के लिए आवश्यक हो तो चरण ४.६ दोहराएँ ।
  7. एक समय चूक अधिग्रहण घ्राण उत्तेजनाओं द्वारा पैदा की प्रतिक्रियाएं रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करो ।
    नोट: गंध समाधान की सटीक आवेदन TTL उत्तेजनाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है । एक ठेठ प्रयोग 4 एस की एक आधारभूत अवधि, उत्तेजना बार ०.१ से लेकर ०.५ एस और 6 की वसूली की अवधि के बाद होता है-10 एस ।
  8. समय अंतराल के लिए odorants के दोहराए उत्तेजना प्रदर्शन > 2 min. 1-1.5 मिलीलीटर · मिन-1करने के लिए प्रवाह की दर निर्धारित करें । के बाद से वैश्विक छिड़काव सभी प्रयोगों के दौरान पर है, स्थानीय रूप से लागू अमीनो एसिड बाहर धोया जाता है ।
    नोट: डिश में समाधान की मात्रा ~ 3 मिलीलीटर है ।
  9. छवि विश्लेषण
    1. प्रतिक्रियाओं का पता लगाना
      1. ImageJ के लिए फिल्में निर्यात करें ।
        नोट: लक्ष्य उत्तेजनाओं का जवाब glomerular क्षेत्रों की उपस्थिति का पता लगा रहा है ।
      2. एक ΔF/एफ0 फिल्म के लिए प्रतिदीप्ति छवियों के कच्चे अनुक्रम रूपांतरण । निंन संबंध के अनुसार बेसल प्रतिदीप्ति में संबंधित परिवर्तनों को मापने: (f-f0)/0, जहां f0 आधारभूत प्रतिदीप्ति स्तरों को इंगित करता है ।
      3. ब्याज के क्षेत्र आकर्षित (रॉय) उत्तेजना के दौरान ख्यात प्रतिदीप्ति बढ़ता दिखा क्षेत्रों के आसपास और रॉय प्रबंधक में अपनी स्थिति रिकॉर्ड (चित्रा 2) । glomerular संरचनाओं से रहित क्षेत्र में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तरों का पता लगाने के लिए ROI ड्रा करें ।
    2. प्रतिक्रियाओं का ठहराव.
      1. प्रतिदीप्ति छवियों के कच्चे अनुक्रम में परिभाषित ROIs प्लेस । प्रत्येक फ़्रेम के लिए चयनित ROIs का माध्य धूसर मान प्राप्त करें । किसी विश्लेषण प्रोग्राम (उदा., इगोर Pro) को प्राप्त मानों के अनुक्रम को स्थानांतरित करें ।
      2. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना, और फिर प्रत्येक रॉय के लिए ΔF/F0 परिवर्तन की गणना (चित्रा 2F) । ΔF/F0 में ROIs चयनित में से हर एक के लिए बढ़ जाती है प्लॉट । बेसल ΔF के मानक विचलन की गणना/एफ0 (उत्तेजना से पहले) ।
        नोट: एक सकारात्मक प्रतिक्रिया माना जाता है यदि उत्तेजना के दौरान ΔF/एफ0 में वृद्धि बेसल मूल्यों के 2 मानक विचलन से बड़े हैं ।

5. घ्राण-निर्देशित व्यवहार परख

नोट: सेटअप के एक योजनाबद्ध आरेख परख प्रदर्शन के लिए 3 चित्रामें दिखाया गया है ।

  1. छोटे छेद एक 6-अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक कुआं के ऊपरी हिस्से में १.५७ mm ओडी x १.१४ mm आईडी टयूबिंग फिट करने के लिए बनाओ । डालने टयूबिंग और सील एक epoxy चिपकने का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: संशोधित पकवान फिर से आसुत जल के साथ पूरी तरह से धोने के बाद कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. एक एमिनो एसिड methionine, leucine, histidine, arginine और lysine युक्त समाधान के ५० मिलीलीटर तैयार (विवरण के लिए चरण ३.२ देखें) । सांद्रता १६० µ मीटर से लेकर 1 मिमी तक हो सकती है । एक ऊंचा जलाशय में समाधान के 20 मिलीलीटर प्लेस ।
  3. परख से पहले कम से 12 ज के लिए tadpoles फ़ीड मत करो । अपने आवास टैंक से 6 tadpoles ले लो और उंहें साफ टैडपोल पानी के 2 एल में जगह odorants के लिए जोखिम को कम करने के लिए ।
  4. एक सफेद एलईडी पर संशोधित 6 कुओं पकवान प्लेस-transilluminator (चित्रा 3) ।
  5. युगल छिड़काव एमिनो एसिड एक कई गुना का उपयोग कर समाधान युक्त जलाशय को देता है ( सामग्री की तालिकादेखें) । छिड़काव प्रणाली की जाँच करें और हवा के बुलबुले को खत्म । 6 कुओं को एक साथ भरें । जलाशय की ऊंचाई समायोजित करने के लिए ≥ के वितरण की अनुमति 5 गंध के भीतर समाधान ~ 30 एस ।
    नोट: एक अच्छी तरह से धो 4 बार गंध समाधान के लिए जोखिम के बाद डबल आसुत जल के साथ ।
  6. प्रत्येक टैडपोल पानी के 10 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से भरें । जगह 1 टैडपोल/ > 3 मिनट के लिए आराम करने के लिए छोड़ दें ।
  7. छवि प्राप्ति सेट अप करें । एक पारंपरिक सीसीडी कैमरा है कि ≥ पर छवियों को प्राप्त कर सकते है का प्रयोग करें 5 हर्ट्ज. एक कंप्यूटर से कैमरा कनेक्ट । यहां, एक जीस MRC5 ज़ेन सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित कैमरे का उपयोग करें, लेकिन अंय समकक्ष विंयास इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि फ़्रेम दर बढ़ाना आवश्यक है, तो पिक्सेल बिन्नी लागू करें । छवियां पूरे 6 अच्छी तरह से पकवान दिखाना चाहिए ।
  8. शुरू छवि अधिग्रहण ऐसी है कि फिल्मों बेसल (30 एस), उत्तेजना (25-35 एस) और वसूली (30-60 एस) पीरियड होते हैं ।
  9. इमेजिंग के बाद टैंक के लिए 6 कुओं पकवान से पशुओं को लौटें ।
  10. ऐसे wrMTrck19के रूप में plugins का उपयोग ImageJ में फिल्मों का विश्लेषण,20 कि गतिशीलता से जुड़े कई मापदंडों प्रदान करते हैं.
  11. विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करने के लिए, पहले एक अच्छी तरह से ३५ mm x ३५ mm (चित्रा 4a) के एक आयताकार रॉय ड्राइंग द्वारा चुनें । पूरे अनुक्रम के अधिकतम प्रक्षेपण की गणना करके एक पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करें । यह टैडपोल के बिना अच्छी तरह की एक छवि प्रदर्शित करना चाहिए ।
  12. कच्चे फिल्म से अधिकतम प्रक्षेपण घटाना । जनरेट किया गया ३२-बिट चलचित्र पर थ्रेशोल्ड करने और wrMTrck प्लगइन लागू करें । मज़बूती से पशु आंदोलनों को ट्रैक करने के लिए WrMTrck मापदंडों समायोजित करें । एक विश्लेषण प्रोग्राम में प्राप्त X, Y निर्देशांक स्थानांतरित करें ।
  13. X-Y का उपयोग निर्देशांक, गंध स्रोत के लिए इयूक्लिडियन दूरी की गणना (वेल में छिड़काव प्रवेश), निम्न समीकरण लागू करने से:
    Equation 1
    जहां ओएस गंध स्रोत और बालक की स्थिति को इंगित करता है एक निश्चित समय में टैडपोल स्थिति इंगित करता है । विवरण के लिए चित्रा 4 देखें ।

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Representative Results

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इस पत्र में, हम vivo में प्रदर्शन करने के लिए दो पूरक दृष्टिकोण का एक संयोजन वर्तमान Xenopus टैडपोल घ्राण प्रणाली की कार्यक्षमता का अध्ययन: i) इमेजिंग presynaptic Ca के लिए एक विधि2 + जीने के glomeruli में परिवर्तन tadpoles एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक का उपयोग कर, और द्वितीय) एक गंध निर्देशित व्यवहार परख कि विशिष्ट जलजनित odorants के जवाब की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूंकि इन दृष्टिकोणों चोट10के बाद घ्राण प्रसंस्करण की वसूली का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया गया है, transecting घ्राण नसों के लिए एक सरल तरीका भी वर्णित है ।

में घ्राण मार्ग के Transection Xenopus tadpoles
प्रक्रिया की वैधता को प्रमाणित करने के दो तरीके हैं । दोनों घ्राण तंत्रिकाओं फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग कर के दृश्य पर भरोसा करते हैं । एक विधि ट्रांसजेनिक tadpoles है कि उनके तंत्रिका तंत्र पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस पर आधारित है । दो अनुशंसित पंक्तियाँ जो एक GFP β-tubulin promotion के अंतर्गत व्यक्त की जाती हैं x. laevis tubb2b-GFP और x. tropicalis NBT-GFP (चित्रा 1, सामग्री की तालिकादेखें) । यदि केवल जंगली प्रकार के जानवरों उपलब्ध हैं, सेमी-दिी इस्तेमाल किया जा सकता है (चरण १.८ देखें) । चित्रा 1 tubb2-GFP X. laevis tadpoles की छवियां दिखाता है । छवियां चार विभिंन जानवरों जहां एक एकल घ्राण तंत्रिका transected था से कर रहे हैं । विच्छेदन कार्यक्षेत्र के तहत कटौती स्पष्ट होनी चाहिए । ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग करने का लाभ यह है कि घ्राण तंत्रिका के सुधार समय की अवधि के बाद किया जा सकता है । जब अनुक्रमिक टिप्पणियों कर रही है, यह धूप को रोकने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए जोखिम को कम करने की सिफारिश की है । एक एकल घ्राण तंत्रिका के अनुभाग उपयोगी है जब एक आंतरिक नियंत्रण की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए के रूप में, सामांय रूप से विकसित की तुलना बनाम rewire्ड glomerular इकाइयों । लक्ष्य पूरी तरह से सूचना के संचरण को दबा रहा है जब दोनों घ्राण नसों के अनुभाग लागू किया जाना चाहिए ।

घ्राण उत्तेजनाओं को presynaptic प्रतिक्रियाओं की लाइव इमेजिंग
कैल्शियम ग्रीन के साथ ORNs के सही लेबल-1 dextran घ्राण बल्ब के स्तर पर देखा जा सकता है (चित्रा 2) widefield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । Glomeruli स्पष्ट (चित्रा 2बी) कर रहे है और फोकस विमान ले जाकर विभिंन परतों में वितरित दिखाई देना चाहिए । glomerular संरचनाओं की आकृति विज्ञान बेहतर अगर एक फोकल माइक्रोस्कोप के बजाय (चित्रा 2सी) प्रयोग किया जाता है हल किया जा सकता है । लेबल glomeruli की संख्या घ्राण उपकला के स्तर पर डाई ऊपर पर निर्भर करता है. इसलिए, यह कार्यविधि सभी glomerular इकाइयों के दृश्यावलोकन की अनुमति नहीं देता है । glomerular क्षेत्र के एक अधिक तीव्र प्रतिदीप्ति धुंधला दिखा जानवरों इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने से पहले चुना जाना चाहिए, क्योंकि वे अधिक ORNs लेबल होते हैं । इस पैंतरेबाज़ी अत्यधिक क्रम में प्रयोगात्मक प्रवाह बढ़ाने के लिए और एक प्रतिदीप्ति लैंप से सुसज्जित एक विदारक गुंजाइश के तहत किया जाना चाहिए की सिफारिश की है । उन जानवरों को अस्वीकार करें जो लेबल glomerular इकाइयां नहीं दिखाते है या जो glomerular परत के विशेष क्षेत्रों के लिए प्रतिबंधित प्रतिदीप्ति दिखाते हैं । Presynaptic Ca2 + प्रतिक्रियाओं डाई लदान के बाद के रूप में जल्द ही 1 दिन के रूप में मनाया जा सकता है । इमेजिंग प्रयोगों के लिए यह उच्च संख्यात्मक एपर्चर के उद्देश्यों का उपयोग करने के लिए वांछनीय है बाहर ले जाने के लिए, आमतौर पर ≥ ०.९.

presynaptic कैल्शियम का स्तर बढ़ता अमीनो एसिड के लिए ORNs के वृक्ष knobs को उजागर किया जा सकता है । यह नाक कैप्सूल के ऊपर गंध समाधान देने केशिका की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है । ध्यान से बचने के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि यह केशिका और/या ORNs की यांत्रिक उत्तेजना के कारण की नोक रोकना सकता है । presynaptic कैल्शियम के स्तर में क्षणिक वृद्धि उत्तेजनाओं ≥ ०.१ s (चित्रा 2डी) के लिए मनाया जा सकता है और एक सही घ्राण transduction का संकेत कर रहे हैं । यह भी कम कैमरा लाभ के साथ बेसल कैल्शियम का स्तर कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है । ORNs के Presynaptic टर्मिनलों उच्च फ्लोरोसेंट बढ़ जाती है प्रदर्शन और यह संकेत संतृप्ति से बचने के लिए आवश्यक है । उच्च लौकिक संकल्प widefield माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक इलेक्ट्रॉन गुणा सीसीडी कैमरा का उपयोग कर, यह ५० हर्ट्ज या उच्चतर के फ्रेम दरों को प्राप्त करने के लिए संभव है. फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग लौकिक संकल्प को कम कर देता है, लेकिन glomerular संरचनाओं की एक बेहतर परिभाषा की अनुमति देती है ।

कैल्शियम (१९० एनएम) बाध्यकारी कैल्शियम के लिए हरे रंग की उच्च समानता विशेष रूप से छोटी प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए उपयोगी है । क्षणिक intracellular कैल्शियम बढ़ाता है glomerular परत में पाया चर रहे हैं । कुछ glomerular क्षेत्रों ΔF/एफ0 ≥ ०.२ में परिवर्तन दिखाने के लिए, जबकि पड़ोसी प्रक्रियाओं भी (चित्रा 2डी) जवाब नहीं हो सकता है । निम्नलिखित कारकों glomerular इकाइयों की प्रतिक्रिया की परिवर्तनशीलता के लिए योगदान: i) लेबल glomeruli की समग्र संख्या, ii) कैल्शियम ग्रीन की intracellular एकाग्रता, और iii) एमिनो एसिड का पता लगाने के लिए ORNs के selectivity. लेबल glomeruli की एक बहुत कम संख्या के बाद से प्रतिक्रिया देख बाधा सकता है, यह बिल्कुल के रूप में संभव के रूप में कई लेबल ORNs युक्त पशुओं के साथ इन प्रयोगों बाहर ले जाने के लिए आवश्यक है ।

घ्राण-निर्देशित व्यवहार
डेटा विश्लेषण
घ्राण-निर्देशित व्यवहार एक कस्टम निर्मित प्रणाली का उपयोग कर अध्ययन किया है । चित्रा 3 को परख बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल उपकरणों की एक योजनाबद्ध ड्राइंग से पता चलता है । परीक्षण अमीनो एसिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए tadpoles की क्षमता में आधारित है, जो odorants के रूप में कार्य करते हैं । एक समाधान पांच अलग एमिनो एसिड (methionine, leucine, histidine, arginine और lysine) के संयोजन उत्तेजना के लिए प्रयोग किया जाता है । समाधान स्थानीय रूप से एक ३५ मिमी के लिए 30 एस के दौरान अच्छी तरह से एक मुक्त तैराकी टैडपोल युक्त दिया जाता है । आने वाले समाधान के लिए tadpoles की तत्काल प्रतिक्रिया गतिशीलता में वृद्धि हुई है । यादृच्छिक संचलन प्रारंभिक ∼ के दौरान होने वाली 5 – 10 एस समाधान आवेदन के odorants के स्रोत की दिशा में एक सीधा तैरने के बाद कर रहे हैं । Tadpoles अमीनो एसिड की डिलीवरी के दौरान नोजल के आसपास के क्षेत्र में कई सेकंड के लिए रहते है और धीरे-धीरे यादृच्छिक दिशाओं में गतिशीलता ठीक ( अनुपूरक वीडियो 1 देखें, 2) ।

प्रायोगिक स्थितियों में वर्णित की अनुमति सामांय तैरना X tropicalis tadpoles चरणों 48-52; हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि बड़े जानवरों के गतिशीलता ३५ mm कुओं में प्रतिबंधित किया जा सकता है । टैडपोल आंदोलनों एक सीसीडी कैमरे के साथ दर्ज कर रहे हैं । गंध समाधान के लिए आकर्षण इयूक्लिडियन दूरी टैडपोल स्थिति (चित्रा 4) से छिड़काव प्रवेश को अलग करने की कमी के रूप में पता लगाया जा सकता है । ३५ मिमी x ३५ मिमी (या पिक्सल में समकक्ष आकार) के एक क्षेत्र के भीतर टैडपोल सिर पदों की ट्रैकिंग घ्राण-निर्देशित व्यवहार (चित्रा 4) का एक मात्रात्मक विश्लेषण प्राप्त करने की अनुमति देता है । टैडपोल आंदोलनों के व्यक्तिगत भूखंडों का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं X-Y छवि विश्लेषण द्वारा प्राप्त निर्देशांक (चित्रा 4बी). निकाली गतिशीलता भूखंड ईमानदारी से वीडियो छवियों को पुन: पेश करना चाहिए ।

घ्राण-निर्देशित व्यवहार प्रयोगों की व्याख्या करने के दो संभव तरीके हैं. पहला दृष्टिकोण zebrafishes21का उपयोग कर पिछले एक अध्ययन पर प्रेरित है । नोजल के आसपास के क्षेत्र में खर्च समय की माप odorants एक सकारात्मक tropism की उपस्थिति सबूत । ८.७५ mm त्रिज्या के ब्याज का एक क्षेत्र (अच्छी तरह से व्यास के ¼ के लिए इसी) समाधान प्रवेश पर केंद्रित यह गंध स्रोत के लिए पशुओं की निकटता को वर्गीकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता है (आंकड़ा 4a, 4c) । निर्धारित अवधि के दौरान नोजल के आसपास के क्षेत्र में tadpoles द्वारा खर्च समय, यानी, 15 एस अंतराल, एमिनो एसिड समाधान (चित्रा 4डी) का पता लगाने की क्षमता की पहचान करने की अनुमति देता है । tadpoles की जनसंख्या का समग्र व्यवहार व्यक्तिगत डेटा (चित्रा 5) के वितरण की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । methionine, leucine, histidine, arginine और lysine का समाधान 1 मिमी या १६० माइक्रोन (चित्रा 5 ए और 5B) पर तैयार किया जाता है जब एक सकारात्मक tropism का पता लगाया जा सकता है । पशु जल आवेदन (चित्रा 5सी) का जवाब नहीं है, इस प्रकार mechanosensitive तंत्र की भागीदारी को खारिज । प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में परिभाषित समय अंतराल के बीच अंतर डन के कई तुलना परीक्षण के साथ ANOVA nonparametric दोहराया उपायों का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है । 15 एस के समय अंतराल में डेटा बिन्नी का नुकसान एक कम लौकिक संकल्प है ।

एक तरीका व्यवहार प्रतिक्रिया के लौकिक जानकारी बढ़ाने के लिए गंध स्रोत से इयूक्लिडियन दूरी के औसत भूखंड बनाने के द्वारा है । हालांकि टैडपोल आंदोलनों एक आंतरिक परिवर्तनशीलता दिखाने के लिए, पशुओं की आबादी का औसत गतिशीलता (आमतौर पर ≥ ४०) घ्राण-निर्देशित व्यवहार से पता चलता है । इस विश्लेषण के लिए यह उत्तेजना की शुरुआत से पहले पशु पदों समूह के लिए आवश्यक है बाहर ले जाने के लिए । चूंकि tadpoles विभिंन स्थानों में पाए जाते है जब गंध समाधान अच्छी तरह से यह इयूक्लिडियन दूरी सेट करने के लिए आवश्यक है में प्रवेश करती है बस उत्तेजना से पहले (चित्रा 6एक, यह भी आंकड़ा 7में शामिल किए जाने के मानदंड देखें) । नकारात्मक और सकारात्मक मूल्यों इसलिए एक आकर्षण या गंध स्रोत से एक प्रतिस्पंदन, क्रमशः संकेत मिलता है । गंध के लिए एक आकर्षण अच्छी तरह से प्रतीपगमन गुणांक ≥ ०.९ के साथ एक रेखीय फ़िट द्वारा वर्णित है । पानी दिया जाता है, तो इयूक्लिडियन दूरी के शुद्ध परिवर्तन 0 के आसपास वितरित कर रहे हैं और यह संभव नहीं है, इस प्रकार एक घ्राण-निर्देशित व्यवहार (चित्रा 6बी) के अभाव का संकेत है, गंध उत्तेजना के दौरान एक लाइन फिट करने के लिए । 1 मिमी और १६० µ मीटर में तैयार एमिनो एसिड समाधान के लिए इयूक्लिडियन दूरी के औसत भूखंडों की तुलना घ्राण-निर्देशित प्रतिक्रिया में अलग देरी का सुझाव ( चित्रा 6A और सीकी तुलना). समय odorants के स्रोत की ओर आंदोलन शुरू करने के लिए आवश्यक अंतराल कम है जब एमिनो एसिड एक उच्च एकाग्रता पर लागू कर रहे हैं । घ्राण-निर्देशित व्यवहार की कमी दोनों घ्राण नसों transected (चित्रा 6डी) के साथ tadpoles में मनाया जाता है ।

वर्णित घ्राण की एक सीमा-निर्देशित व्यवहार परख जटिल द्रव प्लम की स्थापना है । यह देखा जा सकता है अगर एमिनो एसिड समाधान एक डाई द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जैसे कि तेजी से हरे, जब तक प्रणाली की स्थापना । रंग का समाधान का उपयोग प्लम के गठन की पुष्टि और पता चलता है कि जलजनित odorants 5 एस के भीतर अच्छी तरह से किसी भी क्षेत्र में पहुंच । समाधान के वितरण के कारण अशांति की संभावना tadpoles की पार्श्व लाइन से पता चला रहे है और शायद योगदान परिवर्तनशीलता पशु गतिशीलता में मनाया लेकिन घ्राण निर्देशित व्यवहार के साथ हस्तक्षेप नहीं करते । नियंत्रण प्रयोगों के बजाय एमिनो एसिड समाधान के पानी का उपयोग करके पता चलता है कि tadpoles यांत्रिक उत्तेजनाओं से घ्राण भेदभाव करने में सक्षम हैं । ब्याज के क्षेत्र में बिताए गए समय का आकलन (चित्रा 5) और इयूक्लिडियन दूरियों की औसत साजिश (चित्रा 6) दो पूरक तरीकों को घ्राण-tadpoles के निर्देशित प्रतिक्रिया का वर्णन कर रहे हैं ।

समावेशन मानदंड
डेटा विश्लेषण के लिए शामिल किए जाने के मानदंडों को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए । कुछ tadpoles एक गुंजयमान आंदोलन है, जो एक sinusoidal समारोह के लिए इयूक्लिडियन दूरी की साजिश की फिटिंग से सचित्र है (चित्रा 7) दिखाते हैं । इस व्यवहार को प्रदर्शित Tadpoles सभी विश्लेषण से छोड़ दिया जाना चाहिए ।

पशुओं के अपवर्जन कि गंध समाधान के आवेदन की शुरुआत में एक अधिकतम (> 30 मिमी चित्रा 7) या एक ंयूनतम इयूक्लिडियन दूरी (< 5 ए, चित्रा 7सी) नोक से कर रहे है परिवर्तनशीलता को कम करने की अनुमति देता है औसत भूखंडों की । चित्र 7 में सचित्र उदाहरण एमिनो एसिड समाधान के लिए एक सकारात्मक tropism से पता चलता है । टैडपोल उत्तेजना की शुरुआत में समाधान प्रवेश की एक अधिकतम दूरी पर स्थित है । इसलिए, इस रिश्तेदार की स्थिति केवल गंध स्रोत के लिए एक आकर्षण प्रकट कर सकते हैं । चित्र 7 सी विपरीत स्थिति से पता चलता है । यहां, एक टैडपोल अमीनो एसिड समाधान पहुंचाने नोक के आसपास में स्थित है । गंध स्रोत के पास बिताए समय की ठहराव एक प्रतिक्रिया ( चित्रा 5में प्रयुक्त विधि) से पता चलता है; हालांकि, यह प्रवेश की दिशा में एक शुद्ध आंदोलन नहीं दिखा सकते हैं ।

सारांश में, घ्राण-निर्देशित व्यवहार की प्रस्तावित परख एक द्विआधारी परीक्षण परिभाषित करता है । इस विधि के लिए odorants का जवाब tadpoles के एक प्रयोगात्मक समूह की क्षमता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उद्देश्य जटिल घ्राण-निर्देशित प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर स्थापित कर रहा है, उदाहरण के लिए, दिए गए गंध के लिए वरीयताओं का निर्धारण के रूप में, अगर आगे सुधार की आवश्यकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: घ्राण नसों की Transection । tubb2 के प्रतिनिधि छवियां-GFP X. laevis tadpoles एक एकल transection तंत्रिका (तीर) के घ्राण के बाद प्राप्त की । tubb2 की नसों-GFP tadpoles मजबूत प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करते हैं । तंत्रिका transection तुरंत सर्जरी (D0) के बाद स्पष्ट है । घ्राण तंत्रिका की पुनर्वृद्धि स्पष्ट 4 दिनों के बाद कटौती (D4) है । सर्जरी के आठ दिन बाद (D8) नियंत्रण और सुधारित नसों के बीच थोड़ा अंतर है । Tadpoles ०.०२% MS-२२२ में छवियों को इकट्ठा करने के लिए anesthetized थे । घ्राण बल्ब (O.B.), घ्राण नर्व (O.N.), नेज़ल कैप्सूल (नेकां), tectum (टेक), ऑप्टिक नर्व (Op. N.). तीर transected तंत्रिका के स्थान का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : कैल्शियम ग्रीन dextran और presynaptic कैल्शियम का दृश्य के साथ घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के लेबल अमीनो एसिड के साथ उत्तेजना पर. () घ्राण उपकला, घ्राण नसों और घ्राण बल्ब की glomerular परत का स्थान दिखा एक टैडपोल की प्रकाश छवि संचारित । () एक घ्राण widefield द्वारा visualized बल्ब की छवि (wf) माइक्रोस्कोपी । न्यूरॉन्स नाक कैप्सूल पर कैल्शियम ग्रीन-1 dextran के आवेदन द्वारा लेबल किया गया था. प्रतिदीप्ति मनाया glomeruli बनाने घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स से presynaptic टर्मिनलों के अनुरूप. ओ. एन: घ्राण तंत्रिका; ओ. बी: घ्राण बल्ब. () फोकल खंड घ्राण तंत्रिका के प्रवेश से बल्ब के लिए पृष्ठीय स्थित है । घ्राण glomeruli के presynaptic घटक कैल्शियम ग्रीन-1 dextran, के रूप में बी में) का उपयोग कर लेबल था । () Presynaptic टर्मिनलों क्षणिक पांच अलग एमिनो एसिड युक्त एक समाधान के लिए घ्राण उपकला के जोखिम पर उनके कैल्शियम का स्तर में वृद्धि. कैल्शियम प्रतिदीप्ति में सापेक्ष परिवर्तन से पहले प्राप्त की, के दौरान और 1 s उत्तेजना के बाद. () ब्याज के 10 विभिंन क्षेत्रों का वितरण (ROIs) ΔF/एफ0 परिवर्तन की मात्रा के लिए इस्तेमाल किया । ROI11 glomerular परत के बाहर है और प्रतिदीप्ति की पृष्ठभूमि के स्तर को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । () वैयक्तिक ΔF/f0 responses for ROIs E में परिभाषित). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: घ्राण-निर्देशित व्यवहार परख । (एक) योजनाबद्ध परीक्षण में प्रयुक्त उपकरण दिखा आरेख । () ९० एस से अधिक दर्ज की गतिशीलता पटरियों का उदाहरण । प्रत्येक चक्र एक अच्छी तरह से युक्त एक जानवर का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : घ्राण-निर्देशित व्यवहार की ट्रैकिंग । () एक अच्छी तरह से व्यवहार परख के लिए इस्तेमाल दिखा उदाहरण । ब्लू बिंदीदार लाइनें एक्स के स्थान, वाई निर्देशांक (मिमी में) टैडपोल आंदोलनों को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल संकेत (भी अनुपूरक वीडियो 1देखें) । हरी दीर्घवृत्त समाधान प्रवेश की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है । बिंदीदार काली रेखा एमिनो एसिड समाधान (विवरण के लिए पाठ देखें) पहुंचाने ट्यूब करने के लिए समीपस्थ क्षेत्र इंगित करता है । () गतिशीलता में दिखाई गई टैडपोल के व्यवहार की परख के दौरान. रंग कोडित निशान पशु की स्थिति से पहले (ग्रे) और घ्राण उत्तेजना (बैंगनी) के बाद संकेत मिलता है । गंध समाधान के आवेदन के दौरान आंदोलनों एक लौकिक रंग ढाल (30 एस, नीला करने के लिए लाल) में सचित्र हैं । () X, Y टैडपोल पदों का उपयोग कर यह छिड़काव प्रवेश करने के लिए टैडपोल सिर से इयूक्लिडियन दूरी में परिवर्तन की गणना करने के लिए संभव है. ८.७५ mm से कम दूरी नोक के समीपस्थ क्षेत्र के अनुरूप है । () एक में बिंदीदार रेखा द्वारा परिभाषित क्षेत्र में tadpoles द्वारा बिताए गए समय का प्लाट). प्रत्येक बिंदु 15 s अवधि इंगित करता है । पशु गंध समाधान द्वारा आकर्षित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : Tadpoles अमीनो एसिड द्वारा आकर्षित कर रहे हैं । () गंध स्रोत के आसपास के क्षेत्र में tadpoles द्वारा बिताया गया समय । प्रत्येक बिन एक 15 एस अवधि शामिल हैं । बॉक्स प्लॉट्स माध्य (काली क्षैतिज रेखा), 25 से ७५% quartiles (बक्से), और डेटा की श्रेणियां (मूंछें) का प्रतिनिधित्व करता है । एक 1 मिमी एमिनो एसिड समाधान की डिलिवरी गंध स्रोत के लिए tadpoles को आकर्षित किया । () Tadpoles जब एमिनो एसिड की एकाग्रता १६० माइक्रोन करने के लिए कम किया गया था, जब गंध समाधान द्वारा आकर्षित किया गया । () पानी के वितरण पशु व्यवहार को संशोधित नहीं किया । डन के कई तुलना परीक्षण के साथ दोहराया उपाय ANOVA, पी < ०.०५ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : tadpoles के odorants के लिए लौकिक प्रतिक्रिया । (एक) समय के एक समारोह के रूप में गंध स्रोत के लिए औसत इयूक्लिडियन दूरी की साजिश । इयूक्लिडियन दूरी प्रत्येक व्यक्ति का पता लगाने में उत्तेजना से पहले 0 के लिए सेट किया गया था । नकारात्मक और सकारात्मक मूल्यों की कमी और गंध स्रोत के लिए दूरी में वृद्धि, क्रमशः संकेत मिलता है । गंध स्रोत के लिए आकर्षण एक रैखिक फ़िट द्वारा वर्णित किया जा सकता है (r2= ०.९८) । () जल का वितरण गंध स्रोत से दूरी को संशोधित नहीं करता है. () Tadpoles एमिनो एसिड की एक १६० माइक्रोन समाधान के आवेदन का जवाब के रूप में एक रैखिक फ़िट द्वारा प्रगट (r2= ०.९६) । () दोनों घ्राण नसों के साथ Tadpoles अमीनो अम्ल का जवाब नहीं transected. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : घ्राण-निर्देशित व्यवहार परख के लिए शामिल मानदंड । () कुछ tadpoles एक गुंजयमान आंदोलन दिखाते हैं. यह व्यवहार गंध स्रोत के लिए इयूक्लिडियन दूरी की साजिश करने के लिए एक sinusoidal समारोह के सफल फिट द्वारा पता चला है । इस गतिविधि को प्रदर्शित Tadpoles को परीक्षण से बाहर रखा जाना चाहिए । (ख, ग) एक तरीका है odorants को औसत लौकिक प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए (6 चित्रा) एक अधिकतम पर स्थित पशुओं को छोड़कर द्वारा है (ख) या एक ंयूनतम (ग) उत्तेजना की शुरुआत में इयूक्लिडियन दूरी । लाल डॉटेड रेखाएं थ्रेशोल्ड मान (30 mm और 5 mm) को इंगित करती हैं । उत्तेजना की शुरुआत से पहले इयूक्लिडियन दूरी (तीर, बाएं भूखंडों) के लिए सेट है "0" के लिए नकारात्मक या सकारात्मक मूल्यों (सही भूखंड), क्रमशः के रूप में आकर्षक या प्रतिकारक व्यवहार की रिपोर्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Video 1
अनुपूरक वीडियो 1: घ्राण-निर्देशित एक एमिनो एसिड समाधान के वितरण से ट्रिगर व्यवहार । फिल्म एक टैडपोल आज़ादी से एक ३५ mm अच्छी तरह पर तैराकी दिखाता है । नीले दीर्घवृत्त गंध समाधान पहुंचाने नोक की स्थिति को इंगित करता है । शुरुआत और उत्तेजना के अंत में क्रमशः हरे और लाल डॉट्स द्वारा दर्शाया गया है । चित्र 4 व्यवहार का विश्लेषण स्वीकार्य दिखाता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Supplementary Video 2
supplement Video 2: पानी की डिलिवरी के दौरान टैडपोल गतिशीलता । फिल्म एक टैडपोल आज़ादी से एक ३५ mm अच्छी तरह पर तैराकी दिखाता है । नीला दीर्घवृत्त MQ पानी जारी नोजल की स्थिति को इंगित करता है । शुरुआत और जल वितरण की समाप्ति क्रमशः हरे और लाल डॉट्स द्वारा दर्शाया गया है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

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यह कागज तकनीकों कि रहने वाले Xenopus tadpoles में घ्राण रास्ते की कार्यक्षमता की जांच करने के लिए उपयोगी है वर्णन करता है । वर्तमान प्रोटोकॉल उन प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो काम करते हैं, या Xenopusतक पहुंच है; हालांकि, यह भी उन लोगों के लिए दिलचस्प है सेलुलर और आणविक आधारों के उत्थान और मरंमत के अध्ययन शोधकर्ताओं । परिणाम Xenopus में प्राप्त अंय हड्डीवाला मॉडल में इकट्ठे हुए डेटा के साथ संयुक्त किया जा सकता है संरक्षित तंत्र की पहचान । वर्णित तरीकों आनुवंशिक रूप से संशोधित Xenopus18,22,23 के विकास से लाभ होगा और24tadpoles में तंत्रिका तंत्र रोगों के प्रायोगिक मॉडल के लिए लागू कर रहे हैं, 25.

आदेश में vivo डेटा में reproducible प्राप्त करने के लिए, यह सही रियर Xenopus tadpoles के लिए कुंजी है । विशेष रूप से, एक्स tropicalis गरीब आवास की स्थिति के लिए बहुत संवेदनशील है । उदाहरण के लिए, वे 20 डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान बर्दाश्त नहीं करते हैं और 24 से 28 डिग्री सेल्सियस की सीमा में टैंक या पानी प्रणालियों में रखा जाना चाहिए । यह भी स्थापित सीमा के ऊपर पशु घनत्व में वृद्धि नहीं, नियमित रूप से tadpoles फ़ीड और एक इष्टतम जल गुणवत्ता13रखने के लिए महत्वपूर्ण है । मानकीकृत शर्तों के बाद पशु कालोनियों के प्रबंधन बिल्कुल vivo प्रयोगों में reproducibility पाने के लिए आवश्यक है ।

कैल्शियम इमेजिंग के वर्णित विधि vivo में ORNs के एक सही घ्राण transduction का पता लगाने के लिए उपयोगी है । कैल्शियम ग्रीन के साथ ORNs की लोडिंग-1 dextran प्लाज्मा झिल्ली के क्षणिक permeabilization ट्राइटन एक्स-१०० के एक कम एकाग्रता का उपयोग करके हासिल की है, के रूप में पहले17की सूचना दी । इस लोड हो रहा है विधि का मुख्य लाभ सादगी है, क्योंकि यह केवल एक microinjector की आवश्यकता है । एक महत्वपूर्ण खामी यह है कि ट्राइटन एक्स-१०० घ्राण cilia और microvilli के क्षणिक उन्मूलन का कारण बनता है । zebrafish के घ्राण उपकला17उपचार के बाद ४८ घंटे के भीतर पुनर्जीवित. Xenopus tadpoles में पुनर्जनन भी तेजी से हो सकता है odorants के लिए प्रतिक्रियाओं के बाद डाई लदान के बाद 1 दिन मनाया जा सकता है (चित्रा 2डी) । हालांकि, एक विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण सही ट्राइटन एक्स-१०० उपचार के बाद घ्राण उपकला के पुनर्जनन समय का अनुमान करने के लिए आवश्यक है.

लेबलिंग ORNs कैल्शियम ग्रीन के साथ-1 dextran केवल न्यूरॉन्स की आबादी में प्रभावी है, एक उच्च सिग्नल से शोर अनुपात के साथ presynaptic टर्मिनलों के दृश्य की अनुमति (चित्रा 2 बी और 2c). पृष्ठभूमि के लगभग पूरा अभाव लाभप्रद अगर कैल्शियम रंजक के एएम एस्टर रूपों के साथ पूरे घ्राण बल्ब की लोडिंग की तुलना में है । फ्लोरोसेंट ORNs की संख्या जानवर से पशु से अलग है । यह इस प्रकार कई अमीनो एसिड की एक व्यापक घ्राण उत्तेजना का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । हमने methionine, leucine, histidine, arginine और lysine के समाधान का उपयोग करते हुए सफल परिणाम प्राप्त किए हैं । विभिंन अमीनो एसिड के अंय संयोजन भी प्रभावी हो सकता है । एक वैकल्पिक विधि कैल्शियम संकेतकों के साथ ORNs लोड करने के लिए26electroporation है, जो व्यापक रूप से टैडपोल न्यूरॉन्स27में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों को व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । Electroporation वाणिज्यिक या कस्टम निर्मित उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है और एक उत्कृष्ट संकेत करने वाली शोर अनुपात28के साथ ंयूरॉन संरचनाओं के दृश्य की अनुमति देता है । इसी तरह वर्णित दृष्टिकोण के लिए, सेल लेबल आबादी विषम है और जानवर से जानवर से अलग है । Transgenesis वांछनीय है अगर उद्देश्य ंयूरॉंस की एक परिभाषित जनसंख्या22की जांच कर रहा है । उदाहरण के लिए, ORNs के एक प्रतिबंधित समूह में GCaMPs जैसे आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक की अभिव्यक्ति ड्राइविंग, odorants करने के लिए presynaptic टर्मिनलों के एक निर्धारित सेट की प्रतिक्रिया की जाँच करने के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है.

वर्णित विधि कैल्शियम ग्रीन 1 dextran रिपोर्ट vivo में presynaptic टर्मिनल समारोह का उपयोग कर । intracellular कैल्शियम की वृद्धि का अवलोकन एक सही घ्राण transduction और glomeruli के स्तर पर ग्लूटामेट की रिहाई का संकेत है । प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का मात्रात्मक विश्लेषण, तथापि, सीमित है । presynaptic टर्मिनलों की उत्तेजना micromolar रेंज और कैल्शियम ग्रीन के रूप में एक उच्च समानता कैल्शियम सूचक की संतृप्ति के लिए intracellular कैल्शियम का स्तर बढ़ जाती है ध्यान में रखा जाना चाहिए । चित्रा 2 में सचित्र परिणाम widefield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । यह सरलतम दृष्टिकोण है और अधिकांश प्रयोगशालाओं में कार्यान्वित किया जा सकता है. दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग करके सुधार presynaptic समारोह का अधिक मात्रात्मक अनुमान प्राप्त करने की अनुमति सकता है ।

कैल्शियम की प्रतिक्रियाओं के लाइव इमेजिंग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि वहाँ के लिए उपयुक्त स्थिति है कि सुगंधित समाधान प्रदान केशिका । यह नाक कैप्सूल के ऊपर स्थित होना चाहिए और हमेशा ऊतक के साथ सीधे संपर्क से बचने । दोनों की सही वितरण गंध समाधान और छिड़काव के प्रवाह माइक्रोस्कोप के तहत टैडपोल रखने से पहले की जाँच की जानी चाहिए. छिड़काव के लिए इस्तेमाल सभी टयूबिंग हवाई बुलबुले के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए । एमिनो एसिड समाधान का प्रवाह परिवर्तन करने के लिए तुरंत लगातार खोलने और solenoid वाल्व के समापन का जवाब है । देरी हवा की उपस्थिति का संकेत कर रहे हैं । यह भी सही मात्रा बढ़ाता है या खोलने के समय बदलने के बाद दिया समाधान की कमी के लिए जांच करने के लिए वांछनीय है, अर्थात्, ०.१ s से 1 s या इसके विपरीत । photobleaching को कम करने के लिए प्रायोगिक मापदंडों (चरण ४.६) की स्थापना करते समय कम प्रकाश की तीव्रता का प्रयोग करें ।

हालांकि tadpoles के जीवविज्ञान में olfaction के महत्व को अच्छी तरह से29की स्थापना की है, वहां परीक्षण की कमी है सीधे Xenopus लार्वा में घ्राण निर्देशित व्यवहार का आकलन । इस पत्र में वर्णित विधि एक सरल परीक्षण है कि पशुओं की एक बड़ी आबादी में एक गंध उत्तेजना के लिए एक प्रतिक्रिया का पता लगाने की अनुमति देता है । पानी में रसायनों की उपस्थिति के लिए राणा catesbeiana tadpoles की गंध संवेदनशीलता का हाल का वर्णन जटिल तंत्र युग्मन olfaction मोटर व्यवहार30के लिए दिखाता है । इस पत्र में वर्णित परख खाते में घ्राण की आंतरिक परिवर्तनशीलता-tadpoles में निर्देशित व्यवहार लेता है । एकल कुओं की जगह ६-खैर के पकवान का प्रयोग प्रायोगिक प्रवाह को बढ़ाता है. परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कारक ऐसे बेसल गतिशीलता, छिड़काव प्रवेश और सुगंधित समाधान द्वारा उत्पंन प्लम के सापेक्ष स्थिति कई tadpoles औसत से दूर कर रहे हैं । लगभग ४० स्वतंत्र माप अमीनो एसिड के लिए नियंत्रण आकर्षक प्रतिक्रिया का वर्णन करने के लिए आवश्यक हैं ।

हम olfaction परीक्षण के लिए विश्लेषण के दो प्रकार के प्रस्ताव । पहला दृष्टिकोण एक निर्धारित अवधि से अधिक गंध स्रोत के पास बिताया समय quantifies । यह सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है । दूसरा दृष्टिकोण गंध स्रोत से इयूक्लिडियन दूरी की औसत भूखंड पर आधारित है और odorants को लौकिक प्रतिक्रिया का वर्णन उपयोगी है । विश्लेषण के दोनों प्रकार के पूरक और एक ही डेटा द्वारा उत्पंन आ रहे हैं । व्याख्या द्विआधारी है और अनुमति देता है कि उन है कि10नहीं है से odorants भावना भेद जानवरों ।

कैसे तरीकों Xenopus समुदाय के लिए उपयोगी हो सकता है वर्णित है? हालांकि तरीके जंगली प्रकार के जानवरों के लिए अनिवार्य रूप से सचित्र हैं, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि आनुवंशिक संभावनाओं को लगातार Xenopus क्षेत्र में विस्तार कर रहे हैं । vivo ORN प्रतिक्रियाओं और घ्राण-निर्देशित व्यवहार की उपस्थिति में का संयुक्त अध्ययन भी बहुत आगे या रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन द्वारा बनाई गई Xenopus म्यूटेंट में घ्राण जानकारी की सही प्रोसेसिंग की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है 11. कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार परख द्वारा प्रदान की गई जानकारी संयुक्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक उत्परिवर्तन चुनिंदा घ्राण बल्ब के granules कोशिकाओं को प्रभावित ORNs के presynaptic प्रतिक्रिया को संशोधित नहीं होता, लेकिन शायद घ्राण-निर्देशित व्यवहार ख़राब होता ।

vivo में सेलुलर और व्यवहार प्रतिक्रियाओं को जोड़ तरीके न्यूरॉन सर्किट के आनुवंशिक विच्छेदन के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. परिणामों की व्याख्या पिछले रूपात्मक कार्यों, जो31tadpoles में glomerular परत का एक संरचनात्मक नक्शा प्रदान की है द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है । Xenopus tadpoles३२ के घ्राण बल्ब स्लाइस से प्राप्त जानकारी भी बहुत मूल्यवान है । घ्राण बल्ब स्लाइस में mitral/गुच्छा कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग Xenopus tadpoles में घ्राण प्रसंस्करण के मौलिक विशेषताओं का पता चला है, उदाहरण के लिए ORNs की संवेदनशीलता अलग एमिनो एसिड३३ या की प्रासंगिकता के लिए के रूप में घ्राण सूचना के कोडिंग में प्रतिक्रिया विलंब7. हालांकि, मस्तिष्क स्लाइसें एक सीमित क्षमता दिखाने के लिए जटिल एकीकृत विभिंन ंयूरॉन अनुमानों के अनुभाग के कारण अलग ंयूरॉंस सर्किट संबद्ध तंत्र । इसके अलावा, व्यक्तिगत glomerular इकाइयों के गुणों का एक लक्षण वर्णन अभी तक γ-glomerulus३४के अपवाद के साथ मायावी है । क्या एक glomerular इकाइयों tadpoles में विशिष्ट व्यवहार का निर्धारण केवल आनुवंशिक उपकरणों के संयोजन से उत्तर दिया जाएगा का सवाल है, vivo इमेजिंग दृष्टिकोण और व्यवहार परख में

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; SAF2015-63568-R) द्वारा cofunded यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि (ERDF), एम. जी. एफ. Fuortes मेमोरियल फैलोशिप, स्टीफन डब्ल्यू Kuffler फैलोशिप कोष, लौरा और आर्थर Colwin संपंन ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप कोष से प्रतिस्पर्धी अनुसंधान पुरस्कार द्वारा , Fischbach फैलोशिप, और समुद्री जैविक प्रयोगशाला और राष्ट्रीय Xenopus संसाधन RRID के महान पीढ़ी निधि: SCR_013731 (वुड्स होल, MA) जहां इस काम के एक हिस्से का आयोजन किया गया था । हम भी CERCA कार्यक्रम/Generalitat de Catalunya संस्थागत सहायता के लिए धंयवाद । अल एक सेरा Húnter येता.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

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References

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लिविंग <em>Xenopus</em> Tadpoles में घ्राण मार्ग का कार्यात्मक मूल्यांकन
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Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

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