Summary
アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。
Abstract
アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。多数のイメージング技術、電気生理学的手法、行動アッセイへのアクセシビリティなど、複数の実験的利点を提供します。アフリカツメガエル幼生の嗅覚系は特に正常な開発の間に確立されたまたは傷害の後改革シナプスの機能を調査するために適しています。ここでは、リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生。嗅覚に基づく行動アッセイと嗅球の糸球体におけるシナプス カルシウム反応の生体内測定の組み合わせの概要を説明します。メソッドは、シナプス接続の配線を検討する嗅神経の断裂と組み合わせることができます。中枢神経系細胞における GFP レポーターを表現する野生型および遺伝子組換え動物を用いる実験を紹介します。遺伝子組換えオタマジャクシに説明した方法の適用は、脊椎動物の動作を定義する分子基盤の解明に役立ちます。
Introduction
アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の正常な機能を学習する優れた動物モデルを構成します。神経機能生体内で3 を調査できるようにアフリカツメガエル幼生のユニークな特性を透明性、完全に配列されたゲノム1,2, と外科、電気生理学とイメージング技術へのアクセス.この動物モデルの複数の実験的可能性のいくつかはオタマジャクシ感覚運動系4,5,6に対して徹底的な研究によって説明されます。情報レベル シナプスの処理の多くの側面を研究に特に適して神経回路は、アフリカツメガエルのオタマジャクシの嗅覚系7です。まず、そのシナプスの接続はよく定義された: 嗅覚受容ニューロン (ORNs) プロジェクトの嗅球へと臭気マップを生成する糸球体内の僧帽細胞の樹状突起とシナプスの接触を確立します。第二に、その ORNs は嗅覚経路8の機能を維持するために一生神経によって継続的に生成されます。第三に、アフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムは、素晴らしい再生能力を示すが完全切除9後の嗅球を改革することが.
本稿では嗅覚経路の機能を研究する行動実験と生活オタマジャクシで嗅糸球体の画像を結合する方法をについて説明します。ここで詳細な方法は、嗅神経断裂10後の嗅球糸球体接続機能回復の研究に使用されました。嗅覚情報処理の進化は脊椎動物の代表であるアフリカツメガエルのオタマジャクシで得られたデータ保存します。
X. tropicalisを使用して説明する方法を例示されるが、 Xで容易に実装することができます。発生学。大人のX. laevisの大きいサイズにもかかわらず両種は幼生の段階で著しく似ています。主な違いは、ゲノムのレベルで存在します。X. laevisには、allotetraploid のゲノム、長い生成時間 (約 1 年) によって大抵定められる貧しい人々 の遺伝的少ないが表示されます。対照的に、X の性はその短い世代時間 (5-8 ヶ月) と二倍体ゲノムのための遺伝の修正に向いています。代表的な実験は、野生型動物と 3 つの異なる形質転換線に図示されている: Hb9:GFP (X. tropicalis)、NBT:GFP (X. tropicalis)、tubb2:GFP (X. laevis)。
現在の作業に記載されている方法論は、アフリカツメガエルにおいて遺伝的進行と共に考慮されなければなりません。シンプルさと提示の技術の導入が容易になります CRISPR Cas9 技術12によって生成されたアフリカツメガエル行と同様に、既に説明した変異体11を評価する場合に役立ちます。アフリカツメガエル幼生へのアクセスを有するあらゆる研究室で実装できる嗅覚神経を縦断面に使用手術についても述べる。アプローチがシナプス前のカルシウム応答を評価するために使用し、嗅覚に基づく行動が特定の機器を必要とするとはいえ適度な費用でご利用いただけます。方法論研究グループでの使用を促進するために簡単な形式で掲載して、改善を実装することによって、または他の技術、すなわち,組織学的または遺伝学的アプローチへの関連付けによってより複雑なアッセイの拠点を設定することができます。
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Protocol
すべてのプロシージャは、バルセロナ大学の動物研究倫理委員会で承認されました。
注:X. tropicalisとX. laevisのオタマジャクシは、標準的な方法13,14によると飼育されています。オタマジャクシの水は、逆浸透膜によって得られる水を市販食用塩 (材料の表を参照) を追加するによって準備されます。伝導率は、それぞれ ∼700 μ S、∼1、 X. tropicalisとX. laevisのオタマジャクシで 400 μ 秒に調整されます。幼虫は、自然交配または体外受精14によって取得できます。胚はゼリー 2 %l-システイン 0.1 x マーク変更の替え玉 (MMR) での準備を。1 x MMR が含まれています (mM): 2, 塩化ナトリウム 100 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES、0.1 の EDTA、pH 7.8。幼虫は、2-3 日第 25 期後オタマジャクシ水 2 L タンクに転送されます。5 L タンクに配置、10 の密度で維持オタマジャクシ Nieuwkoop フェイバー (NF) 基準15ステージ 40 に達すると、 X. tropicalisとX. laevisのために動物/l. 温度が 23 ~ 25 ° C、18-20 ° C で一定に保たれるオタマジャクシ、それぞれ。ステージ 48-52 NF 条件の動物は、実験に使用されます。
1. 嗅覚神経の断裂
- 0.02% の麻酔ソリューションを準備 MS-222 常温オタマジャクシ水 50 mL に。
- 手術後動物の回復を許可する水おたまじゃくしと小さなタンク (1-2 L) を準備します。
- セルロース定性ろ紙 (4 cm × 3 cm、参照テーブルの材料) の長方形の部分をカットします。
- セルロース 0.02 %222 MS ソリューションにおける定性ろ紙の 2 個セットをウェットし、切り裂くスコープの下に配置します。
- タンクからオタマジャクシをピックアップし、麻酔液に浸します。動物は 2-4 分以内でスイミングを停止し、ピンセットを使用してテール レベルで適用される機械的刺激に反応しません。
-
フィルター紙の長方形の部分に麻酔のオタマジャクシを配置します。脳の構造を視覚化することができますので、上向き、その背側に動物を配置します。
- Vannas はさみ (材料の表を参照) を使用して (に応じて実施される試金の種類) の 1 つまたは両方の嗅神経をカットしました。神経損傷の内部統制を必要とする実験のための単一の神経を縦断面します。
- 行動実験のためには、嗅球に到着したすべての嗅覚情報を抑制するために両方の神経を縦断面します。切り裂くスコープ; 嗅神経の断面の効率で簡単に観察できただし、色素沈着または動物の位置の要因を制限があります。
注:(省略可能)プロシージャの有効性を保証する最良の方法は彼らの神経系に蛍光レポーターを表現する遺伝子組換えオタマジャクシを使用している (代表的な結果を参照してください)。この目的に蛍光 (図 1)、郭清範囲を使用する必要は。野生の種類の動物が利用可能な場合にのみ CM diI でトレースを使用できます。CM diI 鼻カプセル 0.3 M ショ糖で準備の 0.5 mg/mL の溶液を注入するプロトコル 2 (下記参照) に従います。CM diI の作成、保管については、 16を参照してください。プリンシパルの空洞から染料の流出を最小限に抑える必要があります。この目的に射出圧力とマイクロ ピペットの開口部を変更する必要は。嗅球の糸球体層のレベルで蛍光 CM diI の適用後明白な 24 h になります。現在の仕事は CM diI とラベリングを使用して切除プロシージャを証明するだけでただし、このメソッドは、従来の組織学的プロシージャを使用して嗅糸球体の形態の情報を取得するも使用できます。
- 動物を回収タンクに転送します。オタマジャクシは、手術を受ける動物の ~ 1% で予想される出血の存在を注意してください検査実行 〜 10 分以内通常スイミングを回復するべき。
- 0.2 %222 MS ソリューションで負傷した動物を安楽死させます。
2. 蛍光カルシウム指示薬と嗅覚受容ニューロンの分類
- 12% を含む溶液を調製カルシウム グリーン 1 デキストラン (材料の表を参照)、0.1% トリトン X-100, と 1 mM NaCl17。それはヶ月以内に使用することは場合、-80 ° c または-20 ° C でソリューションを格納します。
- ガラス ピペット先端開口部 〜 1-2 μ m (パッチ ・ クランプ実験用電極によく似た直径) を備えるマイクロインジェクション ピペットの引き手を使用して (材料の表を参照してください)。
- 薬剤の量を調整します。0.15-0.3 の注入量を得るために圧力と注入時間を調整、蒸留水を使用して μ L。
注:簡単な手順は、満ちている水 1 μ L ピペットを空にするために必要なパルス数をカウントで構成されます。代表的なパラメーターは、30 psi と 50 ms の噴射時間の圧力です。 - ガラスシリンジでピペットを置き、カルシウム グリーン 1 デキストラン溶液の 〜 2 μ L でそれをロードします。
- 手順 1.1 から 1.6 オタマジャクシを準備します。
- ピペットの先端を鼻腔カプセルの主腔に移動します。
注:図 2Aアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の場所を記述するを参照してください。 - 2.3 で得られた設定を使用して、パフのカップルを提供します。鼻のカプセルに色素の存在を制限します。
- パスツール ピペットを使用して 2-3 分の残りの部分、乾燥を避けるために動物のより尾側の部分に 0.02% MS 222 溶液の滴を注ぐオタマジャクシをしましょう。
- 動物を回収タンクに転送します。
注:それは通常スイミングを回復する必要があります 〜 10 分以内動物の操作は、損傷を引き起こす可能性があります。 - 0.2 %222 MS ソリューションを使用して注入後 15 分の通常の遊泳行動を回復しないオタマジャクシを安楽死させます。
- 投与後日の嗅球糸球体層のレベルで蛍光を観察します。
3. オタマジャクシのシナプス応答のライブ イメージングのための準備
- 実験を行う前に 24-48 h コート シリコーン ・ エラストマー (例えば、Sylgard) で直径 35 mm の 4-6 シャーレです。エラストマーが重合すると、一旦タドポールに合わせて長方形の井戸を作製します。
注:NF ステージ 48-52、 X. tropicalis幼生の典型的な寸法が 10 mm × 4 mm です。 - オタマジャクシの嗅覚刺激として 1 mM アミノ酸溶液に 160 μ M の 100 mL を準備します。ソリューションは、いくつかのアミノ酸の混合物を含むことができます: メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン。アフリカツメガエルリンゲル液、mm で構成されるアミノ酸を希釈: 2, 塩化ナトリウム 100 KCl、1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 グルコース、10 HEPES、240 の mOsm/kg、pH 7.8。PH は 7.8 で維持されますを確認します。
- アミノ酸溶液 20 mL で昇格した貯水池を埋めます。ポリエチレン タンクを接続 28 G のキャピラリー チューブにチューブ (材料表参照) 鼻のカプセルの上に配置します。
注:マイクロマニピュレーターのキャピラリー チューブをマウント (材料の表を参照してください)。空気の泡は欠席する必要があります血流システムから。 - ピンチ弁 (材料の表を参照してください) のトランジスタ-トランジスタ ロジック (TTL) コントロールを使用してアミノ酸ソリューションを適用することで時間的な精度を実現します。刺激物を使用して、TTL パルス (材料の表を参照) を生成します。TTL パルスの持続時間を変更することによって嗅覚ソリューションを提供する時間の精度をチェック、すなわち.、 0.1 を 1 s。
- もう一つ高架リザーバーをアフリカツメガエルリンガー液 100 mL で。
- オタマジャクシの麻酔し、切り裂くスコープ (1.1 から 1.6 のステップ) の下に置きます。
- イメージングのオタマジャクシを準備します。アルビノのオタマジャクシが利用できる場合は、3.9 の手順に進みます、イメージング (ステップ 3.8) を損なうメラノサイトが含まれているためそれ以外嗅球上のスキンを削除します。
注:動物の色素沈着によって実験を実行する 2 つの方法があります。アルビノの動物を使用することをお勧めします。アルビノX. tropicalisラインは、最近 CRISPR Cas9 12または TALENs18によって生成されているし、 X. laevisのアルビノ系統があります。 - Vannas はさみを使用して、中枢神経系の端にオタマジャクシ皮膚に横切開を作る。嗅球と視神経の位置によって簡単に識別ことができます蓋の位置に届かないレベルで切口を作りをすべきであります。
- カットをピンセットを用いて皮膚をピンチし、神経系を引きます。嗅球上のメラノサイトの不在によって削除の成功を確認します。パスツール ピペットを使用して 0.02 %222 MS ソリューションの注ぐことの低下によって動物の潤いを保ちます。
- 塗の皿のウェルに、オタマジャクシを配置 (材料の表を参照してください)。動物の上高真空グリースをコーティングしたガラス基板を置きます。尾の先端に蓋の上部をカバーする coverslip を位置します。
- 嗅球と上板残る細胞外媒体に露出していることを確認します。イメージ投射の間に不動、オタマジャクシを保ちます。アフリカツメガエルリンゲル液 solutioncontaining 100 μ M ツボクラリンでペトリ皿を埋める (参照材料表) 筋収縮を防ぐために。
注:ツボクラリンは、-80 ° c は、もはや 6 ヶ月以上因数に格納されます。 - 正立型顕微鏡下でおたまじゃくしを持って料理を配置します。生きている動物を維持するアフリカツメガエルリンゲル液の持続灌流のポリエチレン チューブ (材料の表を参照) を使用して料理アフリカツメガエルリンゲル液を含む貯水池を接続 > 1 h。
注:ミニ磁気クランプ (材料の表を参照してください)、安定して皿にチューブを接続する非常に便利です。灌流・吸引チューブは、~ 180 ° の角度にある必要があります。 - アフリカツメガエルリンゲル液灌を開始します。実験を通して料理定数のソリューションのレベルを維持します。継続的に血管を血液の循環を観察することによって幼生の生存率を評価します。
4. ライブ嗅糸球体の神経終末の Ca2 +変化のイメージング
注:イメージの作成手順はワイド フィールド顕微鏡用が簡単に取得設定を調整することによって共焦点顕微鏡に適応することができる.イメージングは、正立型顕微鏡マウント防振テーブルの上で実施されなければなりません。
- 低倍率の目的でオタマジャクシを視覚化する 5 x など。
- 嗅神経と 90 ° の角度を形成鼻の 1 つのカプセルの上に匂いのソリューションを提供する毛細血管を配置するマニピュレーターの軸を移動します。匂い嗅球上のソリューションのフロー イメージングを歪める乱れが生じるために避けるべきであります。
- 高倍率、長作動距離 (刺激) を受ける鼻カプセルに同側にある嗅球水浸対物レンズを見つける: 0.9 60Xx エヌ ・ エイ
- 蛍光性の放出を目で確認します。糸球体の構造は明らかである (図 2B) をする必要があります。
- カルシウム イメージングに適したカメラでライブ集録を実行します。全体嗅球、通常 256 x 256 または 512 x 512 のピクセルを含むボックスを定義します。セット取得フレーム率獲得に 20-40 Hz. 基底蛍光の値は彩度の ~ 20%、ゲインを調整します。5 s ビデオを取得します。
- 映画を視覚化します。画像のフォーカス、アーチファクトと飽和ピクセルを含む領域がないことを確認します。16 ビットのカメラを使用している場合、糸球体領域の一般的な蛍光値は 5,000-20,000 a.u. のはずです。撮影条件が最適な場合は、次の手順に進みます。画像の品質を改善したり、ゲイン設定を調整する必要が場合は、4.6 のステップを繰り返します。
- 嗅覚刺激によって誘発される応答を記録するタイムラプス集録を開始します。
注:匂いソリューションの正確なアプリケーションは、TTL の刺激によって制御されます。典型的な実験 4 のベースラインの期間が含まれている s、0.1 から 0.5 まで回刺激に続いて s と 6-10 s の回復期間。 - 時間間隔で匂いの反復的な刺激を実行 > 2 分が 1-1.5 mL·min-1に流量を設定します。グローバルの灌流はすべて実験中には、ローカルで適用されるアミノ酸が色あせています。
注:皿の中の溶液の体積は 〜 3 mL です。 -
画像解析
- 応答の検出
- ImageJ にムービーをエクスポートします。
注:目標は糸球体領域の刺激への応答の存在を検出します。 - ΔF/F0映画に蛍光画像の raw のシーケンスを変換します。次の関係によると基底の蛍光性の相対的な変化を測定: (F F0)/F0F0が蛍光のベースライン レベルを示します。
- 周辺刺激の間に推定される蛍光の増加を示す利益 (率 ROI) の領域の描画し、ROI マネージャー (図 2E) 内の位置を記録します。糸球体の構造に欠けている領域のバック グラウンド蛍光レベルを検出する投資収益率を描画します。
- ImageJ にムービーをエクスポートします。
- 反応の定量化。
- 蛍光画像の raw のシーケンスに定義された Roi を配置します。各フレームの選択した Roi の平均グレー値を取得します。解析プログラムに得られた値のシーケンスを転送 (例えば.、イゴール プロ)。
- バック グラウンド蛍光を引くし、各投資収益率 (図 2 f) の ΔF/F0変更を計算します。選択・ ロワのそれぞれの ΔF/F0の増加をプロットします。(刺激) の前に基底の ΔF/F0の標準偏差を計算します。
注:肯定的な反応は、ΔF/F0の増加中に得られた刺激が基底値の標準偏差は 2 よりも大きいと見なされます。
- 応答の検出
5. 嗅覚に基づく行動分析
注:分析を実行するためのセットアップの図は図 3に示します。
- 6 よく料理の各井戸の上部に 1.57 mm 外径 x 内径 1.14 mm チューブに合うように小さな穴を作る。チューブを挿入し、エポキシ樹脂接着剤を使用して密封する (材料の表を参照してください)。
注:変更された料理再利用できる何回も蒸留水で徹底洗浄後。 - メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン (詳細については手順 3.2 参照) を含むアミノ酸溶液 50 mL を準備します。濃度の範囲は 160 μ M から 1 mM です。高架タンクに溶液 20 mL を配置します。
- アッセイの前に少なくとも 12 時間のオタマジャクシを与えないでください。彼らの住宅のタンクから 6 オタマジャクシを取るし、2 L きれいなオタマジャクシ水の匂いへの露出を最小限に抑えるために配置します。
- 白 LED transilluminator (図 3) に変更された 6 井戸皿を置きます。
- 灌流の入り江を含む多様体を用いたアミノ酸液貯留層にカップル (材料の表を参照してください)。灌流システムをチェックし、空気の気泡を除去します。同時に 6 の井戸を埋めます。≥5 〜 30 内臭気物質溶液の mL の配信を許可する貯留層の高さを調整する s。
注:匂いソリューションへの暴露後 4 回も二重蒸留水でそれぞれを洗ってください。 - 塗りつぶしは各おたまじゃくし水 10 mL とよく。場所 1 オタマジャクシ/ウェル。残りの部分を残す > 3 分。
- 画像の取得を設定します。≥5 hz 接続コンピューターにカメラでの画像を取得することができます従来の CCD カメラを使用します。ここでは、禅のソフトウェアによって制御されるツァイス MRC5 カメラを使用して、他の同等の構成を使用できます。フレーム レートを増加する必要がある場合、は、ピクセルビニングを適用します。画像全 6 よく料理が表示されます。
- その映画を含む基底画像集録を開始 (30 s)、刺激 (25-35 秒) と回復 (30-60 s) 期間。
- イメージング後、動物を 6 井戸皿からタンクに戻ります。
- ImageJ 運動に関連付けられている複数のパラメーターを提供する wrMTrck19,20などのプラグインを使用しての映画を分析します。
- 分析用の画像の準備、まず 35 mm × 35 mm (図 4A) の長方形の投資収益率を描画することによって井戸を選択します。シーケンス全体の最大の投影を計算することにより、背景画像を取得します。タドポールせず井戸のイメージが表示されます。
- 生ムービーから最大投影を減算します。生成された 32 ビット映画に対して閾値処理を行い wrMTrck プラグインを適用します。動物の動きを確実に追跡する WrMTrck パラメーターを調整します。転送得られた解析プログラムに X、Y 座標します。
- 使用する X と Y 座標は、次の式を適用することによって嗅覚ソース (井戸の灌流入口) までのユークリッド距離を計算します。
os は、臭気発生源の位置を示す、少しは特定の時点でオタマジャクシの位置を示します。詳細は、図 4Aを参照してください。
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Representative Results
本稿で提案する体内のアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムの機能の研究を実行する 2 つの相補的アプローチの組み合わせ: 私) 生活の糸球体におけるシナプス前 Ca2 +のイメージング手法を変更オタマジャクシ蛍光カルシウム インジケーター、および ii を使用して) 匂いは特定の水系匂いへの反応を調査するため行動のアッセイを導かれます。嗅覚情報処理を傷害10後の回復を評価するこれらのアプローチが採用されているので嗅覚神経を transecting のための簡単な方法についても述べる.
嗅覚経路の断裂アフリカツメガエルオタマジャクシ
プロシージャの妥当性を証明する 2 つの方法があります。両方は蛍光レポーターを使用して嗅覚神経の可視化に依存します。1 つの方法は、彼らの神経系の蛍光蛋白質を表現する遺伝子組換えオタマジャクシに基づいています。神経 β-チューブリン プロモーター下に GFP を表現する 2 つの推奨される線がX. laevis tubb2b GFP、 X. tropicalis NBT GFP (図 1表の資料を参照してください)。CM diI を使用ことができます野生の種類の動物が利用可能な場合にのみ (1.8 の手順を参照してください)。Tubb2 GFP X. laevisオタマジャクシの画像を図 1に示します。画像単一嗅神経が離断された 4 つの異なる動物からです。カットは郭清範囲の下で明らかにする必要があります。形質転換線を使用しての利点は、嗅神経の改革が期間にわたって続くことができることです。経時的観察を行うときは、光損傷を防ぐために蛍光灯の光への露出を最小限に抑えることをお勧めします。単一嗅神経の区分は、内部統制が必要、例えば、通常開発対配線糸球体のユニットを比較する場合に役立ちます。両方の嗅神経の断面は、目的は完全に情報の伝達を抑制するとき適用されます。
嗅覚刺激に対するシナプス応答のライブ イメージング
カルシウム グリーン 1 デキストランと ORNs の正しい表示は、広視野顕微鏡を用いた (図 2A) 嗅球のレベルで観察できます。糸球体は明らかである (図 2B)、焦点面を移動することによってさまざまな層で分散が表示されます。糸球体の構造の形態より解決できる共焦点顕微鏡を代わりに使用する場合 (図 2C)。ラベルの付いた糸球体の数は、嗅上皮のレベルで染料の通風管に依存します。したがって、この手順はすべての糸球体ユニットの可視化を許可しません。糸球体領域の汚損のより強い蛍光を示す動物より多く ORNs ラベルが含まれているので、撮像実験を実行する前に選択してください。この作戦は実験的スループットを高めるためにお勧め、蛍光ランプ搭載切り裂くスコープで実行する必要があります。ラベルの付いた糸球体ユニットを表示しないまたは糸球体層の特定の領域に制限されて蛍光を示す動物を拒否します。神経終末の Ca2 +応答は色素負荷後 1 日目すぐに観察できます。イメージング実験を遂行するため高開口数、通常 ≥0.9 の目的を使用することをお勧めします。
アミノ酸 ORNs の樹状のノブを公開するシナプス カルシウム濃度の増加を誘発することができます。鼻のカプセルの上匂いソリューションを提供する毛細血管を配置することが重要です。キャピラリーの先端を詰まらせる ORNs の機械的刺激を引き起こすことができるため、接触を避けるために注意する必要があります。前シナプス カルシウム レベルの一時的な増加は刺激 ≥0.1 s (図 2D) 観察することができ、正しい嗅覚伝達を示唆しています。また、低いカメラのゲインと基底のカルシウム レベルを可視化することが重要です。ORNs の神経終末が高い蛍光の増加を表示、信号の飽和を避けるために不可欠であります。広視野顕微鏡を用いた高時間分解能を実現できます。たとえば、電子乗算の CCD カメラを使用して、それは 50 の Hz のフレーム率を達成するためにも高いです。共焦点顕微鏡の使用時間分解能を減少、糸球体構造のより良い定義をことができます。
緑のカルシウムのカルシウムをバインドするための高い親和性 (190 nM)、小さな反応の検出に特に役立ちます。糸球体層で検出された一時的な細胞内カルシウム増加は、変数です。糸球体の一部の地域は ΔF/F0 ≥0.2 の変更を表示する隣接プロセス可能性があります (図 2D) も答えないし、。糸球体の単位の応答の変動要因: i) ラベルの付いた糸球体、ii) 緑、カルシウムの細胞内濃度とアミノ酸を検出する ORNs iii) 性の全体的な数。低すぎるラベル糸球体数は、反応を観察することを妨げる可能性があります、ので、動物の多くは可能な限り ORNs をラベルを含むとこれらの実験を遂行するために不可欠です。
嗅覚に基づく行動
データ分析
オーダーメイドのシステムを使用して、嗅覚に基づく行動を検討しました。試金を遂行するための装置の略図を図 3に示します。テストは、匂いとしてアミノ酸の存在を検出するオタマジャクシの能力に基づいています。5 アミノ酸 (メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン) を組み合わせたソリューションは、刺激に使用されます。ソリューションはローカル中 30 配信も自由遊泳型幼生を含む 35 mm の s。オタマジャクシの着信ソリューションへの即時応答運動性の増加であります。ソリューションのアプリケーションの最初の ∼5-10 s の中に発生するランダムな動きは、匂いの源に向かって直接水泳が続いています。オタマジャクシはアミノ酸の配信中にノズル付近か、数秒間残るし、(補足動画 1、2参照) ランダムな方向に運動を徐々 に回復します。
説明実験条件が許せばX. tropicalisオタマジャクシ ステージ 48-52; 通常泳ぐしかし、それを考慮して 35 mm 井戸のより大きい動物の運動性を制限される場合が、計算する必要があります。オタマジャクシの動きは、CCD カメラで記録されます。嗅覚のソリューションのための魅力は、オタマジャクシの位置 (図 4) から血流口を分離するユークリッド距離の削減として検出できます。35 mm × 35 mm (または同等のサイズ (ピクセル単位)) の領域内のおたまじゃくし頭の位置の追跡は、嗅覚に基づく行動 (図 4A) の定量分析を得ることができます。おたまじゃくし動きの個々 のプロットは、画像解析 (図 4B) によって得られた X と Y 座標を使用して構築されます。抽出された運動のプロットは、映像を忠実に再現する必要があります。
嗅覚に基づく行動実験の解釈の 2 つの方法があります。最初のアプローチは、zebrafishes21を使用して以前の研究に触発されています。匂いを提供するノズル近傍の時間の測定は、肯定的な親和性の存在を証拠します。動物の嗅覚ソース (図 4 a、4 C) への近さの分類に使用液入口を中心に 8.75 mm 半径 (井戸の直径の 1/4 に相当) の関心領域。定義された期間、すなわち15 の間隔中、ノズル近傍のオタマジャクシで過ごした時間のビニング アミノ酸ソリューション (図 4D) を検出する機能を識別することができます。オタマジャクシの人口の全体の動作は、個々 のデータ (図 5A) の分布をプロットすることによって得ることが。1 mM または 160 μ M (図 5 aと5 b)、メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジンのソリューションが準備されるとき、肯定的な親和性を検出できます。動物は水のアプリケーション (図 5C)、従って機械受容機構の参加を破棄には応答しません。ダンの多重比較とノンパラ メトリックの反復測定 ANOVA を使用して各実験群で定義されている間隔を確立ことができます時間の違いをテストします。15 の時間間隔でデータをビニングの不利な点 s は時間分解能が低下します。
行動反応の時空間情報を増加させる方法臭気発生源からのユークリッド距離の平均のプロットを作ることです。オタマジャクシの動きを示す本質的な可変性、動物 (通常 ≥40) の人口の平均の運動は、嗅覚に基づく行動を示しています。この分析を実施するには、グループ刺激のオンセットの前に動物の位置する必要は。オタマジャクシは別の場所で発見されて匂いソリューションを井戸に入るので (図 6A、参照図 7の包含の規準) 刺激の前にちょうど 0 にユークリッド距離を設定する必要があります。負の値と正の値したがってそれぞれアトラクションや臭気発生源から反発に示します。回帰係数 ≥0.9 と線形フィットで悪臭のための魅力をよく説明すると。水が配信される場合、ユークリッド距離の増減が 0 の周り分散し、嗅覚刺激、嗅覚に基づく行動 (図 6B) の不在を示すため中線に合うように不可能です。1 mM、160 μ M で作製したアミノ酸ソリューションのためのユークリッド距離の平均のプロットの比較は、導かれる嗅覚応答 (図 6 aと Cの比較) に異なる遅延をお勧めします。アミノ酸が高濃度で適用されて、匂いの源に向かって移動を開始するために必要な時間間隔が短い。嗅覚に基づく行動の欠如は、両方嗅覚の神経離断 (図 6D) とオタマジャクシで観察されます。
説明ガイド付き嗅覚行動アッセイの制限は、複雑な流体プルームの施設です。これは、システムのセットアップ時、アミノ酸ソリューションが高速グリーンなどの色素と置き換えられる場合に見ることができます。カラー ソリューションの使用を検証します羽毛の形成と水系の匂いもソリューションの提供による 5 s. 乱れ以内の任意の領域に達することを示していますオタマジャクシ側線によって検出される可能性が高いにおそらく貢献動物運動に変動がみられるが、嗅覚ガイド動作に干渉しません。アミノ酸ソリューションの代わりに水を用いて制御実験では、オタマジャクシが機械的刺激から嗅覚を識別することができることを明らかにします。興味 (図 5) の地域と (図 6) のユークリッド距離の平均のプロットにかかる時間の推定は、オタマジャクシの導かれる嗅覚応答を記述する 2 つの相補的な方法です。
選択基準
基準は、データ解析のためのアカウントにも撮影する必要があります。いくつかのオタマジャクシは、正弦関数 (図 7A) までのユークリッド距離のプロットの継ぎ手によって示されている共鳴運動を表示します。すべての分析からこの動作を表示するオタマジャクシを捨てなければなりません。
匂いソリューションのアプリケーションの開始時が最大に動物の排除 (> 30 mm図 7B) または最小ユークリッド距離 (< 5 mm、図 7C) ノズルから可変性を減らすことができます平均のプロット。図 7Bに示した例は、アミノ酸のソリューションのための肯定的な親和性を示しています。タドポールは刺激の発症時液入口の最大距離であります。したがって、この相対位置は、臭気発生源のための魅力を明らかにできるだけ。図 7Cは、逆の状況を示しています。ここでは、オタマジャクシはアミノ酸ソリューションを提供するノズルを離れたです。臭気発生源近くの時間の定量化を示す応答 (図 5で使用される方法);ただし、入口に向かって網の動きを表示できません。
要約するでは、嗅覚に基づく行動の提案のアッセイは、バイナリのテストを定義します。このメソッドは、匂いに応答するオタマジャクシの実験群の能力を検出する使用できます。さらに改善が必要な場合は目的として確立しています複雑な導かれる嗅覚応答の違いなどの設定を決定する悪臭。
図 1:嗅覚神経の切除します。Tubb2 GFP X. laevisオタマジャクシ単一嗅神経 (矢印) の切除後に得られる代表的なイメージ。Tubb2 GFP オタマジャクシの神経は、強い蛍光を表示します。神経断裂は手術 (D0) 後すぐに明らかです。嗅神経の再生は、カット (D4) 後 4 日間明らかです。手術後 8 日 (D8) そこはコントロールと改良された神経の少しの違いです。オタマジャクシが 0.02% に麻酔された MS-222 の画像を収集します。嗅球 (O.B.)、嗅神経 (O.N.)、鼻カプセル (ノースカロライナ州)、蓋 (Tec)、視神経 (Op.N)。矢印は、切断の神経の位置を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: カルシウム緑デキストランとアミノ酸刺激シナプス前性カルシウム流入の可視化と嗅覚受容ニューロンのラベルします。(A) 感染嗅上皮、嗅神経、嗅球の糸球体層の場所を示すオタマジャクシのイメージが明るい。(B) 広視野 (wf) 顕微鏡で可視化した嗅球のイメージ。ニューロンは、鼻のカプセルでカルシウム グリーン 1 デキストランのアプリケーションでラベル付けされました。蛍光観察は、糸球体を形成する嗅覚受容神経細胞からシナプス前ターミナルに対応します。臨時雇用者: 嗅神経;O.B: 嗅球。(C) 共焦点セクション嗅神経のエントリから電球に背側に位置します。嗅糸球体のシナプス前の部品は使用してラベル付けカルシウム グリーン 1 デキストラン、B のように)。(D) 神経終末は一過性、嗅上皮の 5 種類のアミノ酸を含むソリューションへの露出に体内のカルシウム量を増やします。前に、・中・後 1 秒の刺激を得られるカルシウム蛍光の相対的な変化は。(E) 興味 (ROIs) ΔF/F0の変化を定量化するために使用の 10 の異なる地域の分布。ROI11 は糸球体層の外は、蛍光のバック グラウンド レベルを定義するために使用します。(F) 個々 の ΔF/F0レスポンス ・ ロワ E で定義されているため)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:嗅覚に基づく行動アッセイ。(A) 図は、テストで使用される装置を示します。(B) の例で運動トラックの記録以上 90 s。各サークルも含む単一動物を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 嗅覚に基づく行動の追跡します。(A) 例の行動の分析のために使用されるも。青の点線は、X、Y 座標 (mm) で (また見なさい補足ビデオ 1) おたまじゃくしの動きを追跡するために使用の場所を示します。緑の楕円は、ソリューション導入口の位置を表します。黒の点線がアミノ酸ソリューションを提供する管近位領域を示します (詳細は本文を参照してください)。(B) A に示すように幼生の運動) 行動のアッセイ中。色分けされたトレース (グレー) の前に動物の位置を示す、嗅覚刺激 (バイオレット) の後。匂いソリューションのアプリケーション中の動きは一時的な色のグラデーション (30 s、赤、青) で示されます。(C) を使用して X、Y 幼生ポジションそれがオタマジャクシの頭から血流の入口までのユークリッド距離の変化を計算することが可能。8.75 mm より短い距離は、ノズルの近位領域に対応しています。(D) プロット A の点線によって定義される領域でオタマジャクシにかかった時間とする)。各ドットは、15 秒の期間を示します。動物は嗅覚ソリューションによって引き付けられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: オタマジャクシがアミノ酸に惹かれます。(A) 時間臭気発生源近傍のオタマジャクシ。各ビンには、15 秒の期間が構成されています。ボックス プロットは、中央値 (黒いライン)、25 ~ 75% 四分位数 (箱) とデータの範囲 (ひげ) を表します。1 mM アミノ酸ソリューションの提供は、臭気発生源にオタマジャクシを集めました。(B) オタマジャクシは、アミノ酸の濃度が 160 μ M に下がったときに嗅覚ソリューションに魅了されました。(C) 水の配達は、動物の行動を修正しなかった。反復測定 ANOVA ダンとの多重比較検定、p < 0.05 です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 匂いにオタマジャクシの時間応答。(A) 平均時間の関数として臭気発生源までのユークリッド距離のプロット。ユークリッド距離は、それぞれ個別のトレースで刺激する前に 0 に設定されました。正および負の値は、それぞれ減少と臭気発生源までの距離の増加を示します。線形フィットで臭気発生源への魅力を記述できる (r2= 0.98)。(B) 水の配達では、臭気発生源までの距離は変更されません。線形フィットによって明らかにされた、(C) オタマジャクシはアミノ酸の 160 μ M ソリューションのアプリケーションに対応 (r2= 0.96)。(D) 両方の嗅神経離断とオタマジャクシは、アミノ酸には応答しません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 嗅覚に基づく行動の試金のための包含の規準。(A) いくつかのオタマジャクシを共鳴運動。この現象は、臭気発生源までのユークリッド距離のプロットに正弦波関数の成功したフィットで明らかです。このアクティビティを表示するオタマジャクシは、テストから除外すべき。(B、C)匂い (図 6) 平均の時間応答の可変性を抑える方法が最大 (B) または刺激の発症時の最小 (C) ユークリッド距離に位置する動物を除くことです。赤の点線は、しきい値 (30 mm や 5 mm) を示しています。ユークリッド距離刺激 (矢印、左のプロット) の発症が報告する「0」に設定されて前に魅力的または冷淡な行動として負または正の値 (右のプロット) をそれぞれ値します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補助ビデオ 1: アミノ酸ソリューションの提供によってトリガーされる嗅覚誘導動作します。映画は、35 mm も自由に泳いでオタマジャクシを示しています。青色の楕円は、嗅覚のソリューションを提供するノズルの位置を示します。発症と刺激の終了は、それぞれ緑および赤の点で示されます。図 4は、観測された挙動の解析を示しています。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
補助ビデオ 2: 水の配信中にオタマジャクシ運動。映画は、35 mm も自由に泳いでオタマジャクシを示しています。青色の楕円は、MQ の水を放出するノズルの位置を示します。発症と水配達の終わりは、それぞれ緑および赤の点で示されます。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
リビングで嗅覚経路の機能を調査するために役立つ手法について述べるアフリカツメガエルのオタマジャクシ。現在のプロトコルはアフリカツメガエル; へのアクセス、仕事、またはそれらの研究所にとって特に便利しかし、神経細胞の再生と修復の細胞および分子基盤を調査しているそれらの研究のための興味深いですも。アフリカツメガエルで得られた結果は、されるメカニズムを識別するためにその他の脊椎動物モデルで収集したデータを結合できます。説明する方法便利な遺伝子組み換えアフリカツメガエル18,22,23の開発、オタマジャクシ24、神経系疾患の実験モデルに適用できます。 25。
再現性の高い生体内でデータを取得するためには正しくアフリカツメガエルのオタマジャクシをリアにキーです。特に、 X.tropicalisは、貧しい住宅事情に非常に敏感です。たとえば、彼らは 20 ° C 以下の温度を容認しないし、タンクまたは 24 に 28 ° C の範囲での水システムとしなければなりません。また、設立の制限上記の動物の密度を高める、定期的にオタマジャクシをフィード、最適な水品質13を維持することが重要です。次の標準化された条件動物のコロニーの管理は、生体内の実験の再現性を得るために絶対に必要です。
カルシウム イメージング法の説明は ORNs の正しい嗅覚の伝達を検出する便利な生体内で。カルシウム グリーン 1 デキストラン ORNs の荷は、以前に報告した17としてトリトン X-100 の低濃度を用いた細胞膜の過渡透過によって実現されます。マイクロだけで済むために、この載荷方法の主な利点はシンプルさです。重要な欠点は、トリトン X-100 が嗅線毛と微絨毛の一時的な除去を引き起こすことです。治療17後 48 時間以内ゼブラフィッシュ嗅覚の上皮が再生されます。アフリカツメガエル幼生の再生は匂いに反応染料のローディング (図 2D) 後 1 日目に観察できるのでさらに高速かもしれない。ただし、詳細な形態学的分析はトリトン X-100 治療後嗅上皮の再生時間を正確に見積もる必要があります。
カルシウム グリーン 1 デキストラン ORNs ラベルのみ高い信号対雑音比 (図 2 bおよび2 C) と神経終末の視覚化を許可するニューロンの集団で有効です。背景のほぼ完全な欠如は、全体の嗅球からの読み込みするカルシウム染料の AM エステル フォームと比較すると有利です。蛍光 ORNs の数が異なる動物から動物へ。したがって、いくつかのアミノ酸の広範な嗅覚刺激を使用する必要は。メチオニン、ロイシン、ヒスチジン、アルギニン、リジンのソリューションを使用して成功した結果を得た。他の種類のアミノ酸の組み合わせは、効果的な可能性があります。カルシウム指示薬を ORNs に読み込む方法はエレクトロポレーションです26、オタマジャクシ ニューロン27の遺伝的コード化蛍光レポーターを表現するために用いられています。エレクトロポレーションを行うことができます商業またはカスタムメイド機器を使用でき、優れた信号対雑音比28神経構造の可視化。説明のアプローチと同様に、ラベルのセル人口は異種と動物から動物を異なります。遺伝子導入目的はニューロン22の定義された人口を調査している場合お勧めします。たとえば、ORNs の制限されたグループの GCaMPs など遺伝的コード化カルシウム指標の式を運転、匂いに神経終末の定義された一連の応答を調査するために非常に有用かもしれない。
カルシウム グリーン 1 デキストランを使用して記述されているメソッドは、シナプス前ターミナル機能を報告します。細胞内カルシウム増加の観察は正しい嗅覚伝達と糸球体レベルでグルタミン酸の放出を表しています。蛍光の変化の定量的解析は、しかし、限られました。シナプスの刺激は、マイクロモルの範囲に細胞内カルシウム レベルを増加させるし、親和性の高いカルシウム インジケーター緑のカルシウムなどの飽和を考慮する必要があります。図 2に示されている結果を取得するには、広視野顕微鏡を用いたします。これは最も簡単な方法は、ほとんどの実験室で実装することができます。2 光子顕微鏡による改善または遺伝的コード化蛍光レポーターはシナプス前機能のより多くの量的な見積もりを取得できます。
カルシウム応答のライブ イメージングは、嗅覚のソリューションを提供する毛細血管の適切な位置があることが重要です。それは鼻のカプセルの上にあるべきであるし、常に組織との直接接触を避けます。匂いソリューションの正しい配信と、血流の流れの両方は、顕微鏡下でオタマジャクシを配置する前にチェックしなければなりません。灌流に使用されるすべてのチューブは、空気の泡を点検しなければなりません。アミノ酸溶液の流量の変化はすぐに連続の電磁弁の開閉に対応する必要があります。遅延は、空気の存在を示しています。正しいボリュームが増加または減少ソリューションの配信開始時間を変更した後のチェックにお勧めもすなわち.、 0.1 から 1 s またはその逆に s。退色を最小限にするため、実験的パラメーター (ステップ 4.6) の設定中低照度を使用します。
オタマジャクシの生物学における嗅覚の重要性は十分に確立された29が、アフリカツメガエル幼生の嗅覚に基づく行動を直接テストの欠如があります。このペーパーで説明する方法は、動物の大規模な人口で臭気刺激への応答の検出を可能にする簡単なテストです。水の化学薬品の存在のためウシガエルのオタマジャクシの嗅覚感度の最近の記述は、モーター動作30に嗅覚を結合する複雑なメカニズムを示しています。このホワイト ペーパーで説明アッセイでは、オタマジャクシの嗅覚に基づく行動の本質的な変動が考慮されます。単一の井戸ではなく 6 よく料理の使用は、実験のスループットを向上します。変動の要因このような基底運動、灌流入口と立ち上る匂いソリューションによって生成された相対位置は多くのオタマジャクシを平均することによって克服します。約 40 の独立した測定は、アミノ酸のコントロールの魅力的な応答を記述する必要があります。
嗅覚テストの 2 種類の分析を提案する.最初のアプローチは、定義された期間にわたって臭気発生源近く時間を定量化します。それは特に統計分析のために適しています。2 番目のアプローチは、臭気発生源からのユークリッド距離の平均のプロットに基づいており、ニオイの時間応答を記述すると便利です。両方の種類の分析の相補、同じデータによって生成された来る。解釈はバイナリとにより、特徴的な動物はなく、10人からその感覚の匂い。
アフリカツメガエルのコミュニティに説明する方法をどのようにお役に立ちますか。メソッドが野生型動物のため本質的に示されているが、それは遺伝的可能性がアフリカツメガエルにおいて継続的に拡大しているアカウントに取られるべき。体内の ORN の応答の考察を兼ねてや嗅覚に基づく行動の存在はアフリカツメガエル変異体前方または逆引き遺伝スクリーンされた嗅覚情報の正しい処理を調査する非常に有用なも可能します。11. カルシウム イメージングと行動のアッセイによって提供される情報を組み合わせることができます。たとえば、嗅球の顆粒細胞に選択的に影響を与える突然変異は ORNs のシナプス応答を修正だろうがおそらく嗅覚に基づく行動を損なうでしょう。
生体内で細胞・行動反応を関連付ける方法は特に神経回路の遺伝学的解析です。結果の解釈は、オタマジャクシ31糸球体層の解剖学的な地図を提供している以前の形態学的作品で支援できます。アフリカツメガエルのオタマジャクシの32の嗅球スライスから得られる情報は非常に貴重なも。嗅球スライスの僧帽細胞のカルシウム イメージングは異なるアミノ酸33 ORNs の感度や関連性の例としては、アフリカツメガエルのオタマジャクシの嗅覚処理の基本的な特性を明らかにしました。嗅覚情報7符号化における反応潜時。ただし、脳スライスは、数多くの神経細胞突起の断面により異なる神経回路を関連付ける複雑な統合のメカニズムを再現する限られた容量を表示します。また、個々 の糸球体ユニットの特性の評価はまだ34γ 糸球体を除いてとらえどころのないです。単一の糸球体単位がオタマジャクシで特定の動作を決定するかどうかの質問は、遺伝学的ツール、生体内イメージング アプローチ行動アッセイを組み合わせることによってだけ答えたが。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、エル Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO; からの補助金によって支えられました。SAF2015-63568-R) M. G. F. Fuortes 記念フェローシップ、スティーブン ・ w ・ Kuffler 奨学基金、ローラ、アーサー Colwin 恵まれて夏研究奨学基金から競争的研究賞によって、欧州地域開発基金 (ERDF) を cofunded、フィッシュバッハ親睦と海洋生物学研究所の、国立アフリカツメガエル リソース RRID:SCR_013731 (森の穴、マサチューセッツ) この仕事の部分が行った偉大な世代ファンド。またセルサ プログラムに感謝/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ機関サポートのため。アダムローリーはセラ Húnter やつです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
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