Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Функциональная оценка обонятельных путей в жизни Xenopus головастиками

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus головастиков предлагают уникальную платформу для изучения функции нервной системы в естественных условиях. Мы описываем методологий для оценки обработка обонятельной информации в живых личинок Xenopus в нормальных условиях воспитания или после травмы.

Abstract

Xenopus головастиков предлагают уникальную платформу для изучения функции нервной системы. Они обеспечивают несколько экспериментальных преимущества, такие как доступность многочисленных изображений подходов, электрофизиологические методы и поведенческих анализов. Xenopus головастика обонятельной системы особенно хорошо подходит для изучения функции синапсов во время нормального развития или реформировать после травмы. Здесь мы описываем методологий для оценки обработка обонятельной информации в живых личинок Xenopus . Мы наметим сочетание в естественных условиях измерений Пресинаптический кальция ответов в клубочков обонятельные луковицы с обонятельных руководствуясь поведение анализов. Методы могут быть объединены с перерезка обонятельных нервов для изучения переоснащая синаптических подключения. Эксперименты представлены с использованием одичал тип и генетически модифицированных животных, выражая GFP репортеров в клетках центральной нервной системы. Применение подходов, описанных в генетически модифицированных головастиков может быть полезным для распутывая молекулярные основания, которые определяют поведение позвоночных.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Xenopus головастиками представляют отличную животных модель для изучения нормальной функции нервной системы. Прозрачность, полностью виртуализированного генома1,2и доступности методов хирургического, электрофизиологических и изображений являются уникальными свойствами Xenopus личинок, которые позволяют расследований нейронов в естественных условиях3 . Некоторые из нескольких экспериментальных возможностей этой модели на животных показано тщательного исследования головастика сенсорные и моторные системы4,5,6. Особенно хорошо подходит нейронной цепи для изучения многих аспектов обработки на уровне синапсов информации является Xenopus головастика обонятельной системы7. Во-первых, его синаптической связи четко определены: обонятельных рецепторов нейронов (ORNs) проект обонятельные луковицы и установить синаптических контактов с дендриты митрального клапана/тафтинговые клеток внутри клубочков для создания карты запах. Во-вторых его ORNs постоянно создаются нейрогенез на протяжении всей жизни для поддержания функциональности обонятельные пути8. И в-третьих, потому что Обонятельная сенсорная система показывает большой потенциал рекуперативного, Xenopus головастиками способны полностью реформировать их обонятельные луковицы после аблации9.

В этой статье мы описываем подходы, которые сочетают изображения обонятельных клубочков в жизни головастики с поведенческой экспериментов для изучения функциональность обонятельных путей. Описанные здесь методы были использованы для изучения функционального восстановления клубочковых подключения в обонятельные луковицы после Обонятельный нерв перерезка10. Данные, полученные в Xenopus головастиками являются представитель позвоночных, поскольку обонятельные обработка эволюционной сохраняется.

Описанные методы являются примером с помощью X. tropicalis , но они могут быть легко реализованы в X. laevis. Несмотря на больший размер взрослых X. laevisоба вида являются на удивление схожими стадии головастика. Основные различия находятся на уровне генома. X. laevis отображает бедные генетических уступчивость, главным образом определяется ее интрогрессии генома и долго поколения время (приблизительно 1 год). В отличие от X. tropicalis более пригодным для генетических изменений из-за его короче время генерации (5-8 месяцев) и диплоидных генома. Представитель эксперименты проиллюстрированы одичал тип животных и три различных трансгенных линий: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) и tubb2:GFP (X. laevis).

Методологии, изложенной в текущей работе должен рассматриваться наряду с генетической прогрессирует в поле Xenopus . Простота и простая реализация методы, представленные делает их особенно полезными для оценки уже описанных мутантов11, а также линии Xenopus порожденных ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технологии12. Мы также описания хирургическая процедура, используемая для трансектных обонятельные нервы, которые могут осуществляться в любой лаборатории, имеющие доступ к Xenopus головастиками. Подходы, используемые для оценки реакции Пресинаптический кальция и обонятельные руководствуясь поведения требуют специального оборудования, хотя доступен за умеренную плату. Методологии представлены в простой форме для содействия их использованию в научно-исследовательских групп и может установить баз более сложных анализов, либо путем реализации улучшений ассоциации с другими методами, т.е., гистологические или генетические подходы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры были утверждены Комитетом этике исследований на животных в университете Барселоны.

Примечание: X. tropicalis и X. laevis головастиков выращиваются в соответствии со стандартными методами13,14. Головастик вода готовится путем добавления воды, полученные путем обратного осмоса коммерческих соли (см. Таблицу материалы). Проводимость корректируется ∼700 МКС и ∼1, 400 МКС для X. tropicalis и X. laevis головастиков, соответственно. Личинки могут быть получены либо природных спаривания или оплодотворение in vitro14. Эмбрионы dejellied с 2% L-цистеина, подготовленном в 0.1 x Марк изменения Ringers (MMR). 1 x MMR содержит (в мм): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 ЭДТА, pH 7,8. Личинки переносятся после 2-3 дня (этап 25) 2 L цистерн с водой головастик. Когда головастиков достигают стадии 40 Nieuwkoop-Фабер (NF) критерии15, они помещаются в 5 Л танков и поддерживается на плотность 10 животных/л. температура остается неизменной на 23 – 25 ° C и 18 – 20 ° C для X. tropicalis и X. laevis головастики, соответственно. Животных, найденных на этапах 48 — 52 NF критерии используются для экспериментов.

1. перерезка обонятельных нервов

  1. Подготовить обезболивающим раствор 0,02% MS-222 в 50 мл воды головастика при комнатной температуре.
  2. Подготовьте небольшой бак (1 – 2 Л) с головастика воды, чтобы обеспечить возможность восстановления животных после операции.
  3. Разрезать прямоугольные куски качественный фильтр целлюлозная (4 см x 3 см, см. Таблицу материалы).
  4. Мокрые 2 бумажки целлюлозы качественный фильтр в 0,02% раствора MS-222 и разместите их под рассечения сферы.
  5. Выберите головастиков из бака и погрузите его в решение обезболивающим. Животное останавливается плавательный в течение 2-4 мин и не реагируют на механических раздражителей, применяемых на уровне хвост с помощью пинцета.
  6. Место наркотизированных головастика на прямоугольные куски бумаги. Позиция животное с его дорсальной стороной вверх, поэтому могут быть визуализированы структуры мозга.
    1. С помощью беззаботными ножницы (см. Таблицу материалы) вырезать одной или обеих обонятельных нервов (в зависимости от типа анализа осуществляться). Разрез одного нерва для экспериментов, которые требуют внутреннего контроля травмы нерва.
    2. Для поведенческой экспериментов разрез и нервы для того, чтобы подавить всю информацию одоранта, прибывающих в обонятельные луковицы. Эффективность секционирование обонятельных нервов может легко наблюдается рассечения сферу; Однако пигментации или животного позиции может сдерживающими факторами.
      Примечание: (Необязательно) Лучший способ удостоверять действительность процедуры с использованием трансгенных головастиков, которые выражают флуоресцентные репортеры на их нервной системы (см. Представитель результаты). С этой целью необходимо использовать рассечение область с флуоресценцией (рис. 1). Если одичал тип животных доступны, только трассировки с CM-дии могут быть использованы. Следуйте протокол 2 (см. ниже) для введения 0,5 мг/мл раствора CM-дии в 0,3 М сахарозы в носовой капсулой. Смотреть 16 для деталей на приготовления и хранения см дии. Необходимо свести к минимуму утечки красителя из основной полости. С этой целью необходимо изменить давление впрыска и открытие micropipettes. Флуоресцирование на уровне клубочковых слоя обонятельные луковицы становится очевидным 24 ч после применения CM-дии. Настоящая работа использует маркировки с CM-дии просто чтобы сертифицировать перерезка процедуры; Однако этот метод также может использоваться для получения морфологической информации обонятельных клубочков, с использованием обычных гистологические процедур.
  7. Передача животных в резервуар восстановления. Головастики следует восстановить нормальный плавательный в течение ~ 10 мин выполнять тщательную проверку на наличие кровоизлияний, которые, как ожидается, в ~ 1% животных подвергаются хирургии.
  8. Усыпить раненых животных в 0,2% раствор MS-222.

2. Маркировка обонятельных рецепторов нейронов с показателями флуоресцентные кальция

  1. Подготовить раствор, содержащий 12% кальция зеленый-1-декстрана (см. Таблицу материалы), 0,1% тритон X-100 и 1 мм NaCl17. Сохранить решение при-20 ° C или при температуре-80 ° C, если это не могут быть использованы в течение одного месяца.
  2. Подготовиться с помощью съемника микропипеткой микроинъекции стеклянной пипетки с кончика отверстия ~ 1-2 мкм (аналогичные диаметром до микроэлектродов используется для патч зажим экспериментов) (см. Таблицу материалы).
  3. Калибровка объем микроинъекций. С помощью дистиллированной воды, отрегулировать давление и инъекции время для получения томов инъекций 0,15-0,3 мкл.
    Примечание: Простая процедура состоит в подсчете количество импульсов, необходимых для очистки пипетки заполнены с 1 мкл воды. Типичные параметры находятся под давлением 30 psi и 50 мс время впрыска.
  4. Место пипетки в microinjector и загрузить его с ~ 2 мкл раствора кальция зеленый-1 декстрана.
  5. Подготовьте следующие шаги 1.1-1.6 головастиков.
  6. Переместите кончиком пипетки в главных полость носа капсулы.
    Примечание: Смотрите Рисунок 2A , описывающий местоположение обонятельных путей в Xenopus головастиков.
  7. С помощью параметров, полученных в 2.3, доставить несколько затяжек. Ограничьте присутствие краситель носовой капсулой.
  8. Пусть головастика отдых для 2-3 мин, с помощью пипетки Пастера, налить капель MS-222 0,02% раствора на более хвостовой части животного, чтобы избежать высыхания.
  9. Передать животное восстановления танк.
    Примечание: Он должен восстановить нормальный плавательный в ~ 10 мин манипуляции животных может вызвать травмы.
  10. Усыпить головастиков, которые не восстановить нормальный плавательный поведение 15 мин после инъекции, 0,2% раствором MS-222.
  11. Соблюдайте флуоресцирования на уровне клубочковых слоя обонятельные луковицы на следующий день после инъекции.

3. Подготовка головастики живут изображений Пресинаптический ответов

  1. 24-48 ч до проведения эксперимента, пальто 4 – 6 чашек Петри диаметром 35 мм с силиконового эластомера (например, Sylgard). Как только полимеризуется эластомер, изготовить прямоугольные хорошо подогнать головастик.
    Примечание: Типичные размеры для X. tropicalis головастиков, найденных на этапах NF 48 — 52 являются 10 x 4 мм.
  2. Подготовка 100 мл 160 мкм до 1 мм амино кислоты раствор, действуя как одоранта стимул для головастиков. Решение может содержать смесь нескольких аминокислоты: метионин, лейцин, гистидин, аргинин и лизин. Разбавить аминокислоты в Xenopus Рингера раствор, состоящий из (в мм): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 глюкозы, 10 HEPES, 240 мОсм/кг, pH 7,8. Убедитесь, что рН поддерживается на 7,8.
  3. Заполните повышенный резервуар с 20 мл раствора аминокислоты. Подключите водохранилища с полиэтиленовой трубы к 28 G капилляр (см. Таблицу материалы) размещены выше носовой капсулой.
    Примечание: Капиллярная трубка монтируется на микроманипулятор (см. Таблицу материалы). Пузырьки воздуха должны отсутствовать из системы перфузии.
  4. Добиться временной точности в применении решение аминокислота, используя Транзисторно транзисторная логика (ТТЛ) управления электромагнитный щепотку клапанов (см. Таблицу материалы). Стимулятор используется для создания TTL импульсов (см. Таблицу материалы). Проверка точности временной доставить одоранта решения путем изменения длительности импульсов TTL, т.е.., s 0.1 до 1.
  5. Заполните другой повышенный резервуар с 100 мл раствора Рингера Xenopus .
  6. Анестезировать головастиков и поместите его в область рассечения (шаги 1.1-1.6).
  7. Подготовьте головастиков для изображений. Если доступны альбинос головастиков переходите к шагу 3.9, в противном случае удалить кожи над обонятельные луковицы, потому что она содержит меланоцитов, которые ослабляют изображений (шаг 3,8).
    Примечание: Существует два способа выполнить эксперимент в зависимости от пигментации животного. Предпочтительнее использовать альбинос животных. Альбинос штаммы доступны для X. laevis и Альбино X. tropicalis линии недавно созданные ТРИФОСФАТЫ-Cas9 12 или18Таленс.
  8. Ножницами беззаботными, сделайте боковой надрез на коже головастика на краю центральной нервной системы. Следует сделать разрез на уровне обонятельные луковицы и никогда не достигает позиции tectum, которые могут быть легко идентифицированы по местоположению зрительного нерва.
  9. Щепотка вырезать кожу с помощью пинцета и натяните его нервной системы. Проверка успешного удаления отсутствие меланоцитов выше обонятельные луковицы. Держите животное влажные, поливая капли 0,02% раствора MS-222 с помощью пипетки Пастера.
  10. Место головастиков в колодец с покрытием блюдо (см. Таблицу материалы). Положите стекло coverslip покрытием с высокой вакуумной смазка выше животного. Поместите coverslip для покрытия верхней части tectum до конца хвоста.
  11. Убедитесь, что обонятельные луковицы и плакод остаются подверженными внеклеточных среды. Держите головастика неподвижной во время визуализации. Заполните чашку Петри с Xenopus звонаря solutioncontaining 100 мкм тубокурарин (см. Таблицу материалы), чтобы предотвратить сужения мышцы.
    Примечание: Тубокурарин хранится в аликвоты-80 ° c не более чем 6 месяцев.
  12. Поместите блюдо Холдинг головастиков под микроскопом вертикально. Подключите водохранилище, содержащих раствор Рингера Xenopus с блюдо с использованием полиэтиленовых труб (см. Таблицу материалы) для непрерывной перфузии Xenopus Рингера раствор для держать животное в живых для > 1 час.
    Примечание: Мини-магнитные зажимы (см. Таблицу материалы) очень полезны для стабильно соединения труб на блюдо. Перфузии и всасывающие трубы должны быть расположены в ~ 180° угол.
  13. Начало perfusing раствор Рингера Xenopus . Поддерживать уровень раствора в блюдо постоянной на протяжении всего эксперимента. Постоянно оцените жизнеспособность головастика, наблюдая за циркуляцию крови по сосудам.

4. живут изображений Пресинаптический Ca2 + изменений в обонятельные клубочков

Примечание: Визуализации процедура описана для микроскопии поля, но могут быть легко адаптированы к конфокального микроскопа, регулируя параметры приобретения. Изображения должны осуществляться в вертикальном Микроскоп, монтируется на столе вибрации.

  1. Визуализировать головастиков с низким увеличением цели, например 5 x.
  2. Перемещение осей микроманипулятор для размещения капилляров, обеспечивая решение одоранта на вершине один носовой капсулой, образуя под углом в 90 ° с Обонятельный нерв. Поток раствора одоранта выше обонятельные луковицы следует избегать, поскольку это может привести к турбулентности, которые искажают изображение.
  3. Обонятельные луковицы ипсилатерально расположен в носовой капсулы (в зависимости от стимуляции) с помощью большого увеличения, рабочим расстоянием, воды погружение цель найти: 60Xx, 0,9 н.а.
  4. Проверьте флуоресценции выбросов на глаз. Клубочковых структур должно быть очевидным (рис. 2B).
  5. Выполняют живой приобретения с камерой для кальция изображений. Определите окно, содержащее весь обонятельные луковицы, как правило, 256 x 256 или 512 x 512 пикселей. Набор приобретение кадров стоимость приобретения до 20 – 40 Гц. Отрегулируйте выигрыш, так что значения базальной флуоресценции ~ 20% насыщения. Приобрести 5 s видео.
  6. Визуализируйте фильма. Проверьте изображение фокус, отсутствие артефактов движения и регионов, содержащих насыщенные пикселей. Типичный флуоресценции значения клубочковых регионов должна быть 5000-20000 а.е. Если с помощью 16-разрядной камеры. Переходите к следующему шагу, если изображений условия являются оптимальными. Повторите шаг 4.6 Если необходимо улучшить качество изображения или получить настройки.
  7. Начало промежуток времени приобретения для записи ответов, вызываемые обонятельные стимулы.
    Примечание: Точное применение раствора одоранта контролируется TTL раздражителей. Типичная эксперимент содержит базовый период 4 s, следуют стимуляции раз от 0.1 до 0.5 s и восстановительный период 6 – 10 сек.
  8. Выполнение повторяющихся стимуляцию Отдушки для интервалов времени > 2 мин Установите скорость потока-1-1,5 mL·min-1. Так как глобальные перфузии на во всех экспериментах, локально прикладной аминокислоты вымываются.
    Примечание: Объем раствора в блюдо составляет ~ 3 мл.
  9. Анализ изображений
    1. Обнаружение ответов
      1. Экспорт фильмов в ImageJ.
        Примечание: Цель Обнаружение присутствия клубочковых регионов, реагировать на раздражители.
      2. Преобразуйте необработанные последовательность изображений флуоресценции в кино0 ΔF/F. Измерить относительные изменения в базальной флуоресценции согласно следующие отношения: (F-F0) / f0, где F0 указывает базовые уровни флюоресценции.
      3. Нарисуйте регионы интереса (ROI) вокруг районов показаны предполагаемые флуоресценции увеличивается во время стимуляции и записывать их позиции в менеджере ROI (2 рисунокE). Нарисуйте ROI для обнаружения фоновые уровни флюоресценции в районе лишенный клубочковых структур.
    2. Количественная оценка ответов.
      1. Место определенные ROIs в сырой последовательности изображений флуоресценции. Получите среднее значение серого выбранных трансформирования для каждого кадра. Передача последовательности значений, полученных для анализа программы (например., Игорь Pro).
      2. Вычитание фона флуоресценции, а затем вычислить ΔF/F0 изменения для каждой ROI (Рисунок 2F). Участок увеличение ΔF/F0 для каждого из выбранных ROIs. Вычислите стандартное отклонение базальной ΔF/F0 (до стимуляции).
        Примечание: Положительный ответ считается, если увеличение ΔF/Ф0 , полученный при стимуляции размером более 2 стандартных отклонения базальной ценностей.

5. обонятельных руководствуясь поведение Assay

Примечание: Схема установки для выполнения анализа показано на рисунке 3.

  1. Сделайте небольшие отверстия по размеру трубки 1,14 мм ID O.D. x 1.57 мм в верхней части каждой скважины 6-ну блюдо. Вставить трубку и печатью с помощью эпоксидного клея (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Изменение блюдо может быть повторно использован много раз после тщательного мытья с дистиллированной водой.
  2. Подготовка 50 мл раствора аминокислоты, содержащие метионин, лейцин, гистидин, аргинин и лизин (см. шаг 3.2 для подробной информации). Концентрации может варьироваться от 160 мкм до 1 мм. Место 20 мл раствора в повышенных водохранилище.
  3. Не кормите головастиков для по крайней мере 12 h до assay. Взять 6 головастиков от их корпус танка и поместите их в 2 Л воды чистой головастика для сведения к минимуму воздействия одорантов.
  4. Место изменение блюдо 6 скважин на белый LED-transilluminator (рис. 3).
  5. Пара входов перфузии в водохранилище, содержащий аминокислоты решения с помощью коллектора (см. Таблицу материалы). Проверка системы перфузии и устранить воздушные пузыри. Заполните 6 скважин одновременно. Отрегулируйте высоту водохранилища, чтобы разрешить доставку ≥5 мл раствора одоранта в течение ~ 30 s.
    Примечание: Мыть каждый хорошо 4 раза с двойной дистиллированной водой после экспозиции одорант решение.
  6. Заполните каждый хорошо с 10 мл воды головастик. 1 место головастика/хорошо. Отпуск для отдыха > 3 мин.
  7. Настройка загрузки изображений. Используйте обычные CCD камера, которая может приобрести изображений на ≥5 Гц. Подключите камеру к компьютеру. Здесь, использовать камеру Zeiss MRC5 контролируется Zen программное обеспечение, но другие эквивалентные конфигурации могут быть использованы. Если это необходимо увеличить частоту кадров, примените биннинга пикселей. Изображения должны показать весь 6-ну блюдо.
  8. Начало захвата изображений таким образом, что фильмы содержат базальной (30 s), стимул (25 – 35 s) и восстановления (30-60 s) периодов.
  9. Вернуться животных из 6 скважин блюдо танки после съемки.
  10. Анализируйте фильмы в ImageJ, с помощью плагинов, например wrMTrck19,20 , которые предоставляют несколько параметров, связанных с подвижности.
  11. Чтобы подготовить изображения для анализа, сначала выберите колодец, рисование прямоугольного ROI 35 x 35 мм (рис. 4A). Получите фоновое изображение путем расчета максимальной проекции всей последовательности. Он должен отображать изображение скважины без головастик.
  12. Вычтите максимальной проекции от сырой фильм. Порог на созданный фильм 32-разрядных и применять плагин wrMTrck. Настройте параметры WrMTrck надежно отслеживать животных движений. Передача полученных X, Y координаты в программу анализа.
  13. Координат с помощью X-Y, вычислить евклидово расстояние к источнику одоранта (перфузии вход в колодец), используя следующее уравнение:
    Equation 1
    где ОС указывает положение источника запаха и чуть указывает позицию головастиков в заданное время. Смотрите Рисунок 4A для деталей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этой статье, мы представляем сочетание двух взаимодополняющих подходов для выполнения в vivo исследования функциональности Xenopus головастика обонятельной системы: я) метод для визуализации Пресинаптический Ca2 + изменения в клубочков жизни с использованием флуоресцентных кальция индикатор и ii головастиков) запах руководствоваться поведенческих assay, который может использоваться для исследования реакции на конкретный водный отдушки. Поскольку эти подходы были использованы для оценки восстановления обонятельных обработки после травмы10, также описан простой метод для transecting обонятельных нервов.

Перерезка обонятельных путей в Xenopus головастики
Существует два способа удостоверять действительность процедуры. Оба опираются на визуализации обонятельных нервов с использованием флуоресцентных журналистам. Один метод основан на трансгенные головастиков, которые выражают флуоресцентных белков на их нервной системы. Две рекомендованные линии, которые выражают GFP под промоутера нейрональных β-тубулина являются X. laevis tubb2b-GFP и X. tropicalis НБТ-GFP (рис. 1, смотрите Таблицу материалы). Если только одичал тип животных доступны, см дии может использоваться (см. шаг 1,8). Рисунок 1 показывает изображения tubb2-GFP X. laevis головастиков. Изображения являются от четырех разных животных, где один Обонятельный нерв был перерезанных гори. Разрез должно быть очевидным в сферу рассечение. Преимущество использования трансгенных линий является, что реформирование Обонятельный нерв может следовать за определенный период времени. При выполнении последовательных наблюдений, рекомендуется свести к минимуму воздействие флуоресцентный свет для предотвращения повреждений. Вырезание из одного Обонятельный нерв полезен, когда требуется внутренний контроль, как, например, чтобы сравнить нормально развитых против перемонтирован клубочковых единиц. Секционирование обоих обонятельных нервов должны применяться при цель полностью подавления передачи информации.

Жить, визуализации Пресинаптический ответов на обонятельные стимулы
Правильно обозначать ORNs с Грин-1 декстрана кальция может наблюдаться на уровне обонятельные луковицы (рисA) с помощью widefield микроскопии. Клубочков являются очевидными (рис. 2B) и должен появиться распределяется в разных слоях, перемещая плоскости фокуса. Морфология клубочковых структур можно лучше решить если вместо этого используется Конфокальный микроскоп (рис. 2C). Количество помечены клубочков зависит поглощение красителя на уровне обонятельного эпителия. Таким образом эта процедура не позволяет визуализацию всех клубочковых единиц. Животные, показаны более интенсивного окрашивания флуоресценции клубочковых региона должен быть выбран перед выполнением изображений эксперименты, так как они содержат больше ORNs помечены. Этот маневр настоятельно рекомендуется для того, чтобы увеличить пропускную способность экспериментальных и должна быть выполнена под областью рассечения, оснащенного флуоресцентной лампой. Отклонить животных, которые не показывают помечены клубочковых единиц или которые показывают флуоресценции ограничены конкретным областям клубочковых слоя. Как только 1 день после загрузки краситель может наблюдаться Пресинаптический Ca2 + ответы. Для выполнения визуализации экспериментов желательно использовать цели высокая числовая апертура, обычно ≥0.9.

Увеличение уровня Пресинаптический кальция может вызвали подвергая дендритных ручки ORNs до аминокислот. Это важно для позиции капилляров, обеспечивая решение одоранта выше носовой капсулой. Следует позаботиться о том, чтобы избежать контакта, потому что он может засорить кончик капилляра и/или вызвать механической стимуляции ORNs. Переходных увеличивается в пресинаптическом кальция уровнях можно наблюдать на раздражители ≥0.1 s (Рисунок 2D) и свидетельствует о правильной обонятельных трансдукции. Это также важно для визуализации уровня базальной кальция с низкой камеры выгоды. Пресинаптический терминалы ORNs отображения высокой флуоресцентные увеличивается и важно, чтобы избежать насыщения сигнала. Высокое временнóе разрешение может быть достигнуто с widefield микроскопии. Например с использованием электронно умножить CCD камеры, это можно достичь частоту 50 Гц или выше. Использование confocal микроскопии уменьшает временное разрешение, но позволяет более точное определение клубочковых структур.

Высокое сродство кальция зеленый для связывания кальция (190 Нм) особенно полезен для обнаружения небольших ответы. Переходных внутриклеточного кальция увеличивается, обнаруженных в слое клубочковых являются переменными. Некоторые клубочковых регионы показывают изменения в ≥0.20 ΔF/F, в то время как соседних процессов даже не может ответить (Рисунок 2D). Изменчивость реагирования клубочковых единиц способствуют следующие факторы: i) общее число помеченных клубочков, ii внутриклеточной концентрации кальция зеленый и iii) избирательность ORNs обнаружить аминокислоты. Так как слишком низкое количество помечены клубочков может препятствовать наблюдения за ответы, это абсолютно необходимо провести эти эксперименты с животными, содержащие как многие помечены ORNs как можно скорее.

Обонятельные руководствуясь поведение
Анализ данных
Обонятельные руководствуясь поведение изучается с помощью заказных системы. На рисунке 3 показана схема чертеж оборудования, используемого для выполнения анализа. Тест основан в головастиков способность обнаруживать присутствие аминокислот, которые выступают в качестве одорантов. Решение, сочетающее пять различных аминокислот (метионина, лейцин, гистидин, аргинин и лизин) используется для стимуляции. Решение доставляется локально во время 30 s до 35 мм, также содержащий свободноплавающих головастиков. Реакция головастиков поступающих решения является увеличение подвижности. Случайных движений, происходящих во время начальной s ∼5 – 10 решения приложения следуют прямые плавать к источнику отдушки. Головастики остаются на несколько секунд в непосредственной близости от сопла во время доставки аминокислот и постепенно восстановить подвижность в случайных направлениях (см. дополнительный видео 1, 2).

В экспериментальных условиях, описанных позволяют нормально плавать X. tropicalis головастиков этапов 48-52; Однако необходимо учитывать, что моторику крупных животных может быть ограничен в 35 мм скважин. Головастик движения записаны с ПЗС-камеры. Привлечение для решения одоранта могут быть обнаружены как сокращение евклидово расстояние, разделяющее перфузии входе от головастика позиции (рис. 4). Отслеживание головастика руководящие должности в области 35 x 35 мм (или эквивалентного размера в пикселях) позволяет получать количественный анализ поведения, обонятельные гидом (рис. 4A). Отдельные участки головастика движений построены с использованием координат X-Y, полученные путем анализа изображения (Рисунок 4B). Извлеченный моторики участки должны точно воспроизвести видео изображения.

Существует два возможных способа интерпретации обонятельных руководствуясь поведение экспериментов. Первый подход основывается на предыдущем исследовании с использованием zebrafishes21. Измерение времени вблизи сопла, обеспечивая отдушки свидетельствует наличие положительных тропизм. Область интереса 8,75 мм радиус (¼ хорошо диаметр) сосредоточены на входе решение, что она используется для классификации близости от животных к источнику одоранта (рис. 4A, 4 C). Биннинга время, проведенное головастиков вблизи насадку в определенные периоды, т.е. 15 s интервалы, позволяет определить способность обнаруживать аминокислоты решения (рис. 4D). Общее поведение населения головастиков могут быть получены путем построения распределение индивидуальных данных (рис. 5A). Позитивные тропизм может быть обнаружен, когда решение метионин, лейцин, гистидин, аргинин и лизин готовится в 1 мм или 160 мкм (Рисунок 5А и 5B). Животные не реагировать воды приложения (рис. 5C), таким образом, отказавшись от участия mechanosensitive механизмов. Различия между время интервалы, определенные в каждой экспериментальной группы могут создаваться с помощью непараметрических неоднократные меры ANOVA с Данн множественные сравнения теста. Недостаток биннинг данных в интервалах 15 s является сокращение временного разрешения.

Способ увеличить временной информации поведенческие реакции это, сделав средняя участков евклидова расстояния от источника запаха. Хотя головастика движения показывают внутренней изменчивости, средняя подвижности населения животных (обычно ≥40) показывает поведение обонятельные гидом. Для проведения этого анализа необходимо животных позиции группы до начала стимуляции. Так как головастиков находятся в разных местах, когда решением одорант входит в скважину необходимо установить евклидово расстояние 0 перед стимуляции (Рисунок 6A, см. также критерии включения на рис. 7). Поэтому отрицательные и положительные значения указывают притяжения или отталкивания от источника запаха, соответственно. Привлекательность для запаха хорошо описывается линейной подходят с ≥0.9 коэффициенты регрессии. Если вода доставляется, чистые изменения евклидова расстояния распространяются около 0, и это не возможно соответствовать линии во время стимуляции одоранта, показывая тем самым, отсутствие обоняния руководствуясь поведения (Рисунок 6B). Сравнение средней участков евклидова расстояния для решения аминокислоты, подготовленных на 1 мм и 160 мкм предполагают различные задержки в обонятельные руководствуясь ответ (Сравните Рисунок 6A и C). Интервал времени, необходимое для начала движение в направлении источника отдушки короче когда аминокислоты применяются в более высокой концентрации. Отсутствие обоняния руководствуясь поведение наблюдается головастиков с обеих обонятельные нервы перерезанных гори (рис. 6D).

Ограничение описано обонятельных руководствуясь поведенческие анализа является создание сложных жидкости шлейфов. Это можно увидеть если амино кислоты раствор заменяется красителя, как быстро зеленый, при настройке системы. Использование цветных решений проверяет формирования шлейфов и показывает, что водный отдушки достичь любого региона хорошо в течение 5 с. волнений, вызванных доставки решения скорее всего обнаруживаются боковая линия головастиков и вероятно способствовать изменчивость наблюдается в подвижности животных, но не мешают обонятельных управляемое поведение. Управления эксперименты, проведенные с помощью воды вместо аминокислоты решения показывают, что головастиков способны различать обонятельных от механических раздражителей. Оценка времени в регионе интереса (рис. 5) и средний участок евклидова расстояния (рис. 6) являются два взаимодополняющих методов для описания обонятельные руководствуясь ответ головастиков.

Критерии включения
Критерии включения должны также приниматься во внимание для анализа данных. Некоторые головастиков показывают резонансных движение, которое иллюстрируется установку участок евклидова расстояния к синусоидальной функции (рисA). Головастики показано поведение следует отказаться от всех анализа.

Исключение животных, которые в начале применения одоранта решений на максимум (> 30 мм рис. 7Б) или минимального Эвклидова расстояния (< 5 мм, рис. 7C) от сопла позволяет снизить изменчивость Средняя сюжетов. Показано на рисунке 7B пример позитивный тропизм для решения аминокислоты. Головастика расположен на расстоянии максимум раствора на входе в начале стимуляции. Таким образом это относительное положение может только выявить притяжения для источника запаха. Рисунок 7 C показывает обратную ситуацию. Здесь головастика расположен вблизи сопла, обеспечивая решение аминокислоты. Количественная оценка времени вблизи источника запаха показывает ответ (метод, используемый на рис. 5); Однако она не может показать Чистое движение на входе.

Таким образом предлагаемый пробирного обонятельных руководствуясь поведение определяет двоичный тест. Этот метод может использоваться для обнаружения экспериментальной группы головастиков способность реагировать одорантов. Если целью является создание различия между комплекс обонятельных руководствуясь ответы, как например, определения предпочтения для данного требуются дальнейшие улучшения запаха.

Figure 1
Рисунок 1: Перерезка обонятельных нервов. Представитель образы головастиков X. laevis tubb2-GFP, полученные после перерезка одного Обонятельный нерв (стрелки). Нервы tubb2-GFP головастиков отображения сильная флуоресценция. Перерезка нерва является очевидным сразу после операции (D0). Отрастания Обонятельный нерв является очевидным 4 дней после разреза (D4). Восемь дней после операции (D8) очень мало разницы между элементом управления и реформированной нервы. Головастики были под наркозом в 0,02% MS-222 собирать изображения. Обонятельные луковицы (о.б.), Обонятельный нерв (о.н.), носовой капсулой (Северная Каролина), tectum (ПИС), зрительный нерв (Op.N.). Стрелки указывают расположение пересекал нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Маркировки обонятельных рецепторов нейронов с кальция зеленый декстрана и визуализация притока Пресинаптический кальция при стимуляции с аминокислотами. (A) половым свете изображение головастиков расположения обонятельного эпителия, обонятельные нервы и клубочковых слой обонятельные луковицы. (B) изображение обонятельные луковицы, Визуализация по микроскопии widefield (wf). Нейроны были обозначены применение кальция зеленый-1 декстрана в носовой капсулой. Флюоресценция наблюдается соответствует Пресинаптический терминалы от обонятельных рецепторов нейронов, образуя клубочков. О.Н.: Обонятельный нерв; O.B: обонятельные луковицы. (C) конфокальный секции расположен дорзально от входа Обонятельный нерв к колбе. Пресинаптический компонент обонятельных клубочков было названо использование кальция зеленый-1 декстрана, например B). (D) Пресинаптический терминалы временно увеличить их уровни кальция при воздействии обонятельного эпителия раствор, содержащий пять различных аминокислот. Относительные изменения в флуоресцировании кальция, полученные до, во время и после 1 s стимуляции. (E) распространение 10 различных регионов интерес (ROI) используется для количественной оценки изменений0 ΔF/F. ROI11 за пределами клубочковых слоя и используется для определения фоновые уровни флюоресценции. (F) отдельных ΔF/F0 ответов для трансформирования, определенных в E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Обонятельных руководствуясь поведение пробирного. (A) Схематическая диаграмма, показывающая оборудования, используемого в ходе испытания. (B) пример моторики треков Записанная свыше 90 s. Каждый круг представляет, также содержащий одиночного животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Отслеживание обонятельных руководствуясь поведения. (A) пример, показывающий хорошо для поведенческого анализа. Синие пунктирные линии указывают местоположение X, Y координаты (в мм) используется для отслеживания движений головастика (см. также Дополнительные видео 1). Зеленый эллипс представляет позицию раствора на входе. Пунктирная черная линия показывает области проксимальных на трубу, обеспечивая решение аминокислоты (см. текст для подробной информации). (B) моторику головастика, показано в A) в ходе поведенческого анализа. Цветные следы указывают позицию животного до (серый) и после стимуляции обонятельных (фиолетовый). Движения во время применения раствора одоранта проиллюстрированы в височной цвета градиента (30 s, красный, синий). (C) с помощью X, Y головастика позиций можно рассчитать изменения в евклидово расстояние от головы головастика перфузии к входу. Расстояния, короче, чем 8,75 мм соответствуют области проксимальных сопла. Участок (D) время, проведенное головастиков в регионе определяется пунктирной линией в A). Каждая точка обозначает периодом 15 s. Животное привлекает одоранта решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Аминокислоты привлекает головастиков. (A) время, проведенное головастиков вблизи источника запаха. Каждый бин состоит из 15 s период. Прямоугольные представляет медиана (черная горизонтальная линия), 25-75% квартили (коробки) и диапазоны (усы) данных. Поставка раствора амино кислоты 1 мм привлекла головастиков источник запахов. (B) головастиков привлекали решением одорант, когда концентрация аминокислот был сокращен до 160 мкм. (C) Доставка воды не изменяет поведение животных. Неоднократные меры ANOVA с Данн в множественные сравнения теста, p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Височной ответ головастиков одорантов. (A) участок средней евклидово расстояние источник запахов как функцию от времени. Евклидово расстояние было равным 0 до стимуляции каждой индивидуальной трассировке. Положительные и отрицательные значения указывают уменьшение и увеличение расстояния до источника запаха, соответственно. Привлечение к источнику запаха можно описать линейной fit (r2= 0,98). (B) Доставка воды не изменяет расстояние до источника запаха. (C) головастиков реагировать приложение 160 мкм раствором аминокислот обнаруженных линейная fit (r2= 0,96). (D) головастиков с обеих обонятельные нервы перерезанных гори не реагируют на аминокислоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Критерии включения для обоняния руководствуясь поведение assay. (A) некоторые головастиков шоу резонансных движения. Это поведение раскрывается успешно подходят синусоидальной функции на участок евклидова расстояния до источника запаха. Головастики, отображение этой деятельности должны быть исключены из теста. (B, C) Исключив животных, расположенный на максимум (B) или минимальное (C) евклидово расстояние в начале стимуляции способ снизить изменчивость в среднем височной ответ отдушки (рис. 6). Красные пунктирные линии показывают значение порога (30 мм и 5 мм). Евклидово расстояние до наступления стимуляцией (стрелка, оставил участки) имеет значение «0», чтобы отчет привлекательным или отвратительное поведение как отрицательные или положительные значения (правый участков), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Video 1
Дополнительные видео 1: обонятельные руководствуясь поведение вызвано доставки решения аминокислота. Фильм показывает головастика, свободно плавает на 35 мм хорошо. Эллипс синего цвета указывает положение сопла, обеспечивая решение одоранта. Начала и конца стимуляции обозначаются зелеными и красными кружками, соответственно. Рисунок 4 показывает анализ поведения наблюдается. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Supplementary Video 2
Дополнительные видео 2: головастика сократительной способности во время доставки воды. Фильм показывает головастика, свободно плавает на 35 мм хорошо. Эллипс синего цвета указывает положение сопла, выпуская MQ воды. Начала и окончания подачи воды обозначаются зелеными и красными кружками, соответственно. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот документ описывает методы, которые полезны для расследования функциональность обонятельных путей в жизни головастики Xenopus . Текущий протокол является особенно полезным для тех лабораторий, которые работают, или иметь доступ к Xenopus; Однако это также интересно для тех исследователей, изучение клеточной и молекулярной основы нейрональных регенерации и ремонта. Результаты, полученные в Xenopus может сочетаться с данных, собранных в других позвоночных модели для выявления сохранившихся механизмов. Методы, описанные выиграют от развития генетически модифицированных Xenopus18,,22-23 и применимы к экспериментальной модели заболеваний нервной системы в головастиков24, 25.

Для того чтобы получить воспроизводимые в естественных условиях данных, это ключ к правильно задние Xenopus головастиками. В частности X.tropicalis очень чувствителен к плохих жилищных условий. Например они не терпят температурах ниже 20 ° C и должны храниться в цистернах или систем водоснабжения в диапазоне от 24 до 28 ° C. Важно также, чтобы не увеличить животных плотности выше установленных пределов, регулярно кормить головастиков и сохранить качество оптимальный воды13. Управление животных колоний после стандартизированных условий абсолютно необходим для получения воспроизводимость в экспериментах in vivo.

Описан метод кальция изображений для обнаружения правильного обонятельных трансдукции ORNs в естественных условиях. Загрузка ORNs с кальция зеленый-1 декстрана достигается за счет переходные permeabilization мембраны плазмы с помощью низкой концентрации Тритон X-100, как сообщалось ранее,17. Основным преимуществом данного метода загрузки является простота, потому что он требует только microinjector. Важным недостатком является, что Тритон X-100 вызывает переходных ликвидации обонятельных ресничек и микроворсинки. Обонятельный эпителий данио рерио Регенерация в течение 48 часов после лечения17. Регенерация в Xenopus головастиками может быть даже быстрее, поскольку ответы на одорантов можно наблюдать 1 день после окрашивания загрузки (Рисунок 2D). Однако подробный анализ морфологической требуется точно определить время регенерации обонятельного эпителия после лечения X-100 Тритон.

Маркировка ORNs с кальция зеленый-1 декстрана эффективен только в популяции нейронов, позволяя визуализации Пресинаптический терминалов с высоким соотношением сигнал шум (Рисунок 2B и 2 C). Почти полное отсутствие фона выгодно, если по сравнению с загрузкой всего обонятельные луковицы с утра Эстер формы кальция красителей. Количество флуоресцентный ORNs отличается от животных животных. Таким образом, необходимо использовать широкий обонятельные стимулы нескольких аминокислот. Мы добились успешных результатов, используя раствор метионин, лейцин, гистидин, аргинин и лизин. Другие комбинации различных аминокислот, также может быть эффективным. Альтернативный метод для загрузки ORNs с показателями кальция является электропорации26, который широко используется для выражения генетически закодированный флуоресцентные репортеров в головастика нейронов27. Электропорация может быть сделано с помощью коммерческого или по индивидуальному заказу оборудования и позволяет визуализировать нейрональных структур с отличным соотношением сигнал шум28. Аналогично, в описанный подход клеточных популяций помечены неоднородны и отличаются от животных животных. Трансгенез является желательным, если цель изучает совокупность определенных нейронов22. Например выражение показателей генетически закодированный кальция например GCaMPs вождение в ограниченной группы ORNs, может быть очень полезным для исследования реакции определенного набора Пресинаптический терминалов для отдушки.

Описывается метод, с помощью кальция зеленый 1 декстрана сообщает Пресинаптический функции терминала в естественных условиях. Наблюдение за внутриклеточного кальция увеличивается свидетельствует о правильной обонятельных трансдукция и выпуска глутамата на уровне клубочков. Количественный анализ изменений в флуоресцировании, однако, является ограниченной. Стимуляция Пресинаптический терминалов увеличивает уровень внутриклеточного кальция для всех круга и насыщенность высоким сродством кальция индикатора: кальция зеленый должны приниматься во внимание. Показано на рисунке 2 результаты с помощью widefield микроскопии. Это самый простой подход и могут быть реализованы в большинстве лабораторий. Улучшение с помощью двух Фотон микроскопии или генетически закодированный флуоресцентные Репортеры могут разрешить получение более количественные оценки Пресинаптический функции.

Для живых изображений кальция ответов, важно, что есть соответствующее позиционирование капилляров, обеспечивая решение одоранта. Он должен быть расположен выше носовой капсулой и всегда избегать прямого контакта с ткани. Как правильно доставки решения одоранта и поток перфузии должны быть проверены перед размещением головастиков под микроскопом. Все трубы, используемые для перфузии должны быть проверены для воздушных пузырьков. Изменения потока раствора аминокислоты должны реагировать немедленно последовательных открытия и закрытия клапана соленоида. Задержки, свидетельствует о наличии воздуха. Желательно также, чтобы проверить правильный объем увеличивается или уменьшается решения доставлены после изменения времени открытия, т.е.., от 0,1 s 1 s или наоборот. Используйте низкой интенсивности света при экспериментальной параметров (шаг 4.6) для того, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание.

Хотя важность обоняния в биологии головастиков устоявшихся29, есть отсутствие тестов непосредственно оценки обонятельных руководствуясь поведение в Xenopus личинки. Метод, описанный в этом документе является простой тест, который позволяет обнаруживать в ответ на стимул запах в большой популяции животных. Последние описание одоранта чувствительность головастиков рана catesbeiana для присутствия химических веществ в воде иллюстрирует сложные механизмы, сопряжение обоняния с мотор поведение30. Assay, описанных в данном документе принимает во внимание внутреннюю изменчивость обонятельных руководствуясь поведения в головастиков. Использование 6-ну блюдо вместо одиночных скважин увеличивает экспериментальные пропускную способность. Факторы, способствующие изменчивости такие базальной моторики, относительное положение перфузии впуска и перья, созданных решением одорант преодолеваются путем усреднения множество головастиков. Примерно 40 независимых измерений необходимы для описания управления привлекательным ответ для аминокислот.

Мы предлагаем два типа анализа для теста обоняния. Первый подход дает количественную оценку времени вблизи источника запаха за определенный период. Это особенно хорошо подходит для статистического анализа. Второй подход основан на среднем участке евклидова расстояния от источника запаха и полезна для описания временной ответ одорантов. Оба вида анализа являются взаимодополняющими и прийти порожденных те же данные. Интерпретации двоичных и позволяет отличительный животных это чувство отдушки от тех, которые не10.

Как бы полезным Xenopus сообщества описанные методы? Хотя по существу методы иллюстрируются одичал тип животных, следует учесть, что генетические возможности постоянно расширяется в поле Xenopus . Комбинированные исследования в естественных условиях Орн ответов и присутствие обонятельных руководствуясь поведение также может быть очень полезным для расследования правильной обработки обонятельной информации в Xenopus мутантов, создано либо путем прямого или обратного генетического экраны 11. информацию, представленную кальция изображений и поведенческого анализа могут быть объединены. Например мутации, выборочно затрагивающих гранул клетки обонятельной луковицы не будет изменять Пресинаптический ответ ORNs, но вероятно подорвет обонятельных руководствуясь поведение.

Методы сопоставления сотовой и поведенческих реакций в естественных условиях особенно актуальны для генетических рассечение нейронных цепей. Интерпретация результатов можно опираясь на предыдущих морфологических работ, которые обеспечили анатомические карты клубочковых слоя в головастиков31. Информация, полученная от обонятельные луковицы кусков головастиков Xenopus 32 также является очень ценным. Кальция изображений митрального клапана/тафтинговые клеток в обонятельные луковицы ломтики выявило основные характеристики обонятельных обработки в Xenopus головастиков, например чувствительность ORNs различные аминокислоты33 или актуальность задержкой ответов в кодировке7обонятельной информации. Однако срезы мозга показывают, ограниченные возможности для воспроизведения сложных интеграционных механизмов, сопоставление различных нейрональных схем за счет разрезания многочисленные нейрональных прогнозов. Кроме того характеристика свойств отдельных единиц клубочковых пока недостижимой за исключением γ-glomerulus34. Вопрос о ли одной единицы клубочковых определяют конкретные режимы в головастиков будет ответить только путем сочетания генетических инструменты, в естественных условиях изображений подходов и поведенческих анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана от грантов от y El Ministerio де Economía развитию (МИНЕКО; SAF2015-63568-R) cofunded Европейского фонда регионального развития (ЕФРР), конкурентные исследования награды от M. F. G. Fuortes Мемориал стипендии, Стивен W. Kuffler стипендий Фонда, Лаура и Артур Колвин наделены летом исследовательских стипендий Фонда , Фишбах стипендий и большой фонд поколение морской биологической лаборатории и национальной Xenopus ресурсов RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) где часть этой работы была проведена. Мы также благодарим CERCA программы / Женералитата Каталонии для институциональной поддержки. А.л. является членом Серра Húnter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328, (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395, (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69, (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37, (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67, (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5, (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48, (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525, (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2, (6), 91 (2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317, (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18, (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1, (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426, (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6, (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11, (1), 14 (2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33, (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36, (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489, (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26, (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123, (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35, (20), 7892-7902 (2015).
Функциональная оценка обонятельных путей в жизни <em>Xenopus</em> головастиками
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter