Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Funktionell utvärdering av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel

doi: 10.3791/58028 Published: December 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus grodyngel erbjuder en unik plattform för att undersöka funktionen av nervsystemet invivo. Vi beskriver metoder för att utvärdera behandlingen av lukt information i levande Xenopus larver under normala uppfödning eller efter skada.

Abstract

Xenopus grodyngel erbjuder en unik plattform för att undersöka funktionen av nervsystemet. De ger flera experimentella fördelar, såsom tillgänglighet till talrika bildgivande metoder, elektrofysiologiska tekniker och beteendemässiga analyser. Xenopus grodyngel Luktsinnet är särskilt väl lämpad att undersöka funktionen av synapser fastställts under normala utveckling eller reformeras efter skada. Här, vi beskriver metoder för att utvärdera behandlingen av lukt information i levande Xenopus larver. Vi beskriva en kombination av invivo mätningar av presynaptiska calcium svaren i glomeruli i luktbulben med lukt-guidad beteende analyser. Metoder kan kombineras med transection av luktsinnet nerver att studera den uppladdning av synaptic anslutning. Experiment presenteras med både vildtyp och genetiskt modifierade djur uttrycker GFP reportrar i centrala nervsystemet celler. Tillämpningen av de metoder som beskrivs till genetiskt modifierade grodyngel kan vara användbart för att nysta upp de molekylära baser som definierar ryggradsdjur beteende.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Xenopus grodyngel utgör en utmärkt djurmodell för att studera nervsystemets normala funktion. Öppenhet, fullt sekvenserat genomet1,2och tillgängligheten till kirurgisk, elektrofysiologiska och imaging tekniker är unika egenskaper av Xenopus larver som tillåter undersöker neuronala funktioner i vivo3 . Några av flera experimentella möjligheterna av denna djurmodell illustreras av de grundliga studier som utförts på tadpole sensoriska och motoriska system4,5,6. En särskilt väl lämpad neuronala krets att studera många aspekter av informationsbehandling på nivån av synapser är Xenopus grodyngel luktsystem7. För det första dess synaptic anslutning är väl definierad: luktreceptor nervceller (ORNs) projektet till luktbulben och upprätta synaptiska kontakter med dendriter av mitral/tuftade celler inom glomeruli att generera lukt kartor. För det andra skapas dess ORNs kontinuerligt av neurogenes i hela livet att behålla funktionaliteten på olfactory vägar8. Och för det tredje eftersom luktsinnet visar en stor regenerativ förmåga, Xenopus grodyngel kan helt reformera deras luktbulben efter ablation9.

I detta papper beskriver vi metoder som kombinerar avbildning av lukt glomeruli i levande grodyngel med beteendemässiga experiment för att studera funktionaliteten på olfactory vägar. De metoder som beskrivs här användes för att studera glomerulär connectivity i luktbulben funktionell återhämtning efter luktnerven transection10. Data som erhållits i Xenopus grodyngel är representativa för ryggradsdjur eftersom lukt behandling är evolutionärt bevarade.

De metoder som beskrivs exemplifieras med X. tropicalis men de kan enkelt implementeras i X. laevis. Trots den största storleken av vuxen X. laevisär båda arter anmärkningsvärt liknande under grodyngel stadier. De viktigaste skillnaderna är bosatta på genomisk nivå. X. laevis visar dålig genetisk tractability, mestadels bestäms av dess allotetraploid genomet och lång tid (cirka 1 år). Däremot är X. tropicalis mer mottagliga för genetiska modifieringar på grund av dess kortare generationstid (5 – 8 månader) och diploida genomet. De representativa experiment illustreras för vilda djur och tre olika transgena linjerna: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) och tubb2:GFP (X. laevis).

De metoder som beskrivs i det nuvarande arbetet bör övervägas tillsammans med de genetiska fortskrider i fältet Xenopus . Den enkelhet och enkel implementering av tekniker presenteras gör dem särskilt användbara för att utvärdera redan beskrivits mutanter11, liksom Xenopus rader genereras av CRISPR-Cas9-teknik12. Vi beskriver också ett kirurgiskt ingrepp som brukade transekt luktsinnet nerver som kan genomföras i ett laboratorium som har tillgång till Xenopus grodyngel. Metoderna som används för att utvärdera presynaptiska calcium svaren och lukt-guidad beteende kräver särskild utrustning, om än på en måttlig kostnad. Metoder presenteras i en enkel form att främja deras användning i forskargrupper och kan ställa baserna av mer komplexa analyser av genomföra förbättringar eller av föreningen till andra tekniker, dvs, histologiska eller genetiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla förfaranden godkändes av utskottet för forskning på djur-etik vid universitetet i Barcelona.

Obs: X. tropicalis och X. laevis grodyngel föds upp enligt standardmetoder13,14. Grodyngel vatten bereds genom att lägga till kommersiella salter (se Tabell för material) i vatten som erhålls genom omvänd osmos. Ledningsförmåga justeras till ∼700 µS och ∼1, 400 µS för X. tropicalis och X. laevis grodyngel, respektive. Larverna kan erhållas antingen genom naturlig parning eller provrörsbefruktning14. Embryon är dejellied med 2% L-cystein beredd i 0,1 x Marcs modifierade Ringers (MMR). 1 x MMR innehåller (i mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Larver överförs efter 2 – 3 dagar (etapp 25) till 2 L tankar med grodyngel vatten. När grodyngel når scenen 40 Nieuwkoop-Faber (NF) kriterier15, de placeras i 5 L tankar och underhålls med en täthet av 10 djur/L. temperatur hålls konstant på 23 – 25 ° C och 18 – 20 ° C för X. tropicalis och X. laevis grodyngel, respektive. Djur hittade skeden 48 – 52 av NF kriterierna som används för experiment.

1. transection av luktsinnet nerver

  1. Förbereda en anesthetizing lösning 0,02% MS-222 i 50 mL grodyngel vatten vid rumstemperatur.
  2. Förbereda en liten tank (1 – 2 L) med grodyngel vatten för att möjliggöra återhämtning av djur efter operation.
  3. Skär rektangulära bitar av cellulosa kvalitativt filtrerpapper (4 cm x 3 cm, se Tabell för material).
  4. Blöt 2 stycken cellulosa kvalitativt filtrerpapper i lösning 0,02% MS-222 och placera dem under dissekera räckvidd.
  5. Plocka ett grodyngel från tanken och doppa det i anesthetizing lösningen. Djuret slutar simning inom 2 – 4 min och reagerar inte på mekaniska stimuli tillämpas på svansen nivå använda pincett.
  6. Placera den sövda grodyngel på de rektangulära bitarna filtrerpapper. Placera djuret med dess dorsala vänd uppåt, så hjärnstrukturer kan visualiseras.
    1. Med hjälp av Vännäs saxar (se Tabell för material) skär ena eller båda luktsinnet nerver (beroende på vilken typ av analys som skall utföras). Transekt en enda nerv för experiment som kräver en intern kontroll av nervskada.
    2. För beteende experiment, transekt både nerver för att undertrycka alla luktämnet information anländer till luktbulben. Effektiviteten i snittning av luktsinnet nerver kan observeras enkelt dissekera omfattas; pigmentering eller djur position kan dock vara begränsande faktorer.
      Obs: (Valfritt) Det bästa sättet att intyga giltigheten av förfarandet med transgena grodyngel som uttrycker fluorescerande reportrar på deras nervsystem (se representativa resultat). I detta syfte är det nödvändigt att använda en dissektion omfattning utrustad med fluorescens (figur 1). Om bara det finns vilda djur, kan spårning med CM-diI vara anställd. Följ protokoll 2 (se nedan) för att injicera en 0,5 mg/mL lösning av CM-diI beredd i 0,3 M sackaros i de nasala kapseln. Se 16 för mer information om beredning och lagring av CM-diI. Läckage av färgämnet ur huvudsakliga hålrummet måste vara minimera. I detta syfte är det nödvändigt att ändra trycket av injektion och öppnandet av Mikropipetter. Fluorescens på nivån av glomerulär lagret av luktbulben blir uppenbara 24 h efter applicering av CM-diI. Den nuvarande arbetet använder märkning med CM-diI bara för att certifiera transection förfarandet. Denna metod kan dock också användas för att erhålla morfologisk information av lukt glomeruli med konventionella histologiska procedurer.
  7. Överföra djur till återhämtning tank. Grodyngel ska återställa normal simning inom ~ 10 min. utför en noggrann inspektion för förekomst av blödningar, vilka beräknas i ~ 1% av djuren utsatts för kirurgi.
  8. Avliva skadade djur i en lösning med 0,2% i MS-222.

2. märkning av luktreceptor nervceller med fluorescerande kalcium indikatorer

  1. Bered en lösning som innehåller 12% kalcium Green-1-dextran (se Tabell för material), 0,1% Triton X-100, och 1 mM NaCl17. Förvara lösningen vid-20 ° C eller vid-80 ° C om det inte ska användas inom en månad.
  2. Förbereda Glas Pipetter med tip öppningar ~ 1 – 2 µm (liknande diameter till mikroelektroder används för patch-clamp experiment) för Mikroskop med hjälp av en mikropipett avdragare (se Tabell för material).
  3. Kalibrera volymen av microinjections. Använda destillerat vatten, justera trycket och injektion tid för att erhålla injektionsvolymer på 0,15-0,3 µL.
    Obs: Ett enkelt förfarande består i att räkna antalet pulser som krävs för att tömma en pipett fylld med 1 µL av vatten. Typiska parametrar är en tidspress 30 psi och 50 ms injektion.
  4. Placera en pipett i microinjector och ladda den med ~ 2 µL kalcium green-1 dextran lösning.
  5. Förbereda en tadpole följande steg 1.1-1.6.
  6. Flytta spetsen på pipetten i huvudsakliga kaviteten av nasal kapseln.
    Obs: Se figur 2A som beskriver platsen för lukt vägar i en Xenopus grodyngel.
  7. Använder inställningarna som erhållits i 2.3, leverera ett par bloss. Begränsa dye närvaro till nasal kapseln.
  8. Låt den grodyngel vila i 2 – 3 min. med Pasteur pipett, häll droppar av 0,02% MS-222 lösning på mer stjärtfenan delar av djuret att undvika uttorkning.
  9. Överföra djuret till återhämtning tank.
    Obs: Det bör återställa normal simning inom ~ 10 min. Manipulation av djur kan orsaka skador.
  10. Euthanize grodyngel som inte tillfrisknar normal simning beteende 15 min efter injektion med en 0,2% MS-222 lösning.
  11. Iaktta fluorescens på nivån av glomerulär lagret av luktbulben dagen efter injektionen.

3. beredning av grodyngel för levande avbildning av presynaptiska Svaren

  1. 24 – 48 h innan du utför experimentet, coat 4 – 6 petriskålar med 35 mm diameter med silikonelastomerer (t.ex. Sylgard). När elastomer har polymeriserat, fabricera en rektangulär brunn för att passa grodyngel.
    Obs: Typiska dimensioner för X. tropicalis grodyngel hittade NF skeden 48 – 52 är 10 x 4 mm.
  2. Bereda 100 mL en 160 µM till 1 mM amino syra lösningen fungerar som ett luktämnen stimulanspaket för grodyngel. Lösningen kan innehålla en blandning av flera aminosyror: metionin, leucin, histidin, arginin och lysin. Späd aminosyror i Xenopus Ringers lösning, som består av (i mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukos, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Se till att pH bibehålls på 7,8.
  3. Fyll en förhöjd behållare med 20 mL av den amino syra lösningen. Anslut reservoaren med polyeten slangen ett 28 G kapillärrör (se Tabell för material) placeras ovanför nasal kapseln.
    Obs: Kapillärröret är monterad på en micromanipulator (se Tabell för material). Luftbubblor måste vara frånvarande från perfusion systemet.
  4. Uppnå tidsmässiga precision vid tillämpningen av den amino syra lösning med transistor-transistor logic (TTL) kontrollen av nypa magnetventiler (se Tabell för material). En stimulator används för att generera TTL pulser (se Tabell för material). Kontrollera den tidsmässiga precisionen för att leverera luktämnet lösningen genom att ändra längden på TTL pulser, i.e., 0,1 till 1 s.
  5. Fyll ett annat förhöjda reservoar med 100 mL Xenopus Ringers lösning.
  6. Söva ett grodyngel och placera det under dissekera räckvidd (steg 1.1-1.6).
  7. Förbereda ett grodyngel för avbildning. Om albino grodyngel finns Fortsätt till steg 3,9, annars ta bort huden ovanför luktbulben eftersom det innehåller melanocyter som försämrar imaging (steg 3.8).
    Obs: Det finns två sätt att utföra experimentet beroende på pigmentering av djuret. Det är bättre att använda albino djur. Albino stammar är tillgängliga för X. laevis och albino X. tropicalis linjer har nyligen genererats av CRISPR-Cas9 12 eller TALENs18.
  8. Sax, använda Vännäs och göra en lateral incision på tadpole huden i utkanten av centrala nervsystemet. Gör snittet bör göras på nivån av luktbulben och aldrig nå detta bruksläge tectum, som lätt kan identifieras av synnerven var.
  9. Nypa skära huden med hjälp av pincett och dra det över nervsystemet. Verifiera lyckad borttagning av avsaknaden av melanocyter ovan luktbulben. Hålla djuret fuktig av hälla droppar av 0,02% MS-222 lösningen med en Pasteur-pipett.
  10. Placera grodyngel i brunnen av belagda skålen (se Tabell för material). Sätta ett täckglas som belagda med hög vakuum fett över djuret. Placera täckglaset för att täcka toppen av tectum till slutet av svansen.
  11. Säkerställa att de luktbulben och placodes förblir exponerade till extracellulära medium. Hålla grodyngel orörliga under imaging. Fyll petriskål med Xenopus Ringers solutioncontaining 100 µM tubokurarin (se Tabell för material) för att förhindra muskelsammandragningar.
    Obs: Tubokurarin lagras i alikvoter vid-80 ° C längre än 6 månader.
  12. Placera skålen håller grodyngel under en upprätt Mikroskop. Anslut behållaren som innehåller Xenopus Ringers lösning med skålen använder polyeten rör (se Tabell för material) för kontinuerlig perfusionen i Xenopus Ringers lösning för att hålla djuret levande för > 1 h.
    Obs: Mini magnetiska klämmor (se Tabell för material) är mycket användbara stabilt ansluta slangar till skålen. Perfusion och sug rören måste finnas i ~ 180° vinkel.
  13. Starta startas Xenopus Ringers lösning. Upprätthålla den lösningen i skålen konstant under hela försöket. Kontinuerligt utvärdera grodyngel livskraft genom att observera blodcirkulationen genom kärlen.

4. live Imaging av presynaptiska Ca2 + förändringar i lukt Glomeruli

Obs: Imaging förfarandet beskrivs för wide-fältet mikroskopi men kan enkelt anpassas till en confocal Mikroskop genom att justera inställningarna förvärv. Imaging bör utföras i en upprätt Mikroskop monterad på vibrationsdämpande tabellen.

  1. Visualisera grodyngel med en låg förstoring mål, till exempel 5 x.
  2. Flytta de micromanipulator yxorna att placera kapillären leverera luktämnet lösningen på toppen av en nasal kapsel bildar en 90 ° vinkel med luktnerven. Flödet av luktämnet lösningen ovan luktbulben bör undvikas eftersom det kan orsaka turbulenser som snedvrider imaging.
  3. Hitta luktbulben ligger ipsilaterally till nasal kapseln (med förbehåll för stimulering) använder en hög förstoring, långa arbetsavstånd, vatten nedsänkning mål: 60Xx, 0,9 N.A.
  4. Kontrollera fluorescens utsläpp genom ögat. Glomerulär strukturer bör vara uppenbart (figur 2B).
  5. Utföra live förvärv med en kamera som är lämplig för kalcium imaging. Definiera en låda som innehåller hela luktbulben, vanligtvis av 256 x 256 eller 512 x 512 pixlar. Uppsättning förvärv frame rate förvärvet till 20 – 40 Hz. justera känsligheten, så att värdena i basal fluorescens är ca 20% av mättnad. Förvärva en 5 s-video.
  6. Visualisera filmen. Kolla bild fokus, avsaknad av rörelse artefakter och regioner som innehåller mättade pixlar. Typiska fluorescens värden av glomerulär regioner bör vara 5 000 – 20 000 a.u. om använder en 16-bitars kamera. Fortsätt till nästa steg om imaging förhållanden är optimala. Upprepa steg 4,6 om behövs för att förbättra bildkvaliteten eller justera inställningarna för vinst.
  7. Starta en time-lapse förvärv för att registrera svar frammanade av lukt stimuli.
    Obs: Exakt applicering av luktämnet lösningen styrs av TTL stimuli. En typisk experiment innehåller en baseline-period 4 s, följt av stimulering tider allt från 0.1 till 0.5 s och en återhämtningsperiod på 6 – 10 s.
  8. Utföra repetitiva stimuli av odoranter tidsintervall > 2 min. Ange flödet till 1 – 1,5 mL·min-1. Eftersom den globala perfusionen är på under alla experiment, tvättas lokalt tillämpade amino syror ut.
    Obs: Volymen av lösningen i skålen är ~ 3 mL.
  9. Bildanalys
    1. Påvisande av svaren
      1. Exportera filmer till ImageJ.
        Obs: Målet är att upptäcka förekomsten av glomerulär regioner svarar på stimuli.
      2. Omvandla raw sekvensen av fluorescens bilder till en ΔF/F0 film. Mäter relativa förändringar i basala fluorescens enligt följande förhållande: (F-F0) f0, där F0 anger fluorescens utgångsnivåerna.
      3. Rita regioner av intresse (ROI) runt områden visar förmodad fluorescens ökar vid stimulering och spela in sin position i ROI manager (figur 2E). Rita en ROI för att upptäcka fluorescens bakgrundsnivåerna i ett område saknar glomerulär strukturer.
    2. Kvantifiering av svaren.
      1. Placera de definierade ROIs i fluorescens raw bildsekvensen. Få grå medelvärdet av valda ROIs för varje bildruta. Överföra sekvensen av värden som erhålls till en analysprogram (e.g., Igor Pro).
      2. Subtrahera bakgrunden fluorescens, och sedan beräkna ΔF/F0 förändringar för varje ROI (figur 2F). Rita ökningarna i ΔF/F0 för varje av de ROIs som valts. Beräkna standardavvikelsen för basal ΔF/F0 (före stimulering).
        Obs: Ett positivt svar anses om ökningar i ΔF/F0 erhållits under stimulering är större än 2 standardavvikelser av basala värden.

5. lukt-guidad beteende analys

Obs: En schematisk bild av installationen för att utföra analysen visas i figur 3.

  1. Gör små hål att passa 1,57 mm utvändig diameter x 1.14 mm I.D. slangar i den övre delen av varje brunn av en 6-väl maträtt. Infoga slangen och försegla med epoxi lim (se Tabell för material).
    Obs: Modifierade skålen kan återanvändas många gånger efter noggrann tvätt med destillerat vatten.
  2. Förbereda 50 mL av en aminosyra lösning innehållande metionin, leucin, histidin, arginin och lysin (se punkt 3.2 för detaljer). Halterna kan variera från 160 µM till 1 mM. Häll 20 mL av lösningen i en förhöjd reservoar.
  3. Mata inte grodyngel för minst 12 h innan analysen. Ta 6 grodyngel från sina bostäder tank och placera dem i 2 L av ren grodyngel vatten att minimera exponeringen för doftämnen.
  4. Placera den modifierade 6 wells maträtt på en vit LED-transilluminator (figur 3).
  5. Par perfusion öppningarna till behållaren som innehåller aminosyran lösningen med ett samlingsrör (se Tabell för material). Kontrollera systemets perfusion och eliminera luftbubblor. Fyll 6 brunnarna samtidigt. Justera höjden på reservoaren att möjliggöra leverans av ≥ 5 mL luktämnet lösning inom ~ 30 s.
    Obs: Tvätta vart väl 4 gånger med dubbel destillerat vatten efter exponering för luktämnen lösningen.
  6. Fyll varje brunn med 10 mL grodyngel vatten. Plats 1 grodyngel per brunn. Låt vila i > 3 min.
  7. Ställa in bild förvärv. Använd en vanlig CCD-kamera som kan skaffa bilder på ≥ 5 Hz. Anslut kameran till en dator. Använda här en Zeiss MRC5 kamera kontrolleras av Zen programvara men andra motsvarande konfigurationer kan användas. Om det är nödvändigt att öka bildfrekvensen, applicera pixel binning. Bilderna ska visa hela 6-väl skålen.
  8. Börja bild förvärv så att filmer innehåller basala (30 s), stimulans (25 – 35 s) och återhämtning (30-60 s) perioder.
  9. Returnera djur från 6 wells skålen till tankar efter imaging.
  10. Analysera filmer i ImageJ använder plugins såsom wrMTrck19,20 som ger flera parametrar som är associerade till motilitet.
  11. För att förbereda bilder för analys, markerar du först en väl genom att rita en rektangulär ROI på 35 x 35 mm (figur 4A). Skaffa en bakgrundsbild genom att beräkna den maximala projektionen av hela sekvensen. Den bör visa en bild av väl utan grodyngel.
  12. Subtrahera den maximala projektionen från raw filmen. Utföra tröskelvärde på genererade 32-bitars filmen och tillämpa wrMTrck plugin. Justera WrMTrck parametrar för att på ett tillförlitligt sätt spåra djurens förflyttningar. Överföra de erhållna X, Y-koordinater i ett analysprogram.
  13. Använda X-Y-koordinater, beräkna det euklidiska avståndet till luktämnet källan (perfusion inlopp i brunnen), genom tillämpning av följande ekvation:
    Equation 1
    där os anger positionen för lukt källa och tad visar grodyngel position vid en viss tidpunkt. Se figur 4A för detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I detta papper, vi presentera en kombination av två kompletterande metoder att utföra i vivo studie av funktionaliteten i Xenopus grodyngel luktsinnet: jag) en metod för imaging presynaptiska Ca2 + förändringar i glomeruli levande grodyngel med ett fluorescerande kalcium indikator, och ii) guidade en lukt beteendemässiga analysmetod som kan användas för att undersöka specifika vattenburna odoranter svar. Eftersom dessa metoder har använts för att utvärdera återvinning av lukt behandling efter skada10, beskrivs också en enkel metod för transecting luktsinnet nerver.

Transection av lukt vägar i Xenopus grodyngel
Det finns två sätt att intyga giltigheten av förfarandet. Båda beroende på visualisering av luktsinnet nerver använder fluorescerande reportrar. En metod är baserad på transgena grodyngel som uttrycker fluorescerande proteiner på deras nervsystem. Två rekommenderade rader som uttrycker GFP under neuronal β-tubulin främjare är X. laevis tubb2b-GFP och X. tropicalis NBT-GFP (figur 1, se Tabell för material). Om bara det finns vilda djur, CM-diI kan användas (se steg 1,8). Figur 1 visar bilder av tubb2-GFP X. laevis grodyngel. Bilderna är från fyra olika djur där en enda luktnerven var transected. Snittet ska vara uppenbart omfattas dissektion. Fördelen med att använda transgena linjerna är att reformationen i luktnerven kan följas under en tid. När du gör sekventiella observationer, rekommenderas det att minimera exponeringen för fluorescerande ljus att förebygga åldrad hud. Snittning av en enda luktnerven är användbart när en intern kontroll krävs, som till exempel att jämföra normalt utvecklade vs rewired glomerulär enheter. Snittning av både luktsinnet nerver bör tillämpas när syftet är helt undertrycka överföring av information.

Live avbildning av presynaptiska Svaren till lukt stimuli
Den rätta märkning av ORNs med kalcium green-1 dextran kan observeras på den nivån i luktbulben (figur 2A) använder widefield mikroskopi. Glomeruli är uppenbara (figur 2B) och bör visas distribueras i olika lager genom att flytta fokus planet. Morfologi av glomerulär strukturer kan lösas bättre om confocal Mikroskop används istället (figur 2C). Antalet märkta glomeruli beror på dye upptag av luktepitel. Denna procedur tillåter därför inte visualisering av alla glomerulär enheter. Djur som visar en intensivare fluorescens färgning av glomerulär regionen bör väljas innan du utför bildbehandling experiment, eftersom de innehåller mer ORNs märkt. Denna manöver rekommenderas starkt för att öka experimentella genomströmning och bör utföras under en dissekera omfattning utrustad med en fluorescens-lampa. Avvisa djur som inte visar märkt glomerulär enheter eller som visar fluorescens begränsas till särskilda områden av glomerulär lagret. Presynaptiska Ca2 + Svaren kan observeras så snart 1 dag efter dye lastning. För att genomföra imaging experiment är det önskvärt att använda mål av hög numerisk bländare, typiskt ≥0.9.

Ökningar av presynaptiska kalciumnivåer kan vara frammanade utsätta dendritiska knoppar av ORNs till aminosyror. Det är viktigt att placera kapillären leverera luktämnet lösningen ovan nasal kapseln. Försiktighet bör iakttas att undvika kontakt eftersom det kan täppa till spetsen av kapillären eller orsaka mekanisk stimulering av ORNs. Övergående ökningar av presynaptiska kalciumnivåer kan observeras för stimuli ≥0.1 s (figur 2D) och är ett tecken på en rätt lukt transduktion. Det är också viktigt att visualisera basala kalciumnivåer med låg kameran vinst. Presynaptiska terminaler av ORNs Visa hög fluorescerande ökar och det är viktigt att undvika signalerar mättnad. Hög temporal upplösning kan uppnås med widefield mikroskopi. Till exempel är använder en elektron-multiplicerade CCD-kamera, det möjligt att uppnå bildfrekvens på 50 Hz eller högre. Användning av konfokalmikroskopi minskar temporal upplösning men tillåter en bättre definition av glomerulär strukturer.

Kalcium grön hög affinitet för bindande kalcium (190 nM) är särskilt användbart för att upptäcka små svaren. Övergående intracellulära kalcium ökar upptäckts i glomerulär lagret är variabel. Vissa glomerulär regioner visar förändringar i ΔF/F0 ≥0.2, medan närliggande processer inte svarar ens (figur 2D). Följande faktorer bidrar till variationen i svaret av den glomerulära enheter: i) det totala antalet märkta glomeruli, ii) den intracellulära koncentrationen av kalcium grön och iii) ORNs att upptäcka aminosyror selektivitet. Eftersom ett för lågt antal märkta glomeruli kan hindra att observera svaren, är det absolut nödvändigt att genomföra dessa experiment med djur innehåller som många märkt ORNs som möjligt.

Luktsinnet-guidad beteende
Analys av data
Luktsinnet-guidad beteende studeras med ett specialbyggda system. Figur 3 visar en schematisk ritning av utrustning som används för att utföra analysen. Testet baseras i grodyngel förmåga att upptäcka förekomsten av aminosyror, som fungerar som doftämnen. En lösning som kombinerar fem olika aminosyror (metionin, leucin, histidin, arginin och lysin) används för stimulering. Lösningen levereras lokalt under 30 s till en 35 mm brunn innehållande ett frisimmande grodyngel. Grodyngel omedelbara svar på inkommande lösningen är en ökad motilitet. Slumpmässiga rörelser som inträffar under den inledande ∼5 – 10 s lösning ansökan följs av en direkt simma mot källan av doftämnen. Grodyngel kvar i flera sekunder i närheten av munstycket under leverans av aminosyror och återhämta gradvis motilitet i slumpmässiga riktningar (se kompletterande videor 1, 2).

De experimentella förhållanden beskrivs tillåter normala simma X. tropicalis grodyngel stadier 48-52; men måste det beaktas att motiliteten av större djur kan vara begränsad på 35 mm brunnar. Grodyngel rörelser registreras med en CCD-kamera. Attraktion för luktämnen lösningen kan upptäckas som en minskning av det euklidiska avståndet mellan perfusion inlopp från grodyngel position (figur 4). Spårning av grodyngel chef positioner inom ett område av 35 x 35 mm (eller motsvarande storleken i pixlar) kan erhålla en kvantitativ analys av lukt-guidad beteende (figur 4A). Enskilda tomter av grodyngel rörelser är konstruerade med X-Y-koordinater som erhållits genom bildanalys (figur 4B). Extraherade motilitet tomterna måste återge videobilder.

Det finns två möjliga metoder att tolka lukt-guidad beteende experiment. Det första synsättet bygger på en tidigare studie med zebrafishes21. Mätning av den tid som tillbringas i närheten av munstycket leverera odoranter bevisar förekomsten av en positiv tropism. En region av intresserar av 8,75 mm radie (motsvarar ¼ av väl diametern) centrerad på inloppet lösning används för att klassificera närheten av djuren till luktämnet källan (figur 4A, 4 C). Binning den tid som grodyngel i närheten av munstycket under angivna perioder, dvs 15 s intervaller, tillåter att identifiera förmågan att upptäcka aminosyra lösningar (figur 4D). Övergripande beteendet hos en population av grodyngel kan erhållas genom att plotta fördelningen av individuella data (figur 5A). En positiv tropism kan upptäckas när lösningen av metionin, leucin, histidin, arginin och lysin är beredd vid 1 mM eller 160 μM (figur 5A och 5B). Djur svarar inte på vatten ansökan (bild 5C), således kasta deltagande av mechanosensitive mekanismer. Skillnader mellan tid intervall som definieras i varje experimentella gruppen kan fastställas med icke-parametriska upprepade mätningar ANOVA med Dunns multipla jämförelser test. Nackdelen med binning data i tidsintervall 15 s är en minskad temporal upplösning.

Ett sätt att öka temporal information av den beteendemässiga svaren är genom att göra genomsnittliga tomter euklidiska avstånd från lukt källa. Men grodyngel rörelser visar en inneboende variation, visar den genomsnittliga motiliteten i en population av djur (vanligtvis ≥40) den lukt-guidad beteenden. För att utföra denna analys är det nödvändigt att gruppen djurens positioner före uppkomsten av stimulering. Eftersom grodyngel finns på olika platser när luktämnet lösningen träder i brunnen krävs det att ange euklidiska avståndet till 0 precis innan stimulering (figur 6A, se även inklusionskriterierna i figur 7). Negativa och positiva värden anger därför en attraktion eller en motvilja från lukt källa, respektive. En attraktion för lukter är väl beskriven av en linjär passform med regression koefficienter ≥0.9. Om vatten levereras, netto ändringarna av euklidiska avstånd distribueras runt 0 och det är inte möjligt att anpassa en linje under luktämnet stimulering, vilket indikerar frånvaro av en lukt-guidad beteende (figur 6B). Jämförelse av genomsnittliga tomter euklidiska avstånd för aminosyra lösningar beredda på 1 mM och 160 µM föreslår olika förseningar i lukt-guidad svaret (jämför figur 6A och C). Det tidsintervall som krävs för att inleda rörelsen mot källan av doftämnen är kortare när aminosyror används vid en högre koncentration. Brist på lukt-guidad beteende observeras i grodyngel med både luktsinnet nerver transected (figur 6D).

En begränsning av beskrivs lukt-guidad beteendemässiga analysen är inrättandet av komplexa flytande plymer. Detta kan ses om den amino syra lösningen ersätts av ett färgämne, såsom snabbt Green, när du ställer in systemet. Användning av färgade lösningar kontrollerar bildandet av plymer och visar att vattenburna odoranter nå någon region i brunn inom 5 s. turbulenser orsakade av leveransen av lösningen upptäcks sannolikt av den laterala linjen av grodyngel och förmodligen bidra till variabiliteten observerats hos djur motilitet men stör inte luktsinnet guidade beteende. Kontroll-experiment som genomförs med hjälp av vatten i stället för aminosyra lösningar avslöja att grodyngel är kapabel att diskriminera lukt från mekaniska stimuli. Uppskattning av tid i en region av intresse (figur 5) och genomsnittliga handlingen i euklidiska avstånd (figur 6) är två kompletterande metoder för att beskriva den lukt-guidad Svaren av grodyngel.

Inklusionskriterier
Inklusionskriterier måste också beaktas för dataanalys. Vissa grodyngel visar en resonant rörelse, vilket illustreras av montering av handlingen i euklidiska avstånd till en sinusformad funktion(figur 7). Grodyngel visar detta beteende måste kasseras från all analys.

Uteslutandet av djur som i början av tillämpningen av luktämnet lösningar är högst (> 30 mm figur 7B) eller ett minsta euklidiska avstånd (< 5 mm, figur 7C) från munstycket gör minskar variabiliteten av de genomsnittliga tomterna. I exemplet som illustreras i figur 7B visar en positiv tropism för amino syra lösningen. Grodyngel ligger på ett maximalt avstånd av lösning inloppet vid uppkomsten av stimulering. Denna relativa position kan därför endast avslöja en attraktion för lukt källa. Figur 7 C visar den omvända situationen. Här, ligger en tadpole i närheten av munstycket leverera amino syra lösningen. Kvantifiering av den tid som tillbringas nära lukt källa visar ett svar (metod används i figur 5). dock kan det Visa en netto rörelse mot inloppet.

Sammanfattningsvis definierar den föreslagna haltbestämningen av lukt-guidad beteende ett binärt test. Denna metod kan användas för att upptäcka en experimentell grupp av grodyngel förmåga att bemöta odoranter. Ytterligare förbättringar krävs om syftet etablerar skillnader bland komplexa lukt-guidad svaren, som till exempel att bestämma inställningar för lukter.

Figure 1
Figur 1: Transection av luktsinnet nerver. Representativa bilder av tubb2-GFP X. laevis grodyngel erhålls efter transection av en enda luktnerven (pilar). Nerver av tubb2-GFP grodyngel Visa stark fluorescens. Nerv transection är uppenbart omedelbart efter operation (D0). Återväxt av luktnerven är uppenbart 4 dagar efter snittet (D4). Åtta dagar efter operation (D8) det är liten skillnad mellan kontroll och reformerade nerver. Grodyngel var sövda i 0,02% MS-222 att samla bilder. Luktbulben (O.B.), luktnerven (Olsson), nasal kapsel (N.C.), tectum (Tec), synnerven (Op.N.). Pilarna anger platsen för den transected nerven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Märkning av luktreceptor nervceller med kalcium grön dextran och visualisering av presynaptiska calcium tillströmningen vid stimulering med aminosyror. (A) överförda ljus bild av ett grodyngel som visar placeringen av luktepitel, luktsinnet nerver och glomerulär lagret av luktbulben. (B) bild av en luktbulben visualiseras av widefield (wf) mikroskopi. Neuroner var märkt av tillämpningen av kalcium green-1 dextran på nasal kapseln. Fluorescensen observerade motsvarar presynaptiska terminaler från luktreceptor nervceller bildar glomeruli. Olssons: luktnerven; Olsson: luktbulben. (C) Confocal avsnitt beläget dorsalt från posten i luktnerven till glödlampan. Den presynaptiska komponenten av lukt glomeruli var märkt med kalcium green-1 dextran, som i B). (D) presynaptiska terminaler öka kortvarigt sina kalciumnivåer vid exponering av luktepitel att en lösning innehållande fem olika aminosyror. Relativa förändringar i kalcium fluorescens erhållits före, under och efter 1 s stimulering. (E) Distribution av 10 olika regioner av intresse (ROIs) används för att kvantifiera ΔF/F0 förändringar. ROI11 är utanför det glomerulära lagret och används för att definiera bakgrundsnivåer av fluorescens. (F) enskilda ΔF/F0 Svaren för ROIs definieras i E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Luktsinnet-guidad beteende analys. (A) Schematisk bild visar den utrustning som används i testet. (B) exempel på motilitet spår inspelade över 90 s. Varje cirkel representerar en brunn innehållande ett enda djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Spårning av lukt-guidad beteende. (A) i exemplet visar en brunn används för beteendemässiga analysen. Blå streckade linjer visar platsen för X, Y-koordinater (i mm) används för att spåra grodyngel rörelser (se även kompletterande Video 1). Den gröna ellipsen representerar position inloppet lösning. Den prickade svarta linjen visar området proximala till röret levererar den amino syra lösningen (se text för detaljer). (B) motilitet av den grodyngel som visas i A) under den beteendemässiga assay. Färgkodade spår ange positionen för djuret innan (grå) och efter olfactory stimulering (violett). Rörelser under tillämpningen av luktämnet lösningen illustreras i en temporal färgövertoning (30 s, rött till blått). (C) med X, Y grodyngel positioner är det möjligt att beräkna förändringar i euklidiska avståndet från grodyngel chef till inloppet perfusion. Avstånd kortare än 8,75 mm motsvara det proximala området av munstycket. (D) tomt den tid som grodyngel i regionen definieras av den streckade linjen i A). Varje prick indikerar en 15 s-period. Djuret är lockade av luktämnet lösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Grodyngel lockas av aminosyror. (A) tid som användes av grodyngel i närheten av lukt källa. Varje bin består av en 15 s-period. Lådagram representerar medianen (svart horisontell linje), 25 till 75% kvartiler (lådor) och dataområden (morrhår). Leverans av en lösning med 1 mM i aminosyran lockade grodyngel till lukt källa. (B) grodyngel lockades av luktämnet lösningen när koncentrationen av aminosyror reducerades till 160 μM. (C) leverans av vatten ändra inte djurs beteende. Upprepade mätningar ANOVA med Dunn's flera jämförelser test, p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Temporal svar av grodyngel odoranter. (A) tomt Genomsnittligt euklidiska avstånd till lukt källan som en funktion av tiden. Euklidiska avståndet sattes till 0 innan stimulering i varje individuella trace. Negativa och positiva värden anger en minskning och ökning av avståndet till lukt källan, respektive. Attraktion till lukt källa kan beskrivas av en linjär passform (r2= 0,98). (B) leverans av vatten ändrar inte avståndet till lukt källa. (C) grodyngel svara på tillämpningen av en 160 μM lösning av aminosyror som framkommit vid en linjär passform (r2= 0,96). (D) grodyngel med både luktsinnet nerver transected svarar inte på aminosyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Inklusionskriterier för lukt-guidad beteende analysen. (A) vissa grodyngel visar en resonant rörelse. Detta beteende avslöjas av framgångsrika anfall av en sinusformad funktion till handlingen i euklidiska avståndet till lukt källa. Grodyngel visar denna verksamhet bör undantas från testet. (B, C) Ett sätt att minska variationen i det genomsnittliga temporal svaret odoranter (figur 6) är genom att utesluta djur som ligger på högst (B) eller (C) Euclidean minimiavstånd på uppkomsten av stimulering. Röda streckade linjer anger tröskelvärdet (30 mm och 5 mm). Euklidiska avståndet innan uppkomsten av stimulering (pil, vänster tomter) är inställd på ”0” till betänkandet värden attraktiva eller repulsiva beteenden som negativa eller positiva (rätt tomter), respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Video 1
Kompletterande Video 1: lukt-guidad beteende utlöses av leverans av en aminosyra lösning. Filmen visar en tadpole fritt på en 35 mm simförmåga. Den blå ellipsen anger positionen för munstycket leverera luktämnet lösningen. I början och slutet av stimulering indikeras med gröna och röda prickar, respektive. Figur 4 visar analysen av beteendet observeras. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Supplementary Video 2
Kompletterande Video 2: grodyngel motilitet vid leverans av vatten. Filmen visar en tadpole fritt på en 35 mm simförmåga. Den blå ellipsen anger positionen för munstycket släpper MQ vatten. I början och slutet av vatten leverans markeras med gröna och röda prickar, respektive. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta dokument beskriver tekniker som är användbara för att undersöka funktionen av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel. Det nuvarande protokollet är särskilt användbart för de laboratorier som arbetar, eller har tillgång till Xenopus; men är det också intressant för de forskare som studerar cellulära och molekylära baserna av neuronala förnyelse och reparation. Resultat som erhållits i Xenopus kan kombineras med uppgifter som samlats in i andra ryggradsdjur modeller för att identifiera bevarade mekanismer. Metoderna kommer att dra nytta av utvecklingen av genetiskt modifierade Xenopus18,22,23 och tillämpliga experimentella modeller av nervsystemet sjukdomar i grodyngel24, 25.

För att erhålla reproducerbara in vivo-data, är det nyckeln till korrekt bakre Xenopus grodyngel. Särskilt är X.tropicalis mycket känsliga för dåliga boendeförhållanden. Exempelvis de tål inte temperaturer under 20 ° C och bör förvaras i tankar eller vattensystem i intervallet 24-28 ° C. Det är också viktigt att inte öka djurtäthet ovan fastställda gränsvärden, regelbundet mata grodyngel och hålla en optimal vatten kvalitet13. Hantering av djur kolonier efter standardiserade förhållanden krävs absolut för att få reproducerbarhet invivo experiment.

Den beskrivna metoden för kalcium imaging är användbart för att upptäcka en rätt lukt transduktion av ORNs in vivo. Lastning av ORNs med kalcium green-1 dextran uppnås genom övergående permeabilisering av plasmamembranet med en låg koncentration av Triton x-100, som tidigare rapporterade17. Den största fördelen med denna laddningsmetod är enkelhet, eftersom det endast krävs en microinjector. En viktig nackdel är att Triton x-100 orsakar övergående eliminering av lukt cilier och Mikrovilli. Luktepitel av zebrafisk regenererar inom 48 h efter behandling17. Förnyelse i Xenopus grodyngel kan vara ännu snabbare eftersom Svaren till doftämnen kan observeras 1 dag efter dye lastning (figur 2D). En detaljerad Morfologisk analys krävs dock att korrekt uppskatta tiden regenerering av luktepitel efter Triton x-100 behandling.

Märkning ORNs med kalcium green-1 dextran är endast effektivt i en population av nervceller, som möjliggör visualisering av presynaptiska terminaler med högt signal-brus-förhållande (figur 2B och 2 C). Den nästan totala avsaknaden av bakgrunden är fördelaktigt om jämfört med lastning av hela luktbulben med AM ester former av kalcium färgämnen. Antalet fluorescerande ORNs avviker från djur till djur. Det är således nödvändigt att använda en bred olfactory stimulans av flera aminosyror. Vi har fått goda resultat med en lösning av metionin, leucin, histidin, arginin och lysin. Andra kombinationer av olika aminosyror kan också vara effektiva. En alternativ metod att ladda ORNs med kalcium indikatorer är elektroporation26, som ofta används för att uttrycka genetiskt kodade fluorescerande reportrar i grodyngel nervceller27. Elektroporation kan göras med hjälp av kommersiella eller skräddarsydda utrustning och möjliggör visualisering av neuronala strukturer med en utmärkt signal-brus-förhållande28. På samma sätt som den beskrivna metoden, cellpopulationer märkt är heterogena och skiljer sig från djur till djur. Genmodifiering är önskvärt om syftet är undersöka en definierad population av nervceller22. Exempelvis kan det vara mycket användbart att undersöka svaret av en definierad uppsättning presynaptiska terminaler till odoranter körning uttrycket av genetiskt kodade kalcium indikatorer såsom GCaMPs i en begränsad grupp av ORNs.

Den beskrivna metoden använder kalcium-grön 1 dextran rapporterar presynaptiska terminal funktion invivo. Observationen av intracellulära kalcium ökar är vägledande för en rätt lukt transduktion och frisättning av glutamat i nivå med glomeruli. Kvantitativ analys av förändringar i fluorescens är dock begränsad. Stimulering av presynaptiska terminaler ökar intracellulära kalciumnivåer till intervallet mikromolära och mättnad av en hög affinitet kalcium indikator såsom kalcium gröna måste beaktas. Illustreras i figur 2 resultat använder widefield mikroskopi. Detta är det enklaste tillvägagångssättet och kan implementeras i de flesta laboratorier. Förbättring med hjälp av 2-foton mikroskopi eller genetiskt kodade fluorescerande reportrar kunde tillåta att erhålla mer kvantitativa uppskattningar av presynaptiska funktion.

För levande imaging av kalcium svar är det viktigt att det finns lämplig placering av kapillären leverera luktämnet lösningen. Det bör placeras ovanför nasal kapseln och alltid undvika direktkontakt med vävnad. Både den korrekt leveransen av luktämnet lösningen och flödet av perfusionen bör kontrolleras innan du placerar grodyngel under mikroskopet. Alla slangar används för perfusionen måste inspekteras med luftbubblor. Flöde ändringar av amino syra lösningen har att omedelbart reagera på successiva öppning och stängning av magnetventilen. Förseningar är vägledande i närvaro av luft. Det är också önskvärt att kontrollera för rätt volym ökar eller minskar lösning levereras efter byte öppningstid, i.e., från 0,1 s till 1 s eller vice versa. Använd en låg ljusintensitet tablåpaket experimentella parametrar (steg 4,6) för att minimera fotoblekning.

Även om vikten av luktsinnets funktion i biologin av grodyngel är väletablerade29, finns det en brist på tester direkt bedömer lukt-guidad beteende i Xenopus larver. Den metod som beskrivs i detta dokument är ett enkelt test som möjliggör upptäckt av ett svar på en lukt stimulans i en stor population av djur. Den senaste beskrivningen av luktämnet känslighet Rana catesbeiana grodyngel för förekomsten av kemikalier i vatten illustrerar de komplexa mekanismer koppling luktsinnets funktion till motoriska beteende30. Den analysmetod som beskrivs i denna uppsats tar hänsyn till de inneboende variabilitet lukt-guidad beteende hos grodyngel. Användning av en 6-väl maträtt i stället för enstaka brunnar ökar experimentella genomströmning. Faktorer som bidrar till variationen är sådana basala motilitet, relativa position till perfusion inlopp och plymer som genereras av luktämnet lösningen överbryggas genomsnitt många grodyngel. Cirka 40 oberoende mätningar krävs att beskriva kontroll attraktiva svaret för aminosyror.

Vi föreslår två typer av analys för lukt testet. Det första synsättet kvantifierar den tid nära lukt källa över en definierad period. Det är särskilt väl lämpade för statistisk analys. Den andra strategin baseras på genomsnittliga handlingen i euklidiska avstånd från lukt källa och är användbar för att beskriva den temporal svaren på odoranter. Båda typer av analys är komplementära och komma genererade av samma data. Tolkningen är binärt och tillåter särskiljande djur att känsla doftämnen från dem som gör inte10.

Hur kunde de metoder som beskrivs vara användbar till Xenopus gemenskapen? Även om metoderna illustreras i huvudsak för vilda djur, bör det tas hänsyn till att genetiska möjligheter utökar kontinuerligt i fältet Xenopus . Den kombinerade studien av invivo ORN svaren och förekomsten av lukt-guidad beteende kan också vara mycket användbar för att undersöka den korrekt behandlingen av lukt information i Xenopus mutanter skapade antingen framåt eller bakåt genetiska skärmar 11. den information som tillhandahålls av kalcium imaging och beteendemässiga analysen kan kombineras. Exempelvis en mutation som selektivt påverkar granule celler i luktbulben skulle inte ändra ORNs presynaptiska svar men förmodligen skulle försämra lukt-guidad beteende.

Metoder som associerar cellulära och beteendemässiga svaren i vivo är särskilt relevanta för genetiska dissektion av neuronala kretsar. Tolkning av resultat kan vara hjälpt av tidigare morfologiska arbeten, som har gett en anatomisk karta över glomerulär lagret i grodyngel31. Information som erhållits från luktbulben skivor av Xenopus grodyngel32 är också mycket värdefullt. Kalcium avbildning av mitral/tuftade celler i luktbulben skivor har avslöjat grundläggande egenskaper lukt behandling i Xenopus grodyngel, som for example ORNs till olika aminosyror33 känslighet eller relevans svar latenser i kodning av lukt information7. Hjärnan segment visar dock en begränsad förmåga att återge de komplexa integrativa mekanismer som kopplar olika neuronala kretsar på grund av den snittning av talrika neuronala prognoser. En karakterisering av egenskaperna för enskilda glomerulär enheter är också ännu gäckande med undantag för de γ-njure34. Frågan om huruvida enda glomerulär enheter fastställa specifika beteenden i grodyngel besvaras endast genom att kombinera genetisk verktyg, i vivo imaging metoder och beteendemässiga analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) samfinansieras av den Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), av konkurrenskraftig forskning awards från den M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fonden, Laura och Arthur Colwin begåvad sommaren Research Fellowship Fund , den Fischbach gemenskap och stor Generation fonden av den marinbiologiska laboratorium och den nationella Xenopus resurs RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) där en del av detta arbete utfördes. Vi tackar också CERCA Program / Generalitat de Catalunya för institutionellt stöd. A.L. är en Serra Húnter Karl.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) Tecniplast XPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) World Precision Instruments 501985
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) World Precision Instruments 501778
Whatman qualitative filter paper Fisher Scientific WH3030917
X. laevis tubb2-GFP National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFP European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiI ThermoFisher Scientific C-7001
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic ThermoFisher Scientific C-3713
Borosilicate capillaries for microinjection Sutter Instrument B100-75-10 O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.
Puller Sutter Instrument P-97
Microinjector Parker Instruments Picospritzer III
Sylgard-184 Sigma-Aldrich 761028-5EA
Microfil micropipettes World Precision Instruments MF28G-5
Upright microscope Zeiss AxioImager-A1
Master-8 stimulator A.M.P.I.
CCD Camera Hamamatsu Image EM
Solenoid valves Warner Instruments VC-6 Six Channel system
Dow Corning High Vacuum Grease VWR Scientific 636082B
Tubocurarine hydrochloride Sigma-Aldrich T2379
CCD Camera Zeiss MRC-5 Camera Controlled by Zen software
camera lens Thorlabs MVL8ML3 There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used
Epoxy resin RS Components
Manifold Warner Instruments MP-6 perfusion manifold
Micromanipulator for local delivery of solutions Narishige MN-153
Mini magnetic clamps Warner Instruments MAG-7, MAG-6
Polyethylene tubing Warner Instruments 64-0755 O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328, (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395, (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69, (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37, (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67, (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5, (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48, (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525, (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2, (6), 91 (2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317, (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18, (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1, (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426, (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6, (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11, (1), 14 (2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33, (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36, (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489, (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26, (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123, (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35, (20), 7892-7902 (2015).
Funktionell utvärdering av lukt vägar i levande <em>Xenopus</em> grodyngel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).More

Terni, B., Pacciolla, P., Perelló, M., Llobet, A. Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (142), e58028, doi:10.3791/58028 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter