Summary
Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.
Abstract
Xenopus kurbağa yavrularını sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Onlar çok sayıda görüntüleme yaklaşımlar, elektrofizyolojik teknikleri ve davranışsal deneyleri için erişilebilirlik gibi birden çok deneysel avantajlar sağlar. Xenopus iribaş koku alma sistemi normal gelişim sırasında kurulan veya yaralanma sonra reform sinapslarda işlevi araştırmak için özellikle uygundur. Burada, biz yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için yöntemleri tarif Xenopus larvaları. Biz bir arada glomeruli koku güdümlü davranış deneyleri ile olfaktör ampul presynaptic kalsiyum tepkilerin içinde vivo ölçümlerin anahat. Yöntemleri Olfaktör sinirler sinaptik bağlantı hızına uyumlanma çalışmaya transeksiyon ile kombine edilebilir. Deneyler vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar GFP gazetecilere merkezi sinir sistemi hücrelerdeki ifade kullanarak sunulmaktadır. Uygulama için genetik olarak değiştirilmiş kurbağa yavrularını açıklanan yaklaşımların omurgalı davranışı tanımlayın moleküler üsleri çözülüyor için yararlı olabilir.
Introduction
Xenopus kurbağa yavrularını sinir sisteminin normal işlevi eğitim için mükemmel bir hayvan model oluşturur. Şeffaflık, tam sıralı genom1,2ve cerrahi, elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri erişilebilirlik nöronal işlevleri içinde vivo3 soruşturma izin Xenopus larva benzersiz özelliklerdir . Bazı hayvan bu modelin çok deneysel olasılık iribaş duyusal ve motor sistemleri4,5,6tarihinde gerçekleştirilen kapsamlı çalışmalar tarafından gösterilmiştir. Bilgi sinapslarda düzeyinde işlem birçok yönlerini incelemek için özellikle uygun bir nöronal devre Xenopus iribaş koku alma sistemi7' dir. İlk olarak, onun sinaptik bağlantı iyi tanımlanmış: koku reseptör nöronlar (ORNs) proje olfaktör ampul ve dendrites glomeruli koku eşleme içindeki mitral/tufted hücreleri ile sinaptik temas kurmak. İkinci olarak, onun ORNs sürekli neurogenesis koku yolları8işlevselliğini korumak için hayatı boyunca tarafından oluşturulur. Ve üçüncü olarak, Xenopus kurbağa yavrularını koku alma sistemi büyük bir rejeneratif yetenek gösterir çünkü tamamen onların olfaktör ampul ablasyon9' dan sonra reform yapabiliyor musunuz.
Bu yazıda, koku glomeruli yaşayan kurbağa yavrularını görüntüleme koku yolları işlevselliğini çalışmaya Davranışsal deney ile birleştirmek yaklaşımları açıklar. Burada ayrıntılı yöntemleri glomerular bağlantısı'nda olfaktör ampul fonksiyonel iyileşme Olfaktör sinir transeksiyon10' dan sonra eğitim için kullanılmıştır. Xenopus iribaşlar alınan verileri çoğu temsilcisi omurgalıların koku işleme evrimsel olduğu için korunmuş.
X. tropicalis kullanarak açıklanan yöntemleri örneği ama Xiçinde kolayca uygulanabilirdi. laevis. Yetişkin X. laevisdaha büyük boyutlarına rağmen her iki tür iribaş aşamaları sırasında oldukça benzer. Ana farklar genomik düzeyinde bulunur. X. laevis çoğunlukla onun allotetraploid genom ve uzun oluşturma süresi (yaklaşık 1 yıl) tarafından belirlenen zavallı genetik tractability görüntüler. Buna ek olarak, tropicalis X. daha kısa oluşturma süresi (5-8 ay) ve diploit genom nedeniyle genetik değişiklikler için mükellef. Temsilcisi deneyler vahşi-türü hayvanlar ve üç farklı transgenik satır için gösterilmiştir: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) ve tubb2:GFP (X. laevis).
Geçerli çalışmalarında özetlenen metodolojileri Xenopus alanındaki genetik ilerledikçe birlikte düşünülmelidir. Sadelik ve sunulan teknikleri kolay uygulanması yapar onları zaten açıklanan mutantlar11, hem de CRISPR-Cas9 teknoloji12tarafından oluşturulan Xenopus satırları değerlendirmek için özellikle yararlı. Biz de Xenopus kurbağa yavrularını erişimi olan herhangi bir laboratuvar uygulanan Olfaktör sinirler transect için kullanılan bir cerrahi prosedür tanımlamak. Yaklaşımlar presynaptic kalsiyum yanıtları değerlendirmek için kullanılan ve koku güdümlü davranış gerektiren belirli donanımları, kullanılabilir olsa, ılımlı bir mal. Metodolojisi bunların kullanımı araştırma gruplarındaki tanıtmak için basit bir form içinde sunulan ve daha karmaşık deneyleri üsleri geliştirmeler uygulayarak ya da Derneğin diğer teknikleri, yani, histolojik veya genetik yaklaşımlar için ayarlayabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları hayvan Araştırma Etik Komitesi, Barselona Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Not: X. Tropicalis ve X. laevis kurbağa yavrularını standart yöntemleri13,14göre yetiştirilen. Kurbağa yavrusu su ticari tuzları ( Tablo malzemelerigörmek) ters ozmos tarafından elde edilen su ekleyerek hazırlanır. İletkenlik ∼700 µS ve ∼1, X. tropicalis ve X. laevis kurbağa yavrularını için 400 µS için sırasıyla ayarlanır. Larva doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon14tarafından elde edilebilir. Embriyo 0.1 x Marc'ın modifiye Ringers (MMR)'l-sistein hazırlanan % 2 ile dejellied. 1 x MMR içerir (mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7.8. Larva (sahne 25) 2-3 gün sonra 2 lt tank iribaş su ile aktarılır. Kurbağa yavrularını Nieuwkoop-Faber (NF) ölçüt1540 aşaması ulaştığınızda, onlar 5 L tanklarda yerleştirilir ve 10 bir yoğunluk muhafaza X. tropicalis ve X. laevis için hayvanlar/L. sıcaklık 23-25 ° C ve 18 – 20 ° C de sabit tutulur kurbağa yavrularını, anılan sıraya göre. NF ölçüt 48-52 aşamalarında bulunan hayvan deneyleri için kullanılır.
1. transeksiyon Olfaktör sinirler
- %0,02 anesthetizing bir çözüm hazırlamak MS-222 iribaş su oda sıcaklığında 50 ml.
- Küçük tankı (1-2 L) kurbağa ile su kurtarma hayvan ameliyattan sonra izin vermek için hazır olun.
- Selüloz nitel filtre kağıdı (4 cm x 3 cm, bakınız Tablo reçetesi) dikdörtgen parçalar koparıp.
- Selüloz nitel filtre kağıdı % 0,02 MS-222 çözüm içinde 2 adet ıslak ve parçalanmış kapsamına koyun.
- Bir kurbağa yavrusu tankından almak ve anesthetizing çözüm içine bırakın. Hayvan 2-4 dk içinde yüzme durdurur ve cımbız kullanarak kuyruk düzeyinde uygulanan mekanik uyaranlara tepki vermez.
-
İmzalat iribaş üzerinde filtre kağıt dikdörtgen alin. Beyin yapıları görüntülenir şekilde hayvan onun dorsal yüzü yukarı, bakacak şekilde yerleştirin.
- Kenasen makas ( Tablo malzemelerigörmek) kullanılarak bir veya her iki Olfaktör sinirler (uygulanacak tahlil tipine) kesme. Sinir yaralanması iç denetim gerektiren deneyler için tek bir sinir transect.
- Davranışsal deney için her iki sinir olfaktör ampul için gelen tüm propil bilgileri bastırmak için transect. Olfaktör sinirler kesit verimliliğini diseksiyon kapsamına kolayca görülebilir; Ancak, pigmentasyon ya da hayvan pozisyonunda faktörler sınırlama.
Not: (İsteğe bağlı) En iyi yolu yordamı geçerliliğini tasdik floresan gazetecilere sinir sistemlerinde hızlı transgenik kurbağa yavrularını kullanıyor (temsilcisi sonuçları görmek). Bu amaçla, floresan (Şekil 1) ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı kullanmak gereklidir. Vahşi-türü hayvanlar kullanılabilir yalnızca, izleme CM-dıı ile istihdam edilebilir. Protokolü 2 (aşağıya bakın) CM-dıı 0,3 M Sükroz burun kapsül içinde hazırlanan 0,5 mg/mL çözeltisi enjekte için izleyin. 16 ayrıntılı bilgi için bkz: hazırlık ve CM-dıı depolanmasını. Asıl kavite dışında boya kaçağı gerekir olmak en aza indirgemek. Bu amaç için enjeksiyon basıncı ve Mikropipetler açılışı değiştirmek gereklidir. Floresans olfaktör ampul glomerular katman düzeyinde açık 24 h CM-dıı uygulamadan sonra olur. Mevcut çalışma CM-dıı ile etiketleme sadece transeksiyon yordamı tasdik için kullanır; Ancak, bu yöntem aynı zamanda koku glomeruli geleneksel histolojik yordamları kullanarak morfolojik bilgilerini elde etmek için kullanılabilir.
- Hayvan kurtarma deposuna aktarın. Kurbağa yavrularını ~ 10 dk. bir dikkatli incelenmesi bulunup bulunmadığına hayvanların % ~ 1 bekleniyor kanama ameliyata tabi gerçekleştir içinde normal yüzme kurtarmanız gerekir.
- Bir % 0,2 MS-222 çözümde yaralı hayvanları ötenazi.
2. koku reseptör nöronların florasan kalsiyum göstergeler ile etiketleme
- % 12 içeren bir çözüm hazırlamak kalsiyum yeşil-1-dextran (bakınız Tablo malzemeler), % 0,1 Triton X-100 ve 1 mM NaCl17. Eğer bir ay içinde kullanılmak üzere çözüm-20 ° c veya-80 ° C'de depolayın.
- Cam pipetler ipucu açıklıklar ~ 1-2 µm (yama-kelepçe deneyler için kullanılan microelectrodes için benzer çapı) ile bir micropipette çektirmenin kullanılarak mikroenjeksiyon için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).
- Microinjections hacmi kalibre. Distile su, kullanarak 0,15-0,3 enjeksiyon miktarda elde etmek için basınç ve enjeksiyon zamanı ayarlayın µL.
Not: Basit bir prosedür su 1 µL ile dolu bir pipet boşaltmak için gerekli darbeleri sayılması oluşur. 30 psi ve 50 ms enjeksiyon zaman baskısı tipik parametreleridir. - Bir pipet microinjector içinde yer ve kalsiyum yeşil-1 dextran çözüm ~ 2 µL ile yükleyin.
- Aşağıdaki adımları 1.1-1.6 bir kurbağa yavrusu hazırlayın.
- Pipet ucu burun kapsül asıl boşluğuna taşıyın.
Not: Şekil 2bir Xenopus iribaş koku yollar konumunu açıklayanA bakın. - 2.3 içinde elde ayarları kullanarak, birkaç ponponları teslim. Boya varlığı için burun kapsül kısıtlayın.
- 2-3 dk. için Pasteur pipet kullanarak tutun, % 0,02 MS-222 çözüm kurutma kaçınarak hayvan daha kaudal parçaları üzerinde damla dökün iribaş izin.
- Hayvan kurtarma deposuna aktarın.
Not: Normal yüzme kurtarmanız gerekir ~ 10 dk. içinde hayvanlar manipülasyon yaralanmalara neden. - Normal yüzme davranış 15 dk sonra enjeksiyon % 0,2 MS-222 çözüm kullanarak geri mi kurbağa yavrularını ötenazi.
- Gün'den sonra enjeksiyon olfaktör ampul glomerular katman düzeyinde floresans gözlemlemek.
3. Presynaptic tepkilerin canlı görüntüleme için kurbağa yavrularını hazırlanması
- 24-48 h deney önce 4-6 Petri yemekler 35 mm çapında silikon elastomer (örneğin, Sylgard) ile kat. Sonra elastomer polimerli, iribaş uyacak bir dikdörtgen de imal.
Not: Tipik NF aşamalarında 48-52 bulundu X. tropicalis kurbağa yavrularını için 10 x 4 mm boyutlardır. - 100 mL 160 µM 1 mM amino asit çözüm için kurbağa yavrularını bir propil uyarıcı olarak hareket için hazır ol. Çözüm birkaç amino asit karışımı içerebilir: metionin, lösin, histidin, arginin ve lizin. Xenopus zil'ın çözümünde, (mM) oluşan amino asit seyreltik: 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glikoz, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7.8. Bu pH 7.8 korunur emin olun.
- Yükseltilmiş bir rezervuar 20 mL amino asit çözeltisi ile doldurun. Havzanın polietilen ile bağlanmak için 28 G kılcal tüp boru burun kapsül yerleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: Kılcal tüp bir micromanipulator monte edilir ( Tablo malzemelerigörmek). Hava kabarcıkları yok olması gerekir perfüzyon sistemi. - Solenoid çimdik valfleri ( Tablo malzemelerigörmek) transistör transistör mantık (TTL) kontrolünü kullanarak amino asit solüsyonu uygulanmasında zamansal hassas ulaşmak. Bir uyarıcı TTL bakliyat ( Tablo malzemelerigörmek) oluşturmak için kullanılır. TTL Bakliyat, süresi değiştirerek propil çözümleri sunmaya zamansal hassas kontrol i.e., 0.1-1 s.
- Başka bir yükseltilmiş rezervuar 100 mL Xenopus zil'ın çözeltisi ile doldurun.
- Bir kurbağa yavrusu anestezi ve parçalanmış kapsamına (adım 1.1-1.6) yerleştirin.
- Bir kurbağa yavrusu görüntüleme için hazır olun. Albino kurbağa yavrularını yoksa 3.9 adıma geçin, görüntüleme (adım 3.8) zarar melanosit içerdiğinden Aksi takdirde yukarıda olfaktör ampul deri kaldırmak.
Not: Deney hayvanı pigmentasyon bağlı olarak gerçekleştirmek için iki yol vardır. Albino hayvanlar kullanmak tercih edilir. Albino suşları X. laevis için kullanılabilir ve albino X. tropicalis satırları CRISPR-Cas9 12 veya TALENs18tarafından oluşturulan. - Kenasen makas kullanırken, merkezi sinir sistemi kenarındaki kurbağa yavrusu deri üzerinde yanal bir kesi yapmak. Marka kesme olfaktör ampul ve hiç tectum, optik sinir konum tarafından kolayca tanımlanabilir konumunu ulaşan düzeyinde yapılması gerekir.
- Kesilmiş deri Cımbız kullanarak çimdik ve sinir sistemi üzerinden çekin. Melanosit olfaktör ampul yukarıda yokluğunda tarafından başarılı kaldırma doğrulayın. Hayvan % 0,02 MS-222 çözüm Pasteur pipet kullanarak yağan damlaları rutubetli.
- İribaş boyalı çanak kuyunun içine yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Hayvan yukarıda yüksek vakum yağıyla kaplı bir cam coverslip koymak. Kuyruk sonuna tectum üst kapak coverslip getirin.
- Olfaktör ampul ve placodes hücre dışı ortama maruz kalmadığından emin olun. İribaş görüntüleme sırasında hareketsiz tutun. Petri kabına Xenopus zil'ın solutioncontaining 100 µM tubocurarine ile doldurun (kas kasılmaları önlemek için Malzemeler tablobkz:).
Not: Tubocurarine aliquots-80 ° C'de artık 6 aydan depolanır. - İribaş dik bir mikroskop altında tutan çanak yerleştirin. (Bkz. Tablo reçetesi) Polietilen boru Xenopus zil'ın çözüm sürekli perfüzyon için hayvan için canlı tutmak için kullanarak çanak ile Xenopus zil'ın solüsyon içeren rezervuar bağlanmak > 1 h.
Not: (Bkz. Tablo reçetesi) mini manyetik kıskaçları stabil boru yemek için bağlanmak çok yararlıdır. Perfüzyon ve emici borular ~ 180 ° açı içinde yer almalıdır. - Xenopus zil'ın çözüm ventriküler başlatın. Deneme boyunca yemek sabitindeki çözüm seviyesini korumak. Sürekli iribaş canlılığı kan dolaşımını damarlar yoluyla gözlemleyerek değerlendirin.
4. canlı koku Glomeruli Presynaptic Ca2 + değişiklikleri görüntüleme
Not: Görüntüleme yordam geniş alanlı Mikroskopi için açıklanan ancak kolayca confocal mikroskop için satın alma ayarlarını yaparak adapte. Görüntüleme bir anti-titreşim masaya monte bir dik mikroskobu içinde yapılmalıdır.
- Düşük büyütme objektif ile iribaş görselleştirmek örneğin 5 x.
- Olfaktör sinir ile 90 ° açı oluşturan bir burun kapsül üst propil çözüm teslim kılcal yerleştirmek için micromanipulator eksenleri hareket. Görüntüleme deforme turbulences neden olabilir çünkü propil çözüm olfaktör ampul yukarıda akışının kaçınılmalıdır.
- Olfaktör ampul ipsilaterally yüksek büyütme, uzun çalışma mesafesi, kullanarak burun kapsül (stimülasyon) tabi bulunan su daldırma amaç bulmak: 60Xx, 0,9 N.A.
- Floresans emisyon gözle kontrol edin. Glomerular yapıları açık (Şekil 2B) olmalıdır.
- Kalsiyum görüntüleme için uygun bir kamera ile canlı edinme gerçekleştirin. Genellikle, 256 x 256 veya 512 x 512 piksel tüm olfaktör ampul içeren bir kutu tanımlayın. Set edinme çerçeve oranı edinimi için 20-40 Hz. kazanç, böylece bazal floresan ~ %20 doygunluk değerleri ayarlayın. 5 s video elde etmek.
- Film görselleştirin. Görüntü odağı, devamsızlık hareketi eser ve doymuş pikselleri içeren bölgeleri denetleyin. Tipik floresans değerleri glomerular bölgelerin bir 16-bit kamera ile 5.000-20.000 yapıyordum olmalıdır. Görüntüleme koşulları en iyi durumda, sonraki adıma geçin. 4.6 Eğer görüntü kalitesini artırmak veya kazanç ayarlarını yapmak için gerekli adımları yineleyin.
- Koku uyaranlara tarafından uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için hızlandırılmış bir kazanım başlatın.
Not: Kesin uygulama propil çözümün TTL uyaranlara tarafından kontrol edilir. Tipik bir deney 4 temel nokta işareti 0,1 0,5 arasında değişen kez stimülasyon ardından s, s ve iyileşme süresi 6-10 s. - Odorants tekrarlayan elektrodlar zaman aralıkları için gerçekleştirmek > 2 dk. 1-1.5 mL·min-1için akış hızı ayarlayın. Küresel perfüzyon üzerinde tüm deneyler sırasında olduğu için yerel olarak uygulanan amino asitler yıkanır.
Not: Çanak çözümde ~ 3 mL birimdir. -
Görüntü Analizi
- Yanıt-e doğru tespiti
- Filmler için ImageJ verme.
Not: Amaç glomerular bölgeleri uyaranlara yanıt varlığı tespit. - ΔF/F0 sinemaya floresans görüntülerin ham sıra dönüşümü. Aşağıdaki ilişki göre bazal floresans göreli değişiklikleri ölçmek: (F-F0) / f0burada F0 gösterir temel floresans düzeyleri,.
- Faiz (ROI) bölgelerinde sözde floresans artar stimülasyon sırasında gösterilen alanların etrafında çizmek ve yatırım getirisi müdür (Şekil 2E) içindeki konumlarını kaydedin. Arka plan floresans düzeylerine glomerular yapıları yoksun bir alanda algılamak için bir yatırım getirisi çizin.
- Filmler için ImageJ verme.
- Yanıt-e doğru miktar.
- Tanımlanmış ROIs floresans görüntülerin ham sırayla yerleştirin. Her çerçeve için seçili ROIs ortalama gri değeri elde edilir. Bir analiz programı için elde edilen değerler dizisi transfer (e.g., Igor Pro).
- Arka plan floresans çıkarmak ve sonra her ROI (Şekil 2F) ΔF/F0 değişiklikleri hesaplamak. ΔF/F0 artışlar seçili ROIs her biri için arsa. Bazal ΔF/F0 (stimülasyon önce) standart sapmasını hesaplar.
Not: Olumlu bir yanıt ΔF/F0 artışlar sırasında aldıysanız stimülasyon bazal değerlerden 2 standart sapma daha büyük olarak kabul edilir.
- Yanıt-e doğru tespiti
5. koku güdümlü davranış tahlil
Not: Tahlil gerçekleştirmek için Kur bir Şematik diyagramı Şekil 3' te gösterilmiştir.
- 1.57 mm O.D. x 1.14 mm kimlik boru üst kısmında, her şey bir 6-şey tabak sığacak şekilde küçük delikler yapmak. Tüp takın ve bir epoksi yapıştırıcı kullanarak mühür ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: Değiştirilmiş çanak birçok kez distile su ile kapsamlı yıkama sonra yeniden olabilir. - 50 mL metiyonin, lösin, histidin, arginin ve lizin (bkz. Adım 3.2 Ayrıntılar için) içeren bir amino asit çözeltisi hazırlamak. Konsantrasyonları 160 µM için 1 mM arasında olabilir. Yükseltilmiş bir rezervuar çözümde yer 20 mL.
- En az 12 h önce tahlil için kurbağa yavrularını beslemeyin. Onların konut tanktan 6 kurbağa yavrularını alıp odorants maruz en aza indirmek için 2 L temiz iribaş su içinde yerleştirebilirsiniz.
- Değiştirilmiş 6 kuyu tabak bir beyaz LED-transilluminator üzerinde (Şekil 3) yerleştirin.
- Perfüzyon alıcılar bir manifold kullanarak amino asit solüsyonu içeren rezervuar çift ( Tablo malzemelerigörmek). Perfüzyon sistemi kontrol edin ve hava kabarcıkları ortadan kaldırmak. 6 wells aynı anda doldurun. ~ 30 çözümünüzde propil ≥5 mL teslimini sağlamak için rezervuar yüksekliğini ayarlamak s.
Not: Her çift kişilik distile su ile de 4 kez propil çözüm maruz kaldıktan sonra yıkayın. - Her doldurmak 10 mL iribaş su ile iyi. Yer 1 iribaş/iyi. İçin dinlenmeye bırakın > 3 dak.
- Resim alma kadar ayarla. Vasıl ≥5 Hz. bağlamak bir bilgisayara kamera görüntüleri elde edebilirsiniz geleneksel bir CCD fotoğraf makinesi kullanın. Burada, Zen yazılım tarafından kontrollü bir Zeiss MRC5 kamera kullanmak ancak eşdeğer başka yapılandırmalarda kullanılabilir. Kare hızı artırmak gerekli ise, piksel binning geçerlidir. Resim 6 iyi çanak göstermelidir.
- Öyle ki filmler içeren resim alma bazal başlatmak (30 s), uyarıcı (25-35 s) ve kurtarma (30-60 s) dönemleri.
- 6 kuyu çanağı dönüş hayvanlardan tankları görüntüleme sonra için.
- Birden çok parametre hareketliliği için ilişkili sağlamak plugins wrMTrck19,20 gibi kullanarak ImageJ filmlerde analiz.
- Analiz için görüntüleri hazırlamak için önce 35 mm x 35 mm (Şekil 4A) dikdörtgen bir yatırım getirisi çizerek bir şey seçin. Arka plan resmi bütün sıra maksimum projeksiyon hesaplayarak edinin. İribaş olmadan iyi bir resim göstermek gerekir.
- Ham film maksimum projeksiyon çıkarma. Eşik oluşturulan 32-bit film üzerinde gerçekleştirmek ve wrMTrck eklenti uygulayın. Güvenilir bir şekilde hayvan hareketleri izlemek için WrMTrck parametrelerini ayarlamak. Elde edilen aktarım X, Y koordinatları bir analiz programına.
- Kullanarak X-Y koordinatları, aşağıdaki denklemi uygulayarak propil kaynağına (perfüzyon giriş iyi), Öklid uzaklığı hesaplamak:
Burada os koku kaynak konumunu gösterir ve tad iribaş konumu herhangi bir anda gösterir. Şekil 4A ayrıntılı bilgi için bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda, biz bir arada Xenopus iribaş koku alma sistemi işlevselliğini vivo içinde çalışma gerçekleştirmek için iki tamamlayıcı yaklaşımlar mevcut: Ben) presynaptic Ca2 + görüntüleme için bir yöntem değiştirir yaşam glomeruli içinde kurbağa yavrularını bir floresan kalsiyum göstergesi ve II kullanarak) bir koku belirli su bazlı odorants cevaben araştırmak için kullanılan davranış tahlil destekli. Bu yaklaşımlar koku işlendikten sonra yaralanma10kurtarma değerlendirmek için istihdam edilmiştir beri Olfaktör sinirler transecting için basit bir yöntem de açıklanmaktadır.
Transeksiyon koku yollar Xenopus kurbağa yavrularını
Yordamı geçerliliğini tasdik için iki yol vardır. Her ikisi de Olfaktör sinirler floresan gazetecilere kullanarak görselleştirme güveniyor. Bir yöntem floresan proteinler sinir sistemlerinde hızlı transgenik kurbağa yavrularını temel alır. X. laevis tubb2b-GFP ve X. tropicalis NBT-GFP GFP nöronal β-tübülin organizatörü altında hızlı iki önerilen satırlar vardır (Şekil 1, Tablo malzemelerigörmek). CM-dıı vahşi-türü hayvanlar kullanılabilir yalnızca, kullanılabilir (bkz. Adım 1.8). Şekil 1 tubb2-GFP X. laevis kurbağa yavrularını görüntüleri gösterir. Nerede bir tek Olfaktör sinir kopuk dört farklı hayvanlardan görüntülerdir. Kesme diseksiyon kapsamına açık olmalı. Transgenik çizgileri kullanmanın avantajı Olfaktör sinir reformasyon bir süre içinde izlenebilir olduğunu. Sıralı gözlemler yaparken, duyarlilik önlemek için floresan ışığa maruz kalma en aza indirmek için tavsiye edilir. Bir tek Olfaktör sinir kesit bir iç kontrol, normalde Gelişmiş vs rotasyondan glomerular birimleri karşılaştırmak için örneğin gelince, gerekli olduğunda yararlıdır. Amaç tamamen bilgi iletimi baskılayarak her iki Olfaktör sinirler kesit uygulanmalıdır.
Koku bizi canlı tutan presynaptic tepkilerin Imaging yaşamak
ORNs doğru etiketleme ile kalsiyum yeşil-1 dextran olfaktör ampul (Şekil 2A) widefield mikroskobu kullanılarak düzeyde görülebilmektedir. Glomeruli açık (Şekil 2B) vardır ve odak düzlem taşıyarak farklı katmanlarda dağıtılmış görüntülenir. Confocal mikroskop yerine kullanıldığında morfolojisi glomerular yapıları daha iyi çözülmüş olabilir (Şekil 2C). Boya alımı koku epitel düzeyinde etiketli glomeruli sayısını bağlıdır. Bu nedenle, bu yordam tüm glomerular birimler görselleştirme izin vermez. Daha yoğun bir floresan glomerular bölgenin boyama gösterilen hayvan daha fazla ORNs etiketli içerdiğinden görüntüleme deneyler, gerçekleştirmeden önce seçilmelidir. Bu manevra deneysel iş çıkarma yeteneğini artırmak için önerilir ve floresan lamba ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı altında yapılmalıdır. Bu etiketli glomerular birimleri gösterme ya da glomerular katmanın belirli alanları için sınırlı floresans gösteriyor ki hayvan reddetmek. Presynaptic Ca2 + yanıt sürede boya yükledikten sonra 1 gün olarak görülebilir. Deneyler Imaging dışarı taşımak için bu yüksek sayısal diyafram, genellikle ≥0.9 amaçlarını kullanmak için tercih edilir.
Presynaptic kalsiyum düzeyleri artar ORNs dendritik topuzlar amino asitler için açığa uyarılmış olabilir. Burun kapsül propil çözüm teslim kılcal konumlandırmak önemlidir. Çünkü o kılcal ucu yapışmasına neden olabilir ve/veya mekanik ORNs uyarılması neden temasını engellemek için özen gösterilmelidir. Presynaptic kalsiyum düzeyleri geçici artışlar uyaranlara ≥0.1 s (Şekil 2D) için dikkat edilmesi ve doğru bir koku iletim işaret etmektedir. Bazal kalsiyum düzeyleri düşük kamera kazancı görselleştirmek önemlidir. ORNs presynaptic terminallerinin yüksek floresan artar görüntülemek ve sinyal doygunluk kaçınmak için önemlidir. Yüksek zamansal çözünürlük widefield mikroskobu ile elde edilebilir. Örneğin, bir elektron çarpılır CCD kamera kullanarak, bu kare hızları 50 Hz elde etmek mümkün veya daha yüksek olur. Confocal mikroskobu kullanımını zamansal çözünürlük azaltır ancak glomerular yapıları daha iyi tanımlanmasına olanak tanır.
Kalsiyum bağlama için yüksek afinite kalsiyum yeşil (190 nM) küçük yanıt-e doğru saptamak yararlıdır. Geçici hücre içi kalsiyum artış glomerular katmanda algılanan değişken vardır. Glomerular bazı bölgelerde ΔF/F0 ≥0.2, komşu süreçleri bile (Şekil 2D) yanıt değişiklikleri gösterir. Yanıt glomerular birimlerinin çeşitliliği için aşağıdaki faktörler katkıda: i) toplam sayısı etiketli glomeruli, II) kalsiyum yeşil hücre içi konsantrasyonu ve III) selectivity amino asitler algılamaya ORNs. Etiketli glomeruli çok düşük bir dizi yanıt gözlemleyerek engel bu yana, gibi birçok ORNs mümkün olduğunca etiketli içeren hayvanların bu deneyler yapmak kesinlikle gereklidir.
Olfaktör güdümlü davranış
Veri Analizi
Olfaktör güdümlü davranış özel olarak oluşturulmuş bir sistemi kullanılarak incelenmiştir. Şekil 3 tahlil taşımak için kullanılan ekipman çizim bir şematik gösterir. Test odorants hareket amino asitler olup olmadığını belirlemek için kurbağa yavrularını yeteneğine dayanır. Beş farklı amino asitler (metiyonin, lösin, histidin, arginin ve lizin) birleştiren bir çözüm uyarılması için kullanılır. Çözüm yerel olarak 30 sırasında teslim edilir s 35 mm de içeren free-swimming bir kurbağa yavrusu. Kurbağa yavrularını hemen yanıt gelen çözüm için hareketliliği bir artış gözleniyor. Rastgele hareketleri çözüm uygulama ilk ∼5 – 10 s sırasında meydana gelen doğrudan yüzmeye odorants kaynağı doğru tarafından takip edilmektedir. Kurbağa yavrularını meme çevresinde birkaç saniye amino asitler teslim sırasında kalır ve yavaş yavaş (bkz. ek videoları 1, 2) rasgele yönlere hareket kurtarmak.
Açıklanan deneysel koşullar normal yüzme X. tropicalis kurbağa yavrularını Etap 48-52 olanak verir; Ancak, büyük hayvan hareketliliği 35 mm wells sınırlanmış olabilir dikkate alınmalıdır. Kurbağa yavrusu hareketleri bir CCD kamera ile kaydedilir. Propil çözüm için cazibe perfüzyon giriş iribaş konumdan (Şekil 4) ayıran Öklid uzaklığı bir azalma olarak tespit edilebilir. 35 x 35 mm (ya da eşdeğer boyutunu piksel olarak) bir alanda iribaş baş konumlarını izlenmesine koku güdümlü davranış (Şekil 4A) kantitatif analiz almak sağlanır. Kurbağa yavrusu hareketleri ve bireysel araziler görüntü analizi (Şekil 4B) tarafından elde edilen X-Y koordinatları kullanarak inşa edilir. Ayıklanan hareketliliği araziler sadakatle video görüntüleri yeniden gerekir.
Koku güdümlü davranış deneyler yorumlama iki yöntemden vardır. İlk yaklaşım zebrafishes21kullanarak bir önceki çalışma esinlenmiştir. Ölçüm odorants teslim meme çevresinde harcanan zamanın yüzdesi pozitif tropism varlığını kanıtlamaktadır. Bir bölge (iyi çapı ¼ için karşılık gelen) 8,75 mm yarıçap ilgi hayvanların yakınlık (Şekil 4A, 4 C) propil kaynağına sınıflandırmak için kullanılan çözüm giriş yoğunlaştı. Kurbağa yavrularını meme çevresinde tarafından tanımlanmış dönemlerde, Yani, 15 s aralıkları, harcanan süre binning amino asit çözümler (Şekil 4D) algılama yeteneğini tanımlama sağlar. Kurbağa yavrularını nüfusu genel davranışını bireysel veri (Şekil 5A) dağıtım komplo tarafından elde edilebilir. Zaman metiyonin, lösin, histidin, arginin ve lizin çözüm 1 mM veya 160 mikron (Şekil 5A ve 5B) hazırlanan olumlu tropism tespit edilebilir. Hayvanlar su uygulaması (Şekil 5C), böylece mechanosensitive mekanizmaları katılımı atarak yanıt vermez. Deneysel her grupta tanımlanan aralıklarla parametrik olmayan yinelenen ANOVA Dunn'ın birden fazla karşılaştırmayla yöntemlerle kurulabilir saat arasında farklılıklar sınayın. 15 saat aralıklarla veri binning dezavantaj s düşük zamansal çözünürlük olduğunu.
Davranışsal yanıt geçici bilgi artırmak için bir yol ortalama araziler koku kaynaktan Öklid mesafeler yapıyor. Kurbağa yavrusu hareketleri içsel bir değişkenlik göstermesine rağmen hayvanlar (genellikle ≥40) nüfusu ortalama hareket koku güdümlü davranışı gösterir. Bu analizlerini incelemek bu grup hayvan konumlara stimülasyon başlangıcından önce gereklidir. Propil çözüm kuyunun içine girdiğinde kurbağa yavrularını farklı konumlarda bulunan bu yana 0 sadece stimülasyon (Şekil 6A, Ayrıca bakınız Şekil 7dahil ölçütünde) önce Öklid uzaklığı ayarlamak için gereklidir. Negatif ve pozitif değerleri dolayısıyla bir cazibe veya bir itme koku kaynaktan sırasıyla olduğunu. Koku için bir cazibe de regresyon katsayıları ≥0.9 ile doğrusal bir uyum tarafından tanımlanır. Su teslim edilirse, Öklid uzaklığı net değişim 0 dağıtılır ve böylece bir koku güdümlü davranış (Şekil 6B) yokluğu gösteren propil stimülasyon sırasında bir satır sığdırmak mümkün değildir. Karşılaştırma için hazırlanan 1 mM ve 160 µM amino asit çözümler Öklid mesafeler ortalama parsel koku güdümlü yanıt ( Şekil 6A ve Ckarşılaştır) farklı gecikme öneririz. Amino asitler yüksek bir konsantrasyon uygulandığında odorants kaynak karşı hareket başlatmak için gereken zaman aralığını kısadır. Koku güdümlü davranış eksikliği içinde kurbağa yavrularını hem Olfaktör kopuk sinirler ile (Şekil 6D) görülmektedir.
Karmaşık sıvı tüyleri kurulması açıklanan koku güdümlü davranış tahlil bir kısıtlamasıdır. Sistemi ayarlarken gibi hızlı yeşil, bir boya tarafından amino asit çözüm yerine Eğer bu görülebilir. Renkli çözümler kullanımı tüyleri oluşumu doğrular ve su bazlı odorants iyi çözüm tarafından teslim neden 5 s. Turbulences içinde herhangi bir bölge ulaşmak gösterir büyük olasılıkla kurbağa yavrularını sonradan içini kaplamak tarafından algılanır ve muhtemelen katkıda hayvan hareketliliği değişkenliğin gözlenen ama koku rehberli davranışı ile müdahale değil. Denetim amino asit çözümler yerine su kullanarak yapılan deneyler kurbağa yavrularını mekanik uyaranlara koku ayırımcılık için yetenekli olduğunu ortaya koyuyor. Bir bölge (Şekil 5) ilgi ve Öklid mesafeler (Şekil 6) ortalama Arsa harcanan zamanın yüzdesi tahmini kurbağa yavrularını koku güdümlü tepki tanımlamak için iki tamamlayıcı yöntemler vardır.
Katılım kriterleri
Katılım kriterleri da veri analizi için dikkate alınmalıdır. Bazı kurbağa yavrularını sinüsoidal fonksiyon (Şekil 7A) Öklid mesafeler Arsa uygun tarafından resimli rezonans bir hareketlenme. Bu davranış görüntüleme kurbağa yavrularını tüm analiz atılmalıdır.
Propil çözümleri uygulama başlangıcı en yüksek seviyede olan hayvanlar hariç (> 30 mm Şekil 7B) veya en az bir Öklid uzaklığı (< 5 mm, Şekil 7C) meme değişkenliğin azaltılması sağlar ve ortalama araziler. Şekil 7' deB resimli amino asit çözüm için olumlu bir tropism görülmektedir. İribaş stimülasyon başlangıcı çözüm girişi maksimum uzaklıkta yer alır. Bu nedenle, bu göreli konumu sadece koku kaynağı için bir cazibe ortaya çıkarabilir. Şekil 7 C zıt durumu gösterir. Burada, bir kurbağa yavrusu için bir çözüm amino asit teslim meme çevresinde yer alır. Zaman koku kaynağı harcanan miktar gösterir bir yanıt ( Şekil 5' te kullanılan yöntemi); Ancak, giriş doğru net bir hareket gösteremez.
Özet olarak, önerilen tahlil koku güdümlü davranışının bir ikili test tanımlar. Bu yöntem kurbağa yavrularını deneysel bir grup odorants için tepki yeteneğini algılamak için kullanılabilir. Daha fazla iyileştirmeler olup gerekli amaç koku güdümlü karmaşık yanıt arasındaki farklar için verilen tercihleri belirleme örneğin olarak, kuran kokuları.
Şekil 1: Olfaktör sinirler transeksiyon. Bir tek Olfaktör sinir (oklar) transeksiyon sonra elde edilen tubb2-GFP X. laevis kurbağa yavrularını temsilcisi görüntüler. Tubb2-GFP kurbağa yavrularını sinirleri güçlü floresans görüntüler. Sinir transeksiyon hemen ameliyat sonrası (D0) açıktır. Büyütme Olfaktör sinir kesme (D4) sonra belirgin 4 gün olur. Sekiz gün sonra cerrahi (D8) orada küçük denetim ve reform sinirler arasındaki farktır. Kurbağa yavrularını %0,02 anestezi görüntüleri toplamak için MS-222. Olfaktör ampul (O.B.), Olfaktör sinir (O.N.), burun kapsül (N.C.), tectum (Tec), optik sinir (Op.N.). Oklar transected sinir konumunu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Koku reseptör nöronların kalsiyum yeşil dextran ve presynaptic kalsiyum akını üzerine stimülasyon amino asitler ile görselleştirme ile etiketleme. (A)bulaşan hafif görüntü koku epitel, Olfaktör sinirler ve olfaktör ampul glomerular tabakası yerini gösteren bir kurbağa yavrusu. (B) görüntü bir olfaktör ampul widefield (wf) mikroskopi tarafından görüntülenmiştir. Nöronlar kalsiyum yeşil-1 dextran burun kapsül, uygulama tarafından etiketli. Gözlenen floresan presynaptic terminalleri için glomeruli oluşturan koku reseptör neurons karşılık gelir. O.N: Olfaktör sinir; O.B: olfaktör ampul. Dorsally bulunan Olfaktör sinir girdisinden ampul için (C) Confocal bölümünde. Koku glomeruli presynaptic bileşen B olduğu gibi kalsiyum yeşil-1 dextran kullanarak etiketli oldu). (D) Presynaptic terminalleri geçici kalsiyum düzeyleri üzerine koku epitel maruz kalma beş farklı amino asitler içeren bir çözüm artırın. Önce sırasında ve sonrasında 1 s stimülasyon elde edilen kalsiyum floresans göreli değişiklikler. (E) dağıtım ilgi (ROIs) ΔF/F0 değişiklikleri ölçmek için kullanılan 10 farklı bölgelerin. ROI11 dışında glomerular tabakası ve floresan arka plan düzeylerini tanımlamak için kullanılır. (F) bireysel ΔF/F0 yanıt için E tanımlanan ROIs). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Davranış Olfaktör güdümlü tahlil. (A)şematik diyagram ekipman testinde kullanılan gösterilen. (B) örnek hareketliliği parça kaydedildi üzerinde 90 s. Her daire, bir de içeren tek bir hayvan temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Koku güdümlü davranışını izleme. (A)örnek gösterilen davranış tahlil için kullanılan bir şey. Mavi noktalı çizgiler X, Y koordinatları (Ayrıca bkz: ek Video 1) iribaş hareketleri izlemek için kullanılan (mm) olarak konumunu gösterir. Yeşil elipsin çözüm giriş konumunu gösterir. Siyah noktalı çizgi için bir çözüm amino asit teslim tüp proksimal bölgesine gösterir (metin Ayrıntılar için bakınız). (B) hareket A gösterilen iribaş) davranışsal tahlil sırasında. Renk kodlu izlemeler (gri) önce hayvan konumunu belirtin ve sonra koku stimülasyon (menekşe). Hareketleri sırasında uygulama propil çözümün geçici renk degradesi içinde (30 s, kırmızı, mavi) gösterilmiştir. (C) X, Y iribaş pozisyonlar perfüzyon giriş Öklid Uzaklik iribaş baş değişiklikleri hesaplamak mümkündür kullanarak. 8,75 mm daha kısa mesafelerde meme proksimal alanına karşılık gelir. (D) çizgi noktalı çizgi a tarafından tanımlanan bölgede kurbağa yavrularını tarafından harcanan zaman). Her nokta bir 15 s nokta gösterir. Hayvan propil çözüm tarafından çekti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Kurbağa yavrularını amino asitler tarafından çekti. (A)kurbağa yavrularını koku kaynağı civarında tarafından harcanan süre. Her depo gözü 15 s dönemi kapsar. Kutu araziler medyan (siyah yatay çizgi), % 25-75 Dörttebirlikler (kutu) ve veri aralığı (bıyık) temsil eder. 1 mM amino asit çözüm teslimini iribaşlar koku kaynağı için çekti. Ne zaman amino asit konsantrasyonu 160 mikron için indirimli (B) kurbağa yavrularını propil çözüm tarafından çekici. (C) teslim su hayvan davranışları değiştirmek değil. Tekrarlanan ölçüler ANOVA Dunn ile birden fazla karşılaştırma testi, p < 0,05'ın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Kurbağa yavrularını zamansal yanıt olarak odorants. Koku kaynağı Öklid Uzaklik zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama(a)arsa. Öklid uzaklığı 0 stimülasyon her bireysel izleme önce ayarlandı. Negatif ve pozitif değerleri sırasıyla azalma ve koku kaynağı Uzaklik bir artış gösterir. Cazibe koku kaynağı için doğrusal bir uyum tarafından tarif edilebilir (r20,98 =). (B) teslim su koku kaynağı Uzaklik değiştirmez. (C) kurbağa yavrularını yanıt amino asitlerin 160 μm kalınlığında çözüm uygulamaya olarak doğrusal bir uyum tarafından saptandı (r20,96 =). (D) kurbağa yavrularını kopuk her iki Olfaktör sinirler ile amino asitler için yanıt vermez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Koku güdümlü davranış tahlil için dahil kriterleri. (A) bazı kurbağa yavrularını Haritayı bir rezonans hareketi. Bu davranış koku kaynağı Öklid Uzaklik Arsa sinüsoidal bir işleve başarılı uyum tarafından ortaya çıkıyor. Bu faaliyet gösteren kurbağa yavrularını testi dışlanmaları gerekir. (B, C) Odorants (Şekil 6) ortalama zamansal karşılık olarak değişkenlik azaltmak için bir yol (B) en fazla veya en az (C) Öklid mesafe stimülasyon başlangıcı, bulunan hayvanlar hariç tutarak var. Kırmızı noktalı çizgiler eşik değeri (30 mm ve 5 mm) gösterir. Stimülasyon (ok, araziler yaptı) başlangıcı "0"-rapor ayarlamadan önce Öklid uzaklığı çekici veya itici davranışlar olarak negatif ya da pozitif (doğru araziler), sırasıyla değerleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Video 1: koku güdümlü davranışı tetikleyen bir amino asit çözüm tarafından teslim. Film bir iribaş özgürce bir 35 mm'de yüzme gösterir. Mavi elips propil çözüm sunan başlık konumunu gösterir. Başlangıcı ve sonu stimülasyon yeşil ve kırmızı noktalar tarafından sırasıyla belirtilmiştir. Şekil 4 gözlenen davranış analizini gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek Video 2: su teslimat sırasında iribaş hareketliliği. Film bir iribaş özgürce bir 35 mm'de yüzme gösterir. Mavi elips MQ su serbest meme konumunu gösterir. Başlangıçlı ve suyu dağıtım sonu yeşil ve kırmızı noktalar tarafından sırasıyla belirtilmiştir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt yaşayan koku yolları işlevselliğini araştırmak yararlı teknikler açıklanır Xenopus iribaşlar. Geçerli protokol işe veya Xenopuserişimi Bu laboratuarlar için yararlıdır; Ancak, bu da nöronal rejenerasyon ve onarım hücresel ve moleküler üsleri eğitim Bu araştırmacılar için ilginçtir. Xenopus elde edilen sonuçlar diğer omurgalı modellerinde korunmuş mekanizmaları tanımlamak için toplanan veriler ile kombine edilebilir. Açıklanan yöntemleri genetiği değiştirilmiş Xenopus18,22,23 gelişimini yararlanacak ve kurbağa yavrularını24sinir sistemi hastalıklarının deneysel modeller için geçerlidir, 25.
Tekrarlanabilir içinde vivo verilerini elde etmek için bunu doğru Xenopus kurbağa yavrularını arka anahtarıdır. Özellikle, X.tropicalis yoksul konut koşullarını çok hassastır. Örneğin, 20 ° C'den düşük sıcaklıklarda tahammül yok ve tank ya da su sistemleri 24-28 ° c aralığında tutulmalıdır Değil kurulan sınırları üzerinde hayvan yoğunluk artmak, düzenli olarak kurbağa yavrularını beslemek ve optimum su kalite13tutmak önemlidir. Hayvan kolonileri standart koşullar aşağıdaki yönetim içinde vivo deneyler tekrarlanabilirlik kazanmak için kesinlikle gereklidir.
Kalsiyum görüntüleme açıklanan Yöntem ORNs bir doğru koku iletim algılamak yararlı olur içinde vivo. ORNs yükleme ile kalsiyum yeşil-1 dextran Triton X-100, düşük konsantrasyon kullanarak daha önce bildirilen17olarak plazma zarı geçici permeabilization elde edilir. Bu yükleme yöntemi en büyük avantajı basitliğidir, çünkü sadece bir microinjector gerektirir. Önemli bir dezavantajı Triton X-100 koku kirpikler ve microvilli geçici kaldırılması neden olur. Zebra balığı koku epitel 48 saat içinde tedavi17sonra yeniden oluşturur. Xenopus kurbağa yavrularını rejenerasyon daha hızlı yanıt odorants için 1 gün sonra boya (Şekil 2D) yükleme gözlenen olabilir. Ancak, ayrıntılı bir morfolojik analiz koku epitel yenilenme zamanı Triton X-100 tedaviden sonra doğru bir şekilde tahmin etmek için gereklidir.
ORNs kalsiyum yeşil-1 dextran ile etiketleme sadece bir yüksek sinyal gürültü oranı (Şekil 2B ve 2 C) ile presynaptic terminalleri görselleştirme sağlayan bir nüfus nöronların, etkili olur. Neredeyse arka plan olmaması için bütün olfaktör ampul yükleme kalsiyum boyalar AM ester formlarıyla karşılaştırıldığında eğer avantajlıdır. Floresan ORNs sayıda hayvan hayvan farklıdır. Böylece geniş bir koku uyarıcı birkaç amino asitlerin kullanmak gereklidir. Metiyonin, lösin, histidin, arginin ve lizin bir çözüm kullanarak başarılı sonuçlar elde etmiş olursunuz. Diğer kombinasyonları farklı amino asitler de etkili olabilir. ORNs kalsiyum göstergeleri ile yüklemek için alternatif bir yöntem Elektroporasyon26genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere iribaş nöronlar27' deki hızlı için yaygın olarak kullanılan, var. Elektroporasyon yapılabilir Ticari veya özel yapım donanımları kullanarak ve nöronal yapıları mükemmel sinyal-gürültü oranı28ile görselleştirme sağlar. Benzer şekilde açıklanan yaklaşım için etiketli hücre popülasyonlarının türdeş olmayan ve hayvan hayvan farklı. Transgenesis amacı nöronlar22tanımlanmış bir nüfusa araştırmaktadır Eğer arzu edilir. Örneğin, GCaMPs gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ifade ORNs kısıtlı bir grup içinde sürüş, presynaptic terminalleri tanımlanmış bir dizi yanıt odorants olarak araştırmak çok yararlı olabilir.
Kalsiyum-yeşil 1 dextran kullanarak açıklanan yöntemi presynaptic terminal işlev içinde vivo bildirir. Hücre içi kalsiyum artar gözlem doğru koku iletim ve serbest bırakmak-in glutamat glomeruli düzeyde göstergesidir. Kantitatif analiz floresans olarak değişiklikler olduğunu, ancak, sınırlı. Hücre içi kalsiyum düzeyleri micromolar aralığına presynaptic terminalleri uyarılması artırır ve doygunluk kalsiyum yeşil gibi yüksek afinite kalsiyum göstergenin dikkate alınması gerekir. Şekil 2 ' de gösterilen sonuçları widefield mikroskobu kullanılarak elde edilir. Bu en basit yaklaşım ve çoğu laboratuvarlarda uygulanabilir. İki fotonlu mikroskobu kullanarak geliştirme ya da genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere presynaptic işlevinin daha fazla nicel tahminleri elde izin verebilir.
Kalsiyum yanıt-e doğru canlı görüntüleme için uygun propil çözüm teslim kılcal konumlandırma olduğunu önemlidir. Bu burun kapsül üzerinde yer almalıdır ve her zaman doku ile doğrudan temas önlemek. Hem propil çözüm doğru teslimat ve perfüzyon akışının mikroskop altında iribaş yerleştirmeden önce kontrol edilmelidir. Tüm boru perfüzyon için kullanılan hava kabarcıkları için kontrol gerekir. Amino asit çözüm akışı değişiklikleri hemen art arda açılış ve kapanış solenoid vana için cevap vermek zorundayız. Gecikmeler hava varlığını işaret etmektedir. Bu da doğru ses düzeyini artırır veya azaltır çözüm teslim açılış saati değiştirdikten sonra kontrol için arzu edilir i.e., 0.1 s 1 s veya tam tersi için. Düşük ışık şiddeti deneysel parametreleri (adım 4.6) ayarlanırken photobleaching en aza indirmek için kullanın.
Koku alma kurbağa yavrularını biyolojide önemini köklü29olsa da, doğrudan koku güdümlü davranışlara Xenopus larva değerlendirme testleri eksikliği vardır. Bu raporda açıklanan hayvanların büyük bir nüfus içinde bir yanıt bir koku uyarıcı olarak algılanmasını sağlar basit bir test yöntemidir. Rana catesbeiana kurbağa yavrularını su kimyasal maddelerin varlığı için propil duyarlılığını son açıklaması koku alma motor davranış30' a kaplin karmaşık mekanizmalar gösterilmektedir. Bu raporda açıklanan tahlil koku güdümlü davranış kurbağa yavrularını içsel değişkenlik dikkate alır. 6-iyi çanak tek kuyu yerine kullanımı deneysel işlem hacmi artar. Değişkenliği için katkıda bulunan faktörler gibi bazal hareketliliği, perfüzyon giriş ve propil çözüm tarafından oluşturulan tüyleri için göreli konumu birçok kurbağa yavrularını sayı ortalaması alınarak üstesinden vardır. Yaklaşık 40 bağımsız ölçümleri kontrol çekici yanıt amino asitler için tanımlamak için gereklidir.
Koku alma testi için analiz iki tür öneriyorum. İlk yaklaşım tanımlanmış bir dönemde koku kaynağı harcanan süre quantifies. İstatistiksel analiz için özellikle uygundur. İkinci yaklaşım koku kaynaktan Öklid mesafeler ortalama arsa üzerinde temel ve odorants zamansal yanıtı tanımlamak yararlıdır. Her iki tür analiz tamamlayıcı ve aynı verileri tarafından oluşturulan gelir. Yorumu ikili ve ayırt edici hayvanlar o anlamda odorants bu değil10yapmak sağlar.
Açıklanan yöntemleri nasıl Xenopus topluma yararlı olabilir? Yöntemleri aslında vahşi-türü hayvanlar için gösterilmiştir rağmen genetik olanakları Xenopus alanında sürekli genişletiyoruz dikkate alınmalıdır. İçinde vivo ORN yanıt-e doğru kombine incelenmesi ve koku güdümlü davranış varlığı da ileriye veya geriye doğru genetik ekranları tarafından oluşturulan Xenopus mutantlar koku bilgileri doğru işlediğinden araştırmak çok yararlı olabilir 11. kalsiyum görüntüleme ve davranışsal tahlil tarafından sağlanan bilgi birleştirilebilir. Örneğin, seçmeli olarak granül hücre olfaktör ampul etkileyen bir mutasyon ORNs presynaptic yanıt değiştirmek değil ama muhtemelen koku güdümlü davranış zarar verir.
Hücresel ve davranışsal yanıt içinde vivo ilişkilendirme yöntemleri nöronal devreler genetik diseksiyon için özellikle uygundur. Sonuçları yorumu kurbağa yavrularını31glomerular katmanda anatomik bir haritası hazırladık önceki morfolojik işleri tarafından destekli. Xenopus kurbağa yavrularını32 olfaktör ampul dilim elde edilen bilgi çok değerlidir. Kalsiyum görüntüleme mitral/tufted hücrelerinin olfaktör ampul dilimleri koku örnek Xenopus kurbağa yavrularını ORNs farklı amino asitler33 duyarlılığını veya alaka işleme temel özellikleri ortaya koymuştur Yanıt gecikme süreleri koku bilgi7/ kodlama. Ancak, beyin dilimleri çok sayıda nöronal projeksiyonları kesit nedeniyle farklı nöronal devreler ilişkilendirme karmaşık bütünleştirici mekanizmaları çoğaltmak sınırlı kapasitesi göstermektedir. Ayrıca, tek tek glomerular birimleri özelliklerini karakterizasyonu henüz dışında γ-glomerulus34zor olduğunu. İster tek glomerular birimler kurbağa yavrularını içinde belirli davranışlarını belirlemek soruya yalnızca genetik araçları, in vivo görüntüleme yaklaşımlar ve davranışsal deneyleri birleştirerek cevap olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser El "gayri resmi" de Economía y Competitividad (MINECO; dan gelen hibe tarafından desteklenmiştir SAF2015-63568-R) rekabetçi Araştırma Ödülleri M. G. F. Fuortes Memorial Bursu, Stephen W. Kuffler Burs Fonu, Laura ve Arthur Colwin donatılmış yaz araştırma bursu Fonu tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF tarafından), cofunded , Fischbach Bursu ve büyük üretimi Fonu Deniz Biyoloji Laboratuvarı ve ulusal Xenopus kaynak nerede bu eser bir kısmını gerçekleştirilmiştir RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA). Eğer bir Program ayrıca teşekkür ederim / Generalitat de Catalunya kurumsal destek için. Al Serra Húnter biri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
