Summary
We een nieuwe ex vivo model ontwikkeld dat constante spanning met de varkens maag model van toepassing is. Deze ontwikkeling maakt het mogelijk om te evalueren van de prestaties (de hoogte en de duur van de submucosal hoogte) van verschillende SIMs nauwkeurig. De gedetailleerde installatie-methodologie van dit nieuwe model wordt uitgelegd.
Abstract
Verhogen van de prestaties van submucosal injectie materialen (SIMs) is belangrijk voor Endoscopische therapie van vroege gastro-intestinale kanker. Het is essentieel om een ex vivo -model dat SIM prestaties nauwkeurig, voor het ontwikkelen van hoogwaardige SIMs kan evalueren. In onze eerdere studie ontwikkelden we een nieuwe ex vivo model dat kan worden gebruikt voor het evalueren van de werking van verschillende SIMs in detail door de constante spanning op de uiteinden van het model toe te passen. We hebben ook bevestigd dat het voorgestelde nieuwe ex vivo model nauwkeurige submucosal hoogte hoogte (SEH) meting onder uniforme voorwaarden en gedetailleerde vergelijking van de prestaties van verschillende soorten SIMs kunt. Hier beschrijven we de nieuwe ex vivo model en uitleggen van de gedetailleerde installatie-methodologie van dit model. Aangezien alle delen van het nieuwe model gemakkelijk waren te verkrijgen, kan de installatie van het nieuwe model snel worden voltooid. SEH van verschillende SIMs kan nauwkeuriger worden gemeten met behulp van het nieuwe model. De kritische factor die SIM prestaties bepaalt kan worden geïdentificeerd met behulp van het nieuwe model. SIM ontwikkelingssnelheid zal drastisch toenemen na de factor is geconstateerd.
Introduction
Zowel de Endoscopische submucosal dissectie (ESD) en de Endoscopische mucosale resectie (EMR) zijn momenteel voorkomende behandelingen voor beginnende gastro-intestinale kanker1,2. Een submucosal injectie materiaal (SIM) injecteren in de submucosa is een van de belangrijkste stappen voor zowel de EMR en ESD procedures2,3. Grote submucosal hoogte en onderhoud submucosal hoogte zijn essentiële criteria voor het veilig uitvoeren van EMR/ESD.
Hoewel normale zout (NS) heeft gebruikt als een SIM-kaart sinds de uitvinding van Endoscopische therapie4,5, Natrium hyaluronaat (HA) werd geïntroduceerd als een behandeling in de afgelopen jaren6,7. HA werd op grote schaal gebruikt in Endoscopische behandelingen als een superieure SIM toe te schrijven aan zijn hoge prestaties8,9,10,11. Op dit moment een prestatiesvergelijking tussen de bestaande SIMs werd uitgevoerd, en krachtige SIMs werden ontwikkeld om het identificeren van een andere superieure SIM-5,12,13,14, 15,16,17,18.
De ex vivo -model met behulp van een monster van de varkens maag is gebruikt voor het evalueren van de prestaties van de SIM, omdat de schatting van de prestaties van de SIM in de menselijke maag-darmkanaal zeer moeilijk19,20,21 is , 22. dit model conventionele ex vivo is echter zeer eenvoudig, en heeft de ruimte voor verbetering. Een omgeving dichter naar de menselijke gastro-intestinale mucosa te reproduceren kan nauwkeurige evaluatie van de prestaties van de SIM.
In onze eerdere studie ontwikkelden we een nieuwe ex vivo model dat kan worden gebruikt voor het evalueren van de werking van verschillende SIMs in detail door de constante spanning op de uiteinden van het model toe te passen. Wij ook bevestigd dat de voorgestelde nieuwe ex vivo model, toelaat nauwkeurige meting van de ze onder uniforme voorwaarden en een gedetailleerde vergelijking van de prestaties van verschillende soorten SIMs23.
In deze studie, presenteren we een volledige weergave van het nieuwe model ex vivo en de gedetailleerde installatie-methodologie van het nieuwe model ex vivo wordt uitgelegd in detail met behulp van video's en cijfers. Het nieuwe model ex vivo bestaat uit onderdelen die gemakkelijk beschikbaar zijn en kan snel worden ingesteld. Beschrijvingen van gedetailleerde setup methodologie zal bijdragen tot de verspreiding van het nieuwe model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol volgt de richtsnoeren van de verzorging van de dieren van de departementale University of Medicine in Kyoto.
1. bereiding van de monsters met behulp van een varkens maag
Opmerking: De eerste stap is het bereiden van specimens worden gebruikt in de ex vivo model (Figuur 1). De dikte van de varkens maag muur varieert in verschillende gebieden van de maag. Gebruik de bovenste derde van de varkens maag, die relatief vergelijkbaar met de menselijke maag is. Uitsluiten ongeschikte exemplaren waar submucosal hoogte niet als gevolg van fibrose gevonden is.
- Snijd maag specimens in vierkanten met benaderende afmetingen van 6 × 6 cm.
- Opslaan van de maag specimens onmiddellijk bij een temperatuur van-30 ° C.
- Ontdooi bevroren maag exemplaren vlak voor de meetprocedure zodat uniforme meetomstandigheden.
2. gedetailleerde Setup methodologie van een nieuw Model van de Ex Vivo
Opmerking: Strek het ontdooide model op een bord op twee verschillende manieren. Vast in de conventionele ex vivo model, het model met pinnen (figuur 1A)19,20,21,22. Aan de andere kant, in het nieuwe model ex vivo positiebepaling of uitrekken van beide uiteinden van het model met clips aan het produceren van een constante spanning (figuur 1B, C). Alle onderdelen van het nieuwe model zijn eenvoudig te verkrijgen, en de installatie van het nieuwe model kan snel worden afgerond (Figuur 2). De procedure van het nieuwe model is als volgt (Figuur 3):
- Sluit de roestvrij staal clip en de belangrijkste draad en de S-vormige haak (figuur 3A).
- Sluit de draad en de S-vormige haak en het gewicht (figuur 3A).
- Sluit de haak aan het andere uiteinde van de draad. Een trekinrichting is voltooid in het hierboven beschreven proces (figuur 3B).
- Het vaststellen van de riemschijven (Figuur 2b) aan beide uiteinden van de base (Figuur 3 c).
- Plaats de rubber plaat (6 x 6 cm) in het midden van de base (Figuur 3 c).
- Plaats de maag specimen op het rubber plaat en knijp die het specimen met de clip van de trekinrichting eindigt.
- Hang het gewicht door middel van de riemschijf (beide kanten). Aldus, kan constante spanning worden toegepast op het model (Figuur 4).
- Start van de meting van SEH, omdat na de installatie van het nieuwe model volledig afgewerkt is (zie stap 3 hieronder).
3. evaluatie van de prestaties van de SIM-
Opmerking: In deze studie gebruikten we normale zout (NS) en 0,4% Natrium hyaluronaat (HA) als SIMs worden getest, en meten van de twee SIMs SEH. Drie onafhankelijke metingen worden uitgevoerd. De verkregen gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de statistische analysesoftware (GraphPad prisma 7). We continue variabelen (SEH) geanalyseerd met de Student t-test en de grootheden met P < 0,05 significant werden beschouwd. De meting van SEH is als volgt (Figuur 5).
- Nulpunt aanpassing van de hoogte profiel, gebaseerd op de hoogte van de mucosa vóór een submucosal hoogte-procedure uitvoeren In detail, uitgevoerd door nul-punt aanpassing door het indrukken van de knop VOORINSTELLING na de vaststelling van de scriber op de hoogte van de mucosal oppervlakte.
- Injecteren 2,0 mL van elke oplossing horizontaal in de submucosa van het specimen marges met behulp van een 2,5 mL spuit en naald 23-gauge, voor het uitvoeren van een submucosal hoogte procedure (figuur 5A-C).
- Maatregel SEH snel met behulp van een digitale hoogte gage op 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 30, 45 en 60 min na de injectie (figuur 5D). Opnemen in detail, de hoogte weergegeven op de meter hoogte bij de vaststelling van de scriber naar de top van de submucosal hoogte.
- Drie onafhankelijke metingen uitvoeren, en de verkregen resultaten wordt uitgedrukt als het gemiddelde en de standaarddeviatie.
- De verkregen gegevens met behulp van passende statistische software analyseren en evalueren van de prestaties van de SIMs (de prestaties kan worden vergeleken tussen elke SIM-kaart.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEH werd gemeten na verloop van tijd in het nieuwe ex vivo model of conventionele ex vivo model. De waarden van de SEH (NS) gemeten met behulp van de conventionele model [NS werd geïnjecteerd in de submucosa van het specimen vast met spelden (0.0 N)] waren 5.7 mm (0 min), 3,6 mm (5 min), 3.0 mm (10 min), en 2.2 mm (30 min). Op deze manier daalde de waarden van SEH met steeds meer post injectie. Een soortgelijke analyse werd uitgevoerd met behulp van 0,4% HA in plaats van de NS. De waarden van de SEH (0,4% HA) waren 6.5 mm (0 min), 5.2 mm (5 min), 4.8 mm (10 min), en 4.1 mm (30 min). De resulterende SEHs van 0,4% HA waren hoger dan die van NS ongeacht de post injectie tijd. De SEHs (NS en 0,4% HA) verkregen met behulp van de conventionele model (bij afwezigheid van de toegepaste spanning) tentoongesteld relatief grote variaties (met andere woorden, hun standaarddeviaties waren hoog) (figuur 6A).
Vervolgens werden de waarden van de SEH (NS) gemeten met behulp van de conventionele model [NS werd geïnjecteerd in de submucosa van het specimen uitgerekt op een constante spanning (1.5 N)] 4,8 mm (0 min), 3,0 mm (5 min), 2,4 mm (10 min), en 1,8 mm (30 min). Wanneer de spanning werd verhoogd tot 3.0 N onder dezelfde voorwaarden, de waarden van SEH (NS) waren 4.5 mm (0 min), 2,3 mm (5 min), 1.5 mm (10 min), en 1.3 mm (30 min). De SEH gemeten post injectie meermaals daalde met toenemende spanningen. De SEHs die zijn verkregen met behulp van de nieuwe kleine variaties van de model tentoongesteld (met andere woorden, hun standaarddeviaties waren laag) (figuur 6B, C).
Voor de beoordeling van de relatie tussen SEH en spanning toegepast op het model, vergeleken we SEH gemeten bij verschillende spanningen (0.0-3.0 N). In de analyse met het nieuwe model, de SEH verkregen op een spanning van 3.0 N aanzienlijk lager was dan de SEH verkregen op een spanning van 1.5 N (in alle gevallen de voorwaarde P < 0.001 was tevreden). Daarentegen aangezien standaardafwijkingen van SEHs die zijn verkregen met behulp van de conventionele model (0.0 N) hoog waren, was er geen significant verschil tussen SEHs die zijn verkregen met behulp van de conventionele model (0.0 N) en het nieuwe model (1.5 N) (figuur 6D, E).
Figuur 1. Nieuwe ex vivo en conventionele ex vivo model. In het objectmodel van conventionele ex vivo de varkens specimen werd bevestigd met pinnen (A). Aan de andere kant, in de nieuwe ex vivo model, waren beide uiteinden van het specimen uitgerekt met clips aan het produceren van een constante spanning (B). Dit model kan worden aangespannen uniform met behulp van een gewicht, en de spanning kan worden geregeld door het veranderen van het gewicht (C). Elke SIM-kaart werd geïnjecteerd in de submucosa van het specimen, wat leidt tot submucosal hoogte (D). Dit cijfer is gewijzigd van Hirose et al. 23. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Alle onderdelen voor het nieuwe model gebruikt. Het nieuwe model ex vivo bestaat uit onderdelen die gemakkelijk beschikbaar zijn. Alle onderdelen gebruikt voor het nieuwe model ex vivo : (a) ongeveer 50-300 g van gewichten (het gewicht kan gewijzigd worden op de juiste manier afhankelijk van de toegepaste spanning); (b) vaste type katrol met katrol diameter van 25 mm; (c) roestvrij staaldraad met een diameter van 0,45 mm; (d) roestvrij staal clip van breedte 147 mm; (e) roestvrij staal belangrijkste draad met een lengte van 12 cm; (f) roestvrijstalen S-vormige haak; (g) afsluitbare roestvrij stalen S-vormige haak. (Dit cijfer is gewijzigd van Hirose et al. 23). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. De gedetailleerde installatiemethode van het nieuwe model ex vivo . Het nieuwe model ex vivo snel kan worden ingesteld. (A) verbinding maken met de RVS clip (figuur 2d) en de belangrijkste draad (figuur 2e) en de S-vormige haak (Figuur 2 g). Vervolgens sluit de draad (Figuur 2 c), de S-vormige haak (figuur 2f) en het gewicht (Figuur 2a). (B) ten slotte de haak (Figuur 2 g) verbinding te maken met het andere uiteinde van de draad (Figuur 2 c). Een trekinrichting is voltooid in het hierboven beschreven proces. (C) bevestigen de katrollen (Figuur 2b) aan beide uiteinden van de base [rechthoekig houten voet (45 x 60 cm) voor het samenstellen van het model]. Plaats vervolgens de rubber plaat (6 x 6 cm) in het midden van de base. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. De volledige weergave van het nieuwe model ex vivo . Nauwkeurige meting van SEH kan worden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. De meetprocedure met behulp van het nieuwe model ex vivo . Om te beoordelen van de prestaties van de SIM, de omvang van de SEH werd gemeten door een digitale hoogte gage (A). Met een 2.5-mL injectiespuit met een naald 23-gauge, werd 2,0 mL van elke SIM-kaart geïnjecteerd in de submucosa van het specimen marges maken een submucosal hoogte (B, C). De digitale hoogte gage werd gebruikt voor het meten van de hoogte van de submucosal hoogte (dwz., de waarden van SEH) (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Meting van de SEH met behulp van de nieuwe of conventionele model. Na de injectie van NS of 0,4% HA in de submucosa van het specimen vast met spelden (0.0 N) (A) of op een constante spanning (1.5 N of 3.0 N) uitgerekt werd (B, C), de SEH gemeten met behulp van de hoogte gage. Daarna vergeleken we de waarden van SEH gemeten op verschillende spanningen (0.0 1.5 en 3.0 N) na de submucosal injectie van NS (D) of 0,4% HA (E). Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. van meer dan drie onafhankelijke experimenten. (Dit cijfer is gewijzigd van Hirose et al. 23) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De varkens maag gebruikt voor het nieuwe model onmiddellijk na resectie in een diepvriezer moet worden opgeslagen en worden gebruikt binnen een paar maanden na de bevriezing, omdat de versheid van de varkens maag essentieel voor de meting van de SEH is. (We gemeten met behulp van zowel bevroren als niet bevroren maag specimens SEH en bevestigd dat er geen verschil in het resultaat van SEH meting was.)
De kwaliteit van de maag specimens is sterk beïnvloed door de individuele verschillen van varkens magen. Vandaar, is het aanbevolen om uitsluiten natuurlijk dik specimens of exemplaren met vele plooien voor meting. Bovendien kunnen enkele exemplaren worden ongepast exemplaren voor SEH meting als gevolg van fibrose. Het is raadzaam om uit te sluiten van de ongepaste specimens waar submucosal hoogte niet als gevolg van fibrose gevonden is.
Aangezien het spijsverteringskanaal is uitgebreid door endoscopische behandeling, wordt enige spanning toegepast op de gastro-intestinale mucosa. Het bleek dat de prestaties van de SIM (geëvalueerd door het meten van de waarden van SEH) minder met het verhogen van de waarden van spanning toegepast op de specimens. De spanning was dus een belangrijke factor die de prestaties van de SIM (dwz., de waarden van SEH)23. De toepassing van spanning van 1.5-3.0 N kan een omgeving dichter om menselijk gastro-intestinale mucosa te reproduceren. Een beperking van deze methode is echter dat de optimale spanning van het verschil van het specimen gebruikt voor analyse afhangen kan.
In het conventionele model, omdat de spanning toegepast op elk monster varieert afhankelijk van de mate van fixatie van het model, de variaties van de gemeten SEH zijn groot (die correspondeert met de hoge standaardafwijkingen van SEH). Daarom maken deze hoge standaarddeviaties het moeilijk te vergelijken van elke SEH in detail en statistische analyses uit te voeren. Aan de andere kant, als gevolg van kleine variaties van SEH gemeten in het nieuwe model, SIM prestaties kan vergeleken worden nauwkeurig ex vivo en nauwkeurige statistische analyse wordt uitgevoerd.
Kortom, maakt het nieuwe model ex vivo nauwkeurige meting van de SEH en gedetailleerde vergelijking van de prestaties van de SIM. Beschrijvingen van gedetailleerde setup methodologie zal bijdragen tot de verspreiding van het nieuwe model en de ontwikkeling van hoogwaardige materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Kyoto innovatieve medische Technology Research & Development Support System, en door het translationeel onderzoeksprogramma; Strategische promotie voor de praktische toepassing van innovatieve medische technologie (TR-SPRINT) uit Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| weight (153.1 g) | |||
| fixed type pulley | H.H.H. MANUFACTURING | VS25 | |
| stainless steel wire with a diameter of 0.45 mm | Nissa Chain | Cut wire Y-5 | |
| stainless steel clip of width 147 mm | KOKUYO | none | |
| stainless steel key wire with a length of 12 cm | Nissa Chain | P-702 | |
| stainless steel S shaped hook | TRUSCO NAKAYAMA | TCS1.2 | |
| lockable stainless steel S-shaped hook | Mizumoto Machine Mfg | B2054 | |
| rectangular wooden base (45 x 60 cm) | none | none | |
| rubber plate (5 x 5 cm) | none | none | |
| digital height gage | Mitutoyo | HDS-20C | |
| 2.5-mL syringe | Terumo | SS-02SZ | |
| 23-gauge needle | Terumo | NN-2332R | |
| MucoUp | Boston Scientific | none | 0.4% sodium hyaluronate (HA) |
| saline (20 mL) | Otsuka Pharmaceutical | none | normal saline (NS) |
| GraphPad Prism 7 software | GraphPad Inc | none |
References
- Ono, H., et al. Endoscopic mucosal resection for treatment of early gastric cancer. Gut. 48 (2), 225-229 (2001).
- Conio, M., Ponchon, T., Blanchi, S., Filiberti, R. Endoscopic mucosal resection. The American journal of gastroenterology. 101 (3), 653-663 (2006).
- Soetikno, R. M., Gotoda, T., Nakanishi, Y., Soehendra, N. Endoscopic mucosal resection. Gastrointestinal endoscopy. 57 (4), 567-579 (2003).
- Iishi, H., et al. Endoscopic resection of large sessile colorectal polyps using a submucosal saline injection technique. Hepato-gastroenterology. 44 (15), 698-702 (1997).
- Katsinelos, P., et al. A comparative study of 50% dextrose and normal saline solution on their ability to create submucosal fluid cushions for endoscopic resection of sessile rectosigmoid polyps. Gastrointestinal endoscopy. 68 (4), 692-698 (2008).
- Yamamoto, H., et al. A novel method of endoscopic mucosal resection using sodium hyaluronate. Gastrointestinal endoscopy. 50 (2), 251-256 (1999).
- Yamamoto, H., et al. A successful single-step endoscopic resection of a 40 millimeter flat-elevated tumor in the rectum: endoscopic mucosal resection using sodium hyaluronate. Gastrointestinal endoscopy. 50 (5), 701-704 (1999).
- Yamamoto, H., et al. Usefulness and safety of 0.4% sodium hyaluronate solution as a submucosal fluid "cushion" in endoscopic resection for gastric neoplasms: a prospective multicenter trial. Gastrointestinal endoscopy. 67 (6), 830-839 (2008).
- Yamamoto, H., et al. Successful en-bloc resection of large superficial tumors in the stomach and colon using sodium hyaluronate and small-caliber-tip transparent hood. Endoscopy. 35 (8), 690-694 (2003).
- Kishihara, T., et al. Usefulness of sodium hyaluronate solution in colorectal endoscopic mucosal resection. Digestive endoscopy. 24 (5), 348-352 (2012).
- Yoshida, N., et al. Endoscopic mucosal resection with 0.13% hyaluronic acid solution for colorectal polyps less than 20 mm: a randomized controlled trial. Journal of gastroenterology and hepatology. 27 (8), 1377-1383 (2012).
- Uraoka, T., et al. Effectiveness of glycerol as a submucosal injection for EMR. Gastrointestinal endoscopy. 61 (6), 736-740 (2005).
- Conio, M., et al. Comparative performance in the porcine esophagus of different solutions used for submucosal injection. Gastrointestinal endoscopy. 56 (4), 513-516 (2002).
- Moss, A., Bourke, M. J., Metz, A. J. A randomized, double-blind trial of succinylated gelatin submucosal injection for endoscopic resection of large sessile polyps of the colon. The American journal of gastroenterology. 105 (11), 2375-2382 (2010).
- Lee, S. H., et al. A new method of EMR: submucosal injection of a fibrinogen mixture. Gastrointestinal endoscopy. 59 (2), 220-224 (2004).
- Hurlstone, D. P., et al. EMR using dextrose solution versus sodium hyaluronate for colorectal Paris type I and 0-II lesions: a randomized endoscopist-blinded study. Endoscopy. 40 (2), 110-114 (2008).
- Huai, Z. Y., Feng Xian, W., Chang Jiang, L., Xi Chen, W. Submucosal injection solution for endoscopic resection in gastrointestinal tract: a traditional and network meta-analysis. Gastroenterology research and practice. 2015, 702768 (2015).
- Yandrapu, H., et al. Normal saline solution versus other viscous solutions for submucosal injection during endoscopic mucosal resection: a systematic review and meta-analysis. Gastrointestinal endoscopy. , (2016).
- Fernandez-Esparrach, G., Shaikh, S. N., Cohen, A., Ryan, M. B., Thompson, C. C. Efficacy of a reverse-phase polymer as a submucosal injection solution for EMR: a comparative study (with video). Gastrointestinal endoscopy. 69 (6), 1135-1139 (2009).
- Tran, R. T., Palmer, M., Tang, S. J., Abell, T. L., Yang, J. Injectable drug-eluting elastomeric polymer: a novel submucosal injection material. Gastrointestinal endoscopy. 75 (5), 1092-1097 (2012).
- Akagi, T., et al. Sodium alginate as an ideal submucosal injection material for endoscopic submucosal resection: preliminary experimental and clinical study. Gastrointestinal endoscopy. 74 (5), 1026-1032 (2011).
- Eun, S. H., et al. Effectiveness of sodium alginate as a submucosal injection material for endoscopic mucosal resection in animal. Gut and Liver. 1 (1), 27-32 (2007).
- Hirose, R., et al. Development of a new ex vivo model for evaluation of endoscopic submucosal injection materials performance. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 79, 219-225 (2018).
