Summary
Her præsenterer vi en protokol for at visualisere fine strukturer af perifere nerver ved at opnå og farvning 1-2 µm sektioner med toluidin blå
Abstract
Perifere nerver udvide i hele kroppen, innerverer målvæv med motoriske eller sensoriske axoner. På grund af udbredt distribution, er perifere nerver ofte skadet på grund af traumer eller sygdom. Som metoder og strategier er udviklet til at vurdere perifer nerveskade i dyremodeller, funktion og regenerering, er analysere morfometri af perifere nerve blevet en afgørende terminal resultat måling. Toluidin blå farvning af nerve cross dele fremstillet af harpiks indlejret nerve sektioner er en reproducerbar metode til kvalitative og kvantitative vurderinger af perifere nerver, gør det muligt for visualisering af morfologi antallet af axoner og graden af myelination. Denne teknik, kan som med mange andre histologiske metoder, være svært at lære og mestre ved hjælp af standard skriftlige protokoller. Hensigten med denne publikation er derfor at fremhæve skriftlige protokoller for toluidin blå farvning af perifere nerver med videography af den metode, ved hjælp af ischiadicus nerver høstet fra rotter. I denne protokol, vi beskriver i vivo perifere nerve fiksering og samling af væv, og efter fiksering med 2% osmium dinitrogentetraoxid, integrering af nerver i epoxy-harpiks, og ultramicrotome skæring af nerver til 1-2μm tykkelse. Nerve sektioner derefter overført til et glas dias og farves med toluidin blå, hvorefter de kvantitativt og kvalitativt vurderes. Eksempler på de mest almindelige problemer er vist, samt trin for at afhjælpe disse problemer.
Introduction
Perifere nerver udvide i hele kroppen, innerverer målvæv med motoriske eller sensoriske axoner1. Perifere nerve defekter forårsaget af medicinske lidelser og traumer repræsenterer et alvorligt folkesundhedsproblem og har store økonomiske konsekvenser2,3. Trods fremskridt i vurderingen af resultaterne af perifere nerve skader og forståelse nerve regenerering, er traditionelle metoder såsom nerve histologi og farvning teknikker væsentlige værktøjer til kvalitativt og kvantitativt vurdere nerve sundhed som en terminal resultat måling i dyremodeller eller skåret humant væv. Dette er ofte parret med elektrofysiologiske målinger af perifere nervefunktion, hvor morfometri kan afsløre hvorfor funktionelle nerve regenerering gjorde eller ikke opstår.
Toluidin blå farvning af harpiks integreret semi-tynd perifere nerve sektioner er en specialiseret metode til imaging myelinerede nervefibre, at levere høj kvalitet og klare detaljerede billeder af nerve strukturer4,5,6 . Toluidin blå er en acidophilic metakromatisk pletten, opdaget af William Henry Perkin i 18567, og har været anvendt i flere medicinske anvendelser8. Toluidin blå-farvede perifere nerve dele fremstillet af harpiks-embedded nerve segmenter giver mulighed for klart visualisering af nerve strukturer. Visualisering af myelinskeden struktur kan forbedres ved brug af osmium dinitrogentetraoxid efter fiksering4,9. Osmium dinitrogentetraoxid er en giftig oxidant og lipid Fikseringsvæske agent, der interagerer med dobbeltbindinger i lipider, hvilket resulterer i skarp definerede lipid-rige myelin skeder10. Men osmium dinitrogentetraoxid er giftige, dyre, kræver en længere inkubation af nerve segmenter, og bruges ikke altid.
Alternative metoder til forarbejdning og farvning er blevet udviklet til visualisering af perifere nerve morfologi; Paraffin, kryogene skæring og epoxy harpiks-embedded nerve skæring efterfulgt af farvning med toluidin blå eller phenylendiamin løsning er blevet brugt til at kvantificere morfologiske ændringer af perifer nerve regenerering 11,12 . Disse metoder har deres fordele og udbytte vigtige data om antallet af axoner, myelin tykkelse, axon diameter og axon diameter til myelinerede fiber diameter (g-ratio) 11,13,14,15 .
Den primære forskel af harpiks-indlejring i denne protokol er, at det letter at få 1-2 μm tykkelse tværsnit på grund af hårdhed af harpiks samtidig opretholde de histologiske kvaliteter af nerve. Disse tynde sektioner, i stedet for de 4-5 μm tykkelse dele fremstillet af paraffin indlejring, give perifer nerve sektioner med højere opløsning, giver mulighed for en mere nøjagtig kvantificering af axon myelination, som g-ratio, der ikke kan fremstillet af tykkere afsnit16. Mens kryogene skæring kan bruges til at få 1-2 µm sektioner, har det været vores oplevelse, at det er mere vanskeligt at opnå sektioner uden talrige store revner. Sådanne halvtosset sektioner kan medføre unøjagtige optælling af antallet af axoner og aspekter af myelination.
Ud over toluidin blå farvning17, kan en sølvfarvning metode18 og Masson's trichrome farvning4 også bruges til at vise nerve axoner. Men ved hjælp af harpiks indlejring af rotte median nerve sektioner farves med enten hæmatoxylin og eosin eller Masson's trichrome viste svage myelin skeder og ukendt strukturer, mens toluidin blå farvning viste klart myelinskeden billede og let kan være kvantificeret4. Trods nogle begrænsninger, toluidin blå farvning af harpiks indlejret perifere nerver er en værdifuld teknik, der kan bruges, når billeder i høj opløsning af nerve morfologi er påkrævet.
Den primære ulempe for harpiks indlejring er at det er tidskrævende og ikke tillader immunfarvning af de samme væv på grund af vanskeligheden ved antigen hentning i forhold til paraffin og frosne integrerede sektioner teknikker. Således er det ikke generelt muligt at udnytte den samme væv til immunfarvning, der er behandlet via harpiks-indlejring for toluidin blå farvning. Selv om ikke anvendes her, hvis Immunhistokemi ønskes i harpiks integrerede dele, brug af glycol methacrylat indlejring harpiks giver mulighed for Immunhistokemi skal udføres på væv sektioner, men det er relativt dyrt19. Dette kan afbødes lidt ved at skære den perifere nerve i adskilte segmenter, nogle til integrering af resin og andre for immunfarvning direkte efter fiksering.
Processen med toluidin blå farvning af harpiks indlejret perifere nerver, som med de fleste histopatologiske analyse, kan blive brudt op i fem faser, herunder fiksering, dehydrering, indlejring, skæring og farvning20. Vores mål her at give en protokol og praktiske retningslinjer for brug af harpiks integrerede rotte iskiasnerven sektioner farves med toluidin blå at erhverve høj kvalitetsbilleder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksen Sprague Dawley rotter blev anvendt i dette projekt og alle procedurer blev godkendt af universitetet i Wyoming institutionelle dyrs pleje og brug udvalget.
1. kirurgi og i Vivo Nerve fiksation
Bemærk: Leverandøroplysninger for alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol er angivet i Tabel af materialer.
Bemærk: In vivo nerve fiksering bruges til at bevare vævet og reducere strukturel nedbrydning, der kan opstå mellem tidspunktet for døden og samling af nerver. In vivo væv fiksering er en almindelig praksis for udarbejdelse af nervesystemet væv for histologi, hvor perfusion er ofte en forløber for dette. Placering og størrelse af perifere nerver tilladt for in situ fiksering. Vi anbefaler ikke samling og fiksering af væv efter eutanasi på grund af muligheden for væv nedbrydning.
- Forberede bedøvelse rotter ved at placere det i en induktion kammer med 2-3% isofluran, derefter placere den bedøvede rotte i liggende position på toppen af en dissektion mat og fastholde på 1-2% af isofluran via bedøvende næsen kegle. For at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi, forsøgsdyr for pedal tilbagetrækning på bagben fødderne og tjekke for fravær af øjenlågenes reflekser på øjnene ved at røre ved den mediale øjenkrog af øjet.
Bemærk: Intraperitoneal injektion af ketamin er et almindeligt anvendte alternativ til inhalerede isofluran. - For at afsløre iskiasnerven, Barber hår af hind limb(s) og ren glatbarberet områder med 70% ethanol. Med en skalpel eller en saks, gøre en 2-3 cm snit i huden langs hind lemmer fra knæet op til større trochanter, hvor palpering af lårbenet ved hjælp af en steril skalpel til at sikre den rigtige placering i indsnittet. Lårbenet er beliggende lige proksimalt for den mest tilgængelige segment af iskiasnerven. Selv om dette er en ikke-overlevelse kirurgi, bevare steril teknik.
- Efter at hud indsnittet, Find fly mellem biceps femoris muskel og gluteus maximus muskel, og ved hjælp af microdissection saks adskille den underliggende fascia og udsætte 2-3 cm af iskiasnerven understregning. For at afsløre en klar del af iskiasnerven, skal du bruge en retractor for at udvide kløften mellem de to muskler (figur 1A). Med fine pincet og iris saks, omhyggeligt adskille nerven fra omkringliggende bindevæv, tage stor forsigtighed for ikke at komprimere eller skære nerven.
- Tilføje tilstrækkelig Trump fiksativ (4% formaldehyd, 1% glutaraldehyd i 1 x PBS (fosfatbufferet saltopløsning) med 1.16 g af NaH2PO4· H2O pr. 100 mL) ind i hulrummet indeholdende den udsatte nerve for at dække nerven og lad sidde i 10 min. Hvis nødvendigt, sted gaze under hind ben for at forbedre vinklen, så flere fiksativ kan føjes ind i hulrummet. Fjerne fiksativ efter 10 min og Gentag dette trin to gange mere.
- Ved hjælp af en dissekere mikroskop, skære nerve fra begge sider ved hjælp af fine dissektion saks, og sørg for ikke at strække eller klemme iskiasnerven, og straks sætte afsnittene nerve i 15 mL rør indeholdende Trumps fiksativ ved 4 ° C for en uge, skiftende den fiksativ hver 48 timer.
- Efterlad ikke dyr uden opsyn under enhver del af den kirurgiske procedure. Efter fjernelse af nerve, aflive dyr af cervikal dislokation mens under anæstesi.
2. Osmium dinitrogentetraoxid behandling og harpiks indlejring
- Bogføre fiksering, forsigtigt fjerne enhver resterende fedt og bindevæv fra nerve og brug en skarp skalpel til at skære nerven i segmenter ca 5 mm i længden (nerve segmenter kan være adskilt og mærket i forskellige rør). Forberede frisk 2% osmium dinitrogentetraoxid fortyndet i Trumps Fikseringsvæske løsning og holde i et glasrør. Fordyb nerve segmenter i 2% osmium dinitrogentetraoxid til 2 h, som kan være i plast rør i denne korte periode.
Bemærk: Nogle plasticrør reagere med osmium dinitrogentetraoxid, forårsager en mørkfarvning af løsningen, så langvarig opbevaring af osmium dinitrogentetraoxid i plasticrør ikke anbefales. - Ved hjælp af en epoxy indlejring medium kit, forberede den endelige indlejring formel:
- Bland epoxy indlejring medium med DDSA løsning (dodecenylsuccinic anhydrid; blanding A) og bland epoxy indlejring medium med NMA løsning (methylnadic anhydrid; blanding B). Lad begge blandinger, A og B blandes mindst 20 min ved omrøring med en magnetomrører.
- Umiddelbart før anvendelsen, mix blanding A og B og tilføje accelerator DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) i andelen af 1,5 til 2,0% af den samlede volumen af blandingen. Bemærk, at DPM-30 løsning bør måles netop for at forhindre blok bliver mørk i farven og sprødt. Alle harpiks kemikalier er giftige; tage ekstra pleje for at forhindre kontakt med huden eller ved indånding.
- Ved hjælp af 1,5 mL rør, vaske nerve segmenter med PBS og dehydrering processen ved at placere nerve segmenterne i forskellige acetone/destilleret vand passager: 30%, 60% og 90%, koncentrationer i 10 min, så i 100% acetone 3 gange i 10 min. Bemærk, at ethanol kan anvendes stedet acetone.
- For harpiks infiltration, placere nerve segmenterne i en blanding af 1 del af den endelige indlejring blanding og 1 del 100% acetone i 30 min., derefter i en blanding af 2 dele af den endelige indlejring blanding og 1 del 100% acetone i 30 min , og endelig sted nerven segmenter i finalen indlejring blanding i 30 min.
- Sætte nerve segmenter i silikonegummi indlejring forme (vi har brugt 106 mm længde x 71 mm (bredde) x 7 mm dybde; blokere størrelse 11 mm længde x 6 mm (bredde) x 3 mm dybde). Forsigtigt tilføje harpiks oven på nerverne, og sørg for at dække hele nerve segmenter og undgå luftbobler. Lad mug indeholdende nerve segmenter med harpiks til at polymerisere ved 60 ° C natten over.
3. skæring af Ultramicrotome
- Forbered glasknive med et glas kniv maker (figur 1B) og gøre glasknive med både (figur 1 c), som bruges til at indsamle nerve sektioner flyder på destilleret vand.
- Sted harpiks indlejret nerve blokke i ultramicrotome-holderen med den trapezformede side opad. Hjælp af ultramicrotome omfang, trim eventuelle overskydende resin omkringliggende nervevæv, og gøre blok står over for en trapez form og så tæt på den langsgående overfladen af nerve som muligt ved hjælp af en enkelt-kantet klinge, som et barberblad. Ikke trænger gennem nerve-segment, som er genkendelige ved sin mørke farvning af osmium dinitrogentetraoxid langsgående overflade.
Bemærk: Trimning overskydende resin vil reducere området af harpiks at være sectioned og forbedre vingernes ydeevne og skære i efterfølgende trin. - Ved hjælp af ultramicrotome, gøre flere tværsnit tilstrækkeligt til at afsløre en ensartet tværsnit overflade af nervevæv ved hjælp af en almindelig glas kniv. Når dette er gjort, skifte til et glas kniv hvis båd er fyldt med destilleret vand ved stuetemperatur og justere ultramicrotome til 1-2 μm at skære tynde sektioner.
- Overføre flydende tyndslib fra glas kniv båd til en dråbe deioniseret vand på glas dias ved hjælp af metal loop (fig. 1 d). Tørre dias, der indeholder sektioner af passerer flere gange over en flamme i et par sekunder, og sørg for ikke at overophede sektionerne. Pletten tørrede sektioner straks med toluidin blå eller opbevares ved stuetemperatur i flere dage før farvning.
Bemærk: Sektioner kan også tørres ved hjælp af en plade varmere ved 60 ° C i 15 min. En langsom tørring proces gør afsnittene glat.
4. toluidin blå farvning
- Forberede 1% opløsning af toluidin blå ved at opløse 2 g af natriumborat i 100 mL deioniseret vand og derefter tilføje 1 g af toluidin blå og rør indtil opløst. Filtrer løsning ved hjælp af filtrerpapir (pore størrelse: 11 µm) og holde løsningen i en uigennemsigtig flaske ved stuetemperatur i op til to uger.
- Ved hjælp af en plastik pipette eller mikro pipette, tilsættes en dråbe af toluidin blå løsning på toppen af afsnittene nerve og henstår i 20-30 s.
- Skyl alle toluidin blå løsning overskydende ved forsigtigt dypning diassene i ionbyttet vand krukke og Gentag 3 - 4 gange indtil sektioner er klar. Tør dias mindst 15 min. ved 60 ° C eller natten over ved stuetemperatur og derefter dække afsnittene med en coverslip ved hjælp af regelmæssig montering medium. Undersøge de monterede dias straks eller opbevares ved stuetemperatur.
- Undersøges under et lysmikroskop. En 100 X olie fordybelse linse anbefales til detaljerede billeder, der bruges til at beregne g-nøgletal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Harpiks integreret perifer nerve sektioner farves med toluidin blå giver mulighed for nøjagtig histologiske kvantificeringer. Overblik over proceduren, der er vist i (figur 2). Ischiadicus nerver sektioner indkapslet i harpiks medium og farves med toluidin blå viste klare billeder med en optimal opløsning (figur 3). Nerveskader kan forårsage mange forandringer i nerve morfologiske strukturer, for eksempel, ændringer i nerve fiber, axon diameter og myelinskeden tykkelse. Denne metode kan bevare nerve struktur i sin naturlige form, der letter måling af flere parametre som forholdet mellem axon diameter til den samlede fiber diameter (g-forholdet; Figur 4). En række faktorer kan føre til mindre end optimale perifere nerve sektioner herunder tilstedeværelsen af revner (figur 5A) i afsnittet på grund af forkert håndtering af nerve. Huller kan også forekomme i afsnittet (figur 5B) på grund af utilstrækkelig dehydrering. En anden mulig fejl i proceduren foldning af sektionerne (figur 5 c), som kan afhjælpes ved hjælp af vaccination sløjfer til afsnit overførsel på glas dias.
Figur 1: kirurgi og skæring. (A) rotte iskiasnerven under i vivo fiksering. (B) glas kniv maker (C) glasknive med båd. (D) Metal sløjfer bruges til at overføre flød tyndslib fra glasknive til en dråbe deioniseret vand på glas dias. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af metoden anvendt i denne protokol. (A) voksen Sprague Dawley rotte er bedøvede, efterfulgt af i vivo nerve fiksering (B) og nerve samling (C). Det næste skridt er efter fiksering med 2% osmium dinitrogentetraoxid (D) og harpiks embedding (E). Harpiks integrerede nerve sektioner er så klippede (F) og sektioneret (G) ved hjælp af en ultramicrotome. Endelig, nerve sektioner på glas dias farves med toluidin blå (H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tværsnit af en rotte iskiasnerven farves med toluidin blå. Viser sektioner under forskellige forstørrelser (10 X 20 X, 40 X og 60 X) af klart billede med en optimal opløsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: tværsnit af en rotte iskiasnerven farves med toluidin blå. Dette billede i høj opløsning (100 X) kan bruges til at måle forholdet mellem axon diameter til den samlede fiber diameter (g-ratio). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: tværgående dele af en rotte iskiasnerven farves med toluidin blå under forskellige forstørrelser. Vist aresome af de problemer, der kan opstå under udførelsen af denne protokol. (A) og (B). Tilstedeværelsen af revner og huller inde i afsnittet nerve forårsaget af forkert håndtering af afsnittet og utilstrækkelig dehydrering af væv, henholdsvis. (C). foldning af sektionerne, som kan ske under overføre afsnittene fra glasknive til diaset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser af de morfologiske strukturer af perifer nerveskade og regenerering er hyppige emner af undersøgelsen13. I denne protokol beskrive vi trin for at opnå høj kvalitetsbilleder for histologiske kvantificeringer ved hjælp af rotte iskiasnerven væv indkapslet i harpiks blokke og farves med toluidin blå. Denne teknik giver et billede af nerve morfologi, hvor nerve regenerering kan kvantificeres ved at måle antallet af axoner, myelination, tilstedeværelse af infiltrativ fibrotisk væv og sundhed nerver. Mens billederne viser skæring og forarbejdning af uskadt nerver som prøver, de samme trin og materialer kan anvendes til tilskadekomne nerver og nerver regenereres med ledningskanaler eller væv grafts, forudsat at fiksation af væv er tilstrækkelig20, 21.
Mens alle trin i protokollen er væsentlige, er nogle af disse trin mere tilbøjelige til at føre til dårlig kvalitet sektioner eller billeder. Utilstrækkelig væv dehydrering kan føre til huller i afsnittene nerve (figur 5B). En mulig forklaring er immiscibility i harpiks med vand, og overskydende vand i vævet forhindrer harpiks fra infiltrerer væv. Derfor giver mulighed for tilstrækkelig tid og brug af absolutte acetone er afgørende for at sikre ordentlig dehydrering trin. Selvom vi anvendt acetone i denne protokol, kan ethanol også bruges. Mange harpiks, men er ikke reaktivt med ethanol, så vævet skal behandles med propylenoxid til at tjene som en overgang mellem ethanol dehydrering og harpiks indlejring.
På grund af thinness i afsnittene, bør overføre nerve sektioner fra glas kniv til diasset glas ske med stor omhu (figur 5 c). 1-2 μm sektioner er meget skrøbelig, og forkert overførsel af afsnittet kan forårsage afsnittet for at bryde. Hvis afsnittet er hentet i den centrale del af afsnittet med en nål, afsnittet er tilbøjelige til at folde sig selv og ofte vil være vanskeligt at udfolde når overført til diaset. Forskellige værktøjer kan bruges til overførsel af afsnittet til glas dias, herunder nåle og sløjfer, og hver bør testes for den specifikke bruger til at bestemme, hvilket vil give den bedste overførsel resultater. Til vores formål reduceret ved hjælp af en sløjfe, der kunne omfatte hele sektionen stærkt foldning af sektioner, når de blev overført fra glas kniv til objektglas (fig. 1 d).
Ordentlig behandling af nerverne er generelt afgørende som kompression af nerver kan medføre revner at opstå i nerve sektioner (figur 5A). Nerve væv komprimering kan ske ved overførsel af nerve segmenter i processerne af eksponering i dyr, fiksering, dehydrering og harpiks indlejring. For at undgå nerve væv kompression, nerve segmenter skal overføres af fine pincet og samlet op på ene ende af segmentet ideelt ved bare det epineurial lag, så det hele nerve ikke vil blive påvirket. Tilstedeværelsen af revner og linjer (kniv mærker) i afsnittene nerve kan også opstå på grund af kedelig eller overused glasknive. For at sikre optimal skæring, anbefaler vi at gøre frisk glasknive og ændre glaskniven hver 25-30 stykker, færre hvis skæring gennem nerve indkapslet i en kanal.
Harpiks kan være relativt dyrt, er utilstrækkelige, når langsgående nerve sektioner er påkrævet, og kan kræve dyre værktøjer som en ultramicrotome og et glas kniv maker. På trods af disse begrænsninger, toluidin blå farvning af harpiks integreret perifer nerve sektioner er stadig betragtes som guldstandarden for visualisering af tværsnit af perifere nerve morfometri4,5. Længdesnit kan også afsløre vigtige funktioner af perifere nerver, såsom cytoskeletale kontinuitet og noder af Ranvier, men er mest nyttigt med Immunhistokemi. I sådanne tilfælde er det almindelige praksis varierende behandle to dele af den samme nerve, en for toluidin blå tværsnit og den anden for langsgående Immunhistokemi. På grund af øget incidens af perifere nerve traumer og skader og behov på en bedre måde at vurdere nerve morfologiske strukturer, fortsat denne metode kan anvendes som et vigtigt redskab til at få histologiske nerveskader og regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne thankthe Jenkins mikroskopi facilitet på Wyoming Universitet for deres hjælp, og medlemmerne af Bushman lab, Kelly Roballo, Hayden sande, Wupu Osimanjiang og aske Dhunghana, om bistand til pasning af dyr. Denne publikation blev gjort mulig ved en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , Plenum. New York. 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
