Summary
यहां हम प्राप्त करने और toluidine नीले रंग के साथ 1-2 µm वर्गों धुंधला द्वारा परिधीय नसों की ठीक संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद
Abstract
परिधीय नसों शरीर भर में फैली हुई, innervating लक्ष्य ऊतकों मोटर या संवेदी axons के साथ. व्यापक वितरण के कारण, परिधीय नसों अक्सर आघात या रोग के कारण क्षतिग्रस्त हो रहे हैं । के रूप में तरीकों और रणनीतियों के लिए पशु मॉडल, समारोह और पुनर्जनन में परिधीय तंत्रिका चोट का आकलन विकसित किया गया है, परिधीय तंत्रिका के morphometry का विश्लेषण एक आवश्यक टर्मिनल परिणाम माप बन गया है । Toluidine ब्लू तंत्रिका क्रॉस राल एम्बेडेड तंत्रिका वर्गों से प्राप्त वर्गों के दाग परिधीय नसों के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन के लिए एक reproducible विधि है, axons और की डिग्री की आकृति विज्ञान की संख्या के दृश्य को सक्षम करने myelination । इस तकनीक, कई अंय ऊतकवैज्ञानिक तरीकों के साथ के रूप में, जानने के लिए और मानक लिखा प्रोटोकॉल का उपयोग कर गुरु मुश्किल हो सकता है । इस प्रकाशन के इरादे इसलिए विधि की वीडियोग्राफी के साथ परिधीय नसों के toluidine नीले दाग के लिए लिखा प्रोटोकॉल दबाव का चिह्न है, sciatic नसों चूहों से काटा का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल में, हम vivo परिधीय तंत्रिका निर्धारण और ऊतक के संग्रह में वर्णन, और बाद निर्धारण 2% आज़मियम tetroxide के साथ, epoxy राल में नसों की embedding, और ultramicrotome 1-2 माइक्रोन मोटाई के लिए नसों के अनुभाग । तंत्रिका वर्गों तो एक गिलास स्लाइड को हस्तांतरित और toluidine नीले रंग के साथ दाग है, जिसके बाद वे मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन कर रहे हैं । सबसे आम समस्याओं के उदाहरण, साथ ही इन समस्याओं को कम करने के लिए कदम दिखाए जाते हैं ।
Introduction
परिधीय नसों शरीर भर में फैली, innervating लक्ष्य ऊतकों मोटर या संवेदी axons1के साथ. परिधीय तंत्रिका चिकित्सा विकारों और आघात की वजह से दोष एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का प्रतिनिधित्व करते है और बड़े आर्थिक प्रभावों2,3है । परिधीय तंत्रिका चोटों और समझ तंत्रिका पुनर्जनन के परिणामों का आकलन करने में अग्रिम के बावजूद, ऐसे तंत्रिका प्रोटोकॉल और धुंधला तकनीक के रूप में पारंपरिक तरीकों को गुणात्मक और मात्रात्मक तंत्रिका स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए आवश्यक उपकरण है पशु मॉडल या उत्पादत्मक मानव ऊतक में एक टर्मिनल परिणाम माप के रूप में । यह अक्सर परिधीय तंत्रिका समारोह के electrophysiological माप के साथ बनती है, जहां morphometry प्रकट कर सकते है क्यों कार्यात्मक तंत्रिका पुनर्जनन किया था या नहीं हो ।
Toluidine नीले राल के धुंधला-अर्द्ध पतली परिधीय तंत्रिका वर्गों एम्बेडेड इमेजिंग myelinated तंत्रिका तंतुओं के लिए एक विशेष विधि है, उच्च गुणवत्ता प्रदान करता है और तंत्रिका संरचनाओं के स्पष्ट विस्तृत छवियों4,5,6 . Toluidine ब्लू एक acidophilic metachromatic दाग, १८५६7में विलियम हेनरी Perkin द्वारा की खोज की है, और कई चिकित्सा अनुप्रयोगों8में इस्तेमाल किया गया है । Toluidine नीले दाग परिधीय तंत्रिका वर्गों राल से प्राप्त-एंबेडेड तंत्रिका क्षेत्रों तंत्रिका संरचनाओं के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है । myelin म्यान संरचना के दृश्य आज़मियम tetroxide पद निर्धारण4,9के उपयोग से बढ़ाया जा सकता है । आज़मियम tetroxide एक विषैले ऑक्सीडेंट और लिपिड निर्धारण एजेंट है जो लिपिड में दोहरे बांड के साथ इंटरैक्ट करता है, जिसके परिणामस्वरूप लिपिड-रिच myelin म्यान10होते हैं । हालांकि, आज़मियम tetroxide विषाक्त, महंगा है, तंत्रिका क्षेत्रों की एक लंबी गर्मी की आवश्यकता है, और हमेशा इस्तेमाल नहीं किया है ।
प्रसंस्करण और धुंधला के वैकल्पिक तरीकों परिधीय तंत्रिका आकृति विज्ञान के दृश्य के लिए विकसित किया गया है; आयल, क्रायोजेनिक खोदी, और epoxy राल एंबेडेड तंत्रिका toluidine नीले या phenylenediamine समाधान के साथ दाग के बाद खोदी है परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन 11,12 के रूपात्मक परिवर्तन यों तो इस्तेमाल किया गया है . इन तरीकों से प्रत्येक अपने फायदे और उपज axons, myelin मोटाई, axon व्यास, और axon व्यास की संख्या पर आवश्यक डेटा myelinated फाइबर व्यास (जी अनुपात) 11,13,14,15 .
राल के प्राथमिक अंतर-इस प्रोटोकॉल में एंबेडिंग है कि यह 1-2 माइक्रोन मोटाई पार-राल की कठोरता के कारण वर्गों को प्राप्त करने, जबकि तंत्रिका के ऊतकवैज्ञानिक गुणों को बनाए रखने की सुविधा है । इन पतले वर्गों, के रूप में 4-5 माइक्रोन मोटाई तेल embedding से प्राप्त वर्गों का विरोध किया, उच्च संकल्प के साथ परिधीय तंत्रिका वर्गों प्रदान करते हैं, axon myelination के एक और अधिक सटीक ठहराव के लिए अनुमति देता है, जैसे जी अनुपात, कि नहीं किया जा सकता मोटा वर्गों16से प्राप्त की । जबकि क्रायोजेनिक खोदी 1-2 µm वर्गों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह हमारे अनुभव रहा है कि यह कई बड़ी दरारों के बिना वर्गों को प्राप्त करने के लिए और अधिक कठिन है । इस तरह के टूट वर्गों axons और myelination के पहलुओं की संख्या की गलत गिनती पैदा कर सकता है ।
toluidine नीले दाग17के अलावा, एक चांदी धुंधला विधि18 और Masson के trichrome धुंधला4 भी तंत्रिका axons दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, का उपयोग राल चूहे की एंबेडिंग माध्य तंत्रिका या तो hematoxylin और eosin या Masson trichrome के साथ सना हुआ वर्गों बेहोश myelin खोल और अपरिचित संरचनाओं दिखाया, जबकि toluidine नीले दाग स्पष्ट myelin म्यान छवि दिखाया और आसानी से कर सकते है हो quantified4. कुछ सीमाओं के बावजूद, toluidine ब्लू राल एम्बेडेड परिधीय नसों के दाग एक मूल्यवान तकनीक है कि जब तंत्रिका आकृति विज्ञान की उच्च संकल्प छवियों की आवश्यकता है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
राल embedding के लिए प्राथमिक नुकसान यह है कि यह समय लेने वाली है और immunostaining के लिए अनुमति नहीं antigen पुनर्प्राप्ति की कठिनाई के कारण एक ही ऊतक के लिए जब तेल और जमे हुए एंबेडेड वर्गों तकनीकों की तुलना में । इस प्रकार, यह आम तौर पर immunostaining कि राल के माध्यम से संसाधित है के लिए एक ही ऊतक का उपयोग संभव नहीं है-toluidine नीले दाग के लिए embedding । हालांकि यहां इस्तेमाल नहीं किया, अगर immunohistochemistry राल एंबेडेड वर्गों में वांछित है, ग्लाइकोल methacrylate embedding रेजिन के उपयोग के लिए immunohistochemistry ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया जा करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह अपेक्षाकृत महंगा है19। यह कुछ अलग क्षेत्रों में परिधीय तंत्रिका काटने से कम हो सकता है, कुछ राल के लिए-embedding और immunostaining के लिए दूसरों को सीधे निर्धारण के बाद ।
toluidine की प्रक्रिया नीले राल एंबेडेड परिधीय नसों के दाग, के रूप में सबसे histopathological विश्लेषण के साथ, पांच चरणों में भंग किया जा सकता है, निर्धारण सहित, निर्जलीकरण, embedding, अनुभाग, और दाग20। हम यहां उद्देश्य के लिए एक प्रोटोकॉल और राल एंबेडेड चूहे sciatic तंत्रिका toluidine नीले रंग के साथ दाग उच्च गुणवत्ता छवियां प्राप्त वर्गों का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
वयस्क Sprague Dawley चूहों इस परियोजना में इस्तेमाल किया गया और सभी प्रक्रियाओं Wyoming संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. सर्जरी और Vivo तंत्रिका निर्धारण में
नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी सामग्रियों और उपकरणों के लिए विक्रेता जानकारी सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
नोट: vivo तंत्रिका निर्धारण में ऊतक की रक्षा और संरचनात्मक क्षरण है कि मौत के समय और नसों के संग्रह के बीच हो सकता है को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । vivo में ऊतक निर्धारण प्रोटोकॉल, जहां छिड़काव अक्सर इस के लिए एक अग्रदूत है के लिए तंत्रिका तंत्र ऊतक की तैयारी के लिए एक मानक अभ्यास है । प्लेसमेंट और परिधीय नसों के आकार में सीटू निर्धारण के लिए अनुमति दी । हम ऊतक क्षरण की संभावना के कारण इच्छामृत्यु के बाद संग्रह और ऊतक के निर्धारण की सिफारिश नहीं करते ।
- यह 2-3% isoflurane के साथ एक प्रेरण कक्ष में रखकर सामान्य संज्ञाहरण के लिए चूहा तैयार है, तो एक विच्छेदन चटाई के शीर्ष पर प्रवण स्थिति में anesthetized चूहा जगह और संवेदनाहारी नाक शंकु के माध्यम से isoflurane के 1-2% पर बनाए रखने । संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए, हिंद पैर पर पैडल वापसी के लिए परीक्षण जानवरों और आंखों के औसत दर्जे का canthus को छूने से आँखों में palpebral सजगता के अभाव के लिए जाँच करें ।
नोट: ketamine के Intraperitoneal इंजेक्शन isoflurane साँस लेने के लिए एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया विकल्प है. - sciatic तंत्रिका बेनकाब, हिंद अंग (ओं) के बाल दाढ़ी और ७०% इथेनॉल के साथ मुंडा क्षेत्रों को साफ । एक स्केलपेल या कैंची के साथ, अधिक से अधिक trochanter करने के लिए घुटने से हिंद अंग के साथ त्वचा में एक 2-3 सेमी चीरा, जहां टटोलने का कार्य बाँझ स्केलपेल का उपयोग करने के लिए चीरा के उचित स्थान को सुनिश्चित करने के लिए फीमर. फीमर बस sciatic तंत्रिका के सबसे सुलभ क्षेत्र के लिए समीपस्थ स्थित है । हालांकि यह एक गैर उत्तरजीविता सर्जरी है, बाँझ तकनीक बनाए रखें ।
- त्वचा चीरा बनाने के बाद, मछलियां femoris मांसपेशी और gluteus maximus मांसपेशी के बीच विमान का पता लगाने, और microdissection कैंची का उपयोग अंतर्निहित प्रावरणी अलग और रेखांकित sciatic तंत्रिका के 2-3 सेमी बेनकाब । sciatic तंत्रिका की एक स्पष्ट खंड का पर्दाफाश करने के लिए, दो मांसपेशियों के बीच अंतर को चौड़ा करने के लिए एक reट्रेक्टर का उपयोग करें (आंकड़ा 1a). ठीक संदंश और आइरिस कैंची के साथ, ध्यान से संयोजी ऊतक आसपास से तंत्रिका अलग, बहुत ध्यान से सेक करने के लिए या तंत्रिका में कटौती नहीं ले ।
- पर्याप्त ट्रम्प का निर्धारण जोड़ें (4% formaldehyde, 1x पंजाब में 1% glutaraldehyde (फास्फेट बफर खारा) १.१६ g के साथ NaH2PO4 · १०० मिलीलीटर प्रति H2O) गुहा में उजागर तंत्रिका युक्त करने के लिए तंत्रिका कवर और चलो 10 मिनट के लिए बैठते हैं । यदि आवश्यक हो, तो हिंद पैर के नीचे की धुंध को कोण में सुधार करने के लिए ताकि अधिक निर्धारण गुहा में जोड़ा जा सके । 10 मिनट के बाद निर्धारण को हटा दें और इस चरण को दो बार दोहराएं ।
- एक विदारक खुर्दबीन का प्रयोग, दोनों पक्षों से तंत्रिका काट ठीक विच्छेदन कैंची का प्रयोग, यकीन है कि खिंचाव या sciatic तंत्रिका चुटकी नहीं बना, और तुरंत 15 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरुप का निर्धारण युक्त ट्यूब में तंत्रिका वर्गों डाल एक सप्ताह के लिए, बदल निर्धारण हर ४८ एच.
- सर्जिकल प्रक्रिया के किसी भी भाग के दौरान पशुओं को उपेक्षित न छोड़ें । तंत्रिका के हटाने के बाद, संज्ञाहरण के तहत जबकि गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा euthanize जानवरों ।
2. आज़मियम Tetroxide उपचार और राल embedding
- पोस्ट निर्धारण, ध्यान से तंत्रिका से किसी भी शेष वसा और संयोजी ऊतकों को हटाने और एक तेज स्केलपेल का उपयोग करने के लिए खंडों में तंत्रिका कटौती लगभग 5 लंबाई में मिमी (तंत्रिका क्षेत्रों अलग और अलग ट्यूबों में लेबल किया जा सकता है) । ट्रम्प के निर्धारण समाधान में पतला 2% आज़मियम tetroxide तैयार करें और एक ग्लास ट्यूब में रखें । 2 ज, जो समय की इस छोटी सी अवधि के लिए प्लास्टिक ट्यूबों में हो सकता है के लिए 2% आज़मियम tetroxide में तंत्रिका क्षेत्रों विसर्जित कर दिया ।
नोट: कुछ प्लास्टिक ट्यूबों आज़मियम tetroxide के साथ प्रतिक्रिया, समाधान का काला कारण, प्लास्टिक ट्यूबों में आज़मियम tetroxide के लंबे समय तक भंडारण की सिफारिश नहीं है । - एक epoxy embedding मध्यम किट का उपयोग करना, अंतिम embedding सूत्र तैयार करें:
- DDSA समाधान के साथ epoxy embedding माध्यम मिश्रण (dodecenylsuccinic एनहाइड्राइड; मिश्रण एक) और एनएमए समाधान के साथ epoxy embedding मध्यम मिश्रण (methylnadic एनहाइड्राइड; मिश्रण बी) । दोनों मिश्रण एक और बी मिश्रण एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ सरगर्मी से कम से कम 20 मिनट चलो ।
- तुरंत उपयोग करने से पहले, मिश्रण मिश्रण ए और बी और त्वरक DPM-30 (2, 4, 6-tris (dimethylaminomethyl) phenol) १.५ के अनुपात में मिश्रण की कुल मात्रा का २.०% जोड़ें । ध्यान दें कि DPM-30 समाधान ठीक मापा जाना चाहिए रंग और भंगुर में अंधेरे बनने से ब्लॉक को रोकने के लिए । सभी राल रसायनों विषाक्त कर रहे हैं; त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए अतिरिक्त देखभाल या साँस लेना ।
- का उपयोग १.५ मिलीलीटर ट्यूब, पंजाब के साथ तंत्रिका क्षेत्रों धो और अलग एसीटोन/आसुत जल मार्ग में तंत्रिका क्षेत्रों रखकर निर्जलीकरण की प्रक्रिया शुरू: 30%, ६०%, ९०%, 10 मिनट के लिए सांद्रता प्रत्येक, तो १००% एसीटोन में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार । ध्यान रहे कि एसीटोन के स्थान पर एथेनॉल का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- राल घुसपैठ के लिए, अंतिम embedding मिश्रण के 1 भाग और 30 मिनट के लिए 1 हिस्सा १००% एसीटोन के एक मिश्रण में तंत्रिका क्षेत्रों जगह है, तो अंतिम embedding मिश्रण और 1 भाग के 2 भागों के एक मिश्रण में १००% एसीटोन 30 मिनट के लिए , और अंत में 30 मिनट के लिए अंतिम embedding मिश्रण में तंत्रिका क्षेत्रों जगह है ।
- (हम १०६ मिमी लंबाई x ७१ मिमी चौड़ाई x 7 मिमी गहराई का इस्तेमाल किया है) सिलिकॉन रबर embedding मोल्ड में तंत्रिका क्षेत्रों रखो; ब्लॉक आकार 11 मिमी लंबाई x 6 मिमी चौड़ाई x 3 मिमी गहराई) । धीरे तंत्रिकाओं के शीर्ष पर राल जोड़ने के लिए, पूरे तंत्रिका क्षेत्रों को कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है और हवा के बुलबुले बनाने से बचें । रात भर ६० डिग्री सेल्सियस पर polymerize करने के लिए राल के साथ तंत्रिका क्षेत्रों से युक्त मोल्ड छोड़ दें ।
3. Ultramicrotome द्वारा खोदी गई
- एक गिलास चाकू निर्माता (आंकड़ा 1b) का उपयोग कर कांच चाकू तैयार है और नावों (चित्रा 1C), जो आसुत पानी पर तैर तंत्रिका वर्गों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किया जाता है के साथ कांच चाकू बनाते हैं ।
- ultramicrotome धारक में trapezoidal पक्ष के साथ ऊपर का सामना करना पड़ के साथ राल एम्बेडेड तंत्रिका ब्लॉकों प्लेस । ultramicrotome गुंजाइश का उपयोग करना, तंत्रिका ऊतक आसपास के किसी भी अतिरिक्त राल ट्रिम कर दीजिए, और ब्लॉक एक चतुर्भुज आकार का सामना करना और के रूप में संभव के रूप में तंत्रिका के अनुदैर्ध्य सतह के करीब एक एकल ब्लेड धार का उपयोग कर, जैसे एक उस्तरा ब्लेड के रूप में । तंत्रिका खंड है, जो आज़मियम tetroxide द्वारा अपने अंधेरे धुंधला द्वारा पहचानने योग्य है की अनुदैर्ध्य सतह घुसना नहीं है ।
नोट: अतिरिक्त राल की trimming खोदी जा करने के लिए राल के क्षेत्र को कम करने और ब्लेड प्रदर्शन में सुधार होगा और बाद के चरणों में काटने. - ultramicrotome का उपयोग करना, एक सादे कांच के चाकू का उपयोग कर तंत्रिका ऊतक के एक समान पार अनुभाग की सतह को बेनकाब करने के लिए कई पार वर्गों पर्याप्त बनाते हैं । एक बार जब यह किया जाता है, एक गिलास चाकू जिसका नाव कमरे के तापमान पर आसुत पानी से भर जाता है और पतली वर्गों में कटौती करने के लिए 1-2 माइक्रोन के लिए ultramicrotome को समायोजित करने के लिए स्विच ।
- ग्लास चाकू नाव से फ़्लोटिंग पतली अनुभागों धातु पाश का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर पानी की एक बूंद के लिए स्थानांतरण (चित्रा 1 d) । सूखी स्लाइड कुछ सेकंड के लिए एक लौ पर कई बार गुजर रहा द्वारा वर्गों से युक्त, यकीन है कि वर्गों से ज़्यादा गरम नहीं कर रही । दाग toluidine नीले या कई दिनों के लिए कमरे के तापमान पर दुकान धुंधला से पहले के साथ तुरंत वर्गों सूख ।
नोट: वर्गों भी 15 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर गर्म एक थाली का उपयोग कर सूख जा सकता है । एक धीमी गति से सुखाने की प्रक्रिया वर्गों चिकनी बनाता है ।
4. Toluidine नीला दाग
- toluidine नीले के 1% समाधान तैयार बोराटे पानी की १०० मिलीलीटर में सोडियम की 2 ग्राम भंग द्वारा, तो toluidine नीले रंग के 1 जी जोड़ें और हलचल जब तक भंग । फिल्टर पेपर (ताकना आकार: 11 µm) का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर और दो सप्ताह तक के लिए कमरे के तापमान पर एक अपारदर्शी बोतल में समाधान रखने के लिए ।
- एक प्लास्टिक पिपेट या माइक्रो pipettor का प्रयोग, तंत्रिका वर्गों के शीर्ष पर toluidine नीले समाधान की एक बूंद जोड़ने के लिए और 20-30 एस के लिए छोड़ दें ।
- बंद कुल्ला सभी toluidine नीले समाधान अतिरिक्त धीरे से ध्यान में स्लाइडों डूबा जल जार और दोहराने 3-4 बार जब तक वर्गों स्पष्ट कर रहे हैं । ६० डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर रात में कम से 15 मिनट सूखी स्लाइड और फिर नियमित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक coverslip के साथ वर्गों को कवर । घुड़सवार स्लाइड को तुरंत जांचें या कमरे के तापमान पर संग्रहीत करें ।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें । एक 100X तेल विसर्जन लेंस विस्तृत जी अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया छवियों के लिए सिफारिश की है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
राल एम्बेडेड परिधीय तंत्रिका वर्गों toluidine नीले रंग के साथ दाग सटीक ऊतकवैज्ञानिक डेटा quantifications के लिए अनुमति देते हैं । प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन (चित्रा 2) में दिखाया गया है । Sciatic तंत्रिकाओं वर्गों राल मध्यम में एंबेडेड और toluidine नीले रंग के साथ सना हुआ इष्टतम संकल्प (आंकड़े 3) के साथ स्पष्ट चित्र दिखाया । तंत्रिका क्षति तंत्रिका रूपात्मक संरचनाओं में कई परिवर्तन पैदा कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, तंत्रिका फाइबर में परिवर्तन, axon व्यास, और myelin म्यान मोटाई. इस विधि अपने प्राकृतिक रूप में तंत्रिका संरचना की रक्षा कर सकते हैं, जो इस तरह के कुल फाइबर व्यास के लिए axon व्यास के अनुपात के रूप में कई मापदंडों की माप की सुविधा (जी अनुपात; चित्रा 4) । कारकों की एक किस्म तंत्रिका की अनुचित हैंडलिंग के कारण अनुभाग में दरारें (आंकड़ा 5) की उपस्थिति सहित इष्टतम परिधीय तंत्रिका वर्गों से कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । छेद भी खंड (चित्रा 5B) अपर्याप्त निर्जलीकरण के कारण में हो सकता है । प्रक्रिया में एक अंय संभावित त्रुटि वर्गों (चित्रा 5C) है, जो कांच स्लाइड पर खंड हस्तांतरण के लिए inoculating छोरों का उपयोग करके किया जा सकता है की तह है ।
चित्र 1: शल्य चिकित्सा और अनुभाग । (क) वीवो निर्धारण में चूहा sciatic तंत्रिका । (ख) ग्लास चाकू निर्माता नाव के साथ (ग) कांच चाकू । (डी) कांच की स्लाइड पर पानी की एक बूंद को कांच चाकू से मंगाई पतली वर्गों स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल धातु छोरों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल विधि के योजनाबद्ध । (A) एडल्ट Sprague Dawley रैट anesthetized है, जिसके बाद वीवो नर्व निर्धारण (B) और तंत्रिका संग्रह (C)में होता है । अगले कदम के बाद 2% आज़मियम tetroxide (डी) और राल embedding (ई)के साथ निर्धारण है । राल एंबेडेड तंत्रिका वर्गों फिर (F) छंटनी की है और (G) एक ultramicrotome का उपयोग कर खोदी । अंत में, कांच स्लाइड पर तंत्रिका वर्गों toluidine नीले (एच)के साथ दाग रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: अनुप्रस्थ एक चूहे sciatic तंत्रिका toluidine नीले रंग के साथ दाग की धारा । इष्टतम रिज़ॉल्यूशन के साथ स्पष्ट छवि के विभिन्न आवर्धन (10x, 20X, 40X, और 60X) के अंतर्गत अनुभागों को दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: अनुप्रस्थ एक चूहे sciatic तंत्रिका toluidine नीले रंग के साथ दाग की धारा । इस उच्च संकल्प छवि (100X) के लिए कुल फाइबर व्यास (जी अनुपात) axon व्यास के अनुपात को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: एक चूहे sciatic तंत्रिका के अनुप्रस्थ वर्गों विभिंन आवर्धन के तहत toluidine नीले रंग के साथ दाग । इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के दौरान सामना किया जा सकता है समस्याओं का aresome दिखाया गया है । (क) और (ख). तंत्रिका अनुभाग और ऊतक के अपर्याप्त निर्जलीकरण के अनुचित हैंडलिंग की वजह से खंड के अंदर दरारें और छेद की उपस्थिति, क्रमशः । (ग). अनुभागों की तह, जो काँच के चाकू से सेक्शन को स्लाइड में स्थानांतरित करने के दौरान हो सकती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
परिधीय तंत्रिका चोट और पुनर्जनन के रूपात्मक संरचनाओं की परीक्षा13अध्ययन के लगातार विषयों रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम कदम का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता छवियां प्राप्त करने के लिए ऊतकवैज्ञानिक डेटा quantifications का उपयोग कर चूहे sciatic तंत्रिका ऊतक राल ब्लॉकों में एंबेडेड और toluidine नीले दाग के साथ । इस तकनीक तंत्रिका आकृति विज्ञान जिसमें तंत्रिका पुनर्जनन axons की संख्या, myelination की डिग्री, घुसपैठ fibrotic ऊतक की उपस्थिति, और स्वास्थ्य नसों को मापने के द्वारा quantified जा सकता है की एक छवि प्रदान करता है । जबकि छवियों को दिखाने के खंड और नमूनों के रूप में घायल नसों के प्रसंस्करण, एक ही कदम और सामग्री घायल नसों और नाली या ऊतक भ्रष्टाचार के साथ पुनर्जीवित नसों के लिए लागू कर रहे हैं, बशर्ते कि ऊतक के निर्धारण पर्याप्त है20, 21. शी.
जबकि प्रोटोकॉल के सभी कदम आवश्यक हैं, इन कदमों के कुछ और अधिक गरीब गुणवत्ता वर्गों या छवियों के लिए नेतृत्व की संभावना है । अपर्याप्त ऊतक निर्जलीकरण तंत्रिका वर्गों (चित्रा 5B) में छेद करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक संभव विवरण पानी के साथ राल के immiscibility है, और ऊतक में अतिरिक्त पानी ऊतक घुसपैठ से राल को रोकता है । इसलिए, पर्याप्त समय और निरपेक्ष एसीटोन के उपयोग की अनुमति उचित निर्जलीकरण कदम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । हालांकि हम इस प्रोटोकॉल में एसीटोन इस्तेमाल किया, इथेनॉल भी इस्तेमाल किया जा सकता है । कई रेजिन, तथापि, इथेनॉल के साथ प्रतिक्रियाशील नहीं हैं, इसलिए ऊतक propylene ऑक्साइड के साथ इलाज किया जाना चाहिए इथेनॉल निर्जलीकरण और राल embedding के बीच एक संक्रमण के रूप में सेवा करने के लिए ।
वर्गों की ओट के कारण, कांच के चाकू से तंत्रिका वर्गों को काँच की स्लाइड में स्थानांतरित करना बहुत सावधानी के साथ किया जाना चाहिए (फिगर 5C). 1-2 माइक्रोन वर्गों बहुत नाजुक हैं, और खंड के अनुचित हस्तांतरण अनुभाग को तोड़ने के लिए कारण हो सकता है । अनुभाग एक सुई के साथ अनुभाग के मध्य भाग में उठाया जाता है, तो अनुभाग में खुद पर तह करने के लिए प्रवण है और अक्सर जब स्लाइड करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए प्रकट करना मुश्किल हो जाएगा. विभिन्न उपकरणों सुई और छोरों सहित कांच स्लाइड करने के लिए खंड के हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रत्येक सबसे अच्छा हस्तांतरण परिणाम निकलेगा जो निर्धारित करने के लिए विशिष्ट उपयोगकर्ता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. हमारे प्रयोजनों के लिए, एक पाश है कि पूरे अनुभाग बहुत वर्गों की तह कम जब वे खुर्दबीन स्लाइड (चित्रा 1 डी) के लिए कांच के चाकू से स्थानांतरित कर सकता है शामिल कर सकते हैं ।
सामान्य तौर पर, नसों के संपीड़न के रूप में आवश्यक है तंत्रिका वर्गों में होने दरारें पैदा कर सकता है (आंकड़ा 5 ए) । तंत्रिका ऊतक संपीड़न जानवर, निर्धारण, निर्जलीकरण, और राल embedding में जोखिम की प्रक्रिया में तंत्रिका क्षेत्रों के हस्तांतरण के दौरान हो सकता है । तंत्रिका ऊतक संपीड़न से बचने के लिए, तंत्रिका क्षेत्रों ठीक संदंश द्वारा हस्तांतरित किया जाना चाहिए और इस खंड के एक छोर पर आदर्श रूप से सिर्फ epineurial परत द्वारा उठाया, तो पूरी तंत्रिका प्रभावित नहीं होगा । तंत्रिका वर्गों में दरारें और रेखाओं (चाकू के निशान) की मौजूदगी भी सुस्त या ज्यादा इस्तेमाल किए जाने वाले काँच के चाकू की वजह से हो सकती है. इष्टतम अनुभाग की गारंटी करने के लिए, हम ताजा कांच चाकू बनाने की सिफारिश और हर 25-30 कटौती कांच चाकू बदलने, कम अगर तंत्रिका के माध्यम से अनुभाग एक नाली के भीतर जा रहे थे ।
रेजिन अपेक्षाकृत महंगा हो सकता है, अपर्याप्त है जब अनुदैर्ध्य तंत्रिका वर्गों की आवश्यकता होती हैं, और एक ultramicrotome और एक गिलास चाकू निर्माता के रूप में महंगे उपकरणों की आवश्यकता हो सकती है । इन सीमाओं के बावजूद, toluidine नीले राल के दाग एंबेडेड परिधीय तंत्रिका वर्गों अभी भी परिधीय तंत्रिका morphometry4,5के पार वर्गों के दृश्य के लिए सोने के मानक माना जाता है । अनुदैर्ध्य वर्गों भी परिधीय नसों की महत्वपूर्ण सुविधाओं, इस तरह के axonal निरंतरता और Ranvier के नोड्स के रूप में प्रकट कर सकते हैं, लेकिन immunohistochemistry के साथ सबसे अधिक उपयोगी है । ऐसे मामलों में यह एक ही तंत्रिका, toluidine ब्लू क्रॉस वर्गों और अनुदैर्ध्य immunohistochemistry के लिए दूसरे के लिए एक के दो वर्गों को विभेदक प्रक्रिया करने के लिए सामान्य अभ्यास है । परिधीय तंत्रिका आघात और चोटों और तंत्रिका रूपात्मक संरचनाओं का आकलन करने का एक बेहतर तरीका की जरूरतों की वृद्धि की घटनाओं के कारण, इस विधि को तंत्रिका क्षति और पुनर्जनन के ऊतकवैज्ञानिक डेटा हासिल करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण के रूप में लागू किया जा करने के लिए जारी कर सकते हैं ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों को उनकी मदद के लिए Wyoming विश्वविद्यालय में Jenkins माइक्रोस्कोपी सुविधा thankthe करना चाहते हैं, और पशु देखभाल में सहायता के लिए बुशमैन लैब, केली Roballo, हेडन सच, Wupu Osimanjiang और सुबाष Dhunghana, के सदस्यों को । यह प्रकाशन एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आइडिया) द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज से ग्रांट # 2P20GM103432 के तहत संभव बनाया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , Plenum. New York. 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
