Summary
Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina
Abstract
Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.
Introduction
Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori1. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito terminale in modelli animali o asportato tessuto umano. Questo è spesso accoppiato con misurazioni elettrofisiologiche della funzione di nervo periferico, dove morfometria può rivelare perché rigenerazione funzionale del nervo ha fatto o non si è verificato.
Blu di toluidina colorazione di sezioni semi-sottile nervo periferico resina incorporata è un metodo specializzato per l'imaging di fibre di nervo myelinated, fornendo l'alta qualità e immagini dettagliate di strutture nervose4,,5,6 chiare . Blu di toluidina è una macchia di leucodistrofia acidofile, scoperta da William Henry Perkin nel 18567ed è stato utilizzato in diverse applicazioni mediche8. Sezioni blu-macchiato del nervo periferico di toluidina ottenute da segmenti di resina-incastonato del nervo consente una visualizzazione chiara delle strutture nervose. Visualizzazione della struttura della guaina di mielina può essere migliorata mediante l'uso di osmio tetrossido di post-fissazione4,9. Tetrossido di osmio è un ossidante e del lipido fissativo agente tossico che interagisce con i legami doppi in lipidi, con conseguente crudamente definito foderi di myelin ricca di lipidi10. Tuttavia, tetrossido di osmio è tossico, costoso, richiede un'incubazione più lungo dei segmenti del nervo e non viene sempre utilizzato.
Metodi alternativi di lavorazione e colorazione sono stati sviluppati per la visualizzazione della morfologia del nervo periferico; Paraffina, sezionamento criogenico e resina epossidica resina-incastonato del nervo sezionamento seguita mediante colorazione con blu di toluidina o soluzione fenilendiamina è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici del nervo periferico rigenerazione 11,12 . Questi metodi ogni hanno vantaggi e resa essenziale dati sul numero di assoni, mielina spessore, diametro dell'assone e diametro dell'assone a fibra myelinated diametro (g-ratio) 11,13,14,15 .
La distinzione principale di resina-incorporare in questo protocollo è che facilita ottenere sezioni di spessore 1-2 μm a causa della durezza della resina pur mantenendo le qualità istologiche del nervo. Queste sezioni sottili, in contrasto con le sezioni di spessore di 4-5 μm ottenute da paraffina incorporamento, forniscono sezioni periferiche del nervo con risoluzione superiore, consentendo una più accurata quantificazione del myelination assone, come il rapporto di g, che non può essere ottenuti da più spesso sezioni16. Mentre criogenico di sezionamento può essere utilizzato per ottenere le sezioni 1-2 µm, è stato la nostra esperienza che è più difficile da ottenere sezioni senza numerose fessure di grandi dimensioni. Tali sezioni fessurate possono causare imprecisi conteggio del numero degli assoni e aspetti di mielinizzazione.
Oltre alla macchiatura17blu di toluidina, un argento che macchia il metodo18 e di colorazione tricromica di Masson4 utilizzabile anche per mostrare gli assoni del nervo. Tuttavia, utilizzando resina l'incorporamento delle sezioni del nervo mediano di ratto macchiato con ematossilina ed eosina o di Masson tricromica ha mostrati deboli foderi di myelin e strutture non riconosciuti, considerando che la macchiatura blu della toluidina ha mostrato la guaina mielinica chiara immagine e può facilmente essere quantificati4. Nonostante alcune limitazioni, i nervi che macchia di resina incorporata periferico blu di toluidina è una tecnica importante che può essere utilizzata quando sono necessarie immagini ad alta risoluzione della morfologia del nervo.
Lo svantaggio principale per l'incorporamento di resina è che richiede tempo e non consente di immunostaining del tessuto stesso a causa della difficoltà di ricupero dell'antigene rispetto alla paraffina e tecniche di sezioni congelate incorporato. Così, non è generalmente possibile utilizzare lo stesso tessuto per immunostaining che viene elaborato tramite l'incorporamento di resina per la macchiatura blu della toluidina. Anche se non usato qui, se non si desidera immunohistochemistry in resina sezioni embedded, l'utilizzo di incorporamento resine di metacrilato di glicole consente immunohistochemistry essere eseguita su sezioni di tessuto, ma è relativamente costoso19. Questo può essere un po' mitigato tagliando il nervo periferico in segmenti separati, alcuni per l'incorporamento di resina ed altri per l'immunocolorazione direttamente dopo la fissazione.
Il processo di macchiatura blu della toluidina di resina incorporati i nervi periferici, come con l'analisi istopatologica più, può essere suddiviso in cinque fasi, tra cui la fissazione, la disidratazione, l'incorporamento, sezionamento e macchiatura20. Qui ci proponiamo di fornire un protocollo e una guida pratica per l'utilizzo di resina incorporati ratto nervo sciatico sezioni macchiate con immagini di alta qualità per acquisire blu di toluidina.
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Protocol
Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.
1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione
Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.
Nota: In vivo la fissazione del nervo viene utilizzata per conservare i tessuti e ridurre il degrado strutturale che può verificarsi tra il momento della morte e raccolta dei nervi. Fissazione del tessuto in vivo è una pratica standard per la preparazione del tessuto del sistema nervoso per l'istologia, dove la perfusione è spesso un precursore di questo. Il posizionamento e le dimensioni dei nervi periferici ha permesso per la fissazione in situ. Si sconsiglia di accumulazione e fissazione del tessuto dopo l'eutanasia a causa della possibilità di degradazione del tessuto.
- Preparare il ratto per anestesia generale collocandolo in una camera di induzione con 2-3% isoflurane, poi posizionare il ratto anestetizzato in posizione prona sulla cima di una stuoia di dissezione e mantenere a 1-2% di isoflurane via anestetica cono di naso. Per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia, test animali per pedale ritiro alle zampe posteriori e verificare l'assenza di riflessi palpebrali agli occhi toccando il canthus mediale dell'occhio.
Nota: L'iniezione intraperitoneale di ketamina è un'alternativa comunemente usata per via inalatoria isoflurano. - Per esporre il nervo sciatico, radersi i capelli dell'hind limb(s) e pulire le zone rasate con etanolo al 70%. Con un bisturi o forbici, praticare un'incisione di 2-3 cm in pelle lungo l'arto dal ginocchio fino al grande trocantere, dove palpazione del femore utilizzando il bisturi sterile per accertare la corretta posizione dell'incisione. Il femore si trova appena prossimale rispetto al segmento più accessibile del nervo sciatico. Anche se si tratta di un intervento chirurgico non-sopravvivenza, mantenere tecniche sterili.
- Dopo aver effettuato l'incisione cutanea, individuare l'aereo tra il muscolo bicipite femorale e del muscolo di maximus del gluteus e usando le forbici microdissection separare la fascia sottostante ed esporre 2-3 cm del nervo sciatico sottolineatura. Per esporre una sezione trasparente del nervo sciatico, è necessario utilizzare un riavvolgitore per ampliare il divario tra i due muscoli (Figura 1A). Con una pinzetta e forbici iris, separare con cura il nervo dal tessuto connettivo, ponendo la massima cura di non comprimere o tagliare il nervo circostante.
- Aggiungere fissativo sufficiente Trump (4% formaldeide, glutaraldeide al 1% in PBS 1X (tamponato fosfato salino) con 1,16 g di NaH2PO4· H2O / 100 mL) nella cavità contenente il nervo per coprire il nervo e lasciate riposare per 10 min. Se necessario, garza posto sotto la cerva gamba per migliorare l'angolo in modo che altro fissativo può essere aggiunto nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 min e ripetere questo passaggio altre due volte.
- Usando un microscopio per dissezione, tagliare il nervo da entrambi i lati utilizzando forbici dissezione bene, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo sciatico e subito messo le sezioni del nervo in provette da 15 mL contenenti fissativo di briscola a 4 ° C per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 h.
- Non lasciare gli animali incustoditi durante qualsiasi parte della procedura chirurgica. Dopo la rimozione del nervo, eutanasia animali di dislocazione cervicale mentre sotto anestesia.
2. trattamento tetrossido di osmio e l'incorporamento di resina
- Post di fissazione, attentamente rimuovere qualsiasi residuo grasso e tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa 5 mm di lunghezza (nervo segmenti possono essere separati e identificati in diversi tubi). Preparare fresco tetrossido di osmio 2% diluito in soluzione fissante di Trump e tenere in un tubo di vetro. Immergere i segmenti del nervo in tetrossido di osmio 2% per 2 h, che può essere in tubi di plastica per questo breve periodo di tempo.
Nota: Alcuni tubi di plastica reagiscono con tetrossido di osmio, causando un oscuramento della soluzione, in modo prolungato stoccaggio di tetrossido di osmio in tubi di plastica non è raccomandato. - Utilizzando una resina epossidica embedding kit medium, preparare la formula finale di incorporamento:
- Mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione DDSA (anidride dodecenylsuccinic; miscela A) e mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione NMA (anidride methylnadic; miscela B). Lasciare entrambe le miscele A e B mescolare per almeno 20 minuti agitando con un agitatore magnetico.
- Immediatamente prima dell'uso mescolare la miscela A e B e aggiungere l'acceleratore DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) nella proporzione di 1.5-2.0% del volume totale della miscela. Si noti che la soluzione DPM-30 dovrebbe essere misurata proprio per evitare il blocco da diventando di colore scuro e fragili. Tutti i prodotti chimici resina sono tossici; prestare particolare attenzione per evitare il contatto con la pelle o per inalazione.
- Utilizzando provette da 1,5 mL, lavare segmenti del nervo con PBS e iniziare il processo di disidratazione collocando i segmenti del nervo in acetone/distillata diversi passaggi dell'acqua: 30%, 60%, 90%, concentrazioni per 10 minuti ciascuno, quindi in 100% di acetone 3 volte per 10 minuti ciascuno. Si noti che l'etanolo può essere utilizzato al posto di acetone.
- Per l'infiltrazione di resina, posizionare i segmenti del nervo in una miscela di 1 parte della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min, poi in una miscela di 2 parti della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min , e infine posto il nervo segmenti in finale l'incorporamento di miscela per 30 min.
- Mettere i segmenti del nervo in incorporamento stampi in gomma siliconica (ci hanno usato Lunghezza 106 mm x 71 mm di larghezza x profondità mm 7; bloccare Dimensione Lunghezza 11 mm x 6 mm di larghezza x 3 mm di profondità). Aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, facendo attenzione a coprire i segmenti di intero nervo evitando bolle d'aria. Lasciare lo stampo contenente segmenti di nervo con la resina per polimerizzare a 60 ° C durante la notte.
3. sezionamento di ultramicrotomo
- Preparare la lama di vetro usando un coltellinaio di vetro (Figura 1B) e fare vetro coltelli con barche (Figura 1), che vengono utilizzati per raccogliere le sezioni del nervo che galleggia sull'acqua distillata.
- Posizionare blocchi nervosi resina incorporato nel supporto ultramicrotomo con il trapezio lato rivolto verso l'alto. Utilizzando l'ambito di ultramicrotomo, tagliare qualsiasi eccesso di resina che circonda il tessuto nervoso e rendere il blocco di affrontare una forma trapezoidale e come vicino alla superficie longitudinale del nervo possibile usando una lama di taglio singolo, come una lama di rasoio. Non penetrano la superficie longitudinale del segmento del nervo, che è riconoscibile per la sua colorazione scura di tetrossido di osmio.
Nota: Rimozione della resina in eccesso riduce l'area della resina essere sezionato e migliorare le prestazioni di lama e taglio nei passaggi successivi. - Utilizzando l'ultramicrotomo, rendere più sezioni trasversali sufficiente esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del tessuto del nervo usando un coltello di vetro normale. Una volta fatto questo, passare a un coltello di vetro cui barca è riempito con acqua distillata a temperatura ambiente e regolare l'ultramicrotomo a 1-2 μm per tagliare sezioni sottili.
- Trasferimento sezioni sottili galleggiante dalla barca di coltello di vetro a una goccia d'acqua deionizzata su vetrino con anello in metallo (Figura 1). A secco diapositive contenente sezioni passando più volte sopra una fiamma per pochi secondi, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. Macchia secche sezioni immediatamente con toluidina blu o conservare a temperatura ambiente per diversi giorni prima della colorazione.
Nota: Sezioni possono essere asciugati anche utilizzando una piastra scalda a 60 ° C per 15 min. Un lento processo di essiccazione rende liscia le sezioni.
4. blu di toluidina colorazione
- Preparare la soluzione di 1% di blu di toluidina sciogliendo 2 g di borato di sodio in 100 mL di acqua deionizzata, quindi aggiungere 1 g di blu di toluidina e mescolare fino a scioglimento. Filtrare la soluzione utilizzando carta da filtro (dimensione dei pori: 11 µm) e mantenere la soluzione in un flacone opaco a temperatura ambiente fino a due settimane.
- Utilizzando una pipetta di plastica o micro pipetta, aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina nella parte superiore le sezioni del nervo e lasciare per 20-30 s.
- Lavare via tutte le soluzione di blu di toluidina in eccesso delicatamente immergendo i vetrini in acqua deionizzata vaschetta e ripetere 3 - 4 volte fino a quando le sezioni sono chiare. Asciugare i vetrini almeno 15 min a 60 ° C o una notte a temperatura ambiente e poi coprire le sezioni con un vetrino coprioggetto utilizzando il mezzo di montaggio regolare. Esaminare le diapositive montate immediatamente o conservare a temperatura ambiente.
- Esaminare sotto un microscopio chiaro. Un obiettivo ad immersione X 100 è consigliato per immagini dettagliate utilizzate per calcolare i rapporti di g.
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Representative Results
Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamenti nelle fibre nervose, diametro dell'assone e spessore della guaina mielinica. Questo metodo può preservare la struttura nervosa nella sua forma naturale, che facilita la misura di diversi parametri come il rapporto del diametro dell'assone al diametro della fibra totale (g-rapporto; Figura 4). Una varietà di fattori può portare a sezioni meno ottimale del nervo periferico, tra cui la presenza di cricche (Figura 5A) nella sezione a causa di uso improprio del nervo. Fori possono verificarsi anche nella sezione (figura 5B) a causa di insufficiente disidratazione. Un altro possibile errore nella procedura è pieghevole delle sezioni (Figura 5), che possono essere risolto utilizzando loop da inoculo per sezione trasferimento su lastra di vetro.
Figura 1: chirurgia e sezionamento. (A) del nervo sciatico del ratto durante la fissazione in vivo . (B) vetro coltello maker (C) vetro coltelli con la barca. (D) Anelli di metallo utilizzati per trasferire galleggiavano sezioni sottili dai coltelli di vetro per una goccia di acqua deionizzata su vetrino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema del metodo utilizzato in questo protocollo. (A) adulti Sprague Dawley, ratto è anestetizzato, seguita da in vivo del nervo fissazione del nervo e (B) raccolta (C). Il passo successivo è post-fissazione con 2% tetrossido di osmio (D) e resina incorporamento (E). Incorporato del nervo sezioni sono poi tagliati (F) e sezionato (G) utilizzando un ultramicrotomo in resina. Infine, nervo sezioni su vetrino sono macchiati con toluidina blu (H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: sezione trasversale di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu. Mostra sezioni sotto diversi ingrandimenti (10x, 20x, 40x e 60 X) di chiara immagine con risoluzione ottimale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: sezione trasversale di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu. Questa immagine ad alta risoluzione (100 X) può essere utilizzata per misurare il rapporto del diametro dell'assone al diametro della fibra totale (g-rapporto). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: sezioni trasversali di un nervo sciatico di ratto tinto con toluidina blu sotto diversi ingrandimenti. Mostrato sonoaltri dei problemi che possono verificarsi durante l'esecuzione del presente protocollo. (A) e (B). La presenza di crepe e buchi all'interno della sezione del nervo causata da manipolazione impropria della sezione e insufficiente disidratazione del tessuto, rispettivamente. (C). Folding delle sezioni, che può accadere durante il trasferimento delle sezioni dai coltelli di vetro alla diapositiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio13. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando il numero di assoni, grado di mielinizzazione, presenza di tessuto fibrotico infiltrativo e i nervi di salute. Mentre le immagini mostrano sezionamento e lavorazione dei nervi illesi come campioni, gli stessi passaggi e materiali sono applicabili ai nervi feriti e nervi rigenerati con canalette o tessuto innesti, fornito tale fissazione del tessuto è adeguata20, 21.
Mentre tutti i passaggi del protocollo sono essenziali, alcuni di questi passaggi sono più probabilità di portare a sezioni di scarsa qualità o immagini. Disidratazione del tessuto insufficiente può condurre ai fori nelle sezioni del nervo (figura 5B). Una possibile spiegazione è l'immiscibilità di resina con acqua, e l'acqua in eccesso nel tessuto impedisce l'infiltrazione del tessuto di resina. Di conseguenza, permettendo un tempo sufficiente e l'uso di acetone assoluto è essenziale per garantire il passaggio di disidratazione corretta. Anche se abbiamo usato acetone in questo protocollo, etanolo può anche essere utilizzato. Molte resine, tuttavia, non sono reattive con etanolo, così il tessuto dovrà essere trattato con ossido di propilene per servire come una transizione tra la disidratazione di etanolo e l'incorporamento di resina.
A causa della magrezza delle sezioni, trasferimento sezioni del nervo del coltello di vetro sul vetrino deve essere effettuato con grande cura (Figura 5). 1-2 μm sezioni sono molto fragili, e improprio trasferimento della sezione potrebbe causare la sezione di rompere. Se la sezione è raccolto nella parte centrale della sezione con un ago, la sezione è incline a piegare su se stesso e spesso sarà difficile da spiegare quando trasferito alla diapositiva. Diversi strumenti possono essere utilizzati per il trasferimento della sezione sul vetrino, compresi aghi e loop, e ciascuno deve essere testato per l'utente specifico determinare che produrrà la migliore trasferimento di risultati. Per i nostri scopi, utilizzando un ciclo che potrebbe comprendere l'intera sezione notevolmente ridotto la piegatura delle sezioni quando sono stati trasferiti dal coltello di vetro per il vetrino da microscopio (Figura 1).
In generale, la gestione corretta dei nervi è essenziale come compressione dei nervi possa causare crepe si verificano nelle sezioni del nervo (Figura 5A). Compressione del tessuto di nervo può accadere durante il trasferimento di segmenti del nervo nei processi di esposizione in animale, fissazione, disidratazione e l'incorporamento di resina. Per evitare la compressione del nervo del tessuto, segmenti del nervo dovrebbero essere trasferiti da una pinzetta e raccolto su un'estremità del segmento idealmente da solo lo strato epineurial, così l'intero nervo non ne risentiranno. La presenza di crepe e linee (segni di coltello) nelle sezioni del nervo può verificarsi anche a causa di vetro opaco o abusato coltelli. Per garantire il sezionamento ottimali, si consiglia di making coltelli bicchiere fresco e cambiando il coltello di vetro che ogni 25-30 tagli, meno se sezionamento tramite nervo racchiuso all'interno di un condotto.
Le resine può essere relativamente costose, sono inadeguate quando sezioni longitudinali del nervo sono necessari e possono richiedere costosi strumenti quali un ultramicrotomo e un coltellinaio di vetro. Nonostante queste limitazioni, sezioni di toluidina blu macchiatura della resina incorporata periferico del nervo è ancora considerato il gold standard per la visualizzazione di sezioni trasversali di nervo periferico morfometria4,5. Sezioni longitudinali può anche rivelare caratteristiche importanti dei nervi periferici, come continuità assonale e nodi di Ranvier, ma è più utile con immunohistochemistry. In questi casi è la prassi generale per elaborare differenzialmente due sezioni del nervo stesso, uno per toluidina blu sezioni trasversali e l'altro per l'immunoistochimica longitudinale. A causa della maggiore incidenza del trauma periferico del nervo e le lesioni e le esigenze di un modo migliore di valutare strutture morfologiche del nervo, questo metodo può continuare ad essere applicata come strumento essenziale per ottenere dati istologici di danno del nervo e di rigenerazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero dopo impianto di microscopia Jenkins all'Università del Wyoming per il loro aiuto e i membri del laboratorio Bushman, Kelly Roballo, Hayden True, Wupu Osimanjiang e Dhunghana di Subash, per assistenza nella cura degli animali. Questa pubblicazione è stato reso possibile da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto Grant n. 2P20GM103432.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
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