Summary
여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜
Abstract
주변 신경와 모터 또는 감각 축 삭 대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 때문에 광범위 한 분포, 주변 신경은 자주 외상 또는 질병으로 인해 손상 됩니다. 방법 및 전략 주변 신경 손상 동물 모델, 기능 및 재생, 평가 하기 위해 개발 된 주변 신경의 morphometry 분석 되고있다 필수적인 터미널 결과 측정. 톨루이 블루 얼룩 신경의 크로스 섹션 포함 수 지 신경 섹션에서 얻은 주변 신경, 시각화 형태학 축 삭의 수와의 사용의 질적 및 양적 평가 대 한 재현 방법 myelination입니다. 이 기술은 다른 많은 조직학 방법, 것과 같이 어려울 수 있습니다 학습과 표준 작성 된 프로토콜을 사용 하 여 마스터. 이 간행물의 의도 톨루이 블루 videography 메서드를 사용 하 여 쥐에서 수확 하는 좌 골 신경의와 주변 신경의 얼룩에 대 한 서 면된 프로토콜을 강조 하 그러므로 이다. 이 프로토콜에서 우리 주변 신경 기정 vivo에서 그리고의 조직, 그리고 2% 오스뮴 tetroxide와 후 고정 컬렉션 설명 에폭시 수 지, 그리고 ultramicrotome 신경 1-2 μ m 두께 단면에서 신경의 포함. 신경 섹션 다음 유리 슬라이드에 전송 하 고 후 그들은 양적 및 질적 평가 톨루이 파란색으로 물. 예는 가장 일반적인 문제는 이러한 문제를 완화 하기 위해 단계 뿐만 아니라 표시 됩니다.
Introduction
주변 신경 모터 또는 감각 축 삭1대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 의료 장애로 인 한 말 초 신경 결함 외상 중요 한 공중 위생 관심사를 대표 하 고 큰 경제적 파급 효과2,3. 주변 신경 상해의 결과 평가 하 고 신경 재생을 이해에 있는 전진에도 불구 하 고 전통적인 방법 신경 조직학 등 기법을 얼룩이 지는 질적 및 양적 평가 신경 건강에 필수적인 도구 으로 동물 모델 또는 삭제 인간의 조직에 터미널 결과 측정. 이것은 종종 morphometry 기능 신경 재생 않았거나 발생 하지 않은 이유를 밝힐 수 있다 주변 신경 기능의 electrophysiological 측정와 결합 됩니다.
톨루이 블루 이미징 myelinated 신경 섬유, 높은 품질을 제공 하는 전문적인 방법 포함 수 지 주변 신경 반 얇은 섹션의 얼룩이 지 고 신경 구조4,5,6의 상세한 이미지를 지우기 . 톨루이 블루 acidophilic metachromatic 얼룩, 18567, 윌리엄 헨리 Perkin에 의해 발견 이며 여러 의료 응용 프로그램8에서 사용 되었습니다. 톨루이 블루 스테인드 주변 신경 섹션 수 지 포함 신경 세그먼트에서 얻은 신경 구조의 명확한 시각화 수 있습니다. Myelin 칼 집 구조 시각화 오스뮴 tetroxide 후 고정4,9를 사용 하 여 향상 될 수 있습니다. 오스뮴 tetroxide은 독성 산화 제와 지질 통 에이전트 지질에 이중 결합 상호 작용 starkly 정의 된 지질이 풍부한 myelin 칼 집10인. 그러나, 오스뮴 tetroxide 독성, 비싼, 더 이상 외피 신경 세그먼트의 필요 이며 항상 사용 되지 않습니다.
주변 신경 형태학;의 시각화에 대 한 처리 및 얼룩의 대체 방법은 개발 되었다 파라핀, 극저온 단면, 에폭시 수 지에 포함 된 신경 단면 다음 톨루이 파랑 얼룩 또는 phenylenediamine 솔루션 주변 신경 재생 11,12의 형태학 적 변화를 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 이러한 각 메서드는 그들의 이점 및 수율 필수 데이터 축 삭, 수 초 두께, 축 삭 직경 및 myelinated 섬유 직경 (g 비율) 11,,1314,15 축 삭 직경의 수에 .
수 지 포함이 프로토콜의 기본 구분은 그것 신경의 조직학 품질을 유지 하면서 1-2 μ m 두께 횡단면 때문에 수 지의 경도 얻기 용이 합니다. 이러한 얇은 섹션 포함, 파라핀에서 얻은 4-5 μ m 두께 섹션 반대로 주변 신경 축 삭 myelination, g-비율, 수 없는 등의 보다 정확한 정량화에 대 한 높은 해상도 섹션 제공 두꺼운 섹션16에서 얻은. 극저온 단면 1-2 µ m 섹션을 얻기 위해 사용할 수 있는, 그것은 우리의 경험 그것은 수많은 큰 균열 없이 섹션을 얻기 위해 더 어려운 되었습니다. 같은 금이 섹션 축 삭의 수 및 myelination의 측면의 부정확 한 계산을 발생할 수 있습니다.
톨루이 블루17얼룩, 뿐만 아니라 방법18 과 Masson의 trichrome 얼룩4 얼룩은 또한 신경 축 삭 표시를 사용할 수 있습니다. 그러나 반면 톨루이 블루 얼룩 지우기 myelin 칼 집 이미지 그리고 쉽게 중 되며 오신 또는 Masson의 trichrome 보였다 희미 한 myelin 칼 집 및 인식할 수 없는 구조, 스테인드 수 지 쥐 중간 신경 섹션의 포함을 사용 하 여 정량된4수 있습니다. 몇 가지 한계에도 불구 하 고 톨루이 블루 얼룩 포함 된 수 지의 주변 신경 신경 형태학의 고해상도 이미지는 필요한 경우 사용할 수 있는 유용한 기술입니다.
수 지를 포함에 대 한 주요 단점은 그것은 시간이 많이 걸리는 이며 파라핀 및 냉동된 임베디드 섹션 기술에 비해 항 원 복구의 어려움으로 인해 같은 조직의 immunostaining에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 일반적으로 수 지-톨루이 블루 얼룩에 대 한 포함을 통해 처리 되는 immunostaining에 대 한 동일한 조직 활용 수 아니다. 비록 하지 immunohistochemistry 바란다면 여기, 사용 수 지에 포함 된 섹션, 글리콜 메타 크 릴 산 수 지를 포함의 사용 허용 immunohistochemistry 조직 섹션에서 수행할 수 있지만 그것은 상대적으로 비싼19. 이 고정 후 직접 별도 세그먼트, 수 지를 포함에 대 한 일부 및 immunostaining에 대 한 다른 사람으로 말 초 신경 절단 하 여 다소 완화 될 수 있습니다.
톨루이 블루 수 지 얼룩이 지기의 과정으로 가장 histopathological 분석, 나눌 수 있습니다 5 단계, 고정, 탈수를 포함 하 여, 포함, 단면, 그리고20얼룩으로 주변 신경, 임베디드. 우리 하고자 여기 톨루이 얻으려고 블루 높은 품질의 이미지와 함께 포함 된 쥐 좌 골 신경 섹션 스테인드 수 지를 사용 하기 위한 프로토콜 및 실용적인 지침을 제공 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
성인 Sprague Dawley 쥐가이 프로젝트에 사용 된 및 모든 절차 와이오밍 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 수술 및 생체 내 신경 고정
참고: 모든 자료와 장비가이 프로토콜에 대 한 공급 업체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
참고: vivo에서 신경 고정 조직을 보존 하 고 죽음의 시간과 신경의 컬렉션 간에 발생할 수 있는 구조적 성능 저하를 줄일 데 사용 됩니다. 조직의 고정 vivo에서 종종이 전조의 관류는 조직학, 신경 조직의 준비에 대 한 표준 연습 이다. 배치 하 고 원래의 장소에 고정을 위한 허용 주변 신경의 크기. 우리가 수집 및 조직 저하의 가능성으로 인해 안락사 후 조직의 정착을 권장 하지 않습니다.
- 2-3 %isoflurane 유도 챔버에 그것을 배치 하 여 전신 마 취에 대 한 쥐를 준비 다음 마 취 쥐 해 부 매트 위에 발생 하기 쉬운 위치에 놓고 isoflurane 마 취 코 콘을 통해의 1-2%에서 유지 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해, 뒷 발에 페달 철수에 대 한 동물을 테스트 하 고는 법 눈으로 눈에서 종을 반사의 부재에 대 한 확인 합니다.
참고: 마 취 제의 복 주입 흡입된 isoflurane에 일반적으로 사용 되 대안 이다. - 좌 골 신경, 노출 하는 hind limb(s)의 머리를 면도 하 고 70% 에탄올과 면도 영역을 청소. 메스와가 위, 큰 trochanter까지 무릎에서 뒷 다리 따라 피부에 2-3cm 절 개를 하 게 어디 절 개의 적절 한 위치를 보장 하기 위해 살 균 메스를 사용 하 여 대 퇴 골의 촉진. 대 퇴 골은 그냥 근 좌 골 신경의 가장 접근 가능한 세그먼트에 위치 합니다. 비록이 아닌 생존 수술, 무 균 기법을 유지 합니다.
- 피부 절 개 후, 팔 뚝 femoris 근육과 대 둔 근 근육 사이 비행기 찾아서 서가 위를 사용 하 여 기본 근 막 분리 및 밑줄 좌 골 신경의 2-3 cm를 노출 합니다. 좌 골 신경의 명확한 섹션 노출, 두 근육 (그림 1A) 사이의 격차를 확대 하는 견인을 사용 합니다. 좋은 집게와 아이리스가 위, 결합 조직, 압축 또는 신경을 잘라 큰 돌 주변에서 신경 분리 신중 하 게.
- 충분 한 트럼프의 정착 액 (4% 포름알데히드, NaH2PO4·의 1.16 g 1 x PBS (인산 염 버퍼 식 염 수)에서 1%도 추가 100 mL 당 H2O) 포함 하는 신경을 커버 하 고 10 분 동안 앉게 하 노출된 신경 구멍으로. 더 많은 정착 액 캐비티에 추가할 수 있도록 각도 개선 하기 위해 필요한 장소 거 즈는 뒷 다리 아래 다리 경우. 10 분 후에 정착 액을 제거 하 고 두 번 이상이 단계를 반복.
- 해 현미경을 사용 하 여 정밀한 해 부가 위, 스트레칭 또는 좌 골 신경 핀치를 하지를 사용 하 여 양쪽에서 신경 자르고 즉시 신경 섹션 변경 1 주일에 4 ° C에서 트럼프의 정착 제를 포함 하는 15 mL 튜브에 넣고는 정착 액 모든 48 h입니다.
- 두지 마십시오 동물 무인 수술의 일부. 신경의 제거 후, 마 취하에 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.
2. 오스뮴 Tetroxide 치료 및 수 지 포함
- 고정 게시, 신중 하 게 모든 나머지 지방과 결합 조직 신경에서 제거 하 고 날카로운 메스를 사용 하 여 세그먼트 길이 (신경 세그먼트 구분 될 수 있으며 다른 튜브에 표시)에 약 5 mm 신경을 잘라. 신선한 2% 오스뮴 tetroxide 트럼프의 통 솔루션에 희석을 준비 하 고 유리 튜브에 계속. 시간이 짧은 기간에 대 한 플라스틱 튜브에 있을 수 있는 2 시간에 대 한 2% 오스뮴 tetroxide 신경 세그먼트를 담가.
참고: 일부 플라스틱 튜브 오스뮴 tetroxide 플라스틱 튜브에의 장기간된 보관 권장 하지 않습니다 그래서 솔루션, 어둡게 일으키는 오스뮴 tetroxide와 반응. - 매체 키트를 포함 하는 에폭시를 사용 하 여 최종 포함 수식을 준비:
- DDSA 솔루션 (dodecenylsuccinic 무수 물, 혼합물 A) 매체를 포함 하는 에폭시를 혼합 하 고 혼합 NMA 솔루션 (methylnadic 무수 물, 혼합물 B) 매체를 포함 하는 에폭시. A와 B는 자력으로 교 반에 의해 적어도 20 분을 섞어 두 혼합물을 하자.
- 사용 직전 혼합 A와 B를 혼합 하 고 추가 가속기 DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) 혼합물의 총 볼륨의 1.5 ~ 2.0%의 비율에. Note DPM 30 솔루션 어두운 색상 및 취 성 되는 블록을 방지 하기 위해 정확 하 게 측정 되어야 한다. 모든 수 지 화학 물질이 독성; 피부 접촉 또는 흡입을 방지 하기 위해 여분의 주의 분리 했습니다.
- 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 PBS 가진 신경 세그먼트를 세척 하 고 다른 아세톤/증 류 물 구절에 신경 세그먼트를 배치 하 여 탈수 과정을 시작: 30%, 60%, 90%, 10 분 각, 다음 3 시간 10 분 대 한 100% 아세톤에 농도. Note는 에탄올 아세톤 대신 사용 될 수 있다.
- 수 지 침투에 대 한 배치 최종 포함 혼합물의 1 개 부품의 혼합물에서 신경 세그먼트 및 최종 포함 혼합물의 2 개 부품의 혼합물 및 30 분 1 부분 100% 아세톤에서 30 분, 1 부분 100% 아세톤 및 장소 신경 세그먼트는 마지막에 30 분을 위한 혼합물을 포함 하는 마지막으로.
- 실리콘 고무 금형 포함으로 신경 세그먼트를 넣어 (우리 x 7 mm 깊이 x 71 mm 폭 106 m m 길이 사용 하는, 크기 11 m m 길이 6 m m 폭 3 mm 깊이 x x 차단). 부드럽게 전체 신경 세그먼트를 커버 하 고 기포를 만들기 방지 하는 신경 위에 수 지를 추가 합니다. 60 ° C에서 하룻밤 유해를 수 지로 신경 세그먼트를 포함 하는 금형을 둡니다.
3. Ultramicrotome에 의해 단면
- 유리 칼은 유리 칼 메이커 (그림 1B)를 사용 하 여 준비 하 고 보트 (그림 1C), 증 류 된 물에 떠 있는 신경 섹션을 수집 하는 데 사용 되는 유리 칼.
- 포함 된 수 지 신경 블록을 사다리꼴 면이 위로 향하도록 ultramicrotome 홀더에 넣으십시오. 주변 신경 조직을 어떤 과잉 수 지 트림 ultramicrotome 범위를 사용 하 고 블록 사다리꼴 모양 얼굴 그리고 면도날 같은 단일 깨끗 블레이드를 사용 하 여 가능한 신경의 경도 표면에 가까이. 오스뮴 tetroxide에 의해 그것의 어두운 얼룩에 의해 인식할 수 있는 신경 세그먼트의 경도 표면을 침투 하지 않습니다.
참고: 과잉 수 지의 조정 구분 될 블레이드 성능 및 후속 단계에 절단을 개선 하는 수 지의 영역을 줄이는 것입니다. - ultramicrotome를 사용 하 여 여러 횡단면 일반 유리 칼을 사용 하 여 신경 직물의 일정 한 횡단면 표면 노출 하기에 충분 한 확인 합니다. 이 완료 되 면, 그의 보트는 상 온에서 증류수 가득 유리 칼으로 전환 하 고 얇은 섹션을 1-2 μ m ultramicrotome 조정 합니다.
- 금속 루프 (그림 1D)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 유리 칼 보트에서 이온된 물 한 방울 떠 있는 얇은 섹션을 전송. 섹션을 과열 하지 않도록 하는 몇 초 동안 화 염에 여러 번 전달 하 여 섹션을 포함 하는 슬라이드를 건조. 톨루이와 즉시 건조 섹션 블루 얼룩 또는 얼룩 전에 몇 일 동안 실내 온도에 저장.
참고: 섹션 수 있습니다 또한 건조 15 분 동안 60 ° C에서 따뜻한 접시를 사용 하 여. 느린 건조 과정 섹션 부드러운 게.
4. 톨루이 블루 얼룩
- 2g의 나트륨 붕 산 염 이온을 제거 된 물 100 mL에 용 해 하 여 톨루이 블루의 1% 솔루션 준비 다음 톨루이 블루의 1 g을 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 필터 종이 사용 하 여 솔루션을 필터링 (기 공 크기: 11 µ m) 최대 2 주 동안 실내 온도에 불투명 한 병에 솔루션을 계속 하 고.
- 플라스틱 피 펫 또는 마이크로 pipettor 사용 하, 신경 섹션 상단 톨루이 블루 솔루션의 한 방울을 추가 하 고 20-30 s에 대 한 둡니다.
- 부드럽게 찍기 이온된 물 항아리에 슬라이드에 의해 초과 모든 톨루이 블루 솔루션에서 헹 구 고 섹션 분명 때까지 3-4 회 반복. 슬라이드에 15 분 또는 60 ° C에서 하룻밤 실 온에서 건조 하 고 섹션 coverslip 일반 설치 매체를 사용 하 여 커버. 탑재 된 슬라이드를 즉시 검사 하거나 상 온에서 저장 합니다.
- 가벼운 현미경 검사. 100 X 기름 침수 렌즈 g-비율을 계산 하는 데 사용 하는 자세한 이미지에 대 한 것이 좋습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
수 지 포함 섹션 톨루이와 파란 얼룩이 허용 정확한 조직학 데이터 quantifications 주변 신경. 절차의 개요는 (그림 2)에 표시 됩니다. 좌 골 신경 섹션 수 지 매체에 포함 된 하 고 최적의 해상도 (그림 3) 톨루이 블루 분명 보여준 이미지와 스테인드. 신경 손상이 발생할 수 있습니다 많은 변화 신경에 형태학 상 구조, 예를 들어 신경 섬유, 축 삭 직경에 myelin 칼 집 두께 변화. 이 방법은 총 섬유 직경 (g 비율; 축 삭 직경의 비율 등 여러 매개 변수 측정을 용이 하 게 그것의 자연적인 형태로 신경 구조를 유지할 수 있습니다. 그림 4)입니다. 다양 한 요인 때문에 신경의 부적절 한 처리 섹션에서 균열 (그림 5A)의 존재를 포함 한 최적의 주변 신경 섹션 발생할 수 있습니다. 구멍도 절의 (그림 5B) 부족 한 탈수로 인해 발생할 수 있습니다. 절차에서 또 다른 가능한 오류는 유리 슬라이드에 섹션 전송에 대 한 접종 루프를 사용 하 여 해결 될 수 있습니다 (그림 5C), 부분의 접히는.
그림 1: 수술 및 단면. Vivo에서 고정 중 (A) 쥐 좌 골 신경. (B) 유리 칼 메이커 (C) 유리 칼 보트. (D) 전송 하는 데 사용 하는 금속 루프 이온 물 유리 슬라이드에 한 방울을 유리 칼에서 얇은 섹션 들이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:이 프로토콜에 사용 되는 방법의 도식. (A) 쥐 취 성인 Sprague Dawley vivo에서 신경 고정 (B) 와 신경 컬렉션 (C)다음. 다음 단계는 2% 오스뮴 tetroxide (D) 와 후 고정 및 수 지 (E)을포함. 섹션은 손질 (F) 그리고 sectioned (G)는 ultramicrotome를 사용 하 여 포함 된 신경 수 지. 마지막으로, 신경 유리 슬라이드에 대 한 섹션은 톨루이와 스테인드 파란 (H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 쥐 좌 골 신경의 횡 근 섹션 톨루이와 스테인드 파란. 최적의 해상도와 선명한 이미지의 다른 배율 (10 배, 20 X, X, 40 및 60 X) 아래 섹션을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 쥐 좌 골 신경의 횡 근 섹션 톨루이와 스테인드 파란. 이 고해상도 이미지 (100 X) 총 섬유 직경 (g 비율)을 축 삭 직경의 비율을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 가로 섹션 쥐 좌 골 신경의 다른 배율에서 블루 톨루이와 스테인드. 이 프로토콜의 성능 동안 발생할 수 있는 문제의 aresome 표시. (A) 와 (B). 각각 섹션의 부적 절 한 처리 및 조직의 부족 한 탈수로 인 한 신경 섹션 내부 구멍 및 균열의 존재. (C). 유리 칼에서 슬라이드 섹션을 전송 하는 동안 발생할 수 있습니다 섹션의 폴딩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
주변 신경 손상 및 재생의 형태학 적 구조 시험 연구13의 빈번한 주제는. 이 프로토콜에서 우리 조직학 데이터 quantifications 쥐 좌 골 신경 조직 수 지 블록에 포함 된 및 톨루이 파랑 스테인드를 사용 하 여에 대 한 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있는 단계를 설명 합니다. 이 기술은 신경 형태학 축 삭의 수, myelination, infiltrative 거리 조직의 존재와 건강 신경의 정도 측정 하 여 신경 재생 수 정량의 이미지를 제공 합니다. 이미지 표시 단면 손상 되지 않은 신경의 처리와 샘플, 동일한 단계 및 재료 부상된 신경에 적용 되는 신경 도관 또는 조직 이식, 재생성 제공 조직의 그 고정은 적절 한20, 21.
프로토콜의 모든 단계는 필수, 하는 동안 이러한 단계 중 일부를 가난한 품질 섹션 또는 이미지를이 끌 가능성이 더 높습니다. 부족 한 조직 탈수는 신경 섹션 (그림 5B)에 구멍으로 이어질 수 있습니다. 1 개의 가능한 설명은 이다 물, 수 지의 immiscibility 조직에서 과잉의 물 침투는 조직에서 수 지를 방지 한다. 따라서, 충분 한 시간과 절대 아세톤의 사용을 수 있도록 적절 한 탈수 단계를 위해 필수적입니다. 우리는이 프로토콜에 아세톤을 사용, 에탄올도 사용할 수 있습니다. 그러나 많은 수 지,, 하지 않습니다 에탄올, 반응성 조직 에탄올 탈수 및 수 지 포함 전환으로 프로필 렌 산화물과 함께 치료를 해야 하므로.
섹션의 얇음 때문 유리 슬라이드에 유리 칼에서 신경 섹션을 전송 할 수 큰 관심 (그림 5C). 1-2 μ m 섹션은 매우 취약 하 고 섹션의 부적 절 한 전송 휴식 섹션을 발생할 수 있습니다. 섹션 섹션의 중앙 부분에 바늘으로 왔는데은, 경우 섹션 자체에 접는 경향이 이며 자주 슬라이드를 전송할 때 전개 하기 어려울 것입니다. 바늘과 루프를 포함 하 여 유리 슬라이드에 섹션의 전송을 위해 다른 도구를 사용할 수 있습니다 그리고 각 특정 사용자를 보장할 최고의 전송 결과 확인을 위해 시험 되어야 한다. 우리의 목적을 위해 그들은 현미경 슬라이드 (그림 1D) 유리 칼에서 전송 된 경우 섹션의 접는 감소 크게 전체 섹션을 포함할 수 있는 루프를 사용 하 여.
일반적으로, 적절 한 처리는 신경의 압축 신경의 신경 절 (그림 5A)에서 발생 하는 균열을 발생할 수 있습니다 필수적 이다. 신경 조직 압축 신경 세그먼트에 동물, 고정, 탈수, 수 지 포함 노출의 프로세스에 전송 하는 동안 발생할 수 있습니다. 신경 조직 압축을 방지 하려면 신경 세그먼트 미세 집게로 전송 해야 하 고에 세그먼트의 한쪽 끝을 이상적으로 단지 epineurial 계층, 그래서 전체 신경 영향을 받지 않을 것 이다. 균열 및 신경 섹션에서 줄 (칼 자국)의 존재 또한 둔 하거나 남용 유리 칼으로 인해 발생할 수 있습니다. 최적의 단면을 보장 하기 위해 신선한 유리 칼을 만들고 모든 25-30 컷, 도관 내에서 쌌 다 신경을 통해 단면 면 적은 유리 칼을 변경 하는 것이 좋습니다.
수 지 상대적으로 비쌀 수 있습니다, 그리고 적절 한 때 경도 신경 섹션과 필요는 ultramicrotome 및 유리 칼 메이커 같은 비싼 도구를 요구할 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 포함 된 수 지의 주변 얼룩 블루 톨루이 신경 섹션은 여전히 주변 신경 morphometry4,5의 횡단면의 시각화를 위한 금 본 간주 됩니다. 세로 섹션 axonal 연속성 등 노드의 Ranvier, 주변 신경의 중요 한 기능을 밝힐 수 있습니다 하지만 immunohistochemistry 가장 유용. 이러한 경우에 그것은 차동 같은 신경의 두 섹션을 처리 하는 일반적인 연습, 톨루이 한 횡단면 및 경도 immunohistochemistry 블루. 주변 신경 외상 및 상해의 증가 부각 및 신경 형태학 상 구조를 평가 하는 더 나은 방법의 요구,이 방법은 신경 손상 및 재생의 조직학 데이터를 얻기 위해 필수적인 도구로 적용 계속할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 관심 없음 충돌 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 thankthe 젠킨스 현미경 시설 그들의 도움과 멤버 Bushman 실험실의 켈리 Roballo, 헤이든 진정한, Wupu Osimanjiang, Subash Dhunghana, 동물 보호에 대 한 와이오밍 대학에서 하 고 싶습니다. 이 게시가 되었습니다 기관 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 국립 과학 연구소에서의 일반 의료의 부여 # 2P20GM103432에서 건강의 국가 학회.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , Plenum. New York. 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
