Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera böter strukturer av perifera nerver genom att erhålla och färgning 1-2 µm sektioner med toluidinblått blå
Abstract
Perifera nerver sträcker sig i hela kroppen, innervating målvävnaderna med motoriska eller sensoriska axoner. På grund av omfattande distribution, är perifera nerver ofta skadade på grund av trauma eller sjukdom. Som metoder och strategier har utvecklats för att bedöma perifer nervskada i djurmodeller, funktion och förnyelse, har analysera morfometri av perifer nerv blivit en viktig terminal resultatet mätning. Toluidin blå färgning av nerv cross sektioner erhållits från harts inbäddade nerv sektioner är en reproducerbar metod för kvalitativa och kvantitativa bedömningar av perifera nerver, för visualisering av morfologi antal axoner och graden av myelinisering. Denna teknik, kan som med många andra histologiska metoder, vara svårt att lära sig och behärska använder skriftliga standardprotokoll. Avsikten med denna publikation är därför att accentuera skriftliga protokoll för toluidin blå färgning av perifera nerver med videography av metoden, som använder höftnerver skördas från råttor. I detta protokoll, beskriver vi i vivo perifer nerv fixering och insamling av vävnad, och efter fixering med 2% osmium vanligtvis, inbäddning av nerver i epoxiharts och ultramicrotome snittning av nerver till 1-2μm tjocklek. Nerv delar sedan överförs till en glasskiva och färgas med toluidinblått blå, varefter de kvantitativt och kvalitativt bedöms. Exempel på de vanligaste problemen visas, liksom åtgärder för att mildra dessa frågor.
Introduction
Perifera nerver sträcker sig i hela kroppen, innervating målvävnaderna med motoriska eller sensoriska axoner1. Perifer nerv defekter orsakade av medicinska sjukdomar och trauma utgör ett stort folkhälsoproblem och har stora ekonomiska effekter2,3. Trots framsteg i att bedöma resultaten av perifera nervskador och förstå nerv regenerering, är traditionella metoder såsom nerv histologi och färgningsteknik viktiga verktyg för att kvalitativt och kvantitativt bedöma nerv hälsa som en terminal resultatet mätning i djurmodeller eller exciderad mänsklig vävnad. Detta är ofta ihop med elektrofysiologiska mätningar av perifer nervfunktion, där morfometri kan avslöja varför funktionella nerven regenerering gjorde inte eller.
Toluidin blå färgning av harts inbäddade semi tunn perifer nerv sektioner är en specialiserad metod för imaging myeliniserade nervfibrer, hög kvalitet och klart detaljerade bilder av nerv strukturer4,5,6 . Toluidin blå är en acidofiler metakromatisk fläcken, upptäcktes av William Henry Perkin i 18567, och har använts i flera medicinska tillämpningar8. Toluidin blå-färgade perifer nerv sektioner erhållits från harts-embedded nerv segment möjliggör tydlig visualisering av nerv strukturer. Visualisering av myelinskidan struktur kan förbättras genom användning av osmium vanligtvis efter fixering4,9. Osmium vanligtvis är en giftig oxidationsmedel och lipid fixativ agent som interagerar med dubbelbindningar i lipider, vilket resulterar i brutalt definierade lipid-rika myelin slidor10. Dock osmium vanligtvis är giftiga, dyra, kräver en längre inkubation av nerv segment och alltid används inte.
Alternativa metoder för beredning och färgning har utvecklats för visualisering av perifer nerv morfologi; Paraffin, kryogen snittning och epoxi harts-embedded nerv snittning följt av färgning med toluidinblått blå eller fenylendiamin lösning har använts för att kvantifiera morfologiska förändringar av perifer nerv regenerering 11,12 . Dessa metoder varje har sina fördelar och avkastning väsentliga uppgifter på antalet axoner, myelin tjocklek, axon diameter och axon diameter till myeliniserade fiber diameter (g-förhållandet) 11,13,14,15 .
Den primära skillnaden av harts-bädda in i detta protokoll är att det underlättar att få 1-2 μm tjocklek tvärsnitt på grund av hårdheten av kådan bibehållen histologiska kvaliteter av nerven. Dessa tunna sektioner, i motsats till avsnitten 4-5 μm tjocklek erhållits från paraffin inbäddning, ge perifer nerv sektioner med högre upplösning, möjliggör en mer exakt kvantifiering av axon myelinisering, såsom den g-förhållande, som inte kan erhållits från tjockare avsnitt16. Medan kryogena snittning kan användas för att få 1-2 µm sektioner, har det varit vår erfarenhet att det är svårare att få sektioner utan flera stora sprickor. Sådan knäckt sektioner kan orsaka felaktig räkning av antalet axoner och aspekter av myelinisering.
Förutom toluidin blå färgning17, kan silver färgning metod18 och Massons trikrom färgning4 också användas att Visa nerv axoner. Dock färgas använder harts inbäddning av råtta medianusnerven sektioner med hematoxylin och eosin Massons trikrom visade svag myelin slidor och eller okända strukturer, medan toluidin blå färgning visade tydliga myelinskidan bilden och enkelt kan vara kvantifierade4. Trots vissa begränsningar, toluidin blå färgning av harts inbäddade perifera nerver är en värdefull teknik som kan användas när högupplösta bilder av nerv morfologi krävs.
Främsta nackdelen för harts inbäddning är att det är tidskrävande och inte tillåter immunfärgning av samma vävnad på grund av svårigheten att antigen retrieval jämfört med paraffin- och frusna inbäddade snitt tekniker. Det är således inte generellt möjligt att utnyttja samma vävnaden för immunfärgning som bearbetas via harts-inbäddning för toluidin blå färgning. Även om inte används här, immunohistokemi önskas i harts inbäddade sektioner, användning av glykol inbäddning hartser möjliggör immunohistokemi ska utföras på vävnadssnitt, men det är relativt dyra19. Detta kan mildras något av skära den perifera nerven i separata segment, några för harts-inbäddning och andra för immunfärgning direkt efter fixering.
Processen med toluidinblått blå färgning av harts inbäddade perifera nerver, som med mest histopatologisk analys, kan delas i fem faser, inklusive fixering, uttorkning, inbäddning, snittning och färgning20. Vi vill här ge en protokoll och praktiska riktlinjer för att använda harts inbäddade råtta ischiasnerven sektioner färgas med toluidinblått blå att förvärva högkvalitativa bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Adult Sprague Dawley-råttor användes i detta projekt och alla förfaranden godkändes av University of Wyoming institutionella djurens vård och användning kommittén.
1. kirurgi och i Vivo nerv fixering
Obs: Leverantörsinformation för alla material och utrustning som används i detta protokoll är listade i Tabell för material.
Obs: In vivo nerv fixering används för att bevara vävnaden och minska strukturell nedbrytning som kan uppstå mellan död och samling av nerverna. In vivo vävnad fixering är en praxis för beredning av nervsystemet vävnad för histologi, där perfusion är ofta ett förstadium till detta. Placering och storlek av perifera nerver tillåtet för jordbaserad fixering. Vi rekommenderar inte insamling och fixering av vävnad efter dödshjälp på grund av möjligheten av vävnad nedbrytning.
- Inför narkos råttan genom att placera det i en induktion kammare med 2-3% isofluran, sedan placera sövda råtta i liggande position på toppen av en dissektion matta och underhålla på 1-2% av isofluran via bedövningsmedel näsan konen. För att säkerställa tillräckligt djup av anestesi, testa djur för pedal uttag på bakfotarna och kontrollera om avsaknad av palpebrala reflexer på ögonen genom att röra vid den mediala Cantus av ögat.
Obs: Intraperitoneal injektion av ketamin är ett vanligt förekommande alternativ till inhalerade isofluran. - För att exponera ischiasnerven, raka håret av hind limb(s) och ren rakade områdena med 70% etanol. Med en skalpell eller sax, göra en 2-3 cm snitt i huden längs bakbenen från knät upp till den större trochanter, där palpation av lårbenet med en steril skalpell för att säkerställa rätt plats för snittet. Lårbenet är beläget strax proximalt till den mest tillgängliga delen av ischiasnerven. Även om detta är en icke-survival kirurgi, upprätthålla sterila tekniker.
- Efter att huden snittet, lokalisera planet mellan biceps femoris muskeln och gluteus maximus muskeln, och med lokalt sax separata underliggande fascia och exponera 2-3 cm av understrykning ischiasnerven. För att exponera en tydlig del av ischiasnerven, Använd ett upprullningsdon för att vidga klyftan mellan de två musklerna (figur 1A). Med fin pincett och iris sax, noggrant separat nerven från omgivande bindväv, tar stor omsorg inte komprimera eller skära nerven.
- Lägg till tillräcklig Trumps fixativ (4% formaldehyd, 1% glutaraldehyd i 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) med 1,16 g NaH2PO4· H2O per 100 mL) i hålighet innehållande utsatta nerven för att täcka nerven och låt sitta i 10 min. Om nödvändigt, plats gasbinda under hind ben för att förbättra vinkeln så att mer fixativ kan läggas in i hålrummet. Ta bort fixeringsvätskan efter 10 minuter och upprepa detta två gånger.
- Med dissekera Mikroskop, klippa nerven från båda sidor med fina dissektion sax, se till att inte sträcka eller klämmer ischiasnerven, och omedelbart sätta avsnitten nerv i 15 mL rör som innehåller Trumps fixativ vid 4 ° C för en vecka, ändra den fixativ varje 48 h.
- Lämna inte djur utan uppsikt under någon del av det kirurgiska ingreppet. Efter avlägsnande av nerven, avliva djur av cervikal dislokation medan under narkos.
2. Osmium vanligtvis behandling och harts inbäddning
- Bokför fixering, försiktigt bort eventuella återstående fett och bindväv från nerven och Använd en vass skalpell för att skära nerven i segment ca 5 mm i längd (nerv segment separeras och märkt i olika rör). Förbereda färska 2% osmium vanligtvis spädas i Trumps fixativ lösning och hålla i ett glasrör. Fördjupa nerv segment i 2% osmium vanligtvis för 2 h, som kan vara i plaströr under denna korta tid.
Obs: Vissa plaströr reagera med osmium vanligtvis, orsakar en mörkfärgning av lösningen, så långvarig lagring av osmium vanligtvis i plaströr inte rekommenderas. - Använder en epoxi inbäddning medium kit, Förbered den slutliga inbäddning formeln:
- Blanda epoxi inbäddning medium med DDSA lösning (dodecenylsuccinic bauxit, blandning A) och blanda epoxin inbäddning medium med NMA lösning (methylnadic bauxit; blandning B). Låt båda blandningar som A och B blanda minst 20 min under omrörning med en magnetisk omrörare.
- Omedelbart före användning, blanda blandning A och B och gaspedalen DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) av andelen 1,5 till 2,0% av den totala volymen av blandningen. Observera att DPM-30 lösningen borde mätas exakt för att förhindra blocket blir mörk i färgen och sprött. Alla harts kemikalier är giftiga; var extra försiktig att förhindra hudkontakt eller inandning.
- Med 1,5 mL tuber, tvätta nerv segment med PBS och börja dehydratiseringsprocessen genom att placera segmenten nerv i olika aceton/destillerat vatten passager: 30%, 60%, 90%, koncentrationer för 10 min varje, sedan i 100% aceton 3 gånger för varje 10 min. Observera att etanol kan användas i stället för aceton.
- För harts infiltration, placera segmenten nerv i en blandning av 1 del av slutliga inbäddning blandningen och 1 del 100% aceton för 30 min, sedan i en blandning av 2 delar av slutliga inbäddning blandningen och 1 del 100% aceton för 30 min , och slutligen plats nerven segment i finalen inbäddning blandningen i 30 min.
- Sätta segmenten nerv i silikongummi inbäddning formar (vi har använt 106 mm längd x 71 mm bredd x 7 mm djup, blockera storlek 11 mm längd x 6 mm bredd x 3 mm djup). Försiktigt lägga harts ovanpå nerverna, se till att täcka hela nerven segmenten och undvika att göra luftbubblor. Lämna den mögel som innehåller nerv segment med harts att polymerisera vid 60 ° C under natten.
3. snittning av Ultramicrotome
- Förbereda glasknivar med hjälp av ett glas kniv maker (figur 1B) och göra glasknivar med båtar (figur 1 c), som används för att samla nerv delar flyter på destillerat vatten.
- Placera harts inbäddade nerv block i ultramicrotome hållaren med den trapetsformade uppåt. Använda ultramicrotome räckvidd, trimma någon överflödig harts som omger nervvävnad och göra blocket står inför en trapetsoid form så nära längsgående ytan av nerven som möjligt med hjälp en eneggad klinga, såsom ett rakblad. Inte tränga segmentet nerv, som är igenkännlig genom sina mörka färgning av osmium vanligtvis längsgående yta.
Obs: Trimning av överskjutande harts kommer att minska området av harts att vara sektioneras och förbättra blade prestanda och skärning i efterföljande steg. - Använda ultramicrotome, göra flera tvärsnitt som är tillräcklig för att exponera en enhetlig tvärsnitt yta av nervvävnad med hjälp av ett vanligt glas kniv. När detta är gjort, växla till en glas kniv vars båt är fylld med destillerat vatten vid rumstemperatur och justera ultramicrotome till 1-2 μm att skära tunna snitt.
- Överföra flytande tunnslip från glas kniv båten till en droppe avjoniserat vatten på glasskiva med metallöglan (figur 1 d). Torra diabilder som innehåller sektioner av passerar flera gånger över en låga i några sekunder, för att göra säker på att inte överhetta avsnitten. Bets torkade sektioner omedelbart med toluidinblått blå eller förvaras vid rumstemperatur i flera dagar innan färgning.
Obs: Avsnitten kan också torkas med en tallrik som är varmare vid 60 ° C i 15 min. Långsam torkning gör avsnitten len.
4. toluidin blå färgning
- Bered 1% lösning av toluidin blå genom upplösning 2 g natrium Borat i 100 mL avjoniserat vatten, sedan tillsätt 1 g toluidin blå och rör om tills upplöst. Filtrera lösningen med filterpapper (porstorlek: 11 µm) och förvara lösningen i en ogenomskinlig flaskan i rumstemperatur i upp till två veckor.
- Använda en plast pipetten eller mikro vi rekommenderar, Lägg en droppe av toluidin blå lösning på toppen av avsnitten nerv och lämna för 20-30 s.
- Skölj av alla toluidin blå lösning överflödig genom att försiktigt doppa glasen i avjoniserat vatten burk och upprepa 3 - 4 gånger tills sektioner är tydliga. Torka de bilder minst 15 min vid 60 ° C eller över natten i rumstemperatur och sedan täcka avsnitten med ett täckglas som använder vanlig monteringsmedium. Undersöka de monterade bilderna omedelbart eller förvaras vid rumstemperatur.
- Undersöka under ett ljusmikroskop. En 100 X olja nedsänkning lins rekommenderas för detaljerade bilder används för att beräkna g-nyckeltal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Harts inbäddade perifer nerv sektioner som färgas med toluidinblått blå möjliggör korrekt histologiska data kvantifieringar. En översikt över förfarandet visas i (figur 2). Höftnerver sektioner inbäddade i harts medium och färgas med toluidinblått blå visade tydliga bilder med optimal upplösning (figur 3). Nervskador kan orsaka många förändringar i nerv morfologiska strukturer, till exempel förändringar i nerv fiber, axon diameter och myelinskidan tjocklek. Denna metod kan bevara nerv strukturen i sin naturliga form, vilket underlättar mätning av flera parametrar såsom förhållandet mellan axon diameter totala fiber diameter (g-förhållandet; (Se figur 4). En mängd olika faktorer kan leda till mindre än optimala perifer nerv sektioner inklusive förekomsten av sprickor (figur 5A) i avsnittet på grund av felaktig hantering av nerven. Hål kan också uppstå i avsnittet (figur 5B) på grund av otillräcklig uttorkning. Ett annat möjligt fel i förfarandet är vikning av avsnitten (figur 5 c), som kan avhjälpas genom ympning loopar för avsnitt överföring in i glas-bilden.
Figur 1: kirurgi och snittning. (A) råtta ischiasnerven under i vivo fixering. (B) kniv maker (C) glas glasknivar med båt. (D) Metall öglor som används för att överföra flöt tunnslip från glas knivarna till en droppe avjoniserat vatten på glasskiva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av den metod som används i detta protokoll. (A) vuxen Sprague Dawley råtta är sövda, följt av i vivo nerv fixering (B) och nerv samling (C). Nästa steg är efter fixering med 2% osmium vanligtvis (D) och harts inbäddning (E). Harts inbäddade nerv delar är sedan trimmas (F) och sektionerad (G) med en ultramicrotome. Slutligen, nerv sektioner på Glasskiva färgas med toluidinblått blå (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tvärsnitt av en råtta ischiasnerven med toluidinblått färgas blå. Visar avsnitt under olika förstoringar (10 X, 20 X, 40 X och 60 X) av tydlig bild med optimal upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tvärsnitt av en råtta ischiasnerven med toluidinblått färgas blå. Denna högupplösta bild (100 X) kan användas för att mäta förhållandet mellan axon diameter totala fiber diameter (g-förhållandet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tvärgående delar av en råtta ischiasnerven färgas med toluidinblått blå under olika förstoringsgrader. Visat aresome av de problem som kan uppkomma vid fullgörandet av detta protokoll. (A) och (B). Förekomsten av sprickor och hål inuti avsnittet nerv orsakad av felaktig hantering av avsnittet och otillräcklig uttorkning av vävnad, respektive. (C). vikning av avsnitten, som kan hända under överföring av avsnitten från glasknivar till bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersökningar av perifera nervskador och regenerering morfologiska strukturer är ofta föremål för studie13. I detta protokoll beskriver vi stegen för att få högkvalitativa bilder för histologiska data kvantifieringar använda råtta ischiasnerven vävnad inbäddade i harts block och färgas med toluidinblått blå. Denna teknik ger en bild av nerv morfologi där nerven regenerering kan kvantifieras genom att mäta antalet axoner, viss myelinisering, närvaro av infiltrativ fibrotisk vävnad och hälsa nerverna. Medan bilderna visar snittning och bearbetning av oskadd nerver som prover, samma steg och material är tillämpliga på skadade nerver och nerver regenereras med conduits eller vävnad ympkvistar, förutsatt att fixering av vävnad är adekvat20, 21.
Medan alla steg i protokollet är väsentliga, är några av dessa steg mer sannolikt att leda till dålig kvalitet sektioner eller bilder. Otillräcklig vävnaden uttorkning kan leda till hål i avsnitten nerv (figur 5B). En möjlig förklaring är immiscibility av harts med vatten och överflödigt vatten i vävnaden förhindrar harts från infiltrera vävnaden. Så att tillräckligt med tid och användning av absoluta aceton är därför avgörande för att säkerställa ordentlig uttorkning steg. Även om vi använde aceton i detta protokoll, kan etanol också användas. Många hartser, är dock inte reaktiv med etanol, så vävnaden måste behandlas med propylenoxid att fungera som en övergång mellan etanol uttorkning och harts inbäddning.
På grund av tunnhet av avsnitten, bör överföra nerv sektioner från glaskniven till glas bild göras med stor omsorg (figur 5 c). 1-2 μm sektioner är mycket bräcklig, och felaktig överföring av avsnittet kan orsaka avsnittet att bryta. Om avsnittet är plockade upp i den centrala delen av avsnittet med en nål, avsnittet är benägna att vika i sig själv och ofta blir svårt att veckla upp när det överförs till bild. Olika verktyg kan användas för överföring av avsnittet i glas bilden, inklusive nålar och loopar, och varje bör testas för den specifika användaren att avgöra vilket kommer att ge den bästa överföringen resultat. För våra syften minska med en loop som kan omfatta hela avsnittet kraftigt den vikningen av sektioner när de överfördes från glaskniven till Mikroskop bild (figur 1 d).
I allmänhet, är korrekt hantering av nerverna viktigt eftersom kompression av nerver kan orsaka sprickor uppstå i nerv sektioner (figur 5A). Nervkompression vävnad kan inträffa under överföring av nerv segment i processerna för exponering i djur, fixering, dehydrering och inbäddning av harts. För att undvika nervkompression vävnad, nerv segment ska överföras av fin pincett och plockas upp på ena änden av segmentet idealiskt av bara det epineurial lagret, så hela nerven inte påverkas. Förekomsten av sprickor och linjer (kniv märken) i avsnitten nerven kan också uppstå på grund av tråkig eller överutnyttjas glasknivar. För att garantera optimalt sektionering, rekommenderar vi att göra färska glasknivar och ändra glaskniven varje 25-30 nedskärningar, färre om snittningen genom nerv inneslutet i en kanal.
Hartser kan bli relativt dyrt, är otillräckliga när längsgående nerv sektioner krävs och kan kräva dyra verktyg såsom en ultramicrotome och ett glas kniv maker. Trots dessa begränsningar, toluidin blå färgning av harts inbäddade perifer nerv delar fortfarande anses vara den gyllene standarden för visualisering av tvärsnitt av perifer nerv morfometri4,5. Längdsnitt kan också avslöja viktiga funktioner i perifera nerver, såsom axonal kontinuitet och noder av Ranvier, men är mest användbart med immunhistokemi. I sådana fall som det är allmän praxis att differentially bearbeta två sektioner av samma nerv, en för toluidin blå tvärsnitt och den andra för längsgående immunohistokemi. På grund av ökad incidens av perifer nerv trauma och skador och behov av ett bättre sätt att utvärdera nerv morfologiska strukturer, kan denna metod fortsätta att tillämpas som ett viktigt verktyg att få histologiska data av nervskador och regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill thankthe Jenkins mikroskopi anläggning vid University of Wyoming för deras hjälp och medlemmarna i Bushman labbet, Kelly Roballo, Hayden sant, Wupu Osimanjiang och Kalle Dhunghana, för hjälp i djurvård. Denna publikation har möjliggjorts genom en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health under Grant # 2P20GM103432.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , Plenum. New York. 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
