Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3 つの包括的なワークフローを提案します。

Abstract

純粋培養の調査と微生物群集の動態のモニタリングは、理解し、自然の生態系と微生物によって駆動される技術的なアプリケーションを制御することが重要です。次世代配列方法は広く、内細菌叢解析を解決する利用が、彼らは、一般的にリソースと時間がかかるほとんど質的情報を提供します。フローサイト マイクロバイそれらの欠点に苦しまないし、相対サブコミュニティ微量含有量と絶対に提供することができます携帯番号ラインで。それは直接の系統情報を提供しないが、分析深さとアプローチをシーケンスの解像度が向上します。医療研究のルーチンの設定とは対照的に、フローサイトメトリーはまだ広くマイクロバイ分析に使用されます。サンプル準備およびデータ解析パイプラインの不足している情報は、よく教科書の流れ cytometry アプリケーションになるマイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入障壁を作成できます。ここでは、純粋培養のための 3 つの包括的なワークフローを提案する、複雑なコミュニティがそれぞれ挑戦的な行列の中で複雑なコミュニティをクリアします。我々 は個々 のサンプリングと固定の手順を記述する、それぞれのサンプルのセットのプロトコルを汚すを最適化します。手の込んだ複雑な研究の中心とフローサイトメトリー解析とアプリケーション集中ベンチ トップ デバイス、プロシージャを並べ替えセルを記述する、データ分析パッケージを提案します。さらに重要な実験的コントロールを提案し、, それぞれのサンプル セットに提示されたワークフローを適用します。

Introduction

微生物は、生きている人間の多くの面で重要な役割を果たします。彼らは惑星の炭素、窒素、リン、硫黄サイクル12,3を分解と同様、廃水処理などの様々 な産業で4生体触媒の合成として法の主要な生物的ドライバー5やバイオ6。彼らは人間の健康および代謝7、8に直接的な影響は人間のマイクロバイを構成します。したがって、構造、関数および即時の環境への応答における微生物の挙動については、完全に理解し、これらのシステムを操作を目指すなら必要です。次世代シークエンシング (NGS) はマイクロバイ構造と機能9を解決する技術の確立です。ただし、解析と NGS データの評価定量的な情報を得られることはできません、まだ高価、時間のかかる、廊下のパフォーマンスでは敷地内の結果を提供すること準備ができているです。いくつかの細菌は、1 h と常に一定の環境の10のコミュニティ構造の変化の原因の下の生成時刻を表示します。次のようなダイナミクス シーケンスのアプローチを使用して最も科学的研究所の金融・労働力容量をオーバーしました。

対照的に、フローサイトメトリーは、時間、労働とコスト効率を維持しながら NGS データと同様にコミュニティ指紋を提供できます。流れフローサイトメトリー技術単一セルのレベルの微生物群集動態線に従うことを紹介します。異なり、NGS、フローサイトメトリーは機能遺伝子系統所属や情報を提供していません、定量的細胞数を提供します。フローサイトメトリーを用いた微生物群集が明瞭な光散乱と蛍光特性 ((FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) がわかるようにセル サイズと細かさでそれぞれ) サブコミュニティに解決できます。提示方法を主に利用してセル サイズ- および DNA 量の特定の細胞の種類と生理 (成長) の状態に関連付けられている関連する情報。DNA 量は、UV-興奮 4', 6-diamidino 2'-phenylindole (DAPI) DNA の AT リッチ領域にバインドし、異なる染色体レベルを解決することができますも染料を使用して定量化されます。DAPI の蛍光と FSC を組み合わせることによって 50 以上のサブコミュニティ区別および監視が可能時間11とともに組成を変えることを。サブコミュニティの豊富なバリエーションが pH と製品価12, グローバル パラメーター、天気13,14などまたは腸や唾液の場合など、マイクロ環境の環境の変化を関連付けることができます。特定の治療15内細菌叢解析。これらの相関関係には、キーのサブコミュニティがコミュニティ全体の代謝ネットワークの特定の機能を担当が明らかにします。キーのサブコミュニティが具体的に昇格または周囲の微小環境を変えることによって抑制したり後続のシーケンス15やプロテオームの調査のための16のためにソートします。

ただし、微生物群集フローサイトメトリー確立されていませんまだ広く流量フローサイトメトリー装置微生物集団あるいはコミュニティを正しく解決することができる数がかなり低いため。さらに、効果的なデータ評価、コミュニティ解析パイプラインの経験の欠如は、マイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入の障壁を提起するかもしれない。これらの問題に取り組むために包括的なワークフローを設けています。一般的な適用性を示すためには、それを 3 模範的なサンプル セット (補足ファイル 1 S1)、すなわち私に示します) バイオ テクノロジー用に定義された明確な媒体 (シュードモナスの putida KT 2440 上で成長して純粋培養 (PC)ブドウ糖)、ii) 明確な媒体 (合成廃水の活性汚泥コミュニティ (ASC)) と iii で複雑な実験コミュニティ) 密な行列 (トウモロコシのサイレージのコミュニティ (BC) バイオガス) の自然環境から複雑なコミュニティ。

それぞれのサンプル セットのプロトコルの選択に影響を与えるいくつかの要因。深い凍結は有毒な化学薬品の使用を好まれる場合がほとんどショック フロスティングのため液体窒素の使用のためのラボ環境に限定。ホルムアルデヒドの安定化とその後エタノール固定により、分注の準備を必要とせず一括サンプリングと長期間にわたって安定する証明されています。タンパク質フロック、ホルムアルデヒド、次は好ましくない信号雑音比を引き起こす可能性がありますので、人間の唾液15などのタンパク質が豊富なサンプルは、問題となるかもしれません。サンプルの乾燥、この比較での手順のほとんどの時間 (合計で約 1 時間) がかかりますが、有毒化学物質なしサイトで実行することができます。それは、チューブ、冷却またはその他の危険注意せず簡単に出荷することで安定したペレットを得られます。さらに、提案された11をされているたくさんの代替の固定方法。新しいサンプル セットを導入するとき、異なるプロトコルの解像度と固定の安定性をテストするを強くお勧めします。

セットを分析する 2 つの異なる流れの cytometers を使いました: セルソーターと現場適用5に適して表示されます ii) アプリケーション ベンチのトップ アナライザー i) 洗練された高価な研究が中心します。BC は、PC や ASC はセルソーターで測定されたベンチ トップ アナライザーで測定しました。3 つの模範的なサンプルの分析は、最適化された再現性、サンプルの安定性とワークフローの利便のため必要な異なったプロシージャを設定します。次のプロトコルは 3 つの異なるシステムのセクションを指定します。

Protocol

1. サンプリングと固定

  1. 純粋培養: 深い凍結15,17
    1. 5,000 × g室温 (RT) で 5 分間遠心する細胞懸濁液 2 mL をとり、上澄みを廃棄します。
      注: サンプリングした細胞懸濁液は、補助ファイル 1 S1 の説明です。
    2. さらにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 6 mM Na2HPO4、1.8 mM NaH2PO4, 145 mM の NaCl bi 蒸留 H2O、pH 7.2) の 1 mL の細胞を再懸濁します 15% (v/v) における凍害防御剤としてグリセリンを含みます。
    3. -80 ° C でその後のストレージの液体窒素氷とショック凍結で 10 分間インキュベートします。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、少なくとも 1 ヶ月間安定しています。
  2. 汚泥コミュニティをアクティブ化: ホルムアルデヒド安定化 + エタノール固定5,10,18
    1. 15 ° C および 3,200 x gで 20 分間遠心する細胞懸濁液 4 mL をとり、上澄みを廃棄します。
      注: サンプリングした細胞懸濁液は、補助ファイル 1 S1 の説明です。
    2. PBS で 2% のホルムアルデヒドの 4 つの mL を追加し、室温 30 分間インキュベート
      1. 液体の形態で出荷されるホルムアルデヒド添加省添加メタノールを避けるためにパラホルムアルデヒドから 8% ホルムアルデヒド ストック溶液を準備します。70 ° C で 50 mL の PBS にパラホルムアルデヒドの 4 g を追加します。10 M 水酸化ナトリウム溶液約 125 μ L を追加します。かき混ぜ、パラホルムアルデヒドが完全に溶解、それまでし、塩酸凍結ホルムアルデヒド溶液 15 ml でストレージのルート調整約 100 μ L 37 %7.0 に pH 値をクールダウンします。吉濱因数 10 日以上は使用しないでください。
        注意: ホルムアルデヒド処理およびその毒性および変異原性特性のため注意して破棄する必要があります。常にそれを処理しながら手袋を着用します。有毒ガスへの曝露を防ぐために、パラホルムアルデヒドを溶解しながら排気フードを使用します。
    3. 15 ° C と 3,200 x gで 10 分間のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
    4. 70% エタノール 4 mL、-20 ° C でストアでサンプルを再懸濁します
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、少なくとも 2 ヶ月間安定しています。サンプルのプロパティによっては、時間を節約する 4 ° C で 10 分間の 1.2.1 の遠心分離のステップを実行できます。
  3. バイオガス コミュニティ: 乾燥
    1. 2 mL チューブに粘性 digestate のサンプル 200 μ L にクリップされた 1,000 μ L ピペット チップを使用します。
    2. PBS バッファーの 1,700 μ L を加え、徹底的に混ぜます。
    3. 35 kHz、1 分の効果的な出力 80 W 大細胞凝集体を解散して植物細胞残渣付着細胞をデタッチする超音波風呂にチューブを配置します。
    4. サンプルを徹底的にミックス、50 μ メッシュ フィルターを通してサンプルをフィルター、濾液を約 400 μ L の 4 つの因数に分割します。
      注: この時点で因数を準備する 2 つの主要な利点を提供します。まず、小さいボリュームが簡単かつ迅速に機械的に見られる脱水 (遠心) および熱 (乾燥)、通常から少量の厚いバイオガス汚泥のサンプリングは非常に挑戦することができますが。第二に、余分なサンプルは、後続のセルを並べ替え、バックアップ測定またはコントロールの使用可能性があります。
    5. 10 の ° C および 4,000 x gで 10 分間 2 回の因数を遠心し、エタノールを二回とも完全に機械的に可能な限り徹底的にサンプルに見られる脱水します。
    6. 35 ° C、約-97 kPa と安定したペレットを作成する 2,500 x gで 40 分間加熱、真空遠心分離機でサンプルを乾燥させます。暗闇に 4 ° C でペレットを格納します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。ペレットは、少なくとも 6 ヶ月間安定しています。

2. 染色

注: DAPI 染色高解像度ドット プロットが実証されて、コミュニティを分析する際に特に有利なため。染色液の DAPI 濃度は騒音レベルを上回るが、ビーズの下セル ゲート蛍光強度を保証するために最適化する必要があります。最適な計測器の感度とビーズの選択に依存 G/C コンテンツ含まれている微生物のためのサンプルのセットによって異なりますが、新たに導入されたサンプル セットの一般にテストする必要があります。DAPI 0.24 μ M と 1 の濃度をテスト μ M DAPI は提示のセットアップのためお勧めします。他の染料は、特定のアプリケーション用される可能性があります。使用 SYBR グリーンのフィンガー プリント解析 (補足ファイル 1 S1)6,15より絶対測定精度を優先するときのプロトコルを汚す私をお勧めします。それはより少ないサンプルの処理および遠心分離のステップが含まれています、両方の固定および重要な細胞に該当します。細胞の収穫の 1 つだけ遠心分離必要であり重要な細胞の使用、固定をスキップしてサンプル処理のステップをさらに低減します。これは、潜在的なセルの損失、したがって組織的測定誤差を最小限に抑えます。PBS、透過バッファーと染色液は、すべて次の手順中に使用は、サンプルで追加の粒子負荷軽減のため 0.2 μ m のシリンジ フィルター濾過する必要があります。大腸菌BL21 を含む 1 つのサンプルの染色 (DE3) すべてのサンプルのプールと生物学的基準をアドバイスとして。

  1. 純粋培養
    1. サンプル、RT と 5,000 × gで 5 分間遠心を解凍し、上澄みを廃棄します。
    2. 氷冷 PBS で繰り返しピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します、0.035 に OD700 nmを調整 (パス長キュベット= 0.5 cm)。
    3. 汚損のためにセルを準備します。
      1. RT と 5,000 × gで 5 分間調整の細胞懸濁液の 1 mL を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
      2. 0.3 M クエン酸および 4.1 mM Tween20 を含む透過バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁します、徹底的に混ぜます。
      3. 10 分その後の汚損のため透過性の細胞膜を作成する氷のサンプルをインキュベートします。
      4. RT と 5,000 × g で 5 分間のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
    4. 染色 0.68 μ M 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4バッファー (289 mM Na2HPO4, 128 mM NaH2PO4 bi 蒸留 H2O、pH 7) の DAPI を含む液の 1 mL を追加し、ミックスし、RT で暗闇の中で少なくとも 15 分間インキュベートします。
      注: 正確な OD 調整 DAPI の蛍光は DAPI 濃度は一定に保たれる場合、細胞密度によって異なりますので対等な測定を保証するため重要です。上澄みは、セル損失を防ぐために一般に壊れやすいペレットのため慎重に削除必要があります。
      注意: を処理しはその変異原性注意 DAPI を処分します。
  2. 活性汚泥のコミュニティ
    1. 固定サンプルを徹底的にミックスし、ガラス管に 0.6 mL を転送します。1.4 mL の PBS を追加し、手順 1.3.3 RT で 10 分の超音波。4 ° C と 3,200 x g で 10 分間のサンプルを遠心し、上清を除去します。2 mL の PBS を加え、徹底的に混ぜます。5 分の超音波照射します。
    2. 0.035 に OD700 nmを調整 (パス長キュベット= 0.5 cm) PBS の。
    3. 汚損のためにセルを準備します。
      1. 4 ° C と 3,200 x gで 10 分間のサンプルを遠心し、上清を除去します。
      2. 0.11 M クエン酸および 4.1 mM Tween20 を含む透過バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁します、徹底的に混ぜます。
      3. その後の汚損のため透過性の細胞膜を作成する RT で 20 分間インキュベートします。
      4. 4 ° C と 3,200 x gで 10 分間のために再度サンプルを遠心し、上清を除去します。
    4. 0.68 μ M DAPI と 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4バッファーを含む染色液 2 mL を加えて混和 RT で暗闇の中で、少なくとも 60 分を孵化させなさい。
      注: 特定の微生物プラスチック管の管壁に付着する傾向があるプロセス中に失われる可能性がありますと、ガラス管の使用はお勧めします。インキュベート一晩も可能です、通常実習の手順が簡単になります。
      注意: DAPI は、処理およびその変異原性のため注意して破棄する必要があります。
  3. バイオガス コミュニティ
    1. PBS で乾燥した細胞ペレットを中断します。
      1. 800 μ L の PBS を追加、徹底的にミックスし、15 分間浸してペレット。
      2. 1,000 μ L ピペットで液体を吸引し、ずぶぬれのペレットを円筒管にピペット チップ部に移動します。それはそこに固執する必要があります。
      3. 管壁に沿ってペレットは、スカッシュに円形の動きでピペット チップを移動します。
      4. 管の壁に沿ってピペット先端から液を分注して管壁に生じるスラリーを洗います。
      5. 吸引と三度ピペットに中断することによって懸濁液を揺り動かしなさい。
    2. PBS のサンプルを 2 回洗います。
      1. 10 の ° C および 4,000 x gで 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
      2. 1,500 μ L の PBS を加え、徹底的に混ぜます。
      3. 一度上記の 2 つの手順を繰り返します。
    3. 1.3.3 の手順で説明するように 1 分の超音波浴にチューブを配置し、その後、各サンプルを 50 μ メッシュ フィルターを個々 のガラス管にフィルターします。
    4. 外径700 nm 0.035 サンプル 2 mL を希釈 (パス長キュベット= 0.5 cm) PBS の。
    5. 染色 2.2.3 上記の手順で説明したように、セルを準備します。
    6. 0.24 μ M DAPI 染色液 2 mL と 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4バッファー、徹底的にミックスを追加し、暗闇の中室温で一晩インキュベートします。
      注意: DAPI は、処理およびその変異原性のため注意して破棄する必要があります。

3. 測定

注: 2 つの異なる流れの cytometers と模範的なサンプル セットを行った。複雑な高調整、簡単にカスタマイズ可能な研究中心のセルソーターと PC と ASC を行った。PC の分析のためこのデバイスは青前文書の16、要するに説明に従ってセットアップ レーザーが装備されていた (488 nm、400 mW) や紫外線 (334-364 nm、100 mW) アルゴン イオン レーザー。ASC の解析、新しいブルー (488 nm、400 mW) と紫外線 (355 nm、150 mW) 半導体レーザがインストールされていた。両方のケースで青色レーザ誘起 (バンドパス フィルター 488 nm ± 5 nm、中性密度フィルター 1.9) FSC と SSC (バンドパス フィルター 488 nm ± 5 nm、中性密度フィルター 1.9、トリガー)。これらの光学特性は、それぞれセルのサイズとセル密度に関連付けられます。紫外レーザー励起 DAPI 蛍光 (バンドパス フィルター 450 nm ± 32.5 nm) 核 DNA 量の定量化のため。流体システムが最大 0.3 psi でサンプル重圧と 70 μ m ノズル 56 psi (3.86 バー) で実行されました。すべてのパラメーターは、ピーク面積測定分解能を改善するのではなくピークとして記録されました。少なく複雑なフロー キュヴェット、ベンチ トップ アナライザーとバイオガス コミュニティの長期モニタリングを行った。紫外線半導体レーザー (355 nm、50 mW) FSC を誘導するために使用された (バンドパス フィルター 355 nm ± 5 nm) SSC (バンドパス フィルター 355 nm ± 5 nm、トリガー) 信号し、DAPI の蛍光励起 (バンドパス フィルター 455 nm の C)。両方のデバイスの鞘のバッファーで使用される水は、bi 蒸留し、0.1 μ m のフィルターだった。サンプル希釈用 PBS は、可能な限り測定粒子ノイズを低減する 0.2 μ m シリンジ フィルター濾過する必要があります。

  1. 純粋培養と活性汚泥のコミュニティ
    1. 計測器、レーザー、コンピューターおよびソフトウェアを起動し、サンプル分析の準備します。
      1. レーザーの切り替え、動作温度に達するし、ビーム安定性を確保する 15 分間実行します。
      2. Bi 蒸留 H2O 作業ソリューション x 0.2 で希釈鞘バッファー (19 mM KH2PO4、38 mM KCl、166 mM ナ2HPO4、bi 蒸留 H2O 1.39 M NaCl) x 10 の鞘のタンクを埋める (細胞選別の: 0.5 倍実用的なソリューション)。
      3. プライムと約 6 psi 真空廃棄物のタンク 56 psi と流体システム。
      4. サンプル ポート、チューブ、ノズルを洗浄するバック フラッシュ モードで最低 15 分間計測を実行します。
    2. 標準的なビーズで校正いたします。
      1. 線形 (1 μ m ブルー + 2 μ m 帯黄緑色の蛍光) で校正用ビーズ ミックスを準備と対数の範囲 (0.5 μ m と 1 μ m ブルー蛍光)。等しい濃度を達成するために元のストック懸濁液からビーズ懸濁液を希釈します。
      2. 継続的に線形ビーズ ミックスを測定し、ノズルを操作することによってプリセット キャリブレーション テンプレートにビーズのピークに合わせて、レーザー光学位置事前線形の範囲で計測器を校正します。
      3. 対数の範囲に切り替え、対数ビーズ ミックスを連続的に測定します。計測器のハードウェアを微調整する、プリセットのキャリブレーション テンプレートにビーズのピークを合わせてください。光電子増倍管 (光電子増倍管) のゲイン設定を使用して、ビーズ位置を最終調整します。
      4. 楽器の音の位置を確認し、キャリブレーション テンプレートに合わせて調整。
        注: ビーズの位置の固定調整テンプレート測定プロジェクトの前に準備する必要があり、(補足ファイル 1 S4 参照) 変更できません!インストゥルメンタル ノイズ サンプルや光電子の電子ノイズの粒子によって引き起こされることができ、ある程度常に記録されます。ゲインの調整またはプロットのオフセットによって完全にノイズを非表示にすることはお勧めできません。豊かさとノイズ イベントの位置情報の貴重な情報源をすることができます、したがって raw データに含まれている必要があります。非常に粒子の集中的なサンプルかもしれないプロットとデータ分析の理由で雑音の後続の除去が必要になります。楽器の安定性を保証し、したがってサンプル比較測定日の間に定期的に校正を制御します。
    3. 2.1.4 で説明されているように生物学的標準を含むサンプルを測定 (DAPI 染色大腸菌BL21 (DE3) サンプリングし、1.2 で説明 ASC プロトコルに従って静止した段階 (16 h) で固定)。そのプリセット調整テンプレート (参照補正ファイル 1 S5) に関連してピークの位置を確認します。
      注: ルーチン染色とサンプルのすべてのプールと生物学的標準の測定も、汚損プロシージャの内部統制。ビーズを使用してデバイスを校正、生物学的標準はそのプリセット調整テンプレートを適合しない場合は、プロシージャを汚すはおそらく繰り返される必要があります。
    4. サンプルの収集。
      1. 10 分サンプル ポートとチューブを洗浄し、その後サンプルの DAPI の蛍光の安定性確保のための染色液を実行します。
      2. ステンド グラス サンプルを cytometer ノズルの目詰まり防止や毛細血管の流れを測定する前に 50 μ m のメッシュ フィルターをフィルター処理します。
      3. 楽器の安定性を監視し、回顧の校正チェックの可能性を提供するサンプルに対数ビーズ ミックスを追加します。サンプルは、2 つのビードのゲートの各 1,000、2,500 イベント間含める必要があります。
      4. 機器のソフトウェアの新しいサンプル セットの最初の試験測定中にセル ゲートを作成します。この門は、染色したセルが含まし、ノイズとビーズを除外ください。
      5. サンプルをミックスし、250,000 セル (コミュニティ)、または 50,000 セル (純粋な文化) がセル ゲート内で検出されるまで 3,000 イベントの-1の最大速度で測定します。
        注: これらの細胞数は、サンプル セットの経験に基づいて選択されます。数が異なるを使用する測定効率と低豊富サブコミュニティ、どちらの方向の検出間のトレードオフをシフトする可能性があります。
        トラブルシューティング: ビーズのシフトの突然内測定とセルの位置は、ノズル内に閉じ込められた気泡によることができます。これは除去と鞘のバッファーを持つ流体システムの洗浄ノズルの洗浄を必要とします。計測器はノズル (3.1.2 のステップに開始) を再マウントした後に再調整される必要があります。
      6. バック フラッシュ シャット ダウンおよびサンプルの切り替え前に鞘バッファーで十分に楽器。
  2. バイオガス コミュニティ
    1. 計測器、レーザー、コンピューター、サンプル分析用準備、ソフトウェアを起動します。
      1. バック フラッシュ、少なくとも 6 mL のチューブと計測器ソフトウェアの「シース液プライム」関数を使用して緩く接続されているチューブにサンプル ポートを介してシース バッファー (bi 蒸留 H2O)。
      2. Bi 蒸留 H2O 5 μ の-1未満 200 イベントの-1が 0.5 μ の-1通常流量で検出されるまで流体システムを洗浄するを測定します。
    2. システムを調整します。
      1. ビーズ ミックス (0.5 μ m と 1 μ m ブルー蛍光) を準備します。等しい濃度を達成するために元の原液からビーズ懸濁液を希釈します。
      2. 連続ログ4範囲にビーズ ミックスを測定し、流れキュベットとレーザー光の位置を操作することで、プリセットのキャリブレーション テンプレートにビーズのピークを合わせてください。タマのゲイン設定とビーズの位置を最終調整します。
    3. 3.1.3 の手順で説明されているように生物学的標準と校正を制御します。
    4. サンプルの収集。
      1. 1,600 μ L の PBS のステンド グラス サンプルの 400 μ L を希釈を計測・集中テストを実行するイベントの数を監視します。
        注: 調整済みの希釈率が他のサンプル ソースに必要あります。イベント数 1,200 イベントの-1粒子前方散乱 (補足ファイル 1 S2 に負例) に解像度の損失を防ぐために豊富なサンプルでを超えてはいけません。純粋培養は、最大 2,000 イベントの-1で測定できます。
      2. これらの最初の試験測定機器のソフトウェアでセル ゲートを作成します。この門は、染色したセルが含まし、ノイズとビーズを除外ください。
      3. 最大 1,200 イベントの合計 s-1で実行し楽器の安定性を監視し、回顧の校正チェックの可能性を提供するサンプルにビーズ ミックスを追加濃度テストの結果によるとサンプルを希釈します。サンプルは、2 つのビードのゲートの各 1,000、2,500 イベント間含める必要があります。
      4. ミックスし、セル ゲート内 250,000 セル (コミュニティ)、または 50,000 セル (純粋な文化) が検出されるまで、サンプルを測定します。
      5. シャット ダウンとスイッチングのサンプルの前に徹底的に bi 蒸留 H2O で楽器をすすいでください。

4. 細胞選別

注: プロシージャを並べ替えセルを設定する付加的な器械を必要とし、公開プロトコル12に従って実行されます。

  1. 起動の手順 3.1.1-3.1.3 で説明されているように楽器を調整、鞘バッファーの実用的なソリューション × 0.5 を使用します。
  2. DD 周波数と液滴休憩を見つける DD 振幅を設定します。
  3. 偏向板をマウント、それらを充電し、2- または 4 方向の並べ替えモードを決定します。
  4. 2 内部ドロップ遅延校正を実行 μ m イエロー グリーン ビーズ粒子または尋問から移動するセルを取る時間間隔を定義するストリームに接続されている最後の一滴を (レーザー ヒット セル) をポイントします。
  5. スライド ガラス上で 6 回 20 ビーズを並べ替え、ドロップ遅延校正を確認するには顕微鏡でそれらをカウントします。
  6. 並べ替えのゲート テンプレートを準備します。
  7. 使用、"シングルと一滴モード: 最高純度 99%「2,500 より高くないレートで合計時間 (4 ウェイの並べ替えモード) で最大 4 つのゲートで 500,000 セル並べ替えるには、イベントの-1 。
  8. (20,000 × g、6 ° C、25 分) は遠心分離によって細胞を収穫し、後の DNA の隔離とシーケンスの-20 ° C でペレットを凍結します。
    注: 回避 5% 未満でゲート内のセルを並べ替え並べ替えの時間としての相対的な豊かさは相対的な豊かさに逆に比例しています。個々 のステップは、細胞選別機マニュアルで詳細に説明します。必要な細胞数は、それぞれのユース ケースおよび抽出のプロトコルに大きく依存。多数の方法が適用されている: ddPCR (1,000 セル17,19) 16S rdna 塩基 mcrA 私アンプリコン シーケンス (500,000 セル6,10,15) や (最大 10 の7セルx 1.1 プロテオミクス16,17)。セルの並べ替え並べ替えられたサブコミュニティ低い多様性メタゲノム アプローチと組み合わせると特に有利になります。
    注意: 高電圧により並べ替え手順の中には、偏向板を触れないでください。

5. データの解析

注: フローサイト メーターによる測定は、一般的に均一データ構造を持つ「フローサイトメトリー標準」.fcs データ ファイルを生成します。しかし、別の cytometer メーカーがわずかに適応バージョンを使用して、古い器械は最新の FCS 標準 3.1 の 2010 年導入をさかのぼる可能性があります。これはスケーリングの問題は、さまざまな楽器を持って集まった結果の直接比較を防ぐドット プロットにつながります。しかし、個々 のデータ ポイントは常にそれぞれの散布図と異なる列の蛍光強度値を持つ、行列の行に格納されます。提示マイクロバイ解析パイプラインは、微生物のサブコミュニティを記述するのに特徴的なセル サイズと DNA 量を使用します。これらのパラメーターは、FSC と DAPI の蛍光チャンネルの強度に相関 (セルソーター: フロリダ 4、アナライザー: フロリダ 1) とサブコミュニティ クラスター二次元 FSC 対 DAPI 蛍光プロットで視覚化されたときの結果。これらのドット プロット解釈と流れの cytometry のデータの分析を可能にし通常対数スケールします。彼らは独自の cytometer のソフトウェアまたはサード パーティのソリューションを使用して、.fcs ファイルから表示することができます、自動 (フローサイトメトリーによるヒストグラム イメージ比較、シックな) のための基礎および半自動 (フローサイトメトリーによるバーコード、CyBar) コミュニティ分析。

  1. フローサイトメトリーによるヒストグラム イメージ比較
    注: コード、詳細なマニュアルとこのパッケージのためのマニュアル、http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html でご利用いただけます。彼らはまた出版された20をされています。
    1. インストールし R パッケージをロード、.fcs ファイルを含む作業用ディレクトリを設定および実行することによってファイルの一覧を設定します。
      > ソース ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # は FCS ファイルがあるパスに作業ディレクトリを設定
      > # が引用符にパスを入力
      > setwd("")
      > # あなたの作業ディレクトリにある FCS ファイルのファイル名のリストを得る
      > ファイル <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # は、パッケージに含まれている FCS ファイルのファイル名のリストを得る
      > ファイル <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC")、
      + 完全 = true の場合、パターン ="*.fcs")
      > # FlowFrame として最初の FCS ファイルの読み取り
      > フレーム < - 読み取り。FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)
      > # パラメーター/チャンネル名のリストを得る
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. フローサイトメトリーによる生データのイメージを作成するには、"fcs_to_img"パッケージ関数を実行します。
      > # 既定のパラメーターを使用してヒストグラム イメージの作成
      > fcs_to_img(files)
    3. "Img_sub"パッケージ関数を実行して、ヒストグラム イメージのサブセットを定義します。
      > # 画像サブセットの既定のパラメーターを使用してヒストグラムを作成
      > img_sub (ファイル、ch1 ="FS。Log",ch2="FL.4.Log")
    4. "Calculate_overlaps_xor"パッケージの関数を実行することで画像解析を行って重複と XOR を計算します。
      > # リストとしてすべてのサブセットのイメージの名前を保存します。
      > サブセット <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # 重複と XOR 画像を計算し、値を 2 つの新しいファイルに書き込む
      > 結果 <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. 非計量多次元のスケーリング (NMD) の類似性解析のため"plot_nmds"パッケージの関数を実行することによってプロットを作成します。
      > # 表示サンプルの NMD プロット
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. フローサイトメトリーによるバーコード
    注: コード、詳細なマニュアルとこのパッケージのためのマニュアル、http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html でご利用いただけます。また、公開された11,12されています。
    1. すべてのサンプルで使用するマスター ゲート テンプレートを開発します。
      1. ドラッグ アンド ドロップ機能を使用して解析ソフトウェアに .fcs ファイルを読み込みます。
      2. 測定をダブルクリックし、FSC 対 DAPI 蛍光プロットを開くそれぞれのドロップダウン リストから x 軸と y 軸のパラメーターを選択します。
      3. 3.1.4.5 と 3.2.4.4 手順で分析されたセルの数を制御し、それに応じて名前以前セル ゲートを再現するのに多角形描画ツールを使用します。それをプールにすべてのサンプル グループのサンプルの一覧でセル ゲートのエントリをドラッグします。
      4. セル ゲートをダブルクリックし、セル ゲート イベントを可視化する軸の割り当てを修正します。
      5. 次の公開されているガイドライン12楕円ゲート ツール サンプル セットで流行のサブコミュニティを定義し、ゲート テンプレートの整合性を確保する SSC または別の 3 番目のパラメーター21のスキャンを使用します。プール、制御し、他のサンプルのサブコミュニティの割り当てを調整します。
    2. R スクリプトで使用する .txt ファイルに相対サブコミュニティ元素をエクスポートします。
      1. [編集] タブにテーブル エディターを開きます。
      2. 5.2.1.5 のステップで定義され、「親の周波数」に出力統計を設定するすべてのサブコミュニティの列を追加し名前を付けます。
      3. 保存形式とエクスポート先を選択した後「表エディター」でテーブルを作成します。
        注: 解析ソフトウェアは直接相対サブコミュニティ元素を提供します。彼らは、セル ゲートのイベント数によって個々 のサブコミュニティ ゲート [イベント カウントの部門を通じて取得できます。値は、n. a. フィールドを含めることはできません (を参照してくださいマニュアルと具体的な手順についてよく寄せられる質問) R コードでいくつかの追加要件を満たす必要があります .txt ファイルでタブ区切りのマトリックスで救われなければなりません。
    3. インストールし、R パッケージを読み込み、実行することによってデータの読み込み。
      > ソース ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # が引用符にパスを入力
      > setwd("")
      > # 負荷データセット
      > data(Cell_number_sample)
      > # データを表示
      > Cell_number_sample [,-1]
    4. 「正規化」パッケージの関数を実行することによって相対的な存在量を正常化します。
      # データを正規化、2 桁の数字を印刷
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. "Cybar_plot"パッケージの関数を実行することにより、正規化のバーコードと元の相対的な存在量の箱型図を作成します。
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-計数 (data.matrix (Normalized_mean))
      # デフォルトのパラメーターでプロットします。
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. 元の相対的な存在量の NMD プロットを作成します。
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-計数 (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMD プロット正規化されたセル数
      > nmds(Normalized_mean)
    7. 「相互関係」パッケージ関数を実行する、正規化の相対的な存在量とその他のパラメーターの相関分析を作成します。
      > # 負荷データセット
      > data(Corr_data_sample)
      > # 相関値の表示
      > Corr_data_sample [,-1]
      > # 実行相関分析
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      注: シックと CyBar は、相対的存在量に依存します。ただし、フローサイトメトリーは、バイオ テクノロジー用の偉大な関心のあるかもしれない絶対セル番号を決定することも。セルの絶対数を決定するには、興味のゲート内のセルの数は、分析試料の量によって分けられます。分析試料の量は、サンプル (補足ファイル 1 S7 の式) に濃度既知ビーズ懸濁液を追加することによって決定できます。ベンチ トップ アナライザーが、測定中にサンプル チューブ内のボリュームを直接定量化真体積カウント機能追加装備します。セルを数えるためのプロトコルを汚す私 SYBR グリーンを使用する勧めします。

Representative Results

次の代表的な結果複製の必要性を強調し、3 つのサンプル セットのそれぞれに異なるデータの可視化と解析テクニックを例示します。彼らはそれぞれのセットについて標準的な研究の質問に適したデータ評価パイプラインの結果を表示します。ただし、本技術はで示されているサンプル セットに排他的ではありません。流れの cytometry の生データはで、FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 公に利用可能にしました。以前アップロードした ASC データは ID FR FCM ZYD7 の下で利用です。

生物的および技術的なレプリケートされた撮影、準備、公開プロトコル11によると分析します。PC と ASC から生物の複製は、3 つの並列のフラスコから撮影されました。紀元前の生物の複製は、パイロット プラントで 1 つの場所で 3 つの後続サンプリングとして撮影されました。1 つのサンプルの 3 つの因数が固定、染色、技術の再現性を確保するために分析します。以前公開された手順11によると方法の再現性を評価しました。ゲート当たりの標準偏差 (%) を計算するため、1 つのサンプル セット (補足ファイル 1-S6) のすべてのサンプル ゲート テンプレートの使用。

PC の相対的な豊かさの最大の標準偏差は 3.44% 平均の標準偏差は 2.13% (図 1)。ASC と BC は、相対的存在量の最大の標準偏差では、標準偏差の平均値, 2.13% 0.21% (補足ファイル 1-S8) 間 1.27% 0.88% とあった。

標準的な手順、純系文化を調査するときは成長曲線の遅れ位相、世代時間、特定の条件下で細胞密度を分析するための準備です。我々 は、システム (図 2) のより深い理解を達成するためにフローのフローサイトメトリーによる解析のワークフローとこの手順を組み合わせます。DAPI 対 FSC 蛍光プロットでは、バッチ文化のさまざまな時点で文化の細胞周期の状態を明らかにします。マスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を設立 (c1n)、1 つの細胞の割合を定量化する 2 つ (c2n) と複数の染色体 (cXn、図 2 b)。接種の細胞の支配的な割合は、1 つだけの染色体 (93.7 %0 h) を持っていた。これは指数関数的成長は、ほぼすべての細胞に含まれる 1 つ以上 (4 h、99.6%)、(53.1%) の人口の半分はさらに 2 つ以上の染色体を含んでいた以上の間に大きく変化しました。これは、その生成時よりその染色体を複製するP. putidas 機能を示しています。

フローサイトメトリーによる解析は、微生物群集の進化を監視するため非常に役立っています。それは群集の動態をより多くのリソース集中的な分子法5,10よりはるかに近いを従うことができます。我々 は映画でこれらのダイナ ミックスを強調表示され、時間の経過とともに活性汚泥コミュニティ シフトの概要を得た。各 1 秒のフレームは、サンプル ポイント (補足ファイル 2) の FSC 対 DAPI 蛍光プロットを示しています。0 日目と 4 日目の間の非常に明確なシフトは 7 日後コアの共同体の設立が続いた。21 日目に追加サブコミュニティが思い付いた。サブコミュニティ レベルの微生物動態解析を有効なマスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を設立しました。実験のさまざまな段階で支配的なサブコミュニティは、CyBar ツール (図 3) を使用して明確に特定されました。興味深い (キーの時点でトリガーされる豊富で重要な変更) は、ゲートを選択するために助けたと実行可能な相対サブコミュニティ元素の分布とそれを組み合わせること (以上 5% 相対量) の並べ替え、さらに解析22。

工業規模バイオリアクター アプリケーション動揺制限のための潜在的な不に直面できます。彼らは頻繁にまた非合成基板の質の交替のような操作上のパラメーターを変更するのに公開されます。紀元前は、このようなシステムを表し、動的なプラグ流反応器で異なる場所からサンプリングされました。模範的なサンプル ポイントの DAPI 対 FSC 蛍光プロット (図 4) のみ少し空間が発音的異質性を示します。BC は両方を使用してさらに調べた、高速自動シックなより詳細なマスター ゲート テンプレート ベースの CyBar アプローチ。

自動で高速かつ公平な本来産業設定で現地管理バイオ プロセスのために特に興味深いシックをなります。すべての使用可能なサンプルの生 .fcs データを比較します。これらの比較の 2 つの図 5で表示されます。非類似度計算結果では、時空の不均一性に関する前の観察を確認してください。NMD 作成されたプロット フォーム シックなツールの非類似度行列 (図 6) はさらにこの結果を実証し、それに応じてそれを可視化します。

さらに、マスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を使用して紀元前の 23 サブコミュニティの相対的な存在量を算出しました。微生物群集の機能の関係を理解する 48 サンプルを 1 年の期間からの相関分析を行った。これはさらなる調査 (4 セルの並べ替え) のための興味の門を識別するために助けることができます。非生物的パラメーターを正または負の強い相関が好き価が理解して生態系やバイオ テクノロジーの手法を最適化する助けることができる製品です。この相関関係 (図 7) に含まれている有機物負荷率は、このような非生物的パラメーターを例証します。G10、G4 G5 強い正の相関関係を展示し、G8 に負の相関がメタン生成アーキアの方にヒントがあります、おそらく、発酵種を含めることができます。

Figure 1
図 1: 純粋培養のフローサイトメトリーによる解析の再現性です。FSC 対 DAPI の蛍光は、誤差 ± 1 標準偏差 (C, D) を表すしてコントロール ビーズ (A, B) とバーの 3 サブコミュニティ微量含有量 [%] のプロットを印刷します。相対的な存在量は、補助ファイル 1 S6 で示されるゲートのテンプレートから決定しました。A、B および C は、4 h で成長曲線の撮影された 3 つの生物学的複製と 3 技術的複製 P1、P2、P3 サンプル A から準備ができていたし、三度、それぞれ測定: M1、M2、M3 で彼らのそれぞれの標準偏差であります。50,000 イベントがセル ゲートに記録されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 成長カーブの時に撮影した純粋培養の細胞周期解析実験 (A) 以上 12 h..FSC 対 DAPI の蛍光は、指数関数的成長段階で DNA 量の変化を示す双方向時間サンプリングのプロットします。この測定シリーズは、ビーズ (補足ファイル 1 S3 を参照) には含まれません。(B).光密度ベースの成長曲線と誤差範囲 ± 1 標準偏差と、サブコミュニティの相対的な存在量を時間をかけて表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 活性汚泥の群集構造 24 日間にわたって進化。(A) flowCyBar 傾向の類似性によって並べられたそれぞれのゲートのひげで視覚化される周波数分布を重ねることで、対応するカラー キー (B) と NMD プロット ウィット R の類似性解析 < 0.001 (C). 基になるプロットが補足のファイル 2 のフィルム順序で表示されます。補足ファイル 1-S6 でゲートのテンプレートを使用して相対的な存在量を求めた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 産業規模で微生物群集構造の空間的で、一時的な不均一性プラグ フローリアクター バイオガス。4 つの微生物群集構造の比較 (A) サンプリング ポート I ~ IV 223 日。(B) 日 384 ポートの 0 日から時間依存の社会構造の変化の比較 II。ノイズは、可視化を強化する遅ればせながら切断されています。250,000 イベントはセル ゲート (補足ファイル 1-S6) で測定した.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: フローサイトメトリーによるヒストグラム イメージ比較-シックな。シックなアルゴリズムの原理は、それぞれ時空の不均一性を表す 2 つのサンプルを比較することによって例証されます。(i) シックなイメージは、(FSC 対 DAPI 蛍光) を表示する 2 つのパラメーターを選択した後、.fcs ファイルから作成されます。グレースケール (0-255) のピクセルのイベント カウントをコードします。(セルが含まれる領域を指定した後 ii) シックなサブセットが生成されます (ここで: 200 < < 4000、200 x < < 2200 y)。(iii) XOR 組み合わせイメージがサブセット間のピクセルを比較することによって作成されます。差は 0 に等しく、黒として表示されます。差の最大値は 200 に等しい、白として表示されます。対応する XOR 値は、XOR イメージのすべてのピクセルのグレースケール値を追加することによって計算されます。(iv) オーバーレイの組み合わせイメージがサブセットのピクセルのグレースケール値を追加することによって作成されます。対応するオーバーレイの値は、ゼロにしないし、そのための情報が含まれているオーバーレイ イメージのピクセルを数えることによって計算されます。(v) 非類似度の値は、XOR とオーバーレイの値で除して計算されます。これらは、図 6の NMD のプロットのための基礎です。非類似度の値と両方 NMD のプロットをごくわずか空間- と顕著な一時的なコミュニティ不均質。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: シックに基づくバイオガスのコミュニティ サンプルの類似性解析します。0 日のサンプルは、歪曲的な分析 (補足ファイル 1 S11) 非常に異なるコミュニティ構造のためこのプロットから除かれました。NMD のプロットは、低空間についての仮定を確認する-より高い間的異質性シックなツールを使用して、図 5で説明します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: バイオガス コミュニティ相関分析します。マトリックスはスピアマンの順位係数を算出したし、補足ファイル 1 S6 マスター ゲート テンプレートで決定された 23 のサブコミュニティの相対的な存在量に基づきます。1 年の期間からの 48 のサンプルの有機物負荷率 (OLR) と相関します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8: 浮遊性 (P) と汚泥の類似性解析による排水中 (S) コミュニティ。プライマリ浄水 (PCL) 活性化汚泥盆地 (AS) と本格的な廃水処理プラント (補足ファイル 1 - s10 ドット プロット) のダイジェ スター タンク (DT) から採取しました。補足ファイル 1 S6 で示されるゲートのテンプレートを使用して相対的な存在量を求めた。これらのサブコミュニティ元素 CyBar (補助ファイル 1-S10) と NMD を作成する flowCyBar ツールを使って解析したプロット (R < 0.01)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: 純粋培養の固定安定性。0 h で撮影した成長曲線の実験からのサンプルは、15% のグリセロールの固定後は-80 ° C で 28 日間で格納されていました。FSC 対 DAPI の蛍光は、ビーズが表示されますコントロールして印刷します。計測のシリーズでは、ビーズ (補足ファイル 1 S3) は含まれません。50,000 イベントがセル ゲート (補足ファイル 1-S6) で記録されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

補足ファイル 1:ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。

2 の補足ファイル:ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。

Discussion

微生物の個体群と群集の解析に成功には、適切にチューニングされた cytometers、セルのパラメーターの適切な選択、サンプリング、測定、データの評価に向けた固定から信頼性の高いワークフローが必要です。選択したセルのパラメーターする必要があります利用可能な励起波長のコンソート。使用し、低濃度に非常に敏感である DAPI をお勧めしますしかし標準の cytometer セットアップで通常構成されていない紫外線レーザーによって励起する必要があります。他の染料は、サイバーなど緑の私、また、汚れ全体集団やコミュニティが一般的に劣っている解決策を提供します。微生物群集の魚プロシージャまたは生存率テストを使用してはお勧めしません。これらのアプローチは、定量化、およびコミュニティの個々 の種への影響は不明であるために、制御を確認することが可能ではありません。彼らに確実にテスト不能、典型的なコミュニティの相当な割合はまだ純粋な文化として利用できない限り。

セルの並べ替えと同様、サンプリングと固定の手順、プロトコルで重要な手順が含まれます。サンプリングすることができます特定の純粋培養とフロックに集計またはサンプル マトリックスの粒子に付着する微生物群集の傾向によって複雑になります。これらの凝集体を放散し、フローサイトメトリーによる解析結果の信頼性を保証するためにそれらを導入する前に、サンプル内のセルを区切るが欠かせません。発表準備のプロトコルが単一細胞解析を可能にする最適化されました。最終 50 μ m のろ過は、残留集計セルソーターの 70 μ m ノズルとアナライザーの流れキュベットの目詰まりを防止し測定の前に実行されます。廃水処理プラントからセル フロックは、特に豊富な堅牢であり、システムの機能に不可欠です。汚泥ベース確立されたプロトコルをテストする本格的な排水処理プラントの別のタンクで微生物と、浮遊性を調査しました。集計した消費明らかに細胞集塊形成汚泥と群集組成は安定していた。さらに、浮遊性と汚泥ベースのコミュニティはすべての 3 つのサンプル タンク (図 8、補助ファイル 1-S10) でそれらの間の顕著な類似性を展示しました。これらの結果はホルムアルデヒド、エタノール執着の新鮮な -、ホルムアルデヒド処理 - 比較 16S rDNA 増幅配列による検証した-、および並べ替えられたサンプル10。それにもかかわらず、非常に強力なバイオ フィルム細菌密接に接続されたチェーンの成長などの環境試料に挑戦できない可能性が放散します。土壌サンプルは、ユビキタスの粒子、ヒストグラムに表示によって豊富なセルが見えなくなるとは特に問題があります。このような場合、伝統的な配列方法は適用する必要があります。

すべての新しいサンプル セットの固定の安定性は、結果の妥当性を保証するための実験を設計する前にテスト必要があります。良い固定の安定性には、プールされた染色と 1 日に複数のサンプルの時間ポイントの測定もできます。さらに、レプリケーションの測定と回顧セルソート決定的なタイム ポイントのまとめと実験の最終的な評価の後をできます。純粋培養の固定の安定性は 28 日間で (図 9) を確認しました。敷地内の実験サンプル輸送を含む、固定安定性は (この例では、活性汚泥のコミュニティのため 60 日、バイオガスのコミュニティの補足ファイル 1 S9 の 195 日) で長い期間にわたってテストしてください。

染色は通常問題ではありませんが、バイオ情報評価ツールのアプリケーションを許可する生物学的標準で制御する必要があります。大腸菌BL21 のモックのひずみを使いました (DE3) ASC プロトコルによると執着は、すべて染色バッチで使用するための備蓄します。

DAPI、SYBR グリーンから離れて私がされて正常に適用数年14,23,24,25,26の微生物コミュニティを解決します。SYBR グリーン高および低核酸サブセット (HNA および LNA) にコミュニティを解決することができますオンラインのやり方で生きている細胞を用いたします。DAPI、DNA への結合の詳細し 1 つのサンプル セットに 50 以上のサブコミュニティの区別をできるようにしかし、染色する前に固定の手順が必要です。

セルの並べ替えこのアプローチの顕著な特徴は、特定のサブコミュニティがさらに関心のある場合に適用できます。それも PFA (30 分だけ実行されます) もエタノール処理または10を汚す DAPI が後続 16S 私アンプリコン シーケンスにマイナスの影響を持っていたことを強調する必要があります。固定の潜在的な影響し、ステイニングがサブコミュニティ メタゲノム解析はまだテストする必要があります。

多くのコミュニティ機能とトレンドのダイナミクスに関する情報ことができる並べ替え方法から独立したバイオインフォマティクスのツールは、仮想細胞による細胞レベルのコミュニティ機能を解決および非生物的でこれらの機能を接続を含む場合パラメーター。

最近、新しいバイオインフォマティクス評価ツール、両方のサイバーのためすべての有用な数は私と DAPI アプローチ グリーン、フローサイトメトリーによるコミュニティがパターンを解決するために開発されました。これらの FlowFP27、(flowCHIC20、flowCyBar28), 本研究では、パッケージを使用して新鮮な水社会29設立デコンボリューション モデルとによると自分の生理系統を区別するためのツール特徴30。また、フローサイトメトリーによる多様性が断固とした25をすることができます、オンライン ツール10微生物群集のも安定性が続く今ことができます。

したがって、フローサイトメトリー解析における微生物群集と非生物的パラメーター相関の迅速な評価になったら大きな利点があります。しかし、まだメソッドには制限があります。それは、経験に基づいてゲート設定プロシージャのための flowCyBar ツールを使ってオンライン本当に適用できません。さらに、カスタムメイドで使いやすい流れの cytometers の開発は流れフローサイトメトリー マイクロバイ分析アプローチによる増殖を大きく前進するでしょう。この方向の最初のステップは引き受けられた28です。

それにより細菌の世代時間の範囲内で高周波の監視と生態学的パラダイムがフローサイト メーター データ5 に適用されることが示されている、微生物生態学、微生物フローサイトメトリーの応用を想定することができます。 ,10。メソッドはスイス連邦共和国の31の必須飲料水コントロールのような自然環境の定期上映のため非常に便利です。それは人間15または動物32マイクロバイ スクリーニングのような医療用の貴重なツールにすることができます。さらに、バイオインフォマティクスの最新動向が微生物の管理下システムのプロセス コントロールに不可欠なセンサーをする微生物フローサイトメトリーを有効にします。微生物群集フローサイトメトリーは、高解像度の特定のコミュニティのサブセットのゲノムの調査を可能にする細胞の選別のスクリーニング ツールを提供します。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。
 

Acknowledgments

我々 は感謝してプロシージャと純粋培養と活性汚泥コミュニティのデータセットをそれぞれ提供するマイケル ・ ヤーンと Yuting 郭を認めます。我々 はさらに、バイオガスのコミュニティ サンプルの解析にカトリン ・ Mörters を感謝します。この作業によって賄われていた (FNR、プロジェクト バイオガス指紋 Nr。 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe バテレ ドイツの中央政府大臣に代わって食料・農業 (BMEL)、中央技術革新プログラム連邦省の中小企業 (ジンバブエ)経済情勢とエネルギー (BMWi) (INAR 夕べ、16KN043222)、ドイツ Bundesstiftung 環 (DBU、プロジェクト オンデマンドからだ・ フォン ・ Phosphatdünger オーストラリア Reststoffen フォン ブラウエライ und Kläranlage 33960/01-32)、教育のためドイツの中央政府大臣のと研究 (BMBF) (FZK 03XP0041G) とヘルムホルツ協会の資金プログラム指向 (POF III R31 トピック 3 バイオ エネルギー)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).

Tags

環境科学、問題 137、フローサイトメトリー、単一細胞解析、微生物群集の動態、マイクロバイ、サンプル準備フローサイトメトリー、バイオ プロセス制御、監視細胞ダイナミクス、フローサイトメトリーによるデータ分析、flowCHIC、flowCyBar
特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F.,… More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter