Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Характеризующих микрофлора динамика – проточной цитометрии на основе рабочих процессов из чистых культур для природных сообществ

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Анализ потока гранулярных оказалась полезной для расследования чистых культур и мониторинга динамики микробных. Мы представляем три всеобъемлющие процессы, от выборки для анализа данных, для чистых культур и сложных общин в ясно средних, а также в сложных матриц, соответственно.

Abstract

Расследование чистых культур и мониторинга динамики микробных имеет жизненно важное значение для понимания и управления природных экосистем и технического приложения на основе микроорганизмов. Следующего поколения последовательности методы широко используются для разрешения microbiomes, но они, как правило, ресурсов и времени интенсивная и доставить основном качественной информации. Анализ потока гранулярных микрофлора не страдают от этих недостатков и может обеспечить абсолютное и относительное subcommunity обилия клеток номера на линии. Хотя он не доставить прямой филогенетических информацию, он может повысить глубину анализа и урегулирования последовательности подходов. В противоположность медицинских приложений как исследований, так и обычные параметры проточной цитометрии до сих пор не широко используется для анализа микрофлора. Недостающую информацию о образца подготовка и данных анализа трубопроводов могут создавать барьеры для исследователей проблем анализа микрофлора, которые часто будет учебник поток цитометрии приложений. Здесь мы представляем три всеобъемлющих процессов для чистых культур, сложных сообществ в четкие средние и сложные общины в сложных матриц, соответственно. Мы описывают отдельные процедуры выборки и фиксации и оптимизированы пятная протоколы для наборов соответствующих образцов. Разрабатываем гранулярных анализ с комплекс исследований по центру и приложения сосредоточены скамейке Топ устройства, описывают ячейку Сортировка процедуры и предложить анализ пакетов данных. Кроме того предлагаем важный экспериментальный контроль и применять представленных рабочих наборов соответствующих образцов.

Introduction

Микроорганизмы играют жизненно важную роль во многих аспектах человека жить. Они являются основными драйверами биотических планет углерода, азота, фосфора и серы циклов1и выступать в качестве унижающего достоинство2,3 , а также обобщения биокатализаторов4 в различных отраслях промышленности, таких как обработка сточных вод 6 5 или биотехнологии. Они даже являются человеческие микрофлора, которая непосредственно влияет на здоровье человека и метаболизм7,8. Таким образом информация о структуре, функции и динамическое поведение микроорганизмов, в ответ на их непосредственного окружения, является необходимой, если мы стремимся полностью понять и управлять этими системами. Следующее поколение виртуализации (НГС) является сложившаяся технология для разрешения микрофлора структуры и функции9. Однако анализа и оценки данных NGS не могут дать количественную информацию и по-прежнему дорого, длительным и отнюдь не готовы предоставить на месте результаты в рамках коридоров производительности. Некоторые бактерии отображения поколения раз ниже 1 h и причиной постоянно меняется общинных структур в некоторых средах10. После такой динамики используя последовательность подходов будет превышать объем финансовых и трудовых ресурсов большинство научных лабораторий.

В отличие от этого проточной цитометрии может обеспечить сообщество отпечатки пальцев похож на NGS данных, сохраняя при этом более высокую эффективность времени, труда и стоимости. Здесь мы представляем потока гранулярных методы способны следовать микробных динамика на линии на уровне одной ячейки. В отличие от NGS проточной цитометрии не дает филогенетических связей или информацию о функциональных генов, но обеспечивает число количественных клеток. С помощью проточной цитометрии, микробных сообществ может быть преобразована в subcommunities собственный рассеяние света и флуоресценции свойствами (вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC) указания размера ячейки и гранулярности, соответственно). Представленный подход использует преимущественно размер ячейки - и ДНК сумму соответствующую информацию, которые связаны определенные типы клеток и физиологические (рост) государств. Содержание ДНК количественно с помощью УФ возбудимых 4', 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) краситель, который связывается с A-T богатые регионы ДНК и может даже решить различные хромосомном уровнях. Объединив DAPI флуоресценции и FSC более чем 50 subcommunities можно выделить и контроль за обилия переключения времени11. Subcommunity изобилия вариации могут быть связаны с изменениями в микро экологической обстановке, как pH и продукта титры12, с глобальные параметры, такие как Погода13,14, или в случае кишки или слюны microbiomes с некоторых лечения15. Эти корреляции выявить ключевые subcommunities отвечает за выполнение конкретных функций в метаболических сети всего сообщества. Ключевые subcommunities можно затем специально поощрять или подавлены, изменяя окружающие микро среды или сортировать для последующих последовательности15 или proteomic расследование16.

Однако микробных проточной цитометрии не еще широко устанавливается из-за довольно низкое количество потока гранулярных устройств, способных должным образом урегулировать микробных популяций или общин. Кроме того отсутствие опыта, сообщество анализ трубопроводов и оценки эффективных данных могут создавать барьеры для исследователей проблем анализа микрофлора. Мы создали всеобъемлющую рабочие процессы для решения этих проблем. Чтобы проиллюстрировать их общей применимости, мы представим их в трех сетах образцовый пример (дополнительный файл 1-S1), а именно я) чистой культуры (ПК) для биотехнологии, выращенных в определенной среде ясно (Pseudomonas putida KT 2440 на глюкозы), ii) комплекс лаборатории сообщества в четкой среднесрочной (сообщество (ASC) ила в синтетических сточных вод) и iii) комплекс община из природных сред в плотной матрицы (сообщество (BC) биогаза в кукурузный силос).

Выбор протокола для каждого из этих комплектов образцов влияют несколько факторов. Глубокой заморозки forgoes использования токсичных химических веществ, но в основном ограничивается лабораторных сред за счет использования жидкого азота для матирования шок. Формальдегид стабилизации и последующего этанола фиксации позволяет массовых проб без необходимости соответствующей подготовки и доказал быть стабильным в течение длительного периода времени. Однако богатых белком образцы, такие как человеческая слюна15 может быть проблематичным, потому что белок хлопьев, денатурированными, формальдегид, могут вызвать неблагоприятные сигнал шум соотношения. Образец сушка займет больше всего времени (примерно 1 час в общей сложности) процедур в этом сравнении, но может быть выполнена на сайте без токсичных химических веществ. Он дает стабильные окатышей в трубах, которые могут быть легко доставлены без охлаждения или дополнительных мер предосторожности опасности. Кроме того множество альтернативных фиксации методы были предлагаемые11. Мы настоятельно рекомендуем протестировать резолюции и фиксации стабильности различных протоколов при внедрении нового образца набора.

Мы использовали два различных потока цитофлуориметрами для анализа наборы: i весьма сложных и дорогостоящих, исследования по центру ячейки сортировщик и ii приложений сосредоточены скамейке Топ анализатор, который представляется более подходящим для занятия приложения5. До н.э. была измерена с топ анализатор скамейке, в то время как PC и ASC были измерены с сортировщик ячейки. Анализ трех образцовый пример устанавливает необходимые различные процедуры для оптимизированного воспроизводимость, образца стабильности и удобства рабочего процесса. Следующий протокол будет указывать разделы для трех различных систем.

Protocol

1. отбор проб и фиксации

  1. Чистой культуры: глубокое замораживание15,17
    1. Возьмите 2 мл суспензии клеток, центрифуги для 5 мин при комнатной температуре (RT) и 5000 x g и удалить супернатант.
      Примечание: Подвеска пробы клеток описан в дополнительный файл 1-S1.
    2. Ресуспензируйте клеток в 1 мл фосфатный буфер (PBS; 6 мм Na2HPO4, 1.8 мм NaH2PO4, 145 мм NaCl с би дистиллированной H2O, рН 7,2) дополнительно содержит 15% (v/v) глицерин как криозащитных агент.
    3. Проинкубируйте втечение 10 мин на льду и шок замораживание в жидком азоте для последующего хранения при температуре-80 ° C.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы являются стабильными для по крайней мере один месяц.
  2. Активирована Ил сообщества: формальдегид стабилизации + этанол фиксации5,10,18
    1. Возьмите 4 мл суспензии клеток, центрифуги для 20 мин при 15 ° C и 3200 x g и удалить супернатант.
      Примечание: Подвеска пробы клеток описан в дополнительный файл 1-S1.
    2. Добавьте 4 мл 2% формальдегида в PBS и Инкубируйте 30 мин на RT.
      1. Подготовка 8% формальдегида раствор от параформальдегида чтобы избежать сохранения добавки метанола, добавлены к формальдегиду, поставляется в жидком виде. Добавьте 4 g параформальдегида в 50 мл PBS на 70 ° C. Мкл примерно 125 10 М растворе NaOH. Перемешать до тех пор, пока параформальдегида полностью распущены и пусть он затем охладить вниз на RT. Отрегулируйте значение pH 7.0 с приблизительно 100 мкл 37% HCl. замораживание раствора формальдегида в 15 мл аликвоты для хранения. Не используйте размороженные аликвоты больше чем 10 дней.
        Предупреждение: Формальдегид должен обрабатываться и удаляться с осторожностью из-за своих токсичных и мутагенных свойств. Всегда надевайте перчатки при его обработке. Использование вытяжного зонта при растворении параформальдегида для предотвращения воздействия токсичных паров.
    3. Центрифугуйте образцы для 10 мин при 15 ° C и 3200 x g и удалить супернатант.
    4. Ресуспензируйте образца в 4 мл 70% этанола и хранить при-20 ° C.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы являются стабильными в течение 2 месяцев. В зависимости от свойств образца центрифугирования шаг в 1.2.1 также может выполняться для 10 мин при температуре 4 ° C для экономии времени.
  3. Биогаз сообщества: сушки
    1. Используете обрезанный наконечник пипетки 1000 мкл до 200 мкл пример вязкой остатки брожения в 2-мл пробирку.
    2. 1 700 мкл буфера PBS и тщательно перемешать.
    3. Место труб в ультразвуковой ванне на 35 кГц и 80 W эффективной мощностью 1 мин распустить крупноклеточный агрегатов и отсоединить клетки, придерживаясь растительных остатков клеток.
    4. Тщательно перемешать образца, через 50 мкл сетчатый фильтр фильтр образец и разделить фильтрата на четыре аликвоты около 400 мкл.
      Примечание: На данном этапе подготовки аликвоты предоставляет два основных преимущества. Во-первых, меньшие объемы проще и быстрее для обезвоживания механически (центрифуга) и термически (сушка), но проб небольших объемов от обычно толстые биогаз шлам может быть очень сложным. Во-вторых, дополнительные образцы могут использоваться для последующего ячейку Сортировка, резервного копирования измерения или элементы управления.
    5. Центрифуга аликвоты дважды за 10 мин при 10 ° C и 4000 x g и удалить супернатант полностью как раз для механического обезвоживания образца как можно тщательнее.
    6. Сухие образцы в подогревом вакуумные центрифуги для 40 мин при 35 ° C, -около 97 кПа и 2500 x g для создания стабильной гранулы. Храните окатышей на 4 ° C в темноте.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Окатыши являются стабильными, по крайней мере 6 месяцев.

2. Окрашивание

Примечание: DAPI пятнать оказался доставить участки точка высокого разрешения и поэтому особенно выгодно при анализе общин. DAPI концентрация в окрашивание раствора необходимо быть оптимизированы, чтобы гарантировать интенсивности флуоресценции ворота клетки значительно выше уровня шума, но ниже бисер. Оптимум зависит от выбора инструмента чувствительность и шарик, может варьироваться от комплектов образцов из-за G/C содержание микроорганизмов, содержащихся и обычно испытываются новые образцы наборов. Проверка концентрации между 0.24 мкм DAPI и 1 мкм DAPI рекомендуется для представленных установки. Другие красители могут быть использованы для конкретных приложений. Использование SYBR зеленый я пятнать протокол рекомендуется, когда абсолютные подсчета точности приоритет над фингерпринтинговый анализ (дополнительный файл 1-S1)6,15. Она включает в себя меньше пример обработки и центрифугирования шаги и применяется с фиксированной и жизненно важных клеток. Использование жизненно важных клеток дополнительно уменьшает шаги обработки образца, пропуская фиксации и поэтому требует только одного центрифугирования уборочная клеток. Это минимизирует потери клеток и следовательно систематической ошибки. PBS, permeabilization буфер и окрашивание раствора используется во все следующие шаги должны фильтроваться через 0,2 мкм шприц фильтры для снижения нагрузки дополнительных частиц в образце. Пятнать один образец, содержащий Escherichia coli BL21 (DE3) как посоветовал биологических стандарт с бассейном каждый образец.

  1. Чистая культура
    1. Размораживание образцы, центрифуги для 5 мин в RT и 5000 x g и удалить супернатант.
    2. Ресуспензируйте Пелле клеток в ледяной PBS на неоднократные закупорить и отрегулировать ОД700nm до 0,035 (длина путикювет = 0,5 см).
    3. Подготовка клетки для окрашивания.
      1. 1 мл суспензии скорректированных ячейки для 5 мин в RT и 5000 x g центрифуги и удалить супернатант.
      2. Ресуспензируйте клеток в 1 мл permeabilization буфера, содержащего 0,3 М лимонной кислоты и 4,1 мм Tween20 и тщательно перемешать.
      3. Проинкубируйте образцы для 10 мин на льду для создания проницаемость клеточных мембран для последующего окрашивания.
      4. Центрифуга для образца для 5 мин в RT и 5000 x g и удалить супернатант.
    4. Добавьте 1 mL окрашивания раствора, содержащего 0,68 мкм DAPI в 417 мм Na2HPO4/NaH2PO4 буфера (289 мм Na2HPO4, 128 мм NaH2PO4 с би дистиллированной H2O, pH 7), смешать и Инкубируйте по крайней мере 15 минут RT в темноте.
      Примечание: Регулировка точные ОД важно гарантировать сопоставимые измерения, потому что DAPI флуоресценции будет меняться с плотность клеток, если концентрация DAPI остается неизменной. Из-за обычно хрупких гранул для предотвращения потери клеток следует осторожно удалить супернатант.
      Предупреждение: Обрабатывать и распоряжаться DAPI с осторожностью из-за его мутагенных свойств.
  2. Ила сообщества
    1. Тщательно перемешать фиксированной выборки и передачи 0,6 мл в стеклянной трубки. Добавьте 1.4 мл PBS и sonicate 10 мин на RT, как описано в шаге 1.3.3. Центрифуга для образца для 10 мин при 4 ° C и 3200 x g и удалить супернатант. Добавить 2 мл PBS и тщательно перемешать. Sonicate за 5 мин.
    2. Отрегулируйте ОД700nm до 0,035 (длина путикювет = 0,5 см) с PBS.
    3. Подготовка клетки для окрашивания.
      1. Центрифугуйте образцы для 10 мин при 4 ° C и 3200 x g и удалить супернатант.
      2. Ресуспензируйте клеток в 1 мл permeabilization буфер, содержащий 0,11 М лимонной кислоты и 4,1 мм Tween20 и тщательно перемешать.
      3. Проинкубируйте втечение 20 мин на RT для создания проницаемость клеточных мембран для последующего окрашивания.
      4. Центрифугуйте образцы снова за 10 мин при 4 ° C и 3200 x g и удалить супернатант.
    4. Добавить 2 мл окрашивание раствора, содержащего 0,68 мкм DAPI и 417 мм Na2HPO4/NaH2PO4 буфера, тщательно перемешать и инкубировать и по крайней мере 60 мин на RT в темноте.
      Примечание: Рекомендуется использование стеклянных трубок, как некоторые микроорганизмы склонны придерживаться стен пластиковой трубки и могут быть потеряны во время процесса. Инкубации на ночь также возможно и обычно упрощает процедуры лаборатории.
      Предупреждение: DAPI должен обрабатываться и удаляться с осторожностью из-за его мутагенных свойств.
  3. Биогаз сообщества
    1. Приостановите лепешки сушеные клеток в PBS.
      1. 800 мкл PBS, тщательно перемешать и пусть Пелле замочить на 15 мин.
      2. Аспирационная жидкой фазы с 1000 мкл пипетки и переместить пропитанной гранул цилиндрической части стенки трубки с кончиком пипетки. Он должен придерживаться там.
      3. Переместите наконечник пипетки в круговом движении Сквош Пелле вдоль стен труб.
      4. Стирать полученный шлам от стен трубки подачи жидкой фазы от кончика пипетки по стенке трубки.
      5. Агитируйте подвеска аспирационных и приостановив его в пипетку трижды.
    2. Вымойте образца с PBS дважды.
      1. Центрифуга для 5 мин при 10 ° C и 4000 x g и удалить супернатант.
      2. 1 500 мкл PBS и тщательно перемешать.
      3. Повторите два шага выше раз.
    3. Поместите трубки в ультразвуковой ванне за 1 мин, как описано в шаге 1.3.3 и, впоследствии, фильтр каждый образец через сетчатый фильтр 50 мкл в отдельных стеклянной трубки.
    4. Развести 2 мл образца ОД700nm 0,035 (длина путикювет = 0,5 см) с PBS.
    5. Подготовка клетки для окрашивания, как описано в шаге 2.2.3 выше.
    6. Добавить 2 мл окрашивание раствора, содержащего 0.24 мкм DAPI и 417 мм Na2HPO4/NaH2PO4 буфера, тщательно перемешать и инкубировать на ночь на RT в темноте.
      Предупреждение: DAPI должен обрабатываться и удаляться с осторожностью из-за его мутагенных свойств.

3. измерение

Примечание: Образцовый пример наборы были проанализированы с двумя различными потока цитофлуориметрами. С более сложными, высоко регулируемые и легко настраиваемый, исследования по центру ячейки сортировщик были проанализированы PC и ASC. Для анализа ПК, это устройство был оборудован установить вверх, как описано в предыдущей публикации16, короче синий лазер (488 нм, 400 МВт) и ультрафиолета (334 – 364 Нм, 100 МВт) Лазер иона аргона. Для анализа, ASC, новые синий (488 нм, 400 МВт) и ультрафиолетов (355 Нм, 150 МВт) были установлены полупроводниковых лазеров. В обоих случаях синий лазер индуцированной FSC (полосовой фильтр 488 нм ± 5 Нм, фильтр нейтральной плотности 1.9) и СНК (полосовой фильтр 488 нм ± 5 Нм, фильтр нейтральной плотности 1,9, триггер). Эти оптические характеристики связаны с размером ячейки и плотность ячеек, соответственно. УФ лазеров возбужденных DAPI флюоресценция (полосовой фильтр 450 Нм ± 32,5 Нм) для количественного определения содержания клеточных ДНК. Аэрогидродинамических системы выполнялся на 56 psi (3.86 бар) с выборки избыточного давления на максимум 0.3 psi и насадкой 70 мкм. Все параметры были записаны как пик высот вместо пик районах для улучшения измерения разрешения. Долгосрочный мониторинг биогазовой сообщества было проведено с менее сложными, поток кювет основе, топ анализатор скамейке. Ультрафиолетовый лазер (355 Нм, 50 МВт) был использован чтобы побудить FSC (полосовой фильтр 355 Нм ± 5 Нм) и ККК (полосовой фильтр 355 Нм ± 5 Нм, триггер) сигналов и возбуждения флуоресценции DAPI (полосовой фильтр 455 Нм C). Вода, используемая для буфера оболочка обоих устройств был би дистиллированной и 0,1 мкм фильтруют. PBS, используется для разбавления образца следует процедить через 0,2 мкм шприц фильтры для уменьшения шума частиц в максимально возможной степени измерения.

  1. Чистой культуры и ила сообщества
    1. Запустите инструмент, лазерный, компьютер и программное обеспечение и подготовить для анализа проб.
      1. Переключиться на лазеры и запустить за 15 мин до достижения рабочей температуры и обеспечить стабильность луча.
      2. Заполнить бак платье с 10 x буфер оболочка (19 мм х2PO4, 38 мм KCl, 166 мм Na2HPO4, 1,39 М NaCl с би дистиллированной H2O) разбавляют би дистиллированной H2O до 0,2 x рабочего раствора (для сортировки клеток: 0.5 x Рабочий раствор).
      3. Премьер аэрогидродинамических системы с 56 psi давление и цистерн для отходов с примерно 6 psi вакуума.
      4. Запустите инструмент для минимум 15 мин в режиме подсчета для полоскания образца порт, трубы и насадки.
    2. Калибровки стандартных бисером.
      1. Подготовка смеси из бисера для калибровки в линейные (1 мкм синий + 2 мкм желто зеленый люминесцентной) и логарифмический круг (0,5 мкм и 1 мкм синий флуоресцентный). Разбавьте бусины подвеска из оригинального запасов суспензий для достижения равной концентрации.
      2. Постоянно измеряют линейные шарик микс и соответствовать шарик пиков в шаблон предустановленных калибровки, манипулируя сопла и лазерная оптика позиции для предварительной калибровки инструмента в линейному диапазону.
      3. Переключение на логарифмический круг и непрерывно измеряют логарифмической шарик микс. Установите вершины шарик их предустановленных калибровки шаблон для тонкой настройки аппаратной части инструмента. Сделать окончательные коррективы в шарик позицию с помощью параметра получить фотоэлектронный умножитель труб (PMT).
      4. Проверьте положение инструментальных шума и возможно настроить его, чтобы подогнать шаблон калибровки.
        Примечание: Фиксированной калиброванной шаблон для позиции бисер должен быть подготовлен до начала проекта измерения и не могут быть изменены (см. дополнительный файл 1-S4)! Инструментальная шум может быть вызвана частиц в образце или электронного нойза PMT и всегда будет записан в некоторой степени. Это не целесообразно полностью скрыть шум усиления структурной перестройки или участок смещением. Изобилие и позиции событий, шум может быть ценным источником информации и поэтому должны содержаться в исходных данных. Интенсивного образцы очень частиц может потребовать последующего удаления шума для черчения и данных анализа причин. Контроль калибровки в регулярных интервалах во время измерения день, чтобы гарантировать стабильность инструмента и поэтому образец сопоставимости.
    3. Измерить образцов, содержащих стандартом биологических, как описано в 2.1.4 (DAPI окрашенных Escherichia coli BL21 (DE3), отобранных и фиксированной на этапе стационарные (16 h) согласно протоколу ASC, описанные в 1.2). Проверьте пик позицию по отношению к их предустановленных калибровки шаблон (см. дополнительный файл 1-S5).
      Примечание: Обычной окраски и измерения биологических стандарта с каждый пул образцов будет также служить для окрашивания процедуры внутреннего контроля. Если устройство калибруется с помощью шариков и биологических стандарта не соответствует его предустановленных калибровки шаблон, вероятно пятная процедуру необходимо повторить.
    4. Приобретение образца.
      1. Запустите окрашивание решение для 10 мин для полоскания образца порт и трубки и обеспечить стабильность DAPI флуоресценции в последующих примерах.
      2. Фильтр цветного образца с 50 мкм сетчатый фильтр перед измерением для предотвращения засорения цитометр сопла или потока капилляров.
      3. Добавление логарифмическая шарик микс в мониторинга инструмент стабильности и обеспечивать возможность для проверки ретроспективный калибровки. Образцы должны содержать между 1000 и 2500 событий в каждом из двух шарик ворот.
      4. Создайте ячейки ворот в инструмент программного обеспечения во время первого судебного разбирательства измерения нового образца набора. Этот строб должен содержать окрашенных клеток и исключить шум и бусины.
      5. Смешать образцов и измерения максимальной скоростью 3000 событий s-1 до 250.000 клеток (общин) или 50 000 ячеек (чистых культур) обнаружены в пределах ячейки ворот.
        Примечание: Эти клеток выбираются на основе практического опыта с наборами образца. Различные номера может использоваться для сдвига компромисс между эффективностью измерения и обнаружения низкого залегания subcommunities в любом направлении.
        Устранение неполадок: Внезапное интра измерение смен из бисера и позицию ячейки могут быть вызваны пузырьки воздуха, захваченных в сопло. Это обусловливает необходимость удаления и очистки сопла и полоскания аэрогидродинамических системы с оболочкой буфера. Инструмент должен быть скорректирован после перемонтажа сопла (Начните с шага 3.1.2).
      6. Промывание инструмент тщательно с оболочкой буфера до выключения и переключение образцы.
  2. Биогаз сообщества
    1. Запустите инструмент, лазерный, компьютер и программное обеспечение для подготовки анализа проб.
      1. Промывание по крайней мере 6 мл буфера (би дистиллированной H2O) оболочка через НКТ и образец порт в слабо прилагаемый трубку с помощью функции «оболочка жидкости Прайм» инструмент программного обеспечения.
      2. Измерьте би дистиллированной H2O 5 мкл s-1 , чтобы промыть систему аэрогидродинамических до менее чем 200 событий s-1 обнаруживаются на регулярные расхода 0.5 мкл s-1.
    2. Калибровки системы.
      1. Приготовьте смесь из бисера (0,5 мкм и 1 мкм синий флуоресцентный). Разбавьте шарик подвеска из запасов оригинальные решения для достижения равной концентрации.
      2. Непрерывно измерить смеси шарик в диапазоне4 журнала и соответствовать шарик вершины их предустановленных калибровки шаблон, манипулируя потока кювет и лазерная оптика позиции. Сделать окончательные изменения в позиции шарика с параметром Усиление ПМЦ.
    3. Контроль калибровки с биологическим стандарт, как описано в шаге 3.1.3.
    4. Приобретение образца.
      1. Разбавить 400 мкл цветного образца в 1600 мкл PBS, измерить его и контролировать счетчик событий для выполнения теста концентрации.
        Примечание: Показатели скорректированного разрежения могут потребоваться для других источников выборки. Счетчик событий не должен превышать 1200 события s-1 в богатые образцы частиц для предотвращения потери резолюции в вперед точечной (отрицательный пример в дополнительный файл 1-S2). Чистых культур может быть измерена с до 2000 события s-1.
      2. Создайте ячейки ворот в инструмент программного обеспечения в течение этих первых судебных измерений. Этот строб должен содержать окрашенных клеток и исключить шум и бусины.
      3. Разбавьте образца по результатам теста концентрация на максимум 1200 всего событий s-1 и добавить смесь из бисера в образец мониторинга инструмент стабильности и обеспечивать возможность для проверки ретроспективный калибровки. Образцы должны содержать между 1000 и 2500 событий в каждом из двух шарик ворот.
      4. Смешать и измерения образца до 250.000 клеток (общин) или 50 000 ячеек (чистых культур) обнаружены в пределах ячейки ворот.
      5. Промойте инструмент тщательно с би дистиллированной H2O до выключения и включения образцы.

4. ячейку Сортировка

Примечание: Ячейку Сортировка процедура требует дополнительного документа, созданы и выполняется согласно опубликованные протоколы12.

  1. Запуск и калибровки инструмента, как описано в шагах 3.1.1-3.1.3, но использовать 0,5 х рабочего раствора в буфер оболочка.
  2. Установка DD частоты и амплитуды DD найти отламывания капли.
  3. Маунт Прогиб пластины, возложить на них ответственность и решить для 2 - или 4-Way режим сортировки.
  4. Выполнение внутренней раскрывающийся Калибровка задержки с 2 мкм желто зеленый бисер определить интервал времени, который принимает частицы или клеток для поездки из допроса точки (лазерной хитов клеток) до последней капли, прилагается к потоку.
  5. Сортировать 6 раз 20 бусы на стеклянное скольжение и считать их с помощью микроскопа для проверки Калибровка задержки перетаскивания.
  6. Подготовьте шаблон сортировки ворота.
  7. Использование «одно и одно падение режима: высокая чистота 99%» со скоростью не выше, чем 2500 всего события s-1 для сортировки 500000 клеток в максимум 4 ворот одновременно (режим сортировки 4-Way).
  8. Урожай клетки центрифугированием (20000 x g, 6 ° C, 25 мин) и заморозить гранул при-20 ° C для более поздних изоляции ДНК и последовательности.
    Примечание: Избежать сортировки клеток в ворота с менее чем 5% относительного изобилия, как сортировки время обратно пропорционален относительного изобилия. Отдельные шаги описаны подробно в руководстве сортировщик клеток. Число необходимых клеток сильно зависят от использования соответствующих случаев и протоколы извлечения. Многочисленные методы были применены: ddPCR (1000 ячеек17,,19), 16S рДНК или mcrA ампликон последовательности (500000 клеток6,10,15) и протеомики (до 1.1 x 107 клеток 16,17). Сортировки клеток будет особенно выгодно, когда из-за нижней разнообразия в отсортированном subcommunities в сочетании с подходом метагеномики.
    Предупреждение: Не касайтесь пластины дефлектора во время сортировки процедуры из-за высоких напряжений.

5. анализ данных

Примечание: Измерение гранулярных дает «проточной цитометрии стандарт» .fcs файлы данных с структурой обычно форма данных. Однако различные цитометр производители используют немного адаптированных версий и старых инструментов может предшествовали 2010 Введение последних FCS стандартной 3.1. Это может привести к точка сюжет, масштаб проблемы, препятствующие прямое сравнение данных, полученных с различными инструментами. Однако отдельные точки данных всегда хранятся в строках матрицы, с соответствующими разброс и значения интенсивности флуоресценции в разных столбцах. Для описания микробной subcommunities трубопроводов анализа представленных микрофлора использовать отличительные ячейки размер и содержание ДНК. Эти параметры связаны с FSC и DAPI интенсивности флуоресценции канала (ячейка сортировщик: FL-4, анализатор: FL-1) и результат в кластерах subcommunity когда визуализирована в двумерных FSC против DAPI флуоресценции участков. Эти участки точка позволяют интерпретации и анализа потока данных цитометрии и обычно логарифмически масштабированы. Они могут быть отображены из .fcs файлов с помощью несвободных цитометр программного обеспечения или сторонних решений и являются основой для автоматизированной (гранулярных гистограммы изображения сравнения, ШИКАРНЫЕ) и полуавтоматические (гранулярных штриховое кодирование, CyBar) анализ сообщества.

  1. Сравнение изображений гранулярных гистограммы
    Примечание: Код, подробная документация и руководство для этого пакета доступны на http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Они были также опубликованы20.
    1. Установить и загрузить пакет R, установить рабочий каталог, содержащий файлы .fcs и настроить список файлов, выполнив:
      > источник («https://bioconductor.org/biocLite.R»)
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Установить рабочий каталог путь где находятся файлы FCS
      > # Введите путь в кавычки
      > setwd("")
      > # Получить список имен файлов ФТС файлы, расположенные в рабочем каталоге
      > файлы <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Получить список имен файлов FCS, включенных в пакет
      > файлы <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + Полная = TRUE, шаблон = «*.fcs»)
      > # Прочитать первый FCS файл как flowFrame
      > рамка < - чтения. FCS(files[1],ALTER.names=true,Transformation=false)
      > # Получить список названий параметров/канал
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. Создайте образы для гранулярных необработанных данных, выполняя функцию пакет «fcs_to_img»:
      > # Создать гистограмму изображения с использованием параметров по умолчанию
      > fcs_to_img(files)
    3. Определите подмножество гистограммы изображений, выполнив функцию пакет «img_sub»:
      > # Создать гистограмму изображения подмножества с использованием параметров по умолчанию
      > img_sub (файлов, ch1 = "ФС. Log",CH2="FL.4.log»)
    4. Рассчитайте значения параллелизма и XOR для проведения анализа изображений, выполнив функцию пакет «calculate_overlaps_xor»:
      > # Сохранить имена всех подмножество изображений в виде списка
      > подмножеств <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Вычислить параллелизма и XOR изображения и записи значений в двух новых файлов
      > результаты <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. Создание не метрики, что многомерные масштабирования (НМПД) участков для анализа похожести, выполняя функцию пакет «plot_nmds»:
      > # Показать участок НМПД образцов
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Гранулярных штриховое кодирование
    Примечание: Код, подробная документация и руководство для этого пакета доступны на http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Они были также опубликованы11,12.
    1. Разработка мастер ворота шаблон для использования на всех образцах.
      1. Загрузите файлы .fcs в анализ программного обеспечения, используя функцию перетаскивания.
      2. Дважды щелкните измерение и выбрать параметры осей x и y из соответствующих раскрывающихся списков открыть FSC против DAPI флуоресценции сюжет.
      3. Используйте инструмент для рисования многоугольников воспроизвести ворота клеток, ранее использовался для контролировать количество анализируемых клеток в шагах 3.1.4.5 и 3.2.4.4 и назовите его соответственно. Перетащите запись ворота ячейки в списке выборки на все образцы группы объединить его.
      4. Дважды щелкните ячейку ворота и исправить назначения оси для визуализации ячейки ворота события.
      5. Определить subcommunities распространена в образце набора с помощью инструмента эллиптической ворота после опубликованные рекомендации12 и использовать сканирование ГКС или другой третий параметр21 для обеспечения целостности ворота шаблона. Бассейн, контролировать и корректировать распределение subcommunity на другие образцы.
    2. Экспорт относительной subcommunity распространённость в txt-файл для использования в сценарии R.
      1. Откройте редактор таблиц на вкладке Правка.
      2. Добавить столбцы для каждого subcommunity, который был определен на шаге 5.2.1.5 и установить вывода статистики в «частота родителя» и назовите их.
      3. Создайте таблицу в «редакторе таблиц» после выбора сохранения формата и назначения.
        Примечание: Программное обеспечение для анализа непосредственно обеспечивает относительную subcommunity обилия. Они также могут быть получены через Отдел Счетчик событий в отдельных subcommunity ворота, счетчик событий в ворота ячейки. Значения должны быть сохранены в матрице с разделителями табуляции в файле .txt, который не может содержать любые поля н.а. и нуждается в некоторых дополнительных требований для чтения кода R (см. руководство и FAQ для конкретных инструкций).
    3. Установить и загрузить пакет R и загрузить данные, выполнив:
      > источник («https://bioconductor.org/biocLite.R»)
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Введите путь в кавычки
      > setwd("")
      > # Загрузки набора данных
      > data(Cell_number_sample)
      > # Показать данные
      > Cell_number_sample [, -1]
    4. Нормализация относительного обилия, выполняя функцию пакета «нормализовать»:
      # Нормализовать данные, печать 2 цифры
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. Создание штрих-кода нормированного и boxplot оригинального относительного обилия, выполняя функцию пакет «cybar_plot»:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Печать с параметрами по умолчанию
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. Создайте НМПД сюжет оригинальной относительного обилия.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # НМПД участок чел нормализованных чисел
      > nmds(Normalized_mean)
    7. Создайте корреляционный анализ нормализованного относительного обилия и другие параметры, выполнив функцию пакета «корреляции»:
      > # Загрузки набора данных
      > data(Corr_data_sample)
      > # Показывать значения корреляции
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Запуск корреляционный анализ
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Примечание: Шик и CyBar зависят от относительного обилия. Однако проточной цитометрии может также определить абсолютные цифры, которые могут представлять большой интерес для биотехнологии. Чтобы определить абсолютные номер, количество ячеек в ворота интерес делится объема анализируемого образца. Объем анализируемого образца может определяться путем добавления бисера подвеска с известной концентрацией в образце (формула в дополнительный файл 1-S7). Анализатор Топ скамейке дополнительно оснащены верно объемного подсчета особенность, которая непосредственно измеряет объем в метро образцов во время измерения. Рекомендуется использовать SYBR зеленый я пятнать протокол для подсчета клеток.

Representative Results

Следующие представитель результаты подчеркивают необходимость реплицирует и олицетворяют методы визуализации и анализа различных данных на каждом из трех наборов образцов. Они показывают результаты возможных данных оценки трубопроводов для ответа на вопросы стандартные исследования о наборе соответствующих. Однако представленные методы не являются исключительными для выборки, который они представлены с. Необработанные данные потока цитометрии было сделано публично доступна с FlowRepository ID FR-FCM-ZY46. Ранее загруженные данные ASC доступен под ID FR-FCM-ZYD7.

Биологических и технических реплицирует были приняты, подготовлены и проанализированы по данным опубликованных протоколов11. Биологическая реплицирует от PC и ASC были взяты из трех параллельных колбы. Биологических реплицирует до н.э. были взяты три последующих выборок в одном месте на пилотных установках. Три аликвоты одного образца были исправлены, витражи и проанализированы для обеспечения технической воспроизводимости. Воспроизводимость методы проводилась согласно ранее опубликованных процедур11. Шаблон ворота для всех образцов один образец набора (дополнительный файл 1-S6) использовался для вычисления стандартного отклонения (%) за ворота.

Для PC максимальное стандартное отклонение относительное изобилие был 3,44%, в то время как средняя стандартное отклонение было 2,13% (рис. 1). Для ASC и до н.э. Максимальная стандартных отклонений относительного обилия были 1,27% и 0,88%, в то время как средние стандартные отклонения были 2,13% и 0,21% (дополнительный файл 1-S8).

Стандартная процедура, при расследовании чисто штамм культуры, является подготовка кривая роста для анализа участка запаздывания, поколение раз и плотность клеток при определенных условиях. Мы объединили эту процедуру с рабочим процессом анализа гранулярных потока для достижения более глубокого понимания системы (рис. 2). FSC против DAPI флуоресценции участки раскрыть клеточного цикла государства культуры в различных точках пакетного культуры. Главные ворота шаблон (дополнительный файл 1-S6) была создана для количественной оценки доли клеток с одним (c1n), две (c2n) и несколько хромосом (cXn, рис. 2B). Преобладает доля привитых клеток была только одна хромосома (93,7% 0 ч). Это кардинально изменилась во время экспоненциального роста, где почти все ячейки содержит более чем один (99,6%, 4 ч) и свыше половины населения (53,1%) даже содержится более двух хромосом. Это иллюстрирует P. putidas возможность реплицировать его хромосомы быстрее, чем его время генерации.

Анализ потока гранулярных оказался очень полезным для мониторинга эволюции микробных сообществ. Он может следовать сообщество Динамика гораздо ближе, чем больше ресурсов интенсивного молекулярные методы5,10. Мы подчеркнули эти динамики в кино и получил обзор сообщества смены ила со временем. Каждый одной второй кадр показывает FSC против DAPI флуоресценции участок точку выборки (дополнительный файл 2). Очень четкая сдвиг между 0 и день 4 следуют созданию основных сообщества после 7 день. Дополнительные subcommunities подошел на 21 день. Мы создали шаблон Мастер ворота (дополнительный файл 1-S6), включены оценки динамики микробов на subcommunity уровне. Доминирующей subcommunities на различных этапах эксперимента были четко определены, используя средство CyBar (рис. 3). Сочетая его с распределением частот распространённость относительной subcommunity помог выбрать ворота, которые являются интересным (значительные изменения в изобилии, вызвали в точке ключевого времени) и жизнеспособной (более 5% относительного изобилия) для сортировки и далее анализ22.

Промышленных масштабах биореактор приложения могут столкнуться потенциальные пространственных неоднородностей вследствие ограничения агитации. Они также часто подвергаются изменение эксплуатационных параметров, как вносимых в качестве не синтетических субстратов. До н.э. представляет такой системы и выборку из различных населенных пунктов в реакторе потока динамически ведомый вилки. FSC против DAPI флуоресценции участков (рис. 4) точек образцовый пример показать только немного пространственного, но произносится временной гетерогенности. До н.э. Далее было расследовано, используя оба, быстро автоматизированная шик и более углубленного главные ворота шаблон на основе CyBar подхода.

Ее автоматизированной, быстрый и беспристрастной характер, делает шик особенно интересным для занятия контроля биопроцессов в промышленных условиях. Она сравнивает данные сырье .fcs всех доступных образцов. Два из этих сравнений отображаются на рисунке 5. Результирующие значения несходство подтверждают предыдущие замечания, касающиеся пространственной и временной гетерогенности. НМПД участки создается форма ШИКАРНЫЙ инструменты несходство матрицы (рис. 6) далее обосновывает этот результат и визуализирует его соответствующим образом.

Кроме того мы рассчитали относительного обилия 23 subcommunities. до н.э., с помощью шаблона главные ворота (дополнительный файл 1-S6). Чтобы понять функциональные отношения в микробных был проведен анализ корреляции 48 образцов от годичного периода. Это может помочь определить ворота интерес для дальнейшего изучения (4 сортировки клеток). Сильные позитивные или негативные корреляции с абиотических параметров как продукт, который титры может помочь понять и оптимизировать экосистем и биотехнологических процессов. Скорость органических загрузки включены в этой корреляции (рис. 7) служит примером таких абиотических параметров. G5, G4 и G10 exhibit сильные положительные корреляции и возможно может содержать ферментативным видов, в то время как отрицательная корреляция в G8 может намек к метаногенных архей.

Figure 1
Рисунок 1: воспроизводимость анализа гранулярных чистой культуры. FSC vs. DAPI флуоресценции участки с бисером управления (A, B) и бар участки 3 subcommunity распространённость [%] погрешностей, представляющие одно стандартное отклонение ± (C, D). Относительного обилия были определены с ворот шаблон, показанный в дополнительный файл 1-S6. Три биологических реплицирует, A, B и C были взяты из кривой роста на 4 ч и три технических реплицирует P1, P2, P3 были подготовлены из образца A и измеряется трижды, соответственно: M1, M2, M3 и даются с их соответствующих стандартных отклонений. 50,000 события были записаны в ячейки ворот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: анализ клеточного цикла чистой культуры, во время роста кривой эксперимент более 12 ч (A). FSC vs. DAPI флуоресценции сюжеты Би почасовой выборок, которые демонстрируют изменения содержимого ДНК в ходе фазы экспоненциального роста. Эта серия измерений не включают бусины (см. дополнительный файл 1-S3). (B). кривой роста на основе плотность оптических с погрешностей, представляющих одно стандартное отклонение ± и относительного обилия в subcommunities с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: эволюция структуры сообщества ила более 24 дней. (A) flowCyBar с наложением частоты дистрибутивов визуализирована в boxplots для индивидуальных ворот, которые устраиваются по сходству тенденций, соответствующий цветовой ключ (B) и анализ похожести в участок Вит НМПД R < 0,001 () C). Основные участки показаны в фильме последовательности в дополнительный файл 2. Относительного обилия были определены с помощью шаблона ворота в дополнительный файл 1 - S6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: пространственной и временной гетерогенности структуры микробных в промышленном масштабе подключить поток биогазового реактора. (A) сравнение структуры микробных четырех проб порты I-IV на день 223. (B) сравнение вариации структуры зависит от сообщества время от дня 0 день 384 в порту II. Шум отрезан с опозданием для лучшей визуализации. 250000 события были измерены в ячейке ворота (дополнительный файл 1-S6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: сравнение гранулярных гистограммы изображений — шик. Принцип алгоритма ШИКАРНЫЙ проявляется путем сравнения двух выборок, представляющих пространственной и временной гетерогенности, соответственно. (i) ШИКАРНЫЕ изображения создаются из .fcs файлов после выбора два параметра для отображения (FSC против DAPI флуоресценции). Оттенки серого (0-255) коды Счетчик событий в один пиксел. (ii) шик подмножеств создаются после указания области, содержащие клетки (здесь: 200 < < 4000, 200 x < < 2200 y). (iii) XOR сочетание изображение создается путем сравнения пикселей между подмножествами. Никакой разницы равен 0 и отображается как черный. Максимальная разница равна 200 и отображается как белый. Соответствующее значение XOR рассчитывается путем добавления серой шкалы значения всех пикселов в изображении XOR. (iv) накладываемое изображение комбинации создается путем добавления значения серого точек подмножеств. Соответствующее значение оверлей вычисляется путем подсчета пикселей накладываемого изображения, которые не равны нулю и поэтому содержат информацию. (v) несходство значения рассчитываются путем деления значения XOR и оверлея. Они являются основой для НМПД участок на рисунке 6. И различие значения и НМПД сюжет шоу незначительным пространственных- и выраженным височной сообщества неоднородности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: шик на основе подобия анализ образцов сообщества биогаза. 0-день образца был исключен из этого участка, благодаря своей структуре чрезвычайно различные сообщества, искажая анализ (дополнительный файл 1-S11). Участок НМПД подтверждает предположение о низкой пространственной- и выше временной гетерогенности с использованием ШИКАРНЫЙ инструмент и объяснил на рисунке 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: корреляционный анализ на сообщество биогаза. Матрица была рассчитана с использованием коэффициент Спирмена в порядке ранжирования и на основе относительного обилия 23 subcommunities, которые были определены шаблоном главные ворота в дополнительный файл 1-S6. Они были связаны с скорость органических загрузки (OLR) 48 образцов от годичного периода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: анализ похожести планктонных (P) и шлама на основе общин (S) в сточных водах. Образцы были взяты из первичных отстойников (PCL), активированный осадка бассейна (AS) и танк (DT) метантенка полномасштабной стоков (точка участков в дополнительный файл 1-S10). Относительного обилия были определены с помощью ворота шаблон, показанный в дополнительный файл 1-S6. Эти subcommunity обилия также были проанализированы с помощью инструмента flowCyBar для создания CyBar (дополнительный файл 1-S10) и НМПД участок (R < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: стабильность фиксации чистой культуры. Образцы из принятых в 0 ч эксперимента кривая роста были сохранены более 28 дней при температуре-80 ° C после фиксации в 15% глицерина. FSC vs. DAPI флуоресценции участков с элементом управления, проявленную бусины. Серии измерений не включают бусины (дополнительный файл 1-S3). 50,000 события были записаны в ячейки ворота (дополнительный файл 1-S6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Успешный анализ микробных популяций и сообществ требует хорошо налаженный цитофлуориметрами, подходящий выбор параметров клеток и надежный рабочий процесс из выборки и фиксации к измерения и оценки данных. Параметры выбранной ячейки должны консорт с длинами волн доступных возбуждения. Мы используем и рекомендуем DAPI, который очень чувствителен при низких концентрациях; но надо быть в восторге от УФ лазер, который обычно не входят в стандартные цитометр структурах. Другие красители, таких как SYBR зеленый I, также пятно целых народов или общин, но обычно доставить уступает резолюций. Не рекомендуется использовать процедуры рыбы или жизнеспособности тесты в микробных сообществ. Эти подходы не поддаются количественной оценки, проверки и контроля, потому что их воздействие на отдельных видов в общине является неопределенным. Их нельзя проверить надежно, поскольку значительная доля типичный общин по-прежнему не доступны как чистой культуры.

Важнейшие шаги в протоколе включают процедуры отбора проб и фиксации, а также сортировки клеток. Выборка может быть осложнено тенденция некоторых чистых культур и микробных сообществ агрегировать для хлопьев или придерживаться частицы образец матрицы. Важно, чтобы рассеять эти агрегаты и отдельных клеток в образце до введения их анализ потока гранулярных гарантировать надежные результаты. Представленные подготовка протоколов были оптимизированы для включения анализа одной ячейки. Заключительный 50 мкм фильтрация выполняется перед измерением для удаления любых остаточных агрегатов и предотвращения 70 мкм сопла сортировщик клеток и поток кювету анализатора от засорения. Клетки хлопьев из сточных вод, особенно обильные, надежные и жизненно важное значение для функционирования системы. Мы исследовали планктонных и шлама на основе микробных сообществ в различных емкостях полномасштабной сточных вод, для проверки установленного протокола. Шлам, формируя клеток, которые агрегаты были явно рассеялись и состав сообщества оставалась стабильной. Кроме того планктонные и шлама общин выставлены замечательные сходства между ними во всех трех отобранных цистерн (рис. 8, дополнительный файл 1-S10). Эти результаты были проверены путем сравнительного 16S рДНК ампликон sequencing свежие-, формальдегид лечение-, формальдегида и этанола зацикленная-и отсортированный образца10. Тем не менее чрезвычайно сложные экологические пробы, как сильный биоплёнки или бактерий, растущих в тесно связанных цепочек, может быть невозможным для рассеивания. Образцы почвы может быть особенно проблематичным, как повсеместно частицы появляются в гистограмме и могут скрывать клетки, огромное изобилие. В таких случаях необходимо применять методы традиционной последовательности.

Стабильность фиксации каждого нового образца набора должны быть протестированы перед проектирование эксперимент, чтобы гарантировать результат действия. Хорошая фиксация стабильность также позволяет пуле окрашивание и измерения нескольких моментов времени выборки на один день. Кроме того, он позволяет репликации измерения и сортировки ретроспективный клеток решающее время точек после заключения и окончательной оценки этого эксперимента. Стабильность фиксации чистой культуры было проверено более 28 дней (рис. 9). Для занятия экспериментов, включая образец транспорт стабильности фиксации должны быть протестированы в течение более длительных периодов (в данном случае, 60 дней для сообщества ила, 195 дней для биогаза сообщества, дополнительный файл 1-S9).

Окрашивание обычно не проблематично, но необходимо контролировать с биологической стандарт, позволяющий применение bioinformatic инструменты оценки. Мы использовали макет штамм E. coli BL21 (DE3), который был зацикленная согласно протоколу ASC и складированы для использования в каждом пакете окрашивание.

Отдельно от DAPI, SYBR Грин я успешно применяется для устранения микробных сообществ за несколько лет14,23,24,25,26. Зеленый SYBR, я могу решить общин в высокой и низкой нуклеиновой кислоты подмножеств (СКС и МШУ) с использованием живой клетки в онлайн modus. DAPI, более конкретен в привязке к ДНК и позволяет различение более 50 subcommunities в одном тестовом наборе однако требует фиксации шаг до окрашивания.

Сортировки клеток является отличительной чертой этого подхода и могут применяться при определенных subcommunities дальнейшего интереса. Необходимо подчеркнуть, что ни PFA-(выполняется для всего 30 мин), ни этанола лечения или DAPI пятнать10 имели негативное влияние на последующие 16S ампликон последовательности. Потенциал влияет фиксации и пятнать процедуры на subcommunity metagenome анализы еще должна быть проверена.

Много информации о функции сообщества и тенденции динамики могут быть получены независимо от подхода, сортировки, когда с участием Биоинформатика инструменты, которые разрешить функции сообщества на виртуальном уровне по ячейкам и подключить эти функции с абиотической параметры.

Недавно ряд новых инструментов биоинформатики оценки, все полезно для обеих SYBR зеленый я и DAPI подходы, были разработаны для устранения гранулярных сообщества шаблонов. Эти FlowFP27, пакеты используется в этом исследовании (flowCHIC20, flowCyBar28), деконволюции модель создана с пресной водой общины29 и инструмент, используемый для выявления различий штаммов согласно их физиологических характеристики30. Кроме того разнообразие гранулярных могут быть определены25 и даже стабильность свойств микробных сообществ может теперь следовать с онлайн инструмент10.

Таким образом анализ потоков гранулярных имеют огромное преимущество, когда речь заходит о быстрой оценки микробных сообществ и возможных абиотических параметров корреляции. Однако по-прежнему существуют ограничения метода. Он не может применяться действительно онлайн с flowCyBar инструмент, благодаря процедуре параметр опытных основе ворота. Кроме того разработка по индивидуальному заказу, простой в использовании потока цитофлуориметрами значительно ускорит распространение потока гранулярных микрофлора анализ подхода. Первые шаги в этом направлении, предпринятых28.

Будущего применения микробной проточной цитометрии можно предусмотреть в микробной экологии, как позволяет мониторинга высокой частоты в диапазоне от бактериальных поколения раз и было показано, что экологической парадигмы применяются к данным гранулярных5 ,10. Этот метод очень полезен для рутинной показы природных сред, таких как элементы управления обязательного питьевой воды в Швейцарии31. Она также может быть ценным инструментом для медицинских приложений, таких как человека15 или животных32 микрофлора скрининга. Кроме того последние события в области биоинформатики может позволить микробной проточной цитометрии быть составной датчик в процесс управления управляемых микробных систем. Микробных цитометрии также предоставляет инструмент скрининга для сортировки клеток, который позволяет более высокое разрешение геномных исследований конкретного сообщества подмножеств.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.
 

Acknowledgments

Мы с благодарностью признаем Майкл Ян и Yuting Guo для обеспечения процедуры и наборы данных чистой культуры и ила сообщества, соответственно. Мы далее Спасибо Katrin Mörters для анализа образцов сообщества биогаза. Эта работа финансировалась Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (ФНР, биогаз проекта отпечатков пальцев Nr. 22008313) от имени федерального министерства продовольствия и сельского хозяйства (BMEL), Центральный инновационной программы для МСП (зим) федерального министерства экономики и энергетики (BMWi) (ИНАР-ABOS, 16KN043222), Deutsche Винтер Umwelt (DBU, проект по требованию Produktion фон Phosphatdünger aus Reststoffen фон Brauerei унд Kläranlage 33960/01-32), немецкого федерального министерства для образования и Исследования (BMBF) (ФЗК 03XP0041G), и программа ориентированный финансирование Гельмгольц-Объединение (ФОМ III R31 тема 3 Биоэнергия).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 137 проточной цитометрии одноячеистый аналитика динамике микробных микрофлора образца подготовка проточной цитометрии Биопроцесс контроля динамики клеток анализ данных гранулярных flowCHIC flowCyBar
Характеризующих микрофлора динамика – проточной цитометрии на основе рабочих процессов из чистых культур для природных сообществ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F.,… More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter