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निस्र्पक Microbiome गतिशीलता – शुद्ध संस्कृतियों से प्राकृतिक समुदायों के लिए प्रवाह Cytometry आधारित कार्यप्रवाह

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

प्रवाह cytometric विश्लेषण शुद्ध संस्कृतियों की जांच और माइक्रोबियल समुदाय गतिशीलता की निगरानी के लिए मूल्यवान साबित कर दिया है । हम तीन व्यापक कार्यप्रवाह, नमूना से डेटा विश्लेषण करने के लिए, स्पष्ट माध्यम में शुद्ध संस्कृतियों और जटिल समुदायों के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में चुनौतीपूर्ण मैट्रिक्स में क्रमशः प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

शुद्ध संस्कृतियों और माइक्रोबियल समुदाय की गतिशीलता की निगरानी की जांच को समझने और प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों और तकनीकी सूक्ष्मजीवों द्वारा संचालित अनुप्रयोगों को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । अगली पीढ़ी sequencing तरीकों व्यापक रूप से microbiomes को हल करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन वे आम तौर पर संसाधन और गहन समय है और ज्यादातर गुणात्मक जानकारी देने । प्रवाह cytometric microbiome विश्लेषण उन नुकसान से ग्रस्त नहीं है और संबंधित उपसमुदाय बहुतायत और निरपेक्ष सेल संख्या में लाइन प्रदान कर सकते हैं । यह सीधे वंशावली जानकारी डिलीवर नहीं है, यद्यपि यह विश्लेषण गहराई और sequencing approaches का रिज़ॉल्यूशन एन्हांस कर सकते हैं । दोनों अनुसंधान और दिनचर्या सेटिंग्स में चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए तीव्र विपरीत में, प्रवाह cytometry अभी भी व्यापक रूप से microbiome विश्लेषण के लिए नहीं किया जाता है । नमूना तैयारी और डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों पर लापता जानकारी microbiome विश्लेषण चुनौतियों का सामना करना पड़ रहा है कि अक्सर पाठ्यपुस्तक प्रवाह cytometry आवेदन किया जाएगा शोधकर्ताओं के लिए एक प्रवेश बाधा बना सकते हैं । यहां, हम क्रमशः चुनौतीपूर्ण मैट्रिक्स में शुद्ध संस्कृतियों, स्पष्ट मध्यम और जटिल समुदायों में जटिल समुदायों के लिए तीन व्यापक कार्यप्रवाह पेश करते हैं । हम व्यक्तिगत नमूना और निर्धारण प्रक्रियाओं का वर्णन और अनुकूलित दाग प्रोटोकॉल संबंधित नमूना सेट के लिए । हम एक जटिल अनुसंधान केंद्रित और एक आवेदन पीठ शीर्ष डिवाइस केंद्रित के साथ cytometric विश्लेषण विस्तृत, कक्ष छंटाई प्रक्रिया का वर्णन और डेटा विश्लेषण संकुल का सुझाव । हम इसके अलावा महत्वपूर्ण प्रायोगिक नियंत्रण का प्रस्ताव है और संबंधित नमूना सेट करने के लिए प्रस्तुत कार्यप्रवाह लागू होते हैं ।

Introduction

सूक्ष्मजीवों मानव जीना के कई पहलुओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । वे ग्रहों कार्बन, नाइट्रोजन, फास्फोरस और सल्फर1चक्र के मुख्य बायोटिक ड्राइवरों हैं, और2,3 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपशिष्ट जल उपचार के रूप में विभिंन उद्योगों में synthesizing4 के उत्प्रेरक के रूप में कार्य 5 या बायोटेक्नोलॉजी6. वे भी मानव microbiome, जो सीधे मानव स्वास्थ्य और चयापचय7,8को प्रभावित कर रहा है का गठन । इसलिए, संरचना, समारोह और सूक्ष्मजीवों के गतिशील व्यवहार पर जानकारी, उनके तत्काल पर्यावरण के जवाब में, यदि हम पूरी तरह से समझने के लिए और इन प्रणालियों में हेरफेर उद्देश्य आवश्यक है । अगली पीढ़ी sequencing (NGS) microbiome संरचना और9समारोह को हल करने के लिए स्थापित प्रौद्योगिकी है । हालांकि, विश्लेषण और NGS डेटा का मूल्यांकन मात्रात्मक जानकारी नहीं प्राप्त कर सकते हैं, और अभी भी महंगा है, समय लेने वाली और कोई माध्यम से प्रदर्शन गलियारों में साइट पर परिणाम प्रदान करने के लिए तैयार है । कुछ बैक्टीरिया 1 घंटे के नीचे पीढ़ी बार प्रदर्शन और कारण लगातार कुछ वातावरण में समुदाय संरचनाओं बदल10। ऐसी गतिशीलता के बाद, अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग सबसे वैज्ञानिक प्रयोगशालाओं के वित्तीय और कार्यबल क्षमता से अधिक होगा ।

इसके विपरीत, प्रवाह cytometry समुदाय उंगलियों के निशान NGS डेटा के समान प्रदान करते हैं, जबकि एक उच्च समय को बनाए रखने कर सकते हैं, श्रम और लागत कुशलता । यहां, हम वर्तमान प्रवाह cytometric तकनीक एक सेल स्तर पर माइक्रोबियल समुदाय की गतिशीलता लाइन का पालन करने में सक्षम । NGS के विपरीत, प्रवाह cytometry वंशावली संबद्धता या कार्यात्मक जीन पर जानकारी प्रदान नहीं करता है, लेकिन मात्रात्मक सेल संख्या बचाता है । प्रवाह cytometry का उपयोग करना, माइक्रोबियल समुदायों अलग प्रकाश तितर बितर और प्रतिदीप्ति गुण (फॉरवर्ड कैटर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) के साथ उपसमुदायों में हल किया जा सकता है सेल आकार और दानेदार, क्रमशः के संकेत प्रदान करते हैं) । प्रस्तुत दृष्टिकोण मुख्य रूप से सेल आकार और डीएनए राशि संबंधित जानकारी है कि कुछ सेल प्रकार और शारीरिक (वृद्धि) राज्यों से जुड़े होते है का इस्तेमाल करता है । डीएनए सामग्री यूवी उत्तेजित 4 ' का उपयोग कर quantified है, 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) डाई, जो डीएनए के एक टी अमीर क्षेत्रों के लिए बांध और भी गुणसूत्र स्तर भिंन हल कर सकते हैं । DAPI प्रतिदीप्ति और FSC से अधिक ५० उपसमुदायों के संयोजन से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और समय11के साथ बहुतायत बदलने के लिए निगरानी की । उपसमुदाय बहुतायत रूपों ऐसे पीएच और उत्पाद titers12के रूप में सूक्ष्म पर्यावरणीय परिवेश, में परिवर्तन के साथ संबद्ध किया जा सकता है, वैश्विक मापदंडों के साथ, इस तरह के मौसम के रूप में13,14, या आंत या लार के मामले में कुछ चिकित्सा उपचार के साथ microbiomes15. इन सहसंबंधों प्रमुख उपसमुदायों के पूरे समुदाय के चयापचय नेटवर्क में विशेष रूप से कार्यों के लिए जिंमेदार प्रकट करते हैं । प्रमुख उपसमुदायों तो विशेष रूप से पदोंनत किया जा सकता है या आसपास के सूक्ष्म वातावरण, या अनुवर्ती अनुक्रमण15 या proteomic जांच16के लिए क्रमबद्ध फेरबदल द्वारा दबा दिया ।

हालांकि, माइक्रोबियल समुदाय प्रवाह cytometry अभी तक व्यापक रूप से माइक्रोबियल आबादी या समुदायों ठीक से हल करने में सक्षम प्रवाह cytometric उपकरणों की एक जगह कम संख्या के कारण स्थापित नहीं है । इसके अलावा, अनुभव की कमी, सामुदायिक विश्लेषण पाइपलाइनों और प्रभावी डेटा मूल्यांकन microbiome विश्लेषण चुनौतियों का सामना कर रहे शोधकर्ताओं के लिए एक प्रवेश बाधा पैदा कर सकता है । हमने इन मुद्दों से निपटने के लिए व्यापक कार्यप्रवाह स्थापित किया है । उनके सामांय प्रयोज्यता वर्णन करने के लिए, हम उंहें तीन अनुकरणीय नमूना सेट पर पेश करेंगे (अनुपूरक फाइल 1-s), अर्थात् मैं) एक शुद्ध संस्कृति (पीसी) के लिए निर्धारित स्पष्ट माध्यम में वृद्धि हुई अनुप्रयोगों (Pseudomonas putida टी २४४० पर ग्लूकोज), ii) स्पष्ट माध्यम में एक जटिल प्रयोगशाला समुदाय (सक्रिय कीचड़ समुदाय (ए एस सी) सिंथेटिक अपशिष्ट जल में) और iii) एक घने मैट्रिक्स में प्राकृतिक वातावरण से एक जटिल समुदाय (ई. पू.) मक्का सिलेज में बायोगैस समुदाय).

कई कारकों इन नमूना सेट में से प्रत्येक के लिए प्रोटोकॉल विकल्प को प्रभावित करते हैं । गहरी ठंड forgoes विषाक्त रसायनों के उपयोग के लिए, लेकिन ज्यादातर सदमे ठंढ के लिए तरल नाइट्रोजन के उपयोग के कारण प्रयोगशाला वातावरण तक ही सीमित है । formaldehyde स्थिरीकरण और बाद में इथेनॉल निर्धारण aliquot तैयारी के लिए आवश्यकता के बिना थोक नमूना की अनुमति देता है और लंबे समय से अधिक स्थिर होना सिद्ध किया है । हालांकि, इस तरह के मानव लार15 के रूप में प्रोटीन से भरपूर नमूने समस्याग्रस्त किया जा सकता है, क्योंकि प्रोटीन flocs, formaldehyde द्वारा denaturized, शोर अनुपात के लिए प्रतिकूल संकेत पैदा कर सकता है । नमूना सुखाने सबसे अधिक समय लगेगा (कुल में लगभग 1 ज) इस तुलना में प्रक्रियाओं की, लेकिन विषाक्त रसायनों के बिना साइट पर प्रदर्शन किया जा सकता है । यह ट्यूब, जो आसानी से ठंडा या अतिरिक्त जोखिम सावधानियों के बिना भेज दिया जा सकता है में स्थिर छर्रों पैदावार । इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक निर्धारण तरीकों के बहुत से11प्रस्तावित किया गया है । हम दृढ़ता से एक नया नमूना सेट शुरू करने के लिए जब विभिन्न प्रोटोकॉल के संकल्प और निर्धारण स्थिरता का परीक्षण करने के लिए सलाह.

हम दो अलग प्रवाह cytometers का इस्तेमाल किया सेट का विश्लेषण: i) एक उच्च परिष्कृत और महंगी, अनुसंधान केंद्रित सेल सॉर्टर और द्वितीय) एक आवेदन बेंच शीर्ष विश्लेषक जो अधिक साइट पर आवेदन5के लिए उपयुक्त प्रतीत होता है केंद्रित । बीसी बेंच शीर्ष विश्लेषक के साथ मापा गया था, जबकि पीसी और ए एस सी सेल सॉर्टर के साथ मापा गया था. तीन अनुकरणीय नमूना सेट के विश्लेषण अनुकूलित reproducibility, नमूना स्थिरता और कार्यप्रवाह सुविधा के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । निंन प्रोटोकॉल तीन भिंन सिस्टमों के लिए अनुभागों को निर्दिष्ट करेगा ।

Protocol

1. नमूना और निर्धारण

  1. शुद्ध संस्कृति: डीप फ्रीजिंग15,17
    1. सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर लो, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक (आरटी) और ५,००० x जी और supernatant त्यागें ।
      नोट: नमूना सेल निलंबन अनुपूरक फ़ाइल 1-s में वर्णित है ।
    2. फॉस्फेट बफर खारा की 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend (पंजाब; 6 मिमी ना2HPO4, १.८ मिमी णः2PO4, १४५ मिमी NaCl साथ द्वि-आसुत एच2ओ, पीएच ७.२) साथ ही 15% (वी/वी) ग्लिसरॉल एक cryoprotective एजेंट के रूप में युक्त ।
    3. बर्फ और सदमे फ्रीज पर बाद में भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में-८० ° c पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । नमूनों में कम से एक महीने के लिए स्थिर हैं ।
  2. सक्रिय कीचड़ समुदाय: formaldehyde स्थिरीकरण + इथेनॉल निर्धारण5,10,18
    1. सेल निलंबन के 4 मिलीलीटर ले लो, 15 डिग्री सेल्सियस और ३,२०० एक्स जी में 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
      नोट: नमूना सेल निलंबन अनुपूरक फ़ाइल 1-s में वर्णित है ।
    2. पंजाब में 2% formaldehyde के 4 मिलीलीटर और आरटी में 30 मिनट के लिए मशीन जोड़ें ।
      1. paraformaldehyde से 8% formaldehyde स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए संरक्षण additive मेथनॉल तरल रूप में भेज दिया formaldehyde के लिए जोड़ा से बचने के लिए । ७० डिग्री सेल्सियस पर पंजाब के ५० मिलीलीटर के लिए paraformaldehyde के 4 जी जोड़ें । 10 मीटर NaOH सॉल्यूशन के लगभग १२५ µ l को जोड़ें । हलचल जब तक paraformaldehyde पूरी तरह से भंग कर दिया है और इसे तो शांत हो जाओ आर टी. के साथ ७.० के लिए पीएच मान समायोजित लगभग १०० µ l ३७% एचसीएल । भंडारण के लिए 15 मिलीलीटर aliquots में formaldehyde समाधान फ्रीज । 10 दिन से अधिक समय तक aliquots का उपयोग न करें ।
        चेतावनी: Formaldehyde को नियंत्रित करने की जरूरत है और अपने विषाक्त और mutagenic गुणों के कारण देखभाल के साथ निपटारा । इसे संभालते समय हमेशा दस्ताने पहनें । एक निकास हूड का प्रयोग करें, जबकि paraformaldehyde को भंग करने के लिए विषाक्त धुएं के लिए जोखिम को रोकने के ।
    3. 15 डिग्री सेल्सियस और ३,२०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    4. ७०% इथेनॉल के 4 मिलीलीटर में नमूना resuspend और-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । नमूनों में कम से 2 महीने के लिए स्थिर हैं । नमूना गुण पर निर्भर करता है, 1.2.1 में केंद्रापसारक कदम भी 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए किया जा सकता है समय बचाने के लिए ।
  3. बायोगैस समुदाय: सुखाने
    1. एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में चिपचिपा digestate के २०० µ एल नमूना करने के लिए एक कतरनी १,००० µ l पिपेट टिप का उपयोग करें ।
    2. पंजाब के १,७०० µ एल जोड़ें बफर और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    3. ३५ kHz पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ट्यूबों प्लेस और ८० डब्ल्यू प्रभावी उत्पादन शक्ति 1 मिनट के लिए बड़े सेल समुच्चय को अलग करना और संयंत्र सेल अवशेषों को चिपके हुए कोशिकाओं को विभाजित ।
    4. नमूना अच्छी तरह से मिश्रण, एक ५० µ एल मेष फिल्टर के माध्यम से नमूना फिल्टर और लगभग ४०० µ एल के चार aliquots में छानने का विभाजन
      नोट: इस बिंदु पर aliquots तैयारी दो प्रमुख लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, छोटे संस्करणों आसान कर रहे है और तेजी से पानी यांत्रिक (केंद्रापसारक) और थर्मल (सुखाने), लेकिन आमतौर पर मोटी बायोगैस कीचड़ से छोटी मात्रा के नमूने बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है । दूसरा, अतिरिक्त नमूनों अनुवर्ती सेल छंटाई, बैकअप माप या नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    5. 10 डिग्री सेल्सियस और ४,००० एक्स जी में 10 मिनट के लिए दो बार aliquots केंद्रापसारक और supernatant पूरी तरह से दोनों बार के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में नमूने को यांत्रिक रूप से पानी त्यागें ।
    6. एक गर्म निर्वात में नमूने सूखी ३५ डिग्री सेल्सियस पर ४० मिनट के लिए, के बारे में-९७ केपीए और २,५०० एक्स जी स्थिर छर्रों बनाने के लिए केंद्रापसारक । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों की दुकान ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । छर्रों कम से कम 6 महीने के लिए स्थिर रहे हैं ।

2. धुंधला

नोट: DAPI धुंधला उच्च संकल्प डॉट भूखंड देने साबित कर दिया है और इसलिए विशेष रूप से लाभप्रद जब समुदायों का विश्लेषण है । धुंधला समाधान में DAPI एकाग्रता की जरूरत है एक सेल गेट प्रतिदीप्ति तीव्रता शोर स्तर पर अच्छी तरह से ऊपर की गारंटी के लिए अनुकूलित करने के लिए, लेकिन नीचे मोतियों । इष्टतम साधन संवेदनशीलता और मनका पसंद पर निर्भर करता है, निहित सूक्ष्मजीवों के G/C सामग्री के कारण नमूना सेट के बीच भिन्न हो सकते हैं, और आम तौर पर नए पेश नमूना सेट के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. ०.२४ µ m DAPI और 1 µ m DAPI के बीच परीक्षण सांद्रता प्रस्तुत सेटअप के लिए अनुशंसित है । अंय रंगों के विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक SYBR ग्रीन मैं दाग प्रोटोकॉल के उपयोग की सलाह दी जाती है जब निरपेक्ष कोशिका गिनती सटीकता फिंगरप्रिंटिंग विश्लेषण पर प्राथमिकता है (अनुपूरक फ़ाइल 1-s)6,15। यह कम नमूना हैंडलिंग और केंद्रापसारक कदम शामिल है और दोनों निश्चित और महत्वपूर्ण कोशिकाओं के साथ लागू है । महत्वपूर्ण कोशिकाओं का उपयोग आगे निर्धारण लंघन द्वारा नमूना हैंडलिंग कदम कम कर देता है और इसलिए सेल संचयन के लिए केवल एक ही केंद्रापसारक की आवश्यकता है । यह संभावित कोशिका हानि और फलस्वरूप व्यवस्थित माप त्रुटि को कम करता है । पंजाबियों, permeabilization बफर और धुंधला समाधान सभी निंन चरणों के दौरान उपयोग ०.२ µm सिरिंज फ़िल्टर नमूना में अतिरिक्त कण लोड को कम करने के लिए के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए । हर नमूना पूल के साथ एक जैविक मानक के रूप में ई कोलाई BL21 (DE3) युक्त एक नमूने के दाग की सलाह दी है ।

  1. शुद्ध संस्कृति
    1. नमूनों को हटाना, आरटी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और ५,००० x जी और supernatant त्यागें ।
    2. दोहराया pipetting द्वारा आइस कोल्ड पंजाब में सेल गोली resuspend और ०.०३५ (पथ लंबाईcuvette = ०.५ सेमी) के लिए आयुध डिपो700nm समायोजित करें ।
    3. धुंधला के लिए कोशिकाओं को तैयार करें ।
      1. 5 मिनट के लिए आरटी और ५,००० x जी में समायोजित सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर और supernatant त्यागें ।
      2. ०.३ एम साइट्रिक एसिड और ४.१ mM Tween20 और मिश्रण अच्छी तरह से युक्त permeabilization बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
      3. बर्फ पर 10 मिनट के लिए नमूना मशीन बाद धुंधला के लिए पारगंय कोशिका झिल्ली बनाने के लिए ।
      4. आरटी और ५,००० x जी में 5 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    4. ०.६८ µ मीटर DAPI में ४१७ मिमी ना2HPO4/NaH2पीओ4 बफर (२८९ मिमी ना2HPO4, १२८ mm णः2पीओ4 साथ द्वि-आसुत एच2ओ, पीएच 7) से युक्त समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण और अंधेरे में आर टी में कम से 15 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: सटीक आयुध डिपो समायोजन तुलनीय माप की गारंटी के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि DAPI प्रतिदीप्ति कोशिका घनत्व के साथ भिन्न होगा यदि DAPI एकाग्रता निरंतर रखा जाता है । supernatant ध्यान से एक आम तौर पर नाजुक गोली के कारण कोशिका हानि को रोकने के लिए हटाया जाना चाहिए ।
      सावधानी: संभाल और अपने mutagenic गुणों के कारण देखभाल के साथ DAPI निपटान ।
  2. सक्रिय कीचड़ समुदाय
    1. फिक्स्ड नमूना अच्छी तरह से मिश्रण और एक ग्लास ट्यूब में ०.६ मिलीलीटर हस्तांतरण । RT पर 10 मिनट के लिए पंजाब और sonicate के १.४ मिलीलीटर जोड़ें चरण 1.3.3 में वर्णित के रूप में । 4 ° c और ३,२०० x g पर 10 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और supernatant निकालें । पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण । 5 मिनट के लिए Sonicate ।
    2. ०.०३५ के लिए आयुध डिपो700nm समायोजित करें (पथ लंबाईcuvette = ०.५ cm) पंजाबियों के साथ ।
    3. धुंधला के लिए कोशिकाओं को तैयार करें ।
      1. 4 ° c और ३,२०० x g पर 10 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और supernatant निकालें ।
      2. ०.११ एम साइट्रिक एसिड और ४.१ mM Tween20 और मिश्रण अच्छी तरह से युक्त permeabilization बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
      3. आरटी में 20 मिनट के लिए मशीन बाद धुंधला के लिए पारगंय कोशिका झिल्ली बनाने के लिए ।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस और ३,२०० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए फिर से नमूना केंद्रापसारक और supernatant को हटा दें ।
    4. ०.६८ µ एम DAPI और ४१७ mM Na2HPO4/NaH2पीओ4 बफर युक्त समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण और अंधेरे में आर टी पर कम से ६० मिनट की मशीन ।
      नोट: कांच ट्यूबों के उपयोग की सलाह दी जाती है, के रूप में कुछ सूक्ष्मजीवों के लिए प्लास्टिक ट्यूब दीवारों का पालन करते है और इस प्रक्रिया के दौरान खो सकता है । रात भर की मशीनिंग भी संभव है और आमतौर पर प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को सरल ।
      चेतावनी: DAPI को संभाला और अपनी mutagenic गुणों के कारण देखभाल के साथ निपटाने की जरूरत है ।
  3. बायोगैस समुदाय
    1. पंजाब में सूखे सेल गोली निलंबित ।
      1. पंजाब के ८०० µ एल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण और गोली 15 मिनट के लिए भिगो दें ।
      2. एक १,००० µ एल पिपेट के साथ तरल चरण महाप्राण और पिपेट टिप के साथ ट्यूब दीवार के बेलनाकार अनुभाग के लिए लथपथ गोली ले जाएं । यह वहां रहना चाहिए ।
      3. एक परिपत्र गति में पिपेट टिप चाल ट्यूब दीवारों के साथ गोली स्क्वैश ।
      4. ट्यूब दीवार के साथ पिपेट टिप से तरल चरण वितरण द्वारा ट्यूब दीवारों से परिणामी घोल धो लो ।
      5. aspirating द्वारा निलंबन और इसे पिपेट में तीन बार निलंबित कर आंदोलन ।
    2. दो बार पंजाबियों के साथ नमूना धो लें ।
      1. 10 ° c और ४,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
      2. पंजाब के १,५०० µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं ।
      3. दो कदम ऊपर एक बार दोहराएं ।
    3. कदम 1.3.3 में वर्णित के रूप में 1 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ट्यूबों प्लेस और, बाद में, एक व्यक्ति ग्लास ट्यूब में एक ५० µ एल मेष फिल्टर के माध्यम से प्रत्येक नमूने फिल्टर ।
    4. पंजाब के साथ आयुध डिपो700nm ०.०३५ (पथ लंबाईcuvette = ०.५ सेमी) के लिए नमूने के 2 मिलीलीटर पतला ।
    5. ऊपर चरण 2.2.3 में बताया गया के रूप में धुंधला के लिए कोशिकाओं को तैयार करें ।
    6. ०.२४ µ एम DAPI और ४१७ mM Na2HPO4/NaH2पीओ4 बफर युक्त समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण और अंधेरे में आरटी पर रात में गर्मी ।
      चेतावनी: DAPI को संभाला और अपनी mutagenic गुणों के कारण देखभाल के साथ निपटाने की जरूरत है ।

3. मापन

नोट: अनुकरणीय नमूना सेट दो अलग प्रवाह cytometers के साथ विश्लेषण किया गया । पीसी और ए एस सी एक अधिक जटिल, उच्च समायोज्य और आसानी से अनुकूलन, अनुसंधान केंद्रित सेल सॉर्टर के साथ विश्लेषण किया गया । पीसी विश्लेषण के लिए, यह डिवाइस एक लेजर सेट अप के रूप में पिछले प्रकाशन16में वर्णित के साथ सुसज्जित किया गया था, संक्षेप में एक नीला (४८८ एनएम, ४०० मेगावाट) और एक पराबैंगनी (334-364 एनएम, १०० मेगावाट) आर्गन आयन लेजर । ए एस सी विश्लेषण के लिए, नए नीले (४८८ एनएम, ४०० मेगावाट) और पराबैंगनी (३५५ एनएम, १५० मेगावाट) अर्धचालक पराबैंगनीकिरण स्थापित किया गया । दोनों ही मामलों में, नीले लेजर FSC (bandpass फ़िल्टर ४८८ एनएम ± 5 एनएम, तटस्थ घनत्व फिल्टर १.९) और एसएससी (bandpass फ़िल्टर ४८८ एनएम ± 5 एनएम, तटस्थ घनत्व फ़िल्टर १.९, ट्रिगर) प्रेरित किया । इन ऑप्टिकल विशेषताओं सेल आकार और कोशिका घनत्व, क्रमशः से संबंधित हैं । यूवी पराबैंगनीकिरण सेलुलर डीएनए सामग्री के ठहराव के लिए DAPI प्रतिदीप्ति (bandpass फ़िल्टर ४५० एनएम ± ३२.५ एनएम) उत्साहित । द्रव प्रणाली ५६ psi (३.८६ बार) में अधिकतम ०.३ साई और एक ७० माइक्रोन नोक पर नमूना दबाव के साथ चला गया था । मापन रिज़ॉल्यूशन को बेहतर बनाने के लिए सभी पैरामीटर पीक क्षेत्रों के बजाय पीक ऊंचाई के रूप में रिकॉर्ड किए गए थे । बायोगैस समुदाय के दीर्घकालिक निगरानी कम जटिल, प्रवाह cuvette आधारित, बेंच शीर्ष विश्लेषक के साथ आयोजित किया गया । एक पराबैंगनी अर्धचालक लेजर (३५५ एनएम, ५० मेगावाट) FSC (bandpass फ़िल्टर ३५५ एनएम ± 5 एनएम) और एसएससी (bandpass फ़िल्टर ३५५ एनएम ± 5 एनएम, ट्रिगर) संकेतों और उत्तेजित DAPI प्रतिदीप्ति (bandpass फ़िल्टर ४५५ एनएम सी) प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । दोनों उपकरणों के म्यान बफर के लिए इस्तेमाल किया पानी द्वि-आसुत और ०.१ µm फ़िल्टर किया गया था । नमूना कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया पंजाबियों के रूप में अधिक से अधिक माप में कण शोर को कम करने के लिए ०.२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए.

  1. शुद्ध संस्कृति और सक्रिय कीचड़ समुदाय
    1. साधन, लेजर, कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर शुरू और नमूना विश्लेषण के लिए तैयार करते हैं ।
      1. लेजर पर स्विच और 15 मिनट के लिए चलाने के लिए ऑपरेटिंग तापमान तक पहुंचने और बीम स्थिरता सुनिश्चित करते हैं ।
      2. 10x म्यान बफर के साथ म्यान टैंक भरें (19 मिमी KH2पीओ4, ३८ मिमी KCl, १६६ मिमी न2HPO4, १.३९ एम NaCl द्वि-आसुत एच2ओ के साथ) द्वि-आसुत एच2ओ के साथ पतला एक 0.2 एक्स काम समाधान के लिए (सेल छँटाई के लिए: 0.5 x समाधान काम कर रहा है) ।
      3. प्रधानमंत्री दबाव पर ५६ साई और लगभग 6 साई वैक्यूम के साथ अपशिष्ट टैंक के साथ द्रव प्रणाली ।
      4. नमूना बंदरगाह, टयूबिंग और नोजल कुल्ला करने के लिए Backflush मोड में न्यूनतम 15 मिनट के लिए साधन चलाएँ.
    2. मानक मोतियों के साथ जांचना ।
      1. रैखिक (1 माइक्रोन नीले + 2 माइक्रोन पीले-हरे फ्लोरोसेंट) और लघुगणकीय रेंज (०.५ माइक्रोन और 1 माइक्रोन नीले फ्लोरोसेंट) में अंशांकन के लिए मनका घोला जा सकता है तैयार करें । समान सांद्रता प्राप्त करने के लिए मूल स्टॉक सस्पेंशन से मनका निलंबन को पतला करें ।
      2. लगातार रैखिक मनका मिश्रण को मापने के लिए और नोजल और लेजर प्रकाशिकी पदों से जोड़ तोड़ के लिए एक पूर्व निर्धारित अंशांकन टेम्पलेट करने के लिए मनका चोटियों फिट करने के लिए पूर्व रैखिक रेंज में साधन जांचना ।
      3. लघुगणकीय रेंज पर स्विच करें और लगातार लघुगणकीय मनका मिश्रण को मापने । साधन के हार्डवेयर ठीक धुन करने के लिए उनके पूर्व निर्धारित अंशांकन टेम्पलेट के लिए मनका चोटियों फिट. मनका स्थिति photomultiplier ट्यूबों (PMTs) के लाभ की स्थापना का उपयोग करने के लिए अंतिम समायोजन करें ।
      4. वाद्य शोर की स्थिति की जाँच करें और संभवतः यह अंशांकन टेम्पलेट फिट करने के लिए समायोजित ।
        नोट: मोतियों की स्थिति के लिए एक निश्चित अंशांकन टेम्पलेट एक माप परियोजना से पहले तैयार करने की जरूरत है और बदला नहीं जा सकता है (अनुपूरक फ़ाइल 1-S4 देखें)! वाद्य शोर नमूने या PMTs के इलेक्ट्रॉनिक शोर में कणों द्वारा प्रेरित किया जा सकता है और हमेशा कुछ हद तक दर्ज किया जाएगा । यह पूरी तरह से लाभ समायोजन या भूखंड ऑफसेट द्वारा शोर छिपाने के लिए उचित नहीं है । बहुतायत और शोर घटनाओं की स्थिति की जानकारी का एक महत्वपूर्ण स्रोत हो सकता है और इसलिए कच्चे डेटा में समाहित किया जाना चाहिए । बहुत कण गहन नमूने साजिश रचने और डेटा विश्लेषण कारणों के लिए शोर के बाद हटाने जरूरत हो सकता है । साधन स्थिरता और इसलिए नमूना तुलना की गारंटी के लिए एक माप दिन के दौरान नियमित अंतराल में अंशांकन नियंत्रित करें ।
    3. 2.1.4 में वर्णित के रूप में जैविक मानक युक्त नमूना उपाय (DAPI सना हुआ ई कोलाई BL21 (DE3), नमूना और स्थिर चरण के दौरान तय (16 एच) ए एस सी प्रोटोकॉल के अनुसार १.२ में वर्णित). उनके पूर्व निर्धारित अंशांकन टेम्पलेट के संबंध में चोटी की स्थिति की जाँच करें (अनुपूरक फ़ाइल 1-S5 देखें).
      नोट: नियमित धुंधला और नमूनों के हर पूल के साथ जैविक मानक की माप भी धुंधला प्रक्रिया के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे । डिवाइस मोतियों का उपयोग करने पर तुले हैं और जैविक मानक अपने पूर्व निर्धारित अंशांकन टेम्पलेट फिट नहीं है, तो धुंधला प्रक्रिया शायद दोहराया जा करने की जरूरत है ।
    4. नमुना अर्ज.
      1. नमूना बंदरगाह और ट्यूब कुल्ला और बाद के नमूनों में DAPI प्रतिदीप्ति की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट के लिए धुंधला समाधान भागो ।
      2. cytometer नोक या प्रवाह केशिका के कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए माप से पहले एक ५० माइक्रोन मेष फिल्टर के साथ सना हुआ नमूना फ़िल्टर ।
      3. साधन स्थिरता की निगरानी और एक पूर्वव्यापी अंशांकन जांच के लिए संभावना प्रदान करने के लिए नमूना के लिए लघुगणक मनका मिश्रण जोड़ें । नमूने दो मनका फाटकों में से प्रत्येक में १,००० और २,५०० घटनाओं के बीच शामिल होना चाहिए ।
      4. एक नया नमूना सेट के पहले परीक्षण माप के दौरान साधन सॉफ्टवेयर में एक सेल गेट बनाएँ. इस फाटक पर दाग कोशिकाओं को शामिल करने और शोर और मोतियों को शामिल करना चाहिए ।
      5. ३,००० घटनाओं एस-1 जब तक २५०,००० कोशिकाओं (समुदायों) या ५०,००० कोशिकाओं (शुद्ध संस्कृतियों) की एक अधिकतम गति से नमूने और उपाय सेल गेट के भीतर का पता लगाया है मिश्रण ।
        नोट: ये कक्ष गणनाएं नमूना सेट्स के साथ अनुभव के आधार पर चुनी जाती हैं । भिंन संख्या माप दक्षता और या तो दिशा में कम बहुतायत उपसमुदायों के पता लगाने के बीच tradeoff बदलाव किया जा सकता है ।
        समस्या निवारण: मनका और कोशिका स्थिति की अचानक अंतर माप परिवर्तन नोक में फंस हवा के बुलबुले के कारण हो सकता है । यह आवश्यक और नोजल की सफाई और म्यान बफर के साथ तरल पदार्थ के कुल्ला धोने । साधन (3.1.2 कदम के साथ शुरू) नोक रिमाउंट करने के बाद पुनः समायोजन किया जाना चाहिए ।
      6. शटडाउन और नमूनों स्विचन से पहले म्यान बफर के साथ अच्छी तरह से साधन Backflush ।
  2. बायोगैस समुदाय
    1. नमूना विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए साधन, लेजर, कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर शुरू करो ।
      1. उपकरण सॉफ्टवेयर के "म्यान द्रव प्रधानमंत्री" समारोह का उपयोग कर एक ढीला संलग्न ट्यूब में टयूबिंग और नमूना बंदरगाह के माध्यम से म्यान बफर (द्वि-आसुत एच2ओ) के कम से Backflush 6 मिलीलीटर ।
      2. उपाय द्वि-आसुत एच2ओ पर 5 µ एल एस-1 से कम तक द्रवित प्रणाली कुल्ला करने के लिए २०० घटनाओं एस-1 ०.५ µ एल एस-1के नियमित प्रवाह दर पर पाए जाते हैं ।
    2. प्रणाली जांचना ।
      1. मनका मिश्रण (०.५ माइक्रोन और 1 माइक्रोन ब्लू फ्लोरोसेंट) तैयार करें । मूल स्टॉक समाधान से मनका निलंबन पतला बराबर सांद्रता प्राप्त करने के लिए ।
      2. लगातार लॉग4 रेंज में मनका मिश्रण को मापने और प्रवाह cuvette और लेजर ऑप्टिक पदों से छेड़छाड़ करके उनके पूर्व निर्धारित अंशांकन टेम्पलेट के लिए मनका चोटियों फिट । PMTs के लाभ की स्थापना के साथ मनका स्थिति के लिए अंतिम समायोजन करें ।
    3. चरण 3.1.3 में वर्णित के रूप में जैविक मानक के साथ अंशांकन नियंत्रण ।
    4. नमुना अर्ज.
      1. पतला ४०० µ एल के १,६०० µ में सना हुआ नमूना पंजाब के एल, यह उपाय और एक एकाग्रता परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए घटना गिनती की निगरानी.
        नोट: समायोजित कमजोर पड़ने की दर अंय नमूना स्रोतों के लिए आवश्यक हो सकता है । इवेंट गणना १,२०० इवेंट s-1 कण रिच नमूनों में आगे बिखराव (नकारात्मक उदाहरण अनुपूरक फ़ाइल 1-S2 में) को रोकने के लिए से अधिक नहीं होना चाहिए । शुद्ध संस्कृतियों अप करने के साथ मापा जा सकता है २,००० घटनाओं एस-1।
      2. इन पहले परीक्षण माप के दौरान साधन सॉफ्टवेयर में एक सेल गेट बनाएँ । इस फाटक पर दाग कोशिकाओं को शामिल करने और शोर और मोतियों को शामिल करना चाहिए ।
      3. अधिकतम १,२०० कुल घटनाओं एस-1 पर चलाने के लिए एकाग्रता परीक्षण के परिणामों के अनुसार नमूना पतला और साधन स्थिरता की निगरानी और एक पूर्वव्यापी अंशांकन जाँच के लिए संभावना प्रदान करने के लिए नमूना के लिए मनका मिश्रण जोड़ें. नमूने दो मनका फाटकों में से प्रत्येक में १,००० और २,५०० घटनाओं के बीच शामिल होना चाहिए ।
      4. मिश्रण और नमूने को मापने जब तक २५०,००० कोशिकाओं (समुदायों) या ५०,००० कोशिकाओं (शुद्ध संस्कृतियों) सेल गेट के भीतर का पता लगाया है ।
      5. बंद करने से पहले द्वि-आसुत एच2ओ के साथ अच्छी तरह से उपकरण कुल्ला और नमूने स्विचन ।

4. सेल छँटाई

नोट: कक्ष सॉर्ट प्रक्रिया अतिरिक्त साधन सेट की आवश्यकता है और प्रकाशित प्रोटोकॉल12के अनुसार किया जाता है ।

  1. स्टार्ट अप और कदम 3.1.1-3.1.3 में वर्णित के रूप में साधन जांचना, लेकिन एक 0.5 एक्स म्यान बफर का काम कर समाधान का उपयोग करें ।
  2. छोटी बूंद तोड़-बंद खोजने के लिए डीडी आवृत्ति और डीडी आयाम सेट करें ।
  3. विक्षेपन प्लेट माउंट, उंहें चार्ज और 2-या 4-Way सॉर्ट मोड के लिए तय है ।
  4. 2 माइक्रोन पीले-हरे मोतियों के साथ आंतरिक ड्रॉप देरी अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए समय अवधि है कि एक कण या सेल पूछताछ बिंदु से यात्रा करने के लिए लेता है परिभाषित करने के लिए (लेजर हिट सेल) पिछले ड्रॉप स्ट्रीम करने के लिए संलग्न करने के लिए.
  5. एक गिलास स्लाइड पर 6 बार 20 मोतियों तरह और ड्रॉप देरी अंशांकन सत्यापित करने के लिए एक खुर्दबीन के साथ उन्हें गिनती.
  6. सॉर्टिंग गेट टेम्पलेट तैयार करें ।
  7. "एकल और एक-ड्रॉप मोड: उच्चतम शुद्धता ९९%" का उपयोग करें अधिक से अधिक नहीं २,५०० कुल घटनाओं एस-1 एक समय में अधिकतम 4 फाटकों में ५००,००० कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए (4-Way सॉर्ट मोड).
  8. फसल केंद्रापसारक द्वारा (२०,००० x g, 6 ° c, 25 मिनट) और बाद में डीएनए अलगाव और अनुक्रमण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज ।
    नोट: से कम 5% सापेक्ष बहुतायत के साथ फाटकों में छंटाई कोशिकाओं से बचने के रूप में छंटाई समय व्युत्क्रम सापेक्ष बहुतायत के अनुपात में है । व्यक्तिगत चरणों कक्ष सॉर्टर मैनुअल में विस्तार से वर्णित हैं । आवश्यक सेल नंबर संबंधित उपयोग मामलों और निष्कर्षण प्रोटोकॉल पर भारी निर्भर हैं । कई तरीकों को लागू किया गया है: ddPCR (१,००० कोशिकाओं17,19), 16S rDNA या mcrA amplicon अनुक्रमण (५००,००० कोशिकाओं6,10,15) और प्रोटियोमिक् (अप करने के लिए १.१ x 107 कोशिकाओं 16,17). सेल छंटाई विशेष रूप से लाभप्रद जब हल उपसमुदायों में कम विविधता की वजह से एक metagenomics दृष्टिकोण के साथ संयुक्त होगा ।
    चेतावनी: उच्च वोल्टेज के कारण छंटाई प्रक्रिया के दौरान झुकानेवाला प्लेटों को छूने नहीं है ।

5. डेटा विश्लेषण

नोट: cytometric माप पैदावार "प्रवाह cytometry मानक". fcs डेटा फ़ाइलों के साथ एक आम तौर पर समान डेटा संरचना । हालांकि, अलग cytometer निर्माताओं थोड़ा अनुकूलित संस्करणों और पुराने उपकरणों का उपयोग नवीनतम FCS मानक ३.१ के २०१० परिचय की तारीख हो सकती है । यह विभिंन उपकरणों के साथ इकट्ठा परिणामों की प्रत्यक्ष तुलना को रोकने के मुद्दों, जो डॉट साजिश स्केलिंग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं हमेशा एक मैट्रिक्स की पंक्तियों में संग्रहीत किए जाते हैं, संबंधित तितर बितर और विभिंन स्तंभों में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के साथ । प्रस्तुत microbiome विश्लेषण पाइपलाइनों विशिष्ट कोशिका आकार और डीएनए सामग्री का उपयोग करने के लिए माइक्रोबियल उपसमुदायों का वर्णन । इन मापदंडों FSC और DAPI प्रतिदीप्ति चैनल तीव्रता (सेल सॉर्टर: fl-4, विश्लेषक: fl-1) और उपसामुदायिक समूहों में परिणाम जब दो आयामी FSC बनाम DAPI प्रतिदीप्ति भूखंडों में कल्पना करने के लिए संबंधित हैं । ये डॉट भूखंड प्रवाह cytometry डेटा की व्याख्या और विश्लेषण की अनुमति देते हैं और आमतौर पर logarithmically स्केल किए जाते हैं. वे मालिकाना cytometer सॉफ्टवेयर या तीसरे पक्ष के समाधान का उपयोग कर. fcs फ़ाइलों से प्रदर्शित किया जा सकता है और स्वचालित (Cytometric हिस्टोग्राम छवि तुलना, ठाठ) और अर्द्ध स्वचालित (Cytometric Barcoding, CyBar) समुदाय विश्लेषण के लिए आधार हैं ।

  1. Cytometric हिस्टोग्राम छवि तुलना
    नोट: कोड, विस्तृत प्रलेखन और इस पैकेज के लिए एक मैनुअल http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html पर उपलब्ध हैं । वे भी20प्रकाशित हो चुके हैं ।
    1. स्थापित करें और R पैकेज लोड,. fcs फ़ाइलों वाली कार्यशील निर्देशिका सेट करें और निष्पादित कर रहा है एक फ़ाइल सूची सेट करें:
      > स्रोत ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > योनि ("flowCHIC")
      > लाइब्रेरी (flowCHIC)
      > # पथ जहां आपके FCS फ़ाइलें स्थित है करने के लिए काम कर निर्देशिका सेट
      > # उद्धरण चिह्नों में पथ लिखें
      > setwd ("")
      > # अपने काम निर्देशिका में स्थित FCS फ़ाइलों के फ़ाइल नाम की एक सूची प्राप्त करें
      > फ़ाइलें <-list. files (getwd (), पूर्ण = TRUE, प्रतिमान = "*. fcs")
      > # पैकेज करने के लिए शामिल FCS फ़ाइलों के फ़ाइल नाम की एक सूची प्राप्त करें
      > फ़ाइलें <-list. files (system. file ("extdata", पैकेज = "flowCHIC"),
      + पूर्ण = सच है, पैटर्न = "*. fcs")
      > # flowFrame के रूप में पहली FCS फ़ाइल पढ़ें
      > फ़्रेम <-पढ़ें । FCS (फ़ाइलें [1], बदल. names = TRUE, परिवर्तन FALSE =)
      > # पैरामीटर/चैनल के नाम की एक सूची प्राप्त करें
      > नाम (फ़्रेम @ पैरामीटर @ डेटा $ नाम)
    2. "fcs_to_img" पैकेज फ़ंक्शन निष्पादित करके cytometric raw डेटा के लिए छवियाँ बनाएँ:
      > # डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग कर हिस्टोग्राम छवियों बनाएँ
      > fcs_to_img (फ़ाइलें)
    3. "img_sub" पैकेज फ़ंक्शन निष्पादित करके हिस्टोग्राम छवियों के सबसेट निर्धारित करें:
      > # हिस्टोग्राम छवि सबसेट डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग कर बनाएं
      > img_sub (फ़ाइलें, ch1 = "FS । प्रवेश करें ", ch2 =" FL. 4. log ")
    4. "calculate_overlaps_xor" पैकेज फ़ंक्शन निष्पादित करके छवि विश्लेषण संचालित करने के लिए ओवरलैप और exclusive मानों की गणना करें:
      > # एक सूची के रूप में सभी सबसेट छवियों के नाम सहेजें
      > सबसेट <-list. files (पथ = चिपकाएं (getwd (), "chic_subset", sep = "/"), पूर्ण = सच, पैटर्न = "*. png")
      > # ओवरलैप और exclusive छवियों की गणना और दो नई फ़ाइलों के लिए मूल्यों को लिखने
      > परिणाम <-calculate_overlaps_xor (सबसेट्स)
    5. "plot_nmds" पैकेज फ़ंक्शन को निष्पादित करके समानता विश्लेषण के लिए गैर-मैट्रिक बहुआयामी स्केलिंग (NMDS) भूखंड बनाएं:
      > # नमूने के एक NMDS भूखंड दिखाएं
      > plot_nmds (परिणाम $ ओवरलैप, परिणाम $ exclusive)
  2. Cytometric Barcoding
    नोट: कोड, विस्तृत प्रलेखन और इस पैकेज के लिए एक मैनुअल http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html पर उपलब्ध हैं । इनका भी11,12को प्रकाशन किया जा चुका है ।
    1. सभी नमूनों पर उपयोग के लिए एक मास्टर गेट टेम्पलेट विकसित करना ।
      1. खींचें और छोड़ें कार्यक्षमता का उपयोग करते हुए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में. fcs फ़ाइलें लोड करें ।
      2. कोई माप डबल क्लिक करें और FSC बनाम DAPI प्रतिदीप्ति प्लॉट खोलने के लिए संबंधित ड्रॉपडाउन सूचियों से x-और y-अक्ष पैरामीटर्स चुनें ।
      3. पहले चरण 3.1.4.5 और 3.2.4.4 में विश्लेषित कक्षों की संख्या को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया गया कक्ष गेट पुन: उत्पंन करने के लिए बहुभुज आरेखण उपकरण का उपयोग करें और तदनुसार नाम । यह पूल करने के लिए सभी नमूने समूह पर नमूना सूची में कक्ष गेट प्रविष्टि खींचें ।
      4. कक्ष गेट पर डबल क्लिक करें और कक्ष गेट घटनाओं की कल्पना करने के लिए अक्ष असाइनमेंट को सुधारें ।
      5. प्रकाशित दिशानिर्देशों12 का पालन अंडाकार गेट्स उपकरण के साथ सेट नमूना में प्रचलित उपसमुदायों को परिभाषित करने और गेट टेम्पलेट की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए एसएससी या किसी अन्य तीसरे पैरामीटर21 की स्कैनिंग का उपयोग करें । पूल, नियंत्रण और अंय नमूनों पर उपसमुदाय आवंटन समायोजित करें ।
    2. संबंधित उपसमुदाय बहुतायत को एक. txt फ़ाइल में R स्क्रिप्ट में उपयोग के लिए निर्यात करें ।
      1. संपादन टैब के साथ तालिका संपादक खोलें ।
      2. चरण 5.2.1.5 में परिभाषित किया गया था कि हर उपसमुदाय के लिए स्तंभ जोड़ें और आउटपुट आँकड़े "पैरेंट की आवृत्ति" करने के लिए सेट और उन्हें नाम ।
      3. बचत स्वरूप और गंतव्य चुनने के बाद "तालिका संपादक" में तालिका बनाएँ.
        नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर सीधे संबंधित उपसमुदाय बहुतायत प्रदान करता है । वे भी सेल गेट में घटना गिनती द्वारा व्यक्तिगत उपसमुदाय के गेट में घटना गिनती के विभाजन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । एक. txt फ़ाइल में एक टैब सीमांकित मैट्रिक्स में सहेजा जा करने के लिए मान है जो किसी भी एनए फ़ील्ड नहीं हो सकते है और R कोड द्वारा पढ़ने के लिए कुछ अतिरिक्त आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए की आवश्यकता है (देखें मैनुअल और FAQ विशिष्ट निर्देशों के लिए) ।
    3. स्थापित करें और R पैकेज लोड और डेटा निष्पादित कर रहा है लोड:
      > स्रोत ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > योनि ("flowCyBar")
      > # उद्धरण चिह्नों में पथ लिखें
      > setwd ("")
      > # लोड डेटासेट
      > डेटा (Cell_number_sample)
      > # डेटा दिखाएं
      > Cell_number_sample [,-1]
    4. "सामान्य" पैकेज फ़ंक्शन निष्पादित करके सापेक्ष बहुतायत को सामान्य:
      # डेटा को सामान्य, 2 अंक मुद्रित
      सामांय (Cell_number_sample [,-1], अंक = 2)
    5. सामान्यीकृत की एक बार कोड और मूल रिश्तेदार बहुतायत के एक boxplot "cybar_plot" पैकेज समारोह को क्रियांवित करने से बनाएं:
      Normalized_mean <-सामांयीकरण (Cell_number_sample [,-1], अंक = 2)
      Normalized_mean <-data. फ़्रेम (data. मैट्रिक्स (Normalized_mean))
      डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ # भूखंड
      cybar_plot (Normalized_mean, Cell_number_sample [,-1])
    6. मूल सापेक्ष बहुतायत के एक NMDS भूखंड बनाएं ।
      > Normalized_mean <-सामान्य (Cell_number_sample [,-1], अंक = 2)
      > Normalized_mean <-data. फ़्रेम (data. मैट्रिक्स (Normalized_mean))
      > # सामान्यीकृत cel संख्या के NMDS भूखंड
      > nmds (Normalized_mean)
    7. सहसंबंध "सहसंबंध" पैकेज फ़ंक्शन निष्पादित करके सामांय सापेक्ष बहुतायत और अंय मापदंडों के संबंध विश्लेषण बनाएं:
      > # लोड डेटासेट
      > डेटा (Corr_data_sample)
      > # सहसंबंध मान दिखाएं
      > Corr_data_sample [,-1]
      > # भागो सहसंबंध विश्लेषण
      > सहसंबंध (Corr_data_sample [,-1])
      नोट: ठाठ और CyBar सापेक्ष बहुतायत पर निर्भर करते हैं । हालांकि, प्रवाह cytometry भी निरपेक्ष सेल संख्या है, जो प्रौद्योगिकी के लिए बहुत रुचि हो सकता है निर्धारित कर सकते है अनुप्रयोगों । निरपेक्ष कक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए, ब्याज के गेट में कक्षों की संख्या विश्लेषण नमूना वॉल्यूम द्वारा विभाजित है । विश्लेषण नमूना मात्रा नमूना (अनुपूरक फ़ाइल 1-S7 में फार्मूला) में एक ज्ञात एकाग्रता के साथ मनका निलंबन जोड़कर निर्धारित किया जा सकता है । बेंच शीर्ष विश्लेषक इसके अतिरिक्त सीधे माप के दौरान नमूना ट्यूब में मात्रा quantifies कि एक सच्चे volumetric गिनती सुविधा के साथ सुसज्जित है. यह सेल गिनती के लिए एक SYBR ग्रीन मैं दाग प्रोटोकॉल का उपयोग करने की सलाह दी है ।

Representative Results

निम्नलिखित प्रतिनिधि परिणाम दोहराने की आवश्यकता पर जोर देते हैं और प्रत्येक तीन नमूना सेट पर विभिन्न डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण तकनीकों उदाहरण देना. वे संभव डेटा मूल्यांकन संबंधित सेट के बारे में मानक अनुसंधान सवालों का जवाब देने के लिए उपयुक्त पाइपलाइनों के परिणाम दिखाते हैं । हालांकि, प्रस्तुत तकनीक नमूना सेट है जो वे के साथ प्रस्तुत कर रहे है के लिए अनंय नहीं हैं । कच्चे डेटा प्रवाह cytometry FlowRepository आईडी FR-के साथ सार्वजनिक रूप से उपलब्ध कराया गया था-ZY46 । पहले से अपलोड ए एस सी डाटा आईडी FR के तहत उपलब्ध है-ZYD7 ।

जैविक और तकनीकी प्रतिकृति लिया, तैयार किया गया और प्रकाशित प्रोटोकॉल11के अनुसार विश्लेषण । जैविक पीसी और ए एस सी से प्रतिकृति तीन समानांतर कुप्पी से लिया गया । ईसा पूर्व की प्रतिकृति एक पायलट स्केल संयंत्र में एक स्थान पर तीन बाद के नमूने के रूप में लिया गया । एक नमूना के तीन aliquots तय, दाग और तकनीकी reproducibility सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण किया गया । तरीके reproducibility पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं के अनुसार मूल्यांकन किया गया था11. एक नमूना सेट (अनुपूरक फ़ाइल 1-S6) के सभी नमूनों के लिए एक गेट टेम्पलेट मानक विचलन की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था (प्रति गेट%) ।

पीसी के लिए, सापेक्ष बहुतायत के अधिकतम मानक विचलन ३.४४% था, जबकि औसत मानक विचलन २.१३% (चित्रा 1) था । ए एस सी और ई. पू., सापेक्ष बहुतायत के अधिकतम मानक विचलन के लिए १.२७% और ०.८८% थे, जबकि मानक विचलन के औसत २.१३% और ०.२१% (अनुपूरक फ़ाइल 1-S8) थे ।

एक मानक प्रक्रिया, जब एक शुद्ध तनाव संस्कृति की जांच, एक विकास वक्र की तैयारी के लिए विशिष्ट परिस्थितियों में अंतराल चरण, पीढ़ी बार और कोशिका घनत्व का विश्लेषण है । हम प्रणाली (चित्रा 2) की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए प्रवाह cytometric विश्लेषण कार्यप्रवाह के साथ इस प्रक्रिया को संयुक्त । FSC बनाम DAPI प्रतिदीप्ति भूखंडों बैच संस्कृति के विभिंन बिंदुओं पर संस्कृति के सेल चक्र राज्यों से पता चलता है । एक मास्टर गेट टेम्पलेट (अनुपूरक फ़ाइल 1-S6) एक (c1n), दो (c2n) और एकाधिक गुणसूत्रों (cXn, चित्रा 2 बी) के साथ कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाता है के लिए स्थापित किया गया था । inoculated कोशिकाओं के प्रमुख अनुपात (0 एच में ९३.७%) केवल एक गुणसूत्र था । यह काफी घातीय वृद्धि के दौरान बदल गया है, जहां लगभग सभी कोशिकाओं को एक से अधिक (९९.६%, 4 ज) और जनसंख्या के आधे से अधिक समाहित (५३.१%) यहां तक कि दो गुणसूत्रों से अधिक समाहित । यह अपनी पीढ़ी के समय से तेजी से अपने गुणसूत्रों को दोहराने के लिए पी putidaएस क्षमता दिखाता है ।

प्रवाह cytometric विश्लेषण माइक्रोबियल समुदायों के विकास की निगरानी के लिए बहुत उपयोगी साबित कर दिया है । यह बहुत अधिक संसाधन गहन आणविक विधि5,10से अधिक करीब समुदाय गतिशीलता का पालन कर सकते हैं । हम एक फिल्म में इन गतिशीलता पर प्रकाश डाला और समय के साथ सक्रिय कीचड़ समुदाय बदलाव का एक सिंहावलोकन प्राप्त की । हर एक दूसरे फ्रेम एक नमूना बिंदु (अनुपूरक फ़ाइल 2) के एक FSC बनाम DAPI प्रतिदीप्ति भूखंड से पता चलता है । 0 दिन और 4 दिन के बीच एक बहुत अलग बदलाव 7 दिन के बाद एक कोर समुदाय की स्थापना के बाद किया गया । अतिरिक्त उपसमुदाय 21 दिन में आया था । हम एक उपसमुदाय के स्तर पर माइक्रोबियल गतिशीलता का मूल्यांकन सक्षम है कि एक मास्टर गेट टेम्पलेट (अनुपूरक फ़ाइल 1-S6) की स्थापना की । प्रयोग के विभिंन चरणों में प्रमुख उपसमुदायों स्पष्ट रूप से CyBar उपकरण (चित्रा 3) का उपयोग कर पहचाने गए थे । रिश्तेदार उपसमुदाय बहुतायत की आवृत्ति वितरण के साथ यह मेल के लिए द्वार है कि (बहुतायत में महत्वपूर्ण परिवर्तन एक महत्वपूर्ण समय बिंदु पर शुरू) और व्यवहार्य (5% से अधिक सापेक्ष बहुतायत) छंटाई के लिए और आगे के लिए चयन में मदद विश्लेषण22.

औद्योगिक पैमाने पर प्रतिक्रिया अनुप्रयोगों संभावित स्थानिक आंदोलन सीमाओं के कारण heterogeneities का सामना कर सकते हैं । वे भी अक्सर गैर सिंथेटिक सब्सट्रेट की गुणवत्ता में बारी की तरह, संचालन मापदंडों को बदलने के लिए उजागर कर रहे हैं. ईसा पूर्व इस तरह की एक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है और एक गतिशील रूप से संचालित प्लग फ्लो रिएक्टर में विभिन्न इलाकों से नमूना लिया गया था. FSC बनाम DAPI प्रतिदीप्ति भूखंड (चित्रा 4) अनुकरणीय नमूना अंक के केवल थोड़ा स्थानिक दिखाने के लिए, लेकिन स्पष्ट लौकिक विविधता । बीसी आगे दोनों का उपयोग कर जांच की थी, तेजी से स्वचालित ठाठ और अधिक में गहराई मास्टर गेट आधारित टेम्पलेट CyBar दृष्टिकोण.

इसकी स्वचालित, तेजी से और निष्पक्ष प्रकृति, एक औद्योगिक सेटिंग में के लिए विशेष रूप से दिलचस्प बनाता है पर साइट के नियंत्रण के लिए है । यह सभी उपलब्ध नमूनों की रॉ. fcs डेटा की तुलना करता है । इनमें से दो की तुलना चित्रा 5में प्रदर्शित की जाती है । परिणामस्वरूप समानता मान स्थानिक और लौकिक विविधता के विषय में पिछले टिप्पणियों की पुष्टि करें । NMDS भूखंडों के रूप में उत्पंन ठाठ उपकरण समानता मैट्रिक्स (चित्रा 6) आगे इस परिणाम को पुष्ट और यह तदनुसार visualizes ।

इसके अलावा, हम एक मास्टर गेट टेंपलेट (अनुपूरक फ़ाइल 1-S6) का उपयोग कर ईसा पूर्व के 23 उपसमुदायों के सापेक्ष बहुतायत की गणना । एक एक वर्ष की अवधि से ४८ नमूनों का सहसंबंध विश्लेषण माइक्रोबियल समुदाय में कार्यात्मक संबंधों को समझने के लिए आयोजित किया गया था । यह आगे की जांच के लिए ब्याज के गेट्स की पहचान करने में मदद कर सकते है (4 सेल छंटाई) । उत्पाद titers की तरह अजैव मापदंडों के साथ मजबूत सकारात्मक या नकारात्मक सहसंबंध को समझने और पारिस्थितिकी प्रणालियों और प्रौद्योगिकी प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने में मदद कर सकते हैं । इस सहसंबंध में शामिल कार्बनिक लोड दर (चित्रा 7) मिसाल इस तरह के एक अजैव पैरामीटर । G5, जी-4 और G10 मजबूत सकारात्मक सहसंबंध प्रदर्शन और संभवतः fermentative प्रजातियों में शामिल हो सकता है, जबकि जी-8 में नकारात्मक संबंध methanogenic archaea की ओर संकेत हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: विशुद्ध संस्कृति के cytometric विश्लेषण का Reproducibility । FSC बनाम DAPI नियंत्रण मोतियों के साथ प्रतिदीप्ति भूखंडों (ए, बी) और 3 उपसमुदाय बहुतायत के बार भूखंडों [%] त्रुटि सलाखों के साथ ± एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व (सी, डी) । संबंधित बहुतायत गेट टेंपलेट अनुपूरक फ़ाइल 1-S6 में दिखाए गए के साथ निर्धारित किया गया । तीन जैविक प्रतिकृति a, B और C 4 ज में वृद्धि वक्र के लिया गया था और तीन तकनीकी प्रतिकृति P1, P2, पी 3 नमूने से तैयार किया गया एक और एक बार मापा गया, क्रमशः: M1, M2, एम 2, और उनके संबंधित मानक विचलन के साथ दिया जाता है । सेल गेट में ५०,००० घटनाएं दर्ज हुईं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:12 घंटे से अधिक एक विकास वक्र प्रयोग के दौरान लिया शुद्ध संस्कृति के सेल चक्र विश्लेषण (a) । FSC बनाम DAPI द्वि-प्रति घंटा नमूने है कि घातीय विकास के दौर के दौरान डीएनए सामग्री की एक पारी प्रदर्शित की प्रतिदीप्ति भूखंडों । इस माप श्रृंखला में मोती शामिल नहीं है (अनुपूरक फ़ाइल 1-S3 देखें) । (ख). ऑप्टिकल घनत्व-त्रुटि समय के साथ उपसमुदायों में ± एक मानक विचलन और सापेक्ष बहुतायत का प्रतिनिधित्व सलाखों के साथ विकास वक्र आधारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:24 दिनों में सक्रिय कीचड़ समुदाय संरचना का विकास । (क) प्रवृत्तियों की समानता, इसी रंग कुंजी (ख) और एक NMDS साजिश बुद्धि में एक समानता विश्लेषण के लिए boxplots में visualized आवृत्ति वितरण ओवरले के साथ flowCyBar की तरह है, इस प्रकार के रुझानों ग) । अनुपूरक फाइल 2 में फिल्म अनुक्रम में अंतर्निहित भूखंड दिखाए जाते हैं । सापेक्ष बहुतायत अनुपूरक फ़ाइल 1-S6 में गेट टेंपलेट का उपयोग कर निर्धारित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक औद्योगिक पैमाने पर प्लग फ्लो बायोगैस रिएक्टर में माइक्रोबियल समुदाय संरचना के स्थानिक और लौकिक विविधता । (एक) दिन २२३ पर चार नमूना बंदरगाहों I-IV के माइक्रोबियल समुदाय संरचना की तुलना । (ख) दिन के समय निर्भर समुदाय संरचना रूपांतरों की तुलना 0 दिन ३८४ के लिए बंदरगाह द्वितीय में । दृश्य को बढ़ाने के लिए शोर देर से ही काट दिया गया है । सेल गेट (अनुपूरक फाइल 1-S6) में २५०,००० घटनाओं को मापा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Cytometric हिस्टोग्राम छवि तुलना-ठाठ । ठाठ एल्गोरिथ्म के सिद्धांत क्रमशः स्थानिक और लौकिक विविधता का प्रतिनिधित्व करने वाले दो नमूनों की तुलना करके उदाहरण है । (i) ठाठ छवियों को प्रदर्शित करने के लिए दो मापदंडों का चयन करने के बाद. fcs फ़ाइलों से बनाया जाता है (FSC बनाम DAPI प्रतिदीप्ति). greyscale (0-255) ईवेंट गणना को पिक्सेल में कोड्स करते हैं । (ii) ठाठ उपसमुच्चय (यहां: २०० < x < ४०००, २०० < y < २२००) कक्षों वाले क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के बाद उत्पन्न होते हैं । (iii) exclusive संयोजन छवि उपसेट्स के बीच पिक्सेल्स की तुलना करके बनाई जाती है. कोई अंतर नहीं बराबर 0 और काले रंग के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । अधिकतम अंतर २०० के बराबर है और सफेद के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । इसी exclusive मान को exclusive इमेज में सभी पिक्सल के ग्रे स्केल मानों को जोड़कर परिकलित किया जाता है । (iv) ओवरले संयोजन छवि उपसमुच्चय की पिक्सल के greyscale मूल्यों को जोड़कर बनाया जाता है । संगत ओवरले मान की गणना किसी अधिव्याप्त छवि के पिक्सेल को परिकलित करके की जाती है जो शूंय के बराबर नहीं होती और इसलिए जानकारी होती है । (v) exclusive और अधिव्याप्त मानों को विभाजित करके समानता मान की गणना की जाती है । ये फिगर 6में NMDS प्लॉट का आधार है । दोनों समानता मूल्यों और NMDS भूखंड एक नगण्य स्थानिक दिखाने के लिए और एक स्पष्ट लौकिक समुदाय विविधता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: ठाठ आधारित बायोगैस समुदाय के नमूनों की समानता विश्लेषण । 0 दिन का नमूना अपने अत्यंत अलग समुदाय संरचना विकृत विश्लेषण (अनुपूरक फाइल 1-S11) के कारण इस भूखंड से बाहर रखा गया था । NMDS साजिश कम स्थानिक और उच्च लौकिक विविधता ठाठ उपकरण का उपयोग किया और चित्रा 5में समझाया के बारे में धारणा की पुष्टि करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: बायोगैस समुदाय पर सहसंबंध विश्लेषण । मैट्रिक्स स्पीमरन की रैंक क्रम गुणांक का उपयोग कर की गणना की गई और 23 उपसमुदायों कि अनुपूरक फ़ाइल 1-S6 में मास्टर गेट टेम्पलेट के साथ निर्धारित किया गया था की सापेक्ष बहुतायत पर आधारित है । वे एक साल की अवधि से ४८ नमूनों के लिए कार्बनिक लदान दर (OLR) के साथ संबंधित थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: planktonic की समानता विश्लेषण (पी) और कीचड़ के आधार पर अपशिष्ट जल में समुदायों (ओं) । नमूने प्राथमिक स्पष्ट (PCL), सक्रिय कीचड़ बेसिन (के रूप में) और डाइजेस्टर टैंक (डीटी) एक पूर्ण पैमाने पर अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र (अनुपूरक फाइल 1-S10 में डॉट भूखंड) से लिया गया । सापेक्ष बहुतायत अनुपूरक फ़ाइल 1-S6 में दिखाया गया गेट टेम्पलेट का उपयोग कर निर्धारित किया गया । इन उपसमुदाय बहुतायत भी एक CyBar (अनुपूरक फ़ाइल 1-S10) और NMDS भूखंड (R < 0.01) बनाने के लिए flowCyBar उपकरण के साथ विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: शुद्ध संस्कृति का निर्धारण स्थिरता । 0 एच में लिया गया वृद्धि वक्र प्रयोग से नमूने 15% ग्लिसरॉल में निर्धारण के बाद 28 दिनों में-८० ° c पर संग्रहीत किए गए थे । FSC बनाम DAPI नियंत्रण मोतियों के साथ प्रतिदीप्ति भूखंड दिखाए जाते हैं. माप श्रृंखला में मोती (अनुपूरक फ़ाइल 1-S3) शामिल नहीं है । सेल गेट (अनुपूरक फाइल 1-S6) में ५०,००० इवेंट्स दर्ज किए गए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फ़ाइल 1: कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक फ़ाइल 2: कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

माइक्रोबियल आबादी और समुदायों के एक सफल विश्लेषण अच्छी तरह से देखते cytometers, सेल मापदंडों और नमूने और माप और डेटा मूल्यांकन की ओर निर्धारण से एक विश्वसनीय कार्यप्रवाह का एक उपयुक्त विकल्प की आवश्यकता है । चयनित कक्ष पैरामीटर्स को उपलब्ध उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ सॉर्ट करना आवश्यक है । हम DAPI का उपयोग करें और अनुशंसा करते हैं, जो कम सांद्रता पर बहुत संवेदनशील है; लेकिन जरूरत है एक यूवी लेजर, जो आमतौर पर मानक cytometer सेट अप में शामिल नहीं है द्वारा उत्तेजित हो । ऐसे SYBR ग्रीन के रूप में अंय रंगों, मैं भी पूरे आबादी या समुदायों दाग लेकिन आम तौर पर हीन संकल्प उद्धार । हम माइक्रोबियल समुदायों में मछली प्रक्रियाओं या व्यवहार्यता परीक्षणों का उपयोग करने की सिफारिश नहीं है । इन दृष्टिकोणों का अंदाजा लगाना, सत्यापित करना और नियंत्रण असंभव है क्योंकि समुदाय में व्यक्तिगत प्रजातियों पर उनका प्रभाव अनिश्चित है. वे मज़बूती से परीक्षण नहीं किया जा सकता है, जब तक ठेठ समुदायों के एक पर्याप्त अनुपात के रूप में अभी भी एक शुद्ध संस्कृति के रूप में उपलब्ध नहीं है ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में नमूना और निर्धारण प्रक्रिया के साथ ही कक्ष सॉर्टिंग शामिल हैं । नमूना flocs करने के लिए समग्र करने के लिए कुछ शुद्ध संस्कृतियों और माइक्रोबियल समुदायों की प्रवृत्ति से जटिल हो सकता है या नमूना मैट्रिक्स के कणों का पालन करने के लिए । यह इन समुच्चय के अपव्यय और उंहें शुरू करने के लिए cytometric विश्लेषण प्रवाह के लिए विश्वसनीय परिणाम की गारंटी से पहले एक नमूने में कोशिकाओं को अलग आवश्यक है । प्रस्तुत तैयारी प्रोटोकॉल एकल सेल विश्लेषण को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया गया । एक अंतिम ५० µm निस्पंदन माप से पहले किसी भी अवशिष्ट समुच्चय को हटाने और सेल सॉर्टर के ७० µm नोक और कॉलेस्ट्रॉल से विश्लेषक के प्रवाह cuvette को रोकने के लिए किया जाता है । अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से सेल flocs विशेष रूप से प्रचुर, मजबूत और प्रणाली के समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं । हम एक पूर्ण पैमाने पर अपशिष्ट जल उपचार संयंत्र के विभिन्न टैंकों में planktonic और कीचड़ आधारित माइक्रोबियल समुदायों की जांच की, स्थापित प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए । कीचड़ बनाने सेल समुच्चय स्पष्ट रूप से नष्ट कर दिया गया और समुदाय संरचना स्थिर रहे । इसके अलावा, planktonic और कीचड़ आधारित समुदायों के सभी तीन नमूना टैंक में उन दोनों के बीच उल्लेखनीय समानता का प्रदर्शन (8 चित्रा, अनुपूरक फ़ाइल 1-S10) । ये परिणाम एक ताजा-, एक formaldehyde इलाज के तुलनात्मक 16S rDNA amplicon अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया-, एक formaldehyde और इथेनॉल निर्धारण-, और एक हल नमूना10. फिर भी, असाधारण चुनौतीपूर्ण पर्यावरणीय नमूनों, जैसे मजबूत फिल्मों या बैक्टीरिया कसकर जुड़े जंजीरों में बढ़ रही है, नष्ट करना असंभव हो सकता है । मिट्टी के नमूनों विशेष रूप से समस्याग्रस्त किया जा सकता है, के रूप में सर्वव्यापी कणों हिस्टोग्राम में दिखाई देते है और सरासर बहुतायत से कोशिकाओं अस्पष्ट कर सकते हैं । ऐसे मामलों में, पारंपरिक अनुक्रमण विधियों को लागू करने की आवश्यकता है ।

हर नए नमूना सेट के निर्धारण स्थिरता परिणाम वैधता की गारंटी के लिए प्रयोग को डिजाइन करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए । अच्छा निर्धारण स्थिरता भी एक ही दिन में कई नमूना समय अंक के परित धुंधला और माप सक्षम बनाता है । यह इसके अलावा प्रतिकृति माप और पूर्वव्यापी सेल निष्कर्ष और प्रयोग के अंतिम मूल्यांकन के बाद निर्णायक समय अंक की छंटाई में सक्षम बनाता है । विशुद्ध संस्कृति के निर्धारण की स्थिरता को 28 दिनों में सत्यापित किया गया था (चित्रा 9) । नमूना परिवहन सहित साइट पर प्रयोगों के लिए, निर्धारण स्थिरता अब समय पर परीक्षण किया जाना चाहिए (इस मामले में, सक्रिय कीचड़ समुदाय के लिए ६० दिन, बायोगैस समुदाय के लिए १९५ दिन, अनुपूरक फाइल 1-S9) ।

धुंधला आम तौर पर समस्याग्रस्त नहीं है, लेकिन जरूरत है एक जैविक मानक के साथ नियंत्रित करने के लिए bioinformatic मूल्यांकन उपकरण के आवेदन की अनुमति है । हम नकली तनाव ई. कोलाई BL21 (DE3) है, जो ए एस सी प्रोटोकॉल के अनुसार और हर धुंधला बैच में उपयोग के लिए भंडारित किया गया था ।

DAPI के अलावा, SYBR ग्रीन मैं सफलतापूर्वक कई वर्षों14,23,24,25,26के लिए माइक्रोबियल समुदायों को हल करने के लिए लागू किया गया है । SYBR ग्रीन मैं उच्च और कम न्यूक्लिक एसिड उपसमुच्चय में समुदायों को हल (HNA और LNA) एक ऑनलाइन ढंग में रहते कोशिकाओं का उपयोग कर सकते हैं । DAPI, तथापि, डीएनए के लिए अपनी बाध्यकारी में अधिक विशिष्ट है और एक नमूना सेट में ५० से अधिक उपसमुदायों के भेद में सक्षम बनाता है, लेकिन एक निर्धारण चरण धुंधला करने से पहले की आवश्यकता है ।

सेल छंटाई इस दृष्टिकोण की एक उत्कृष्ट सुविधा है और अगर कुछ उपसमुदायों के आगे ब्याज की है लागू किया जा सकता है । यह बल दिया जाना चाहिए कि न तो पीएफए-(केवल 30 मिनट के लिए प्रदर्शन किया) और न ही इथेनॉल उपचार या DAPI धुंधला10 बाद 16S amplicon अनुक्रमण पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ा । निर्धारण और उपसमुदाय metagenome विश्लेषण पर धुंधला प्रक्रियाओं के संभावित प्रभाव अभी भी परीक्षण किया जाना चाहिए ।

समुदाय के कार्यों और प्रवृत्ति गतिशीलता पर जानकारी का एक बहुत bioinformatics उपकरण है कि सेल स्तर से एक आभासी सेल पर समुदाय सुविधाओं को हल करने और अजैव के साथ इन सुविधाओं से कनेक्ट जब शामिल छंटाई दृष्टिकोण से स्वतंत्र प्राप्त किया जा सकता है पैरामीटर.

हाल ही में, नए bioinformatics मूल्यांकन उपकरण, दोनों SYBR ग्रीन मैं और DAPI दृष्टिकोण के लिए सभी उपयोगी के एक नंबर, cytometric समुदाय पैटर्न को हल करने के लिए विकसित किया गया है । ये27FlowFP हैं, पैकेज इस अध्ययन में इस्तेमाल किया (flowCHIC20, flowCyBar28), एक deconvolution ताजा जल समुदायों के साथ स्थापित मॉडल29 और एक उपकरण उनके शारीरिक के अनुसार भेदभाव उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया विशेषताएँ30. इसके अतिरिक्त, cytometric विविधता25 निर्धारित किया जा सकता है और भी माइक्रोबियल समुदायों के स्थायित्व गुण अब एक ऑनलाइन उपकरण10के साथ पीछा किया जा सकता है ।

इस प्रकार, प्रवाह cytometric विश्लेषण एक बड़ा लाभ है जब यह माइक्रोबियल समुदायों और संभव अजैव पैरामीटर सहसंबंध के तेजी से मूल्यांकन करने के लिए आता है । हालांकि, अभी भी विधि के लिए सीमाएं हैं । यह flowCyBar उपकरण के साथ सही मायने में ऑनलाइन लागू नहीं किया जा सकता, अनुभवी आधारित गेट सेटिंग प्रक्रिया के कारण. इसके अलावा, कस्टम के विकास बनाया, आसान प्रवाह cytometers का उपयोग करने के लिए बहुत प्रवाह cytometric microbiome विश्लेषण दृष्टिकोण के प्रसार अग्रिम होगा । इस दिशा में पहला कदम28शिवसैनिकों का है ।

यह जीवाणु पीढ़ी के समय की सीमा के भीतर उच्च आवृत्ति की निगरानी की अनुमति देता है के रूप में माइक्रोबियल प्रवाह cytometry के भविष्य अनुप्रयोगों, माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में अनुरूप किया जा सकता है और यह पारिस्थितिकी मानदंड cytometric डेटा 5 के लिए लागू कर रहे हैं कि दिखाया गया है ,10. विधि31स्विट्जरलैंड में अनिवार्य पीने के पानी के नियंत्रण की तरह प्राकृतिक वातावरण की दिनचर्या की जांच के लिए बहुत उपयोगी है । यह भी मानव15 या पशु३२ microbiome स्क्रीनिंग की तरह चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है । इसके अलावा, bioinformatics में नवीनतम घटनाओं में सक्षम हो सकता है माइक्रोबियल प्रवाह cytometry प्रबंधित माइक्रोबियल प्रणालियों की प्रक्रिया नियंत्रण में एक अभिंन संवेदक हो । माइक्रोबियल समुदाय cytometry भी सेल छंटाई, जो विशिष्ट समुदाय सबसेट के उच्च संकल्प जीनोमिक जांच की अनुमति देता है के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
 

Acknowledgments

हम कृतज्ञता प्रक्रिया और शुद्ध संस्कृति और सक्रिय कीचड़ समुदाय, क्रमशः के डेटासेट प्रदान करने के लिए माइकल जाँन और Yuting गुओ स्वीकार करते हैं । हम आगे बायोगैस समुदाय के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए Katrin Mörters धंयवाद । यह काम Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe ई. वी. (FNR, परियोजना बायोगैस-फिंगरप्रिंट Nr. २२००८३१३) द्वारा वित्त पोषित किया गया था जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री फॉर फूड ऐंड कृषि (BMEL) की ओर से संघीय मंत्रालय के एसएमई (ZIM) के लिए केंद्रीय नवाचार कार्यक्रम आर्थिक मामलों और ऊर्जा (BMWi) (इनार-ऐबों, 16KN043222), ड्यूश Bundesstiftung Umwelt (DBU, परियोजना पर मांग Produktion वॉन Phosphatdünger ऑस्ट्रेलिया Reststoffen वॉन Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), जर्मन संघीय शिक्षा के लिए मंत्रालय और रिसर्च (BMBF) (FZK 03XP0041G), और Helmholtz एसोसिएशन के कार्यक्रम उन्मुख वित्त पोषण (POF III R31 विषय 3-ऊर्जा) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

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पर्यावरण विज्ञान अंक १३७ फ्लो cytometry सिंगल सेल एनालिटिक्स माइक्रोबियल समुदाय गतिशीलता microbiome नमूना तैयारी प्रवाह cytometry जैव प्रक्रिया नियंत्रण निगरानी सेल गतिशीलता cytometric डेटा विश्लेषण flowCHIC flowCyBar
निस्र्पक Microbiome गतिशीलता – शुद्ध संस्कृतियों से प्राकृतिक समुदायों के लिए प्रवाह Cytometry आधारित कार्यप्रवाह
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Lambrecht, J., Schattenberg, F.,… More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

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