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CARACTERISATION Microbiome dynamique – écoulement Cytometry basé dans les Workflows de Cultures pures des communautés naturelles

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Analyse en cytométrie en flux s’est avérée précieuse pour enquêter sur des cultures pures et le contrôle dynamique des communautés microbiennes. Nous présentons trois flux de travail complet, de prélèvement d’échantillons pour l’analyse des données, des cultures pures et communautés complexes dans un milieu claire ainsi que dans des matrices difficiles, respectivement.

Abstract

L’enquête des cultures pures et le suivi de la dynamique des communautés microbiennes sont essentiels pour comprendre et maîtriser les écosystèmes naturels et les applications techniques grâce aux micro-organismes. Prochaine génération méthodes de séquençage sont largement utilisés pour résoudre les microbiomes, mais ils sont généralement des ressources et temps intensif et offrent pour la plupart des informations qualitatives. Microbiome cytométrie ne souffre pas de ces inconvénients et peut fournir l’abondance sous-communauté relative et absolue cellule numérote en-ligne. Bien qu’il ne livre pas directes informations phylogénétiques, il peut augmenter la profondeur de l’analyse et la résolution des approches de séquençage. Contrairement aux applications médicales dans la recherche et les paramètres courants, cytométrie en flux est encore peu utilisée microbiome analyse. Informations manquantes sur les pipelines analyse préparation et données échantillon peuvent créer une barrière à l’entrée pour les chercheurs face à des défis d’analyse microbiome qui seraient souvent des demandes de cytométrie en flux montant pour manuels. Ici, nous présentons trois flux de production complète pour des cultures pures, communautés complexes en clairement moyennes et complexes des communautés dans des matrices difficiles, respectivement. Nous décrivent les procédures d’échantillonnage et fixation individuelles et optimisé souillant des protocoles pour les ensembles d’échantillons respectifs. Nous élaborer l’analyse par cytométrie en flux, avec une recherche complexe centrée et un dispositif d’application de haut banc ciblée, décrire la cellule procédure de tri et proposons des ensembles d’analyse de données. En outre, nous proposons des contrôles expérimentaux importants et appliquer les flux de travail présentée à l’ensembles d’échantillons respectifs.

Introduction

Les microorganismes jouent un rôle essentiel dans de nombreux aspects de l’homme vivant. Ils sont les principaux facteurs biotiques de la carbone de planètes, azote, phosphore et soufre cycles1et acte comme dégradant2,3 comme synthèse4 biocatalyseurs dans diverses industries, telles que le traitement des eaux usées 6 5 ou la biotechnologie. Ils constituent même le microbiome humain, qui a une influence directement sur la santé humaine et métabolisme7,8. Par conséquent, les informations sur la structure, fonction et comportement dynamique des micro-organismes, en réponse à leur environnement immédiat, sont nécessaires si nous voulons bien comprendre et manipuler ces systèmes. Next generation sequencing (NGS) est la technologie établie pour résoudre microbiome structure et la fonction9. Cependant, l’analyse et l’évaluation des données de l’end ne peut pas donner des informations quantitatives et est toujours coûteux, chronophages et pas du tout prête à fournir des résultats sur place dans les couloirs de la performance. Certaines bactéries affichent l’heure de génération au-dessous de 1 h et cause de structures communautaires dans certains environnements10en constante évolution. Suite à cette dynamique, en utilisant des approches de séquençage dépasserait la capacité financière et de la main-d'œuvre des laboratoires plus scientifiques.

En revanche, cytométrie peut fournir des empreintes communautaires similaires aux données de l’end, tout en conservant une efficacité plus grande du temps, du travail et coût. Nous présentons ici les techniques de cytométrie en flux d’écoulement en mesure de suivre la dynamique communauté microbienne à ligne au niveau de la cellule unique. Contrairement à NGS, cytométrie de flux ne fournit pas d’affiliation phylogénétique ou informations sur gènes fonctionnels, mais fournit le nombre de cellules quantitative. À l’aide de cytométrie en flux, les communautés microbiennes pouvant être résolues en sous-communautés avec facteur de dispersion distinct et des propriétés de fluorescence (forward scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC) fournissent des indications sur la taille des cellules et la granularité, respectivement). L’approche présentée utilise principalement cell taille - et ADN s’élèvent des informations connexes qui sont associés à certains types de cellules et les États physiologiques (croissance). Le contenu en ADN est quantifié à l’aide de l’UV-excitables 4', 6-diamidino-2'-phénylindole (DAPI) colorant, se lie aux régions riches A-T de l’ADN et peut même résoudre différents niveaux chromosomiques. En combinant fluorescence DAPI et FSC plus de 50 sous-communautés peuvent distinguer et surveillées pour la commutation des abondances de temps11. Les variations d’abondance sous-communauté peuvent être corrélées avec les changements dans les environs de micro-environnementales, telles que le pH et produit des titres12, avec des paramètres globaux, tels que la météo13,14, ou en cas d’intestin ou de la salive microbiomes avec certains traitements médicaux15. Ces corrélations révèlent sous-communautés clées responsables des fonctions particulières dans le réseau métabolique de l’ensemble de la communauté. Les sous-communautés clées peuvent ensuite être spécifiquement promues supprimées en altérant les micro-environnements environnantes ou triées pour séquençage subséquent15 ou proteomic investigation16.

Cependant, cytométrie en flux communauté microbienne n’est pas encore largement établi en raison du nombre relativement faible de dispositifs de cytométrie en flux capables de résoudre correctement les populations microbiennes ou communautés. En outre, le manque d’expérience, communauté analyse pipelines et évaluation des données efficace peut poser une barrière à l’entrée des chercheurs face à des défis de l’analyse sur le microbiome. Nous avons créé des flux de travail complet pour s’attaquer à ces questions. Pour illustrer leur applicabilité générale, nous allons présenter eux sur trois ensembles d’échantillons exemplaire (fichier complémentaire 1-S1), à savoir j’ai) une culture pure (PC) pour des applications biotechnologiques, cultivées dans un milieu défini clairement (l'Pseudomonas putida KT 2440 sur le glucose), ii) une communauté de labo complexes dans un milieu transparent (Communauté de boues activées (ASC) dans les eaux usées synthétiques) et iii) une communauté complexe de milieux naturels dans une matrice dense (Communauté de biogaz (BC) en maïs ensilage).

Plusieurs facteurs influencent le choix du protocole pour chacun de ces ensembles d’échantillons. Cryogénique renonce à l’utilisation de produits chimiques toxiques, mais est essentiellement limitée à des environnements de laboratoire grâce à l’utilisation d’azote liquide pour le glaçage au choc. La stabilisation du formaldéhyde et éthanol ultérieur fixation permet un échantillonnage en vrac sans la nécessité d’une préparation aliquote et s’est avéré pour être stable sur de longues périodes. Toutefois, les échantillons riches en protéines tels que la salive humaine15 peuvent être problématiques, flocs de protéine, denaturized par la formaldéhyde, pourraient provoquer un défavorable rapports signal sur bruit. Le séchage des échantillons aura le plus de temps (environ 1 h au total) des procédures dans cette comparaison, mais peut être effectué sur place sans produits chimiques toxiques. Il donne des granulés stables en tubes, qui peuvent être facilement expédiés sans prendre de précautions supplémentaires ou refroidissement risque. En outre, beaucoup de méthodes de fixation alternative ont été proposées11. Nous conseillons vivement de tester la stabilité de résolution et de la fixation de différents protocoles lors de l’introduction d’un nouvel ensemble de l’échantillon.

Nous avons utilisé deux cytomètres différent afin d’analyser les ensembles : i) une recherche hautement sophistiqué et coûteux, centrée trieuse et ii) un analyseur haut de la page application axée banc, qui semble plus approprié pour application sur5. La Colombie-Britannique a été mesurée avec l’analyseur de dessus de banc, tandis que le PC et l’ASC ont été mesurés avec le trieur de cellules. L’analyse de l’échantillon trois exemplaires définit des procédures différentes requis pour la reproductibilité optimisée, de stabilité de l’échantillon et de commodité de flux de travail. Le protocole suivant spécifie les sections pour les trois systèmes différents.

Protocol

1. l’échantillonnage et la Fixation

  1. Culture pure : deep gel15,17
    1. Prélever 2 mL de suspension cellulaire, centrifuger pendant 5 min à température ambiante (RT) et 5 000 x g et éliminer le surnageant.
      Remarque : La suspension cellulaire échantillonnés est décrite dans le fichier complémentaire 1-S1.
    2. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl avec bi-distillée H2O, pH 7,2) en outre contenant 15 % (v/v) de glycérol comme agent cryoprotecteur.
    3. Incuber pendant 10 min sur glace et choc congélation dans l’azote liquide pour stockage à-80 ° C.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons sont stables pendant au moins un mois.
  2. Activé la communauté de boues : stabilisation de formaldéhyde + éthanol fixation5,10,18
    1. Prendre 4 mL de la suspension cellulaire, centrifuger pendant 20 min à 15 ° C et 3 200 x g et éliminer le surnageant.
      Remarque : La suspension cellulaire échantillonnés est décrite dans le fichier complémentaire 1-S1.
    2. Ajouter 4 mL de 2 % de formaldéhyde dans du PBS et incuber 30 min à température ambiante.
      1. Préparer 8 % formaldéhyde solution de paraformaldéhyde à éviter la conservation méthanol additif ajouté au formaldéhyde expédié sous forme liquide. Ajouter 4 g de paraformaldéhyde à 50 mL de PBS à 70 ° C. Ajouter environ 125 µL de solution de NaOH à 10 M. Remuer jusqu'à ce que le paraformaldéhyde a complètement dissoute et laisser ensuite refroidir à RT. Ajustez le pH à 7.0 avec environ 100 µL 37 % HCl. gel la solution de formaldéhyde en aliquotes de 15 mL pour le stockage. Ne pas utiliser des aliquotes décongelées supérieure à dix jours.
        ATTENTION : Formaldéhyde doit être manipulé et disposé avec soin en raison de ses propriétés mutagènes et toxiques. Toujours porter des gants lors de la manipulation il. Utiliser un conduit d’évacuation tout en dissolvant la paraformaldéhyde pour prévenir l’exposition aux vapeurs toxiques.
    3. Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 15 ° C et 3 200 x g et éliminer le surnageant.
    4. Remettre en suspension l’échantillon dans 4 mL d’éthanol à 70 % et les conserver à-20 ° C.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons sont stables pendant au moins 2 mois. En fonction des propriétés de l’échantillon, l’étape de centrifugation en 1.2.1 peut également être effectuée pendant 10 min à 4 ° C pour gagner du temps.
  3. Communauté de biogaz : séchage
    1. Utiliser un embout de pipette 1 000 µL écrêté à l’échantillon de 200 µL de digestion visqueuse dans un tube de 2 mL.
    2. Ajouter 1 700 µL de tampon PBS et bien mélanger.
    3. Placer les tubes dans un bain à ultrasons à 35 kHz et puissance apparente de 80 W pendant 1 min à dissoudre les agrégats à grandes cellules et détacher les cellules collées pour planter les résidus cellulaires.
    4. Bien mélanger l’échantillon, l’échantillon filtrer sur un filtre à tamis 50 µL et diviser le filtrat en quatre parties aliquotes d’environ 400 µL.
      Remarque : Préparer des aliquotes à ce stade offre deux atouts majeurs. Tout d’abord, les plus petits volumes sont plus facile et plus rapide d’égouttage mécanique (centrifugeuse) et thermiquement (séchage), mais le prélèvement d’échantillons de petits volumes de habituellement boues épaisses biogaz peut être très difficile. Deuxième, extra échantillons peuvent être utilisés pour la cellule ultérieure tri, mesures de sauvegarde ou de contrôles.
    5. Centrifuger les aliquotes deux fois pendant 10 min à 10 ° C et 4 000 x g et éliminer le surnageant complètement les deux fois pour assécher les mécaniquement l’échantillon aussi complètement que possible.
    6. Faire sécher les échantillons dans une centrifugeuse chauffée sous vide pendant 40 min à 35 ° C, kPa et x 2 500 g pour créer des granulés stables d’environ-97. Stocker les pellets à 4 ° C dans l’obscurité.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les pellets sont stables pendant au moins 6 mois.

2. la coloration

NOTE : La coloration DAPI s’est avéré pour livrer des parcelles de dot de haute résolution et est donc particulièrement avantageuse lors de l’analyse des communautés. La concentration de DAPI dans la solution colorante doit être optimisée afin de garantir une intensité de fluorescence cellulaire porte bien au-dessus du niveau de bruit mais en dessous les perles. L’optimum dépend du choix de sensibilité et de perle d’instrument et peut varier entre les ensembles d’échantillons en raison de la teneur en G/C des micro-organismes contenus doit généralement être testé pour ensembles d’échantillons nouvellement introduites. Contrôle des concentrations entre 0.24 µM DAPI et 1 µM DAPI est recommandé pour l’installation présentée. Autres colorants peuvent être utilisés pour des applications spécifiques. L’utilisation d’un SYBR Green I souillant le protocole est conseillée lorsque cellule absolue précision de comptage est priorisée sur les empreintes digitales analyse (fichier complémentaire 1-S1)6,15. Elle comprend moins étapes de manipulation et de la centrifugation d’échantillon et s’applique aux cellules fixes et vitales. L’utilisation de cellules vitales, réduit encore les étapes de gestion d’échantillon en sautant la fixation et nécessite donc qu’une centrifugation pour la récolte des cellules. Cela minimise la perte potentielle de cellules et erreur de mesure en conséquence systématique. Le PBS, tampon perméabilisation et coloration solution utilisée pendant toutes les étapes suivantes doivent être filtré à travers des filtres de seringue 0,2 µm de réduire la charge de particules supplémentaires dans l’échantillon. La coloration d’un échantillon contenant des Escherichia coli BL21 (DE3) comme une norme biologique avec chaque pool d’échantillon est conseillée.

  1. Culture pure
    1. Décongeler les échantillons, centrifuger pendant 5 min à RT et 5 000 x g et éliminer le surnageant.
    2. Resuspendre le culot cellulaire dans du PBS de glace froide par pipetage répétées et ajuster l' OD700nm à 0,035 (chemin longueurcuvette = 0,5 cm).
    3. Préparer les cellules pour la coloration.
      1. Centrifuger 1 mL de suspension cellulaire ajusté pendant 5 min à RT et 5 000 x g et éliminer le surnageant.
      2. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de perméabilisation contenant de l’acide citrique 0,3 M et 4,1 mM Tween20 et bien mélanger.
      3. Incuber l’échantillon pendant 10 min sur la glace pour créer des membranes cellulaires perméables pour coloration ultérieure.
      4. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à RT et 5 000 x g et éliminer le surnageant.
    4. Ajouter 1 mL de solution contenant 0.68 µM DAPI dans un tampon 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 (289 mM Na2HPO4, 128 mM NaH2PO4 avec bi-distillée H2O, pH 7) de la coloration, les mélanger et Incuber pendant au moins 15 min à ta dans l’obscurité.
      NOTE : Ajustement précis OD est cruciale pour garantir des mesures comparables car la fluorescence DAPI varie avec la densité des cellules si la concentration de DAPI est maintenue constante. Le surnageant doit être retiré avec précaution en raison d’une pastille généralement fragile afin d’éviter la perte de cellules.
      ATTENTION : Manipuler et l’éliminer DAPI avec soin en raison de ses propriétés mutagènes.
  2. Communauté de boues activées
    1. Bien mélanger l’échantillon fixe et transférer 0,6 mL dans un tube de verre. Ajouter 1,4 mL de PBS et laisser agir pendant 10 min à RT comme indiqué au point 1.3.3. Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 4 ° C et 3 200 g x et éliminer le surnageant. Ajouter 2 mL de PBS et bien mélanger. Laisser agir pendant 5 min.
    2. Ajuster l' OD700nm à 0,035 (chemin longueurcuvette = 0,5 cm) avec du PBS.
    3. Préparer les cellules pour la coloration.
      1. Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 4 ° C et 3 200 x g et éliminer le surnageant.
      2. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de perméabilisation contenant de l’acide citrique 0,11 M et 4,1 mM Tween20 et bien mélanger.
      3. Incuber pendant 20 min à RT pour créer des membranes cellulaires perméables pour coloration ultérieure.
      4. Centrifuger l’échantillon à nouveau pendant 10 min à 4 ° C et 3 200 x g et éliminer le surnageant.
    4. Ajouter 2 mL de solution colorante contenant 0,68 µM DAPI et 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 tampon, bien mélanger et incuber pendant au moins 60 min à ta dans l’obscurité.
      Remarque : L’utilisation de tubes de verre est conseillée, car certains micro-organismes ont tendance à adhérer aux parois du tube en plastique et peuvent être perdues pendant le processus. Incubation pendant la nuit est également possible et généralement simplifie les procédures de laboratoire.
      ATTENTION : DAPI a besoin d’être traités et éliminés avec soin en raison de ses propriétés mutagènes.
  3. Communauté de biogaz
    1. Suspendre le culot cellulaire séchées dans du PBS.
      1. Ajouter 800 µL de PBS, bien mélanger et laisser le culot à tremper pendant 15 min.
      2. Aspirer la phase liquide avec une pipette µL 1 000 et déplacer le culot de tremper la partie cylindrique de la paroi du tube avec embout de la pipette. Il devrait en rester là.
      3. Placez l’embout de la pipette dans un mouvement circulaire pour écraser le culot le long des parois du tube.
      4. Laver la barbotine qui éteint les parois du tube en distribuant de la phase liquide de l’embout de la pipette le long de la paroi du tube.
      5. Agiter la suspension en aspirant et en suspendant dans la pipette trois fois.
    2. Laver l’échantillon avec du PBS.
      1. Centrifuger pendant 5 min à 10 ° C et 4 000 x g et éliminer le surnageant.
      2. Ajouter 1 500 µL de PBS et bien mélanger.
      3. Répétez les deux étapes ci-dessus une fois.
    3. Placer les tubes dans un bain à ultrasons pendant 1 min, comme indiqué au point 1.3.3 et filtrer par la suite, chaque échantillon à travers un filtre de maille de 50 µL dans un tube de verre.
    4. Diluer 2 mL de l’échantillon à OD700nm 0,035 (chemin longueurcuvette = 0,5 cm) avec du PBS.
    5. Préparer les cellules pour la coloration comme expliqué dans l’étape 2.2.3 ci-dessus.
    6. Ajouter 2 mL de solution colorante contenant 0.24 µM DAPI et 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 tampon, bien mélanger et laisser incuber pendant la nuit à ta dans l’obscurité.
      ATTENTION : DAPI a besoin d’être traités et éliminés avec soin en raison de ses propriétés mutagènes.

3. mesure

Remarque : Les ensembles d’échantillons exemplaires ont été analysés avec deux cytomètres différents. Le PC et le CSA ont été analysés avec un trieur de cellules centré des recherches plus complexes, hautement réglable et facilement personnalisable. Pour l’analyse du PC, cet appareil était équipé d’un laser défini comme décrit dans la précédente publication16, bref un bleu (488 nm, 400 mW) et un rayonnement ultraviolet (334 – 364 nm, 100 mW) laser ionique à l’argon. Pour l’analyse de l’ASC, bleu plus récent (488 nm, 400 mW) et ultraviolet (355 nm, 150 mW) ont été installés des lasers à semi-conducteurs. Dans les deux cas, le laser bleu induite par le FSC (bandpass filter 488 nm ± 5 nm, filtre de densité neutre 1.9) et le SSC (bandpass filter 488 nm ± 5 nm, filtre de densité neutre 1,9, détente). Ces caractéristiques optiques sont liés à la taille des cellules et la densité des cellules, respectivement. Les lasers UV excité la fluorescence DAPI (450 nm ± 32,5 nm du filtre passe-bande) pour la quantification de la teneur en ADN cellulaire. Le système fluidique a été exécuté à 56 (3,86 bars psi) avec la surpression de l’échantillon à maximale 0,3 lb/po2 et une buse de μm 70. Tous les paramètres ont été enregistrés comme les hauteurs des pics au lieu des pics afin d’améliorer la résolution de la mesure. La surveillance à long terme de la communauté de biogaz a été réalisée avec la cupule de flux moins complexe, basée, analyseur de dessus de banc. Un laser à semi-conducteur ultraviolet (355 nm, 50 mW) a été utilisé pour induire la FSC (355 nm ± 5 nm du filtre passe-bande) et SSC (bandpass filter 355 nm ± 5 nm, déclencheur) signaux et exciter la fluorescence DAPI (passe-bande filtre 455 nm C). L’eau utilisée pour le tampon de la gaine des deux appareils était bi-distillée et 0,1 µm filtré. Le PBS utilisé pour la dilution de l’échantillon doit être filtré à travers des filtres de seringue 0,2 µm pour atténuer le bruit de la particule dans les mesures autant que possibles.

  1. Une culture pure et la communauté de boues activées
    1. Démarrer l’instrument, laser, informatique et logiciels et de préparer pour l’analyse de l’échantillon.
      1. Passez sur les lasers et lancez pendant 15 min atteindre la température de fonctionnement et assurer la stabilité de la poutre.
      2. Remplissez le réservoir de la gaine avec 10 x gaine tampon (19 mM KH2PO4, 38 mM KCl, 166 mM Na2HPO4, 1,39 M NaCl avec bi-distillée H2O) dilué avec bi-distillée H2O à un 0,2 x solution de travail (pour le tri des cellules : 0,5 x solution de travail).
      3. Amorcer le système fluidique avec 56 lb/po2 sur la pression et le réservoir à matières avec environ 6 lb/po2 sous vide.
      4. Faire fonctionner l’instrument pendant minimum 15 min en mode rincez pour rincer le port de l’échantillon, les tubes et les buses.
    2. Calibrer avec perles standards.
      1. Préparer les mélanges de perle pour l’étalonnage dans le linéaires (1 μm μm bleu + 2 jaune-vert fluorescent) et gamme logarithmique (0,5 μm et fluorescente bleue 1 μm). Diluer la suspension de la perle des suspensions stocks originales pour atteindre des concentrations égales.
      2. En permanence mesurer le mélange de billes linéaires et adapter les pics de perle à un modèle prédéfini d’étalonnage en manipulant la buse et laser postes optiques pré calibrer l’instrument dans la gamme linéaire.
      3. Passez à la gamme logarithmique et mesurer en permanence le mélange de billes logarithmique. Monter les pics de perle à leur modèle de calibrage prédéfini pour affiner le matériel de l’instrument. Effectuer les derniers ajustements à la position de perle, utilisez le réglage de gain des tubes photomultiplicateurs (PMT).
      4. Vérifiez la position du bruit instrumental et peut-être ajuster pour l’adapter le modèle de calibration.
        Remarque : Un modèle d’étalonnage fixe pour la position des billes doit être préparé avant un projet de mesure et ne peut pas être modifié (voir le fichier complémentaire 1-S4) ! Le bruit instrumental peut être induit par des particules de l’échantillon ou le bruit électronique de la PMT et est toujours enregistré dans une certaine mesure. Il n’est pas conseillé de cacher le bruit complètement par gain ajustement ou intrigue offset. L’abondance et la position des événements bruit peuvent être une source précieuse d’informations et devraient donc figurer dans les données brutes. Des échantillons de particules très intensif peuvent nécessiter le retrait subséquent du bruit pour des raisons d’analyse comploter et de données. Contrôler l’étalonnage à intervalles réguliers au cours d’une journée de mesure pour garantir la stabilité de l’instrument et donc déguster comparabilité.
    3. Mesurer un échantillon contenant la norme biologique tel que décrit dans 2.1.4 (DAPI teinté Escherichia coli BL21 (DE3), échantillonnés et fixe au cours de la phase stationnaire (16 h) selon le protocole NCP décrite en 1.2). Vérifier la position de pointe en ce qui concerne leur gabarit de calibrage prédéfini (voir fichier complémentaire 1-S5).
      NOTE : La coloration systématique et à la mesure de la norme biologique avec chaque pool d’échantillons servira également un contrôle interne pour la procédure de marquage. Si l’appareil est calibré à l’aide de perles et la norme biologique ne s’adapte pas son modèle de calibrage prédéfini, la procédure de marquage doit probablement être répété.
    4. Acquisition de l’échantillon.
      1. Exécutez la solution colorante pendant 10 minutes rincer le port de l’échantillon et le tube et assurer la stabilité de la fluorescence DAPI dans les échantillons.
      2. Filtrer l’échantillon coloré avec un filtre de maille de 50 μm avant la mesure pour prévenir le colmatage de la buse du cytomètre ou flow capillaire.
      3. Ajouter le mélange de billes logarithmique de l’échantillon à contrôler la stabilité de l’instrument et offrent la possibilité d’une vérification rétrospective d’étalonnage. Les échantillons devraient contenir entre 1 000 et 2 500 événements dans chacune des portes deux perles.
      4. Créer une porte de cellule dans le logiciel de l’instrument lors de la première mesure du procès d’un nouvel ensemble de l’échantillon. Cette porte doit contenir les cellules colorées et exclure le bruit et les perles.
      5. Mélanger les échantillons et mesurer à une vitesse maximale de 3 000 événements s-1 jusqu'à 250 000 cellules (collectivités) ou 50 000 cellules (cultures pures) sont détectés dans la porte de la cellule.
        Remarque : Ces globules sont choisis en fonction de l’expérience avec les ensembles d’échantillons. Différents numéros peuvent être utilisés pour décaler le compromis entre l’efficacité de la mesure et la détection des sous-communautés de faible abondance dans les deux sens.
        Dépannage : Soudaine intra-mesure déplacements du talon et position de cellule peut être causée par des bulles d’air piégées dans la buse. Cela nécessite l’enlèvement et le nettoyage de la buse et le rinçage du système fluidique avec le tampon de la gaine. L’instrument doit être réajusté après remontage du gicleur (Commencez par l’étape 3.1.2).
      6. Rincez l’instrument soigneusement avec le tampon de la gaine avant arrêt et commutation des échantillons.
  2. Communauté de biogaz
    1. Démarrer l’instrument, laser, informatique et de logiciels à préparer pour l’analyse de l’échantillon.
      1. Rincez au moins 6 mL de tampon de gaine (bi-distillée H2O) à travers le tube et l’emplacement de l’échantillon dans un tube plus ou moins attaché à l’aide de la fonction de « premier fluide gaine » du logiciel instrument.
      2. Mesurer bi-distillée H2O à 5 µL s-1 de rincer le système fluidique jusqu'à ce que moins de 200 événements s-1 sont détectés au débit régulier de 0,5 µL s-1.
    2. Calibrer le système.
      1. Préparer le mélange de billes (0,5 μm et fluorescente bleue 1 μm). Diluer la suspension de la perle de l’originales solutions courantes pour atteindre des concentrations égales.
      2. En permanence mesurer le mélange de billes dans la gamme de4 log et adapter les pics de perle à leur modèle de calibrage prédéfini en manipulant les positions optiques de flux, cuvette et laser. Effectuer les derniers ajustements à la position de perle avec le réglage de gain de la PMT.
    3. Contrôler l’étalonnage avec la norme biologique comme indiqué au point 3.1.3.
    4. Acquisition de l’échantillon.
      1. Diluer 400 µL de l’échantillon coloré en 1 600 µL de PBS, mesurer et surveiller le nombre d’événements pour exécuter un test de concentration.
        NOTE : Taux de dilution ajusté peuvent être nécessaires pour d’autres sources de l’échantillon. Le nombre d’événements ne doit pas dépasser 1 200 événements s-1 dans des échantillons de particules riches pour éviter la perte de résolution dans la dispersion vers l’avant (exemple négatif en fichier complémentaire 1-S2). Des cultures pures peuvent être mesurées avec jusqu'à 2 000 événements s-1.
      2. Créer une porte de cellule dans le logiciel de l’instrument au cours de ces premières mesures du procès. Cette porte devrait contenir les cellules colorées et exclure les perles et le bruit.
      3. Diluer l’échantillon selon les résultats de l’essai de la concentration de courir au maximum 1 200 événements total s-1 et ajouter le mélange de billes à l’échantillon à contrôler la stabilité de l’instrument et offrent la possibilité d’une vérification rétrospective d’étalonnage. Les échantillons devraient contenir entre 1 000 et 2 500 événements dans chacune des portes deux perles.
      4. Homogénéiser et mesurer l’échantillon jusqu'à 250 000 cellules (collectivités) ou 50 000 cellules (cultures pures) sont détectés dans la porte de la cellule.
      5. Rincer l’instrument soigneusement avec du bi-distillée H2O avant l’arrêt et commutation des échantillons.

4. cellule Tri

Remarque : La cellule procédure de tri nécessite des instruments supplémentaires mis en place et s’effectue selon des protocoles publiés12.

  1. Démarrage et calibrer l’instrument tel que décrit dans les étapes 3.1.1-3.1.3, mais utiliser un 0,5 x solution de travail de la mémoire tampon de gaine.
  2. Définissez le DD fréquence et l’amplitude DD pour trouver la rupture gouttelette.
  3. Montez les plaques de déflexion, chargez-les et décider le Mode de tri pour 2 ou 4 voies.
  4. Effectuer l’étalonnage interne chute de retard avec 2 perles jaune-vert μm pour définir l’intervalle de temps que prend une particule ou cellule de voyager de l’interrogatoire point (laser hits cell) jusqu'à la dernière goutte attachée dans le flux.
  5. Trier les 6 fois 20 perles sur une lame de verre et les compter avec un microscope pour vérifier l’étalonnage de retard goutte.
  6. Préparer le modèle de porte tri.
  7. Utilisation du « mode unique et goutte : plus haute pureté 99 % » à un taux ne dépassant pas 2 500 total des événements s-1 pour trier 500 000 cellules dans maximum 4 portes à la fois (Mode de tri 4 voies).
  8. Récolter les cellules par centrifugation (20 000 x g, 6 ° C, 25 min) et geler le culot à-20 ° C pour le séquençage et l’isolement d’ADN plus tard.
    Remarque : Évitez le tri des cellules dans les portes avec moins de 5 % abondance relative, comme le temps de tri est inversement proportionnelle à l’abondance relative. Les différentes étapes sont décrites en détail dans le manuel de trieur de cellules. Le nombre de cellules nécessaires dépendent fortement les cas d’utilisation respectives et les protocoles d’extraction. De nombreuses méthodes ont été appliquées : ddPCR (1 000 cellules17,,19), l’ADNr 16 s ou mcrA amplicon séquençage (500 000 cellules6,10,,15) et la protéomique (jusqu'à 1,1 x 107 cellules 16,,17). Le tri cellulaire sera particulièrement avantageux lorsqu’il est combiné avec une démarche métagénomique à cause de la faible diversité dans les sous-communautés triées.
    ATTENTION : Ne pas toucher les déflecteurs au cours de la procédure de tri en raison des tensions élevées.

5. analyse

Remarque : La mesure de la cytométrie de flux donne « cytométrie standard » .fcs des fichiers de données avec une structure de données généralement uniforme. Cependant, cytomètre différents fabricants utilisent des versions légèrement adaptées et anciens instruments pourraient datent d’avant l’introduction de 2010 du FCS dernière norme 3.1. Cela peut conduire à plot point mise à l’échelle des problèmes qui empêchent la comparaison directe des résultats recueillis avec différents instruments. Toutefois, les points de données individuels sont toujours stockés dans les lignes d’une matrice, avec le scatter respectif et les valeurs d’intensité de fluorescence dans les différentes colonnes. Les pipelines d’analyse microbiome présentés utilisent la taille des cellules distinctives et la teneur en ADN pour décrire les sous-communautés microbiennes. Ces paramètres sont corrélés à l’intensité de canal de fluorescence FSC et DAPI (trieur de cellules : FL-4, analyseur : FL-1) et le résultat en grappes sous-communauté lorsque visualisées dans les parcelles de fluorescence FSC vs DAPI bidimensionnels. Ces parcelles de dot permettent l’interprétation et l’analyse des données de cytométrie de flux et sont habituellement de façon logarithmique échelle. Ils peuvent être affichés de .fcs fichiers utilisant des solutions de logiciel ou de la tierce partie propriétaire cytomètre et servent de base à l’automatisé (cytométrie de flux histogramme Image comparaison, CHIC) et semi-automatique (Cytometric Barcoding, CyBar) analyse de la communauté.

  1. Comparaison par cytométrie en flux histogramme de l’Image
    Note : Le code, une documentation détaillée et un manuel pour ce paquet sont disponibles à http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Ils ont également été publiées20.
    1. Installer et charger le package R, définir le répertoire de travail contenant les fichiers .fcs et mettre en place une liste de fichiers en exécutant :
      > source ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Définir le répertoire de travail vers le chemin où se trouvent vos fichiers FCS
      > # Tapez le chemin d’accès dans les citations
      > setwd("")
      > # Obtenir une liste des noms de fichier des fichiers FCS situés dans votre répertoire de travail
      > fichiers <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Obtenir une liste des noms de fichier des fichiers FCS inclus au forfait
      > fichiers <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full = TRUE, modèle = « *.fcs »)
      > # Lire le premier fichier de FCS comme flowFrame
      > cadre < - lire. FCS(Files[1],ALTER.Names=true,transformation=false)
      > # Obtenir une liste des noms de paramètre/canal
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. Créer des images pour les cytométrie de flux des données brutes en exécutant la fonction de paquet « fcs_to_img » :
      > # Créer l’histogramme des images en utilisant les paramètres par défaut
      > fcs_to_img(files)
    3. Définir des sous-ensembles des images histogramme en exécutant la fonction de paquet « img_sub » :
      > # Créer l’histogramme des sous-ensembles d’image à l’aide des paramètres par défaut
      > img_sub (fichiers, ch1 = "FS. Log",CH2="FL.4.log »)
    4. Calculer les valeurs de chevauchement et XOR pour effectuer l’analyse d’image en exécutant la fonction de paquet « calculate_overlaps_xor » :
      > # Enregistrer les noms de toutes les images de sous-ensemble sous forme de liste
      > des sous-ensembles <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Calculer des chevauchements et des images XOR et écrire des valeurs dans deux nouveaux fichiers
      > résultats <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. Créer non-metric que Multidimensional scaling (JNM) parcelles pour l’analyse de la similitude en exécutant la fonction de paquet « plot_nmds » :
      > # Afficher une parcelle JNM des échantillons
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Code à barres par cytométrie en flux
    NOTE : Le code, une documentation détaillée et un manuel pour ce paquet sont disponibles à http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Ils ont également été publiées11,12.
    1. Développer un modèle de portail principal à utiliser sur tous les échantillons.
      1. Charger les fichiers .fcs dans le logiciel d’analyse à l’aide de la fonctionnalité glisser- d├⌐poser.
      2. Double-cliquez sur une mesure et choisir les paramètres d’axes x et y dans les listes déroulantes respectives pour ouvrir un terrain de fluorescence FSC vs DAPI.
      3. Le polygone, outil de dessin permet de reproduire la porte cellule précédemment utilisée pour contrôler le nombre de cellules analysées dans les étapes 3.1.4.5 et 3.2.4.4 et nommez-le en conséquence. Faites glisser l’entrée de porte de cellule dans la liste de l’échantillon sur le groupe de tous les échantillons en commun il.
      4. Double-cliquez sur la porte de la cellule et l’affectation de l’axe afin de visualiser les événements de porte cellule correcte.
      5. Définir les sous-communautés répandues dans l’ensemble de l’échantillon avec l’outil elliptique portes suivant les lignes directrices publiées12 et utiliser le balayage de la SSC ou un autre troisième paramètre21 pour assurer l’intégrité du modèle de porte. Piscine, contrôler et ajuster l’allocation sous-communauté sur les autres échantillons.
    2. Exporter l’abondance relative de sous-communauté dans un fichier .txt pour utilisation dans le script de R.
      1. Ouvrez l’éditeur de tableau avec l’onglet édition.
      2. Ajouter des colonnes pour chaque commune qui a été défini à l’étape 5.2.1.5 et définir la statistique de sortie pour « frequency of parent » et nommez-les.
      3. Créer la table dans l’éditeur de « table » après avoir choisi le gain de format et la destination.
        Remarque : Le logiciel d’analyse fournit directement l’abondance relative de sous-communauté. Ils peuvent également être obtenus en divisant le nombre d’événements dans le portail sous-communauté individuel par le nombre d’événements dans la porte de la cellule. Les valeurs doivent être enregistrés dans une matrice de délimité par des tabulations dans un fichier .txt qui ne peut pas contenir tous les champs de n.a. et doit répondre à certaines exigences supplémentaires pour être lu par le code R (voir le manuel et la FAQ pour obtenir des instructions spécifiques).
    3. Installer et charger le package R et charger les données en exécutant :
      > source ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Tapez le chemin d’accès dans les citations
      > setwd("")
      > # Charge dataset
      > data(Cell_number_sample)
      > # Afficher les données
      > Cell_number_sample [, -1]
    4. Normaliser les abondances relatives en exécutant la fonction de paquet de « normaliser » :
      # Normaliser les données, imprimez les 2 chiffres
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. Créer un code à barres de la normalisée et un boxplot de l’abondance relative original en exécutant la fonction de paquet « cybar_plot » :
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (Data (Normalized_mean))
      # Tracés avec les paramètres par défaut
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. Créer un terrain de SNDM de l’abondance relative original.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (Data (Normalized_mean))
      > Terrain JNM # d’un nombre normalisé cel
      > nmds(Normalized_mean)
    7. Créer l’analyse de corrélation de l’abondance relative normalisée et d’autres paramètres en exécutant la fonction de paquet de « corrélation » :
      > # Charge dataset
      > data(Corr_data_sample)
      > Les valeurs de corrélation show #
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Exécuter une analyse de corrélation
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      NOTE : CHIC et CyBar s’appuient sur l’abondance relative. Cependant, cytométrie en flux peut également déterminer les numéros de cellule absolue, ce qui pourraient être d’un grand intérêt pour les applications biotechnologiques. Pour déterminer le nombre de cellule absolue, le nombre de cellules dans la porte de l’intérêt est divisé par le volume de l’échantillon analysé. Le volume de l’échantillon analysé peut être déterminé en ajoutant la suspension de la perle avec une concentration connue dans l’échantillon (formule fichier complémentaire 1-S7). L’analyseur de dessus de banc est également équipée d’un dispositif de comptage volumétrique vrai qui quantifie directement le volume dans le tube à essais pendant la mesure. Il est conseillé d’utiliser un SYBR Green I souillant le protocole pour le comptage des cellules.

Representative Results

Les résultats représentatifs suivants mettent l’accent sur la nécessité de réplicats et illustrent les techniques de visualisation et d’analyse de données différentes sur chacune des trois séries d’échantillon. Ils présentent les résultats des données possible évaluation pipelines adapté pour répondre aux questions de recherche sur le jeu respectif. Cependant, les techniques présentées ne sont pas exclusifs à l’ensemble de l’échantillon qui elles sont présentent. Les données brutes de cytométrie de flux a été rendues publique avec l’ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Précédemment les données téléchargées de NCP sont disponibles sous l’ID FR-FCM-ZYD7.

Réplicats techniques et biologiques ont été prises, préparés et analysés selon les protocoles publiés11. Réplicats biologiques du PC et ASC proviennent de trois flacons parallèles. Réplicats biologiques de la Colombie-Britannique ont servi de trois prélèvements ultérieurs à un endroit dans une usine pilote. Trois aliquotes d’un échantillon ont été fixés, teintés et analysées afin d’assurer la reproductibilité technique. La reproductibilité des méthodes a été évaluée conformément aux procédures précédemment publiées11. Un modèle de portail pour tous les échantillons d’ensemble d’un seul échantillon (fichier complémentaire 1-S6) a été utilisé pour le calcul de l’écart (%) par la porte.

Pour le PC, l’écart maximal de l’abondance relative se 3,44 %, l’écart moyen est de 2,13 % (Figure 1). Pour l’ASC et la Colombie-Britannique, l’écart maximal de la norme de l’abondance relative ont été 1,27 % et 0,88 %, tandis que les moyennes des écarts étaient 2,13 % et 0,21 % (fichier complémentaire 1-S8).

Une procédure standard, lors d’enquêtes sur une culture pure souche, est la préparation d’une courbe de croissance d’analyser la phase de latence, temps de génération et la densité des cellules dans des conditions spécifiques. Nous avons combiné cette procédure avec le flux de travail analyse de cytométrie en flux pour atteindre une meilleure compréhension du système (Figure 2). Le FSC vs DAPI fluorescence parcelles révèlent les États de cycle cellulaire de la culture à différents moments de la culture de lot. Un modèle de portail principal (fichier complémentaire 1-S6) a été créé afin de quantifier la proportion de cellules avec un (c1n), deux (c2n) et plusieurs chromosomes (cXn, Figure 2 b). La proportion prédominante de cellules inoculées n'eu qu’un seul chromosome (93,7 % 0 h). Cela a changé radicalement au cours de la phase exponentielle de croissance où presque toutes les cellules contiennent plus d’un (99,6 %, 4 h) et plus de la moitié de la population (53,1 %) contenaient même plus de deux chromosomes. Cela illustre la capacité de s P. putidade reproduire ses chromosomes plus vite que son temps de génération.

Analyse en cytométrie en flux s’est avéré très utile pour suivre l’évolution des communautés microbiennes. Il peut suivre la dynamique des communautés beaucoup plus proche que la méthodes moléculaires intensive des ressources plus5,10. Nous avons mis en lumière ces dynamiques dans un film et a gagné un aperçu des changements de communauté boues activées au fil du temps. Chaque image une seconde montre une parcelle de fluorescence FSC vs DAPI d’un point de prélèvement (2 de fichier supplémentaire). Un déplacement très distinct entre 0 et jour 4 a été suivi de la mise en place d’une communauté de base après le 7e jour. Sous-communautés supplémentaires est venu au jour 21. Nous avons établi un modèle de portail principal (fichier complémentaire 1-S6) permettant l’évaluation des dynamiques microbiennes au niveau sous-communauté. Les sous-communautés dominantes dans les différentes étapes de l’expérience ont été clairement identifiées à l’aide de l’outil CyBar (Figure 3). Combinant avec la distribution des fréquences de l’abondance relative sous-communauté viable et a aidé à choisir les portes qui sont intéressant (changement significatif en abondance déclenchée à un moment clé) (abondance relative à plus de 5 %) pour le tri et plus analyse22.

Demandes de bioréacteur à échelle industrielle peuvent affronter des hétérogénéités spatiales potentielles en raison des limites de l’agitation. Ils sont également fréquemment exposés à l’évolution des paramètres opérationnels, comme les déviations dans la qualité des substrats non synthétique. La Colombie-Britannique représente un tel système et a été échantillonnée dans diverses localités dans un réacteur à flux dynamiquement par fiche. Parcelles de fluorescence de la FSC vs DAPI (Figure 4) de l’exemplaire points montrent l’hétérogénéité temporelle seulement peu spatiale, mais prononcée. La Colombie-Britannique a été étudiée plus loin en utilisant les deux, le CHIC rapide automatisée et le modèle de maître porte plus approfondi basée CyBar approche.

Sa nature automatisée, rapide et impartiale, rend le CHIC particulièrement intéressante pour le contrôle sur place des bioprocédés en milieu industriel. Il compare les données brutes .fcs de tous les échantillons disponibles. Deux de ces comparaisons sont affichés dans la Figure 5. Les valeurs résultantes de dissimilarité confirment les observations précédentes concernant l’hétérogénéité spatiale et temporelle. La forme de parcelles générées JNM la dissimilarités outils CHIC (Figure 6) plus justifie ce résultat et il visualise en conséquence.

En outre, nous avons calculé les abondances relatives des 23 sous-communautés de la Colombie-Britannique en utilisant un modèle de portail principal (fichier complémentaire 1-S6). Une analyse de corrélation de 48 échantillons prélevés dans une période d’un an a été réalisée pour comprendre les relations fonctionnelles dans la communauté microbienne. Ceci peut aider à identifier les portes de l’intérêt pour complément d’enquête (4 cellules tri). Fortes corrélations positives ou négatives avec des paramètres abiotiques comme produit des titres peuvent aider à comprendre et à optimiser des écosystèmes et des processus biotechnologiques. Le taux de charge organique inclus dans cette corrélation (Figure 7) illustre un tel paramètre abiotique. G5, G4 et G10 présentent de fortes corrélations positives et pouvaient contenir éventuellement espèces fermentatives, tandis que la corrélation négative au G8 pourrait soupçon vers methanogenic archaea.

Figure 1
Figure 1 : reproductibilité de l’analyse par cytométrie en flux de la culture pure. Fluorescence FSC vs DAPI parcelles avec perles de contrôle (A, B) et un bar de parcelles de l’abondance de 3 sous-communauté [%] avec des barres d’erreur qui représente un écart ± (C, D). Les abondances relatives ont été déterminées avec le modèle de portail illustré fichier complémentaire 1-S6. Trois réplicats biologiques A, B et C ont été prises de la courbe de croissance à 4 h trois répétitions techniques P1, P2, P3 et ont été préparée à partir d’échantillon A mesuré trois fois, respectivement : M1, M2, M3 et sont donnés avec leurs écarts respectifs. 50 000 événements ont été enregistrés dans la porte de la cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : analyse du cycle cellulaire de la culture pure préléves par une courbe de croissance expérimenter plus 12 h. (A). Fluorescence FSC vs DAPI parcelles des bi-horaire des échantillonnages qui montrent un changement de la teneur en ADN pendant la phase de croissance exponentielle. Cette série de mesures n’inclut pas les perles (voir fichier complémentaire 1-S3). (B). courbe de croissance axée sur la densité optique avec des barres d’erreur qui représente un écart de ± et abondances dans les sous-communautés au fil du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Evolution de la structure communautaire de boues activées pendant 24 jours. (A) le flowCyBar avec des distributions de fréquence visualisées en boîtes pour les portes individuelles qui sont conclues par la similitude des tendances qui vient se superposer, le correspondant de couleur touche (B) et une analyse de similarité dans un esprit d’intrigue JNM R < 0,001 () C). les parcelles sous-jacentes sont présentées dans la séquence de film supplémentaire 2 fichier. Abondances relatives ont été déterminées en utilisant le modèle de porte dans le fichier complémentaire 1 - S6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : hétérogénéité spatiale et temporelle de la structure de la communauté microbienne à l’échelle industrielle brancher réacteur biogaz. D’échantillonnage (A) la comparaison de la structure de la communauté microbienne des quatre ports I à IV jour 223. (B) la comparaison entre les variations de structure temps communautaire dépendant du jour 0 au jour 384 en port II. Le bruit a été coupé tardivement pour améliorer la visualisation. 250 000 événements ont été mesurées dans la porte de la cellule (fichier complémentaire 1-S6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : comparaison par cytométrie en flux histogramme de l’Image — CHIC. Le principe de l’algorithme de CHIC est illustré en comparant deux échantillons représentant l’hétérogénéité spatiale et temporelle, respectivement. (i) CHIC images sont créés à partir des fichiers .fcs après avoir sélectionné deux paramètres pour afficher (fluorescence FSC vs DAPI). Le niveaux de gris (0-255) codes le nombre d’événements à un pixel. (ii) CHIC sous-ensembles sont générés après la spécification de la zone contenant des cellules (ici : 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR combinaison image est créée en comparant des pixels entre les sous-ensembles. Aucune différence est égale à 0 et s’affiche en noir. Écart maximal est égal à 200 et s’affiche en blanc. La valeur correspondante de XOR est calculée en additionnant les valeurs de l’échelle de gris de tous les pixels dans l’image XOR. (iv) superposition combinaison image est créé en ajoutant les valeurs de niveaux de gris des pixels des sous-ensembles. La valeur correspondante de la superposition est calculée à partir des pixels d’une image de superposition qui ne pas égal à zéro et donc contiennent des informations. (v) la dissimilitude valeurs sont calculées en divisant les valeurs XOR et superposition. Voici la base de l’intrigue de JNM dans la Figure 6. Aussi bien les valeurs de dissimilarité et le spectacle de terrain JNM une négligeable spatiale- et une hétérogénéité de la communauté temporelle prononcé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : CHIC base analyse de la similitude des échantillons communauté biogaz. L’échantillon 0-day a été exclu de ce complot grâce à sa structure communautaire extrêmement différentes qui faussent l’analyse (fichier complémentaire 1-S11). L’intrigue de JNM confirme l’hypothèse au sujet peu spatiale- et supérieure hétérogénéité temporelle à l’aide de l’outil CHIC et expliquait à la Figure 5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : analyse de corrélation sur la communauté biogaz. La matrice a été calculée à l’aide du coefficient de rang de Spearman et repose sur l’abondance relative des 23 sous-communautés qui ont été déterminées avec le modèle de la porte principale dans fichier complémentaire 1-S6. Ils sont en corrélation avec le taux de charge organique (OLR) pour 48 échantillons prélevés dans une période d’un an. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : analyse de similarité des planctoniques (P) et des boues basé dans les eaux usées, les communautés de (S). Échantillons ont été prélevés sur le bassin de boues de clarificateur primaire (PCL), activé (AS) et le réservoir de digesteur (DT) d’une usine de traitement des eaux usées à grande échelle (parcelles de dot dans fichier complémentaire 1-S10). Abondances relatives ont été déterminées à l’aide du modèle portail indiqué dans le fichier complémentaire 1-S6. L’abondance de ces sous-communauté a également analysé avec l’outil flowCyBar pour créer un CyBar (fichier complémentaire 1-S10) et JNM intrigue (R < 0,01). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : stabilité de la Fixation de la culture pure. Échantillons provenant de l’expérience de courbe de croissance prise à 0 h ont été stockées pendant 28 jours à-80 ° C après fixation à 15 % de glycérol. Fluorescence FSC vs DAPI parcelles avec contrôle perles sont indiqués. Série de mesures n’inclut pas les perles (fichier complémentaire 1-S3). 50 000 événements ont été enregistrés dans la porte de la cellule (fichier complémentaire 1-S6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Une analyse réussie des populations microbiennes et des communautés nécessite des cytomètres de flux bien réglé, un choix approprié des paramètres de maille et un flux de travail fiable de prélèvement d’échantillons et de fixation vers l’évaluation de la mesure et de données. Les paramètres de la cellule sélectionnée doivent consort avec les longueurs d’onde d’excitation disponible ; Nous utilisons et recommandons DAPI, qui est très sensible à de faibles concentrations ; mais il faut être excité par un laser UV, ce qui n’est généralement pas compris dans les configurations standard cytomètre. Autres colorants, comme le SYBR Green I, aussi tache de populations entières ou communautés mais offrent généralement des résolutions inférieures. Nous ne recommandons pas en utilisant les procédures du poisson ou des tests de viabilité dans les communautés microbiennes. Ces approches sont impossibles à quantifier, de vérifier et de contrôler leurs effets sur les espèces individuelles dans la Communauté étant incertain. Ils ne peut pas être fiable testés, tant qu’une proportion importante des communautés typiques n’est toujours pas disponible comme une culture pure.

Des étapes cruciales dans le protocole comprennent des procédures d’échantillonnage et de fixation ainsi que tri cellulaire. L’échantillonnage peut être compliquée par la tendance de certaines cultures pures et les communautés microbiennes à agréger à flocs ou adhèrent aux particules de la matrice de l’échantillon. Il est essentiel de se dissiper ces agrégats et de séparer les cellules dans un échantillon avant de leur présenter de cytométrie pour garantir des résultats fiables. Les protocoles de préparation présentées ont été optimisées pour permettre l’analyse de cellule unique. Une filtration finale 50 µm est effectuée avant la mesure pour enlever n’importe quel agrégat résiduelle et empêcher la buse de 70 µm de la trieuse et la cuvette de l’écoulement de l’analyseur de boucher. Flocons de cellules des usines de traitement des eaux usées sont particulièrement abondante, robuste et vitale pour le fonctionnement du système. Nous avons étudié les planctoniques et boues fondé des communautés microbiennes dans les différents réservoirs d’une usine de traitement des eaux usées à grande échelle, pour tester le protocole établi. La boue formant cellule agrégats ont été clairement dissipées et la composition de la communauté est restée stables. En outre, les communautés planctoniques et axée sur les boues présentaient une similitude remarquable entre eux dans toutes les trois réservoirs échantillonnés (Figure 8, fichier complémentaire 1-S10). Ces résultats ont été vérifiés par comparatif 16 s rDNA amplicon séquençage d’une douce, une formaldéhyde traitées-, un formaldéhyde et l’éthanol fixé-et un échantillon trié10. Néanmoins, extraordinairement difficile des échantillons environnementaux, tels que les biofilms fortes ou bactéries qui poussent dans les chaînes étroitement connectés, peut être impossible de se dissiper. Des échantillons de sol peuvent être particulièrement problématiques, car les particules omniprésents apparaissent dans l’histogramme et peuvent masquer les cellules par pure abondance. Dans ce cas, les méthodes de séquençage traditionnelles doivent être appliquées.

La stabilité de la fixation de chaque nouvel ensemble de l’échantillon doit être testée avant de concevoir l’expérience pour garantir la validité du résultat. Stabilité de la bonne fixation permet également la mise en commun la souillure et la mesure de plusieurs points de temps d’échantillon sur une seule journée. Il permet en outre des mesures de réplication et rétrospective cellule Tri des moments décisifs, après la conclusion et l’évaluation finale de l’expérience. La stabilité de la fixation de la culture pure a été vérifiée pendant 28 jours (Figure 9). Pour des expériences sur place, y compris le transport de l’échantillon, la stabilité de la fixation doit être testée sur de longues périodes (dans ce cas, 60 jours pour la communauté de boues activées, 195 pour la communauté de biogaz, fichier complémentaire 1-S9).

La coloration n’est généralement pas problématique mais doit être contrôlée avec une norme biologique pour permettre l’application des outils d’évaluation de la bioinformatique. Nous avons utilisé la simulacre souche e. coli BL21 (DE3), qui a été fixé selon le protocole NCP et stockées pour une utilisation dans chaque lot de coloration.

Mis à part le DAPI, SYBR Green I a été appliquée avec succès pour résoudre des communautés microbiennes pour plusieurs années14,23,24,25,26. SYBR Green je peux résoudre les communautés en sous-ensembles de haute et basse des acides nucléiques (HNA et LNA) à l’aide de cellules vivantes dans un mode en ligne. DAPI, cependant, est plus précis dans sa liaison à l’ADN et permet la distinction de plus de 50 sous-communautés dans un seul échantillon ensemble mais nécessite une étape de fixation avant la coloration.

Cellule de tri est une caractéristique remarquable de cette approche et peut être appliquée si certaines sous-communautés présentent un intérêt supplémentaire. Il faut souligner que ni PFA-(jouée pendant seulement 30 min) ni traitement à l’éthanol ou DAPI coloration10 avait un effet négatif sur le séquençage d’amplicon 16 s ultérieures. Potentiel des influences de la fixation et coloration des procédures sur le métagénome sous-communauté analyses doivent encore à tester.

Beaucoup d’informations sur les fonctions communautaires et de la tendance dynamique peut être obtenu indépendamment de l’approche tri lorsqu’ils concernent des outils bioinformatiques qui résoudre des fonctions communautaires sur le plan de cellule par cellule virtuelle et ces fonctionnalités de connexion avec abiotiques paramètres.

Récemment, un certain nombre de nouveaux outils bioinformatiques évaluation, tous utiles pour les deux le SYBR vert j’ai et les approches DAPI, ont été développées pour résoudre des modèles communautaires par cytométrie en flux. Il s’agit de FlowFP27, les paquets utilisés dans cette étude (flowCHIC20, flowCyBar,28), un modèle de déconvolution établi avec eau douce communautés29 et un outil qui permet de discriminer les souches selon leur physiologique caractéristiques30. En outre, la diversité par cytométrie en flux peut être déterminée25 et propriétés de stabilité même des communautés microbiennes peuvent être suivies avec un outil en ligne de10.

Ainsi, les analyses de cytométrie en flux ont un énorme avantage quand il s’agit d’une évaluation rapide des communautés microbiennes et les corrélations de paramètres abiotiques. Cependant, il y a toujours les limites de la méthode. Il ne s’applique véritablement en ligne avec l’outil de flowCyBar, en raison de la procédure de réglage porte base expérimentés. En outre, le développement des cytomètres sur mesure, facile à utiliser favoriserait grandement la prolifération de l’approche d’analyse de flux par cytométrie en flux microbiome. Premiers pas dans cette direction sont entrepris28.

Les applications futures de la cytométrie microbienne peuvent imaginer en écologie microbienne, car il permet la surveillance de haute fréquence dans la plage de temps de génération bactérienne et il a été démontré que les paradigmes écologiques soient appliquent aux données par cytométrie en flux5 ,,10. La méthode est très utile pour des projections systématiques des milieux naturels comme les contrôles obligatoires de l’eau potable en Suisse31. Il peut également être un outil précieux pour des applications médicales comme humain15 ou animaux32 microbiome dépistage. En outre, derniers développements en bioinformatique permettrait la cytométrie microbienne à un capteur intégré dans les contrôles des systèmes microbiens gérés. Population microbienne cytometry fournit également un outil de dépistage pour le tri des cellules, qui permet une meilleure résolution recherches génomiques des sous-ensembles spécifiques communautaires.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.
 

Acknowledgments

Nous remercions Michael Jahn et Yuting Guo pour fournir la procédure et les ensembles de données de la culture pure et de la communauté de boues activées, respectivement. Nous remercions encore Katrin Mörters pour analyser les échantillons de communauté de biogaz. Ce travail a été financé par le Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.v. (FNR, projet biogaz-Fingerprint Nr. 22008313) pour le compte du ministère fédéral allemand pour l’alimentation et l’Agriculture (BMEL), le Programme d’Innovation pour les PME (ZIM) du ministère fédéral Central des affaires économiques et de l’énergie (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), la Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, projet sur-demande Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), le ministère fédéral allemand de l’éducation et La recherche (BMBF) (FZK 03XP0041G) et axés sur le programme de financement de l’Association Helmholtz (POF III R31 sujet 3 bioénergie).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

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References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).

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Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

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