Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kendetegner Microbiome Dynamics – flowcytometri baseret arbejdsprocesser fra renkulturer naturlige samfund

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Flow cytometric analyse har vist sig værdifuld for undersøger renkulturer og overvågning af mikrobielle samfund dynamics. Vi præsenterer tre omfattende arbejdsprocesser, prøveudtagning til analyse af data, for renkulturer og komplekse samfund i klare medium såvel som i udfordrende matricer, henholdsvis.

Abstract

Undersøgelsen af renkulturer og overvågning af mikrobielle samfund dynamics er afgørende for at forstå og styre naturlige økosystemer og tekniske anvendelser drevet af mikroorganismer. Næste generation sekventering metoder er almindeligt brugt til at løse microbiomes, men de er generelt ressourcen og tiden intensivt og levere det meste kvalitative oplysninger. Flow cytometric microbiome analyse ikke lider under disse ulemper og kan give relative subcommunity mængder og absolut celle numre på linje. Selv om det ikke levere direkte fylogenetiske oplysninger, kan det forbedre analyse dybde og opløsning af sekventering metoder. I skarp kontrast til medicinske anvendelser i både forskning og rutinemæssig indstillinger, er flowcytometri stadig ikke meget udbredt for microbiome analyse. Manglende oplysninger om prøven forberedelse og data analyse rørledninger kan oprette en adgangsbarriere for forskere udfordringer microbiome analyse, vil ofte være lærebog flow flowcytometri applikationer. Her præsenterer vi tre omfattende arbejdsgange for renkulturer, komplekse samfund i klart medium og komplekse samfund i udfordrende matricer, henholdsvis. Vi beskriver enkelte stikprøver og fiksering procedurer og optimeret farvning protokoller til de respektive prøve sæt. Vi uddybe cytometric analyse med en kompleks forskning centreret og en ansøgning fokuseret bænken øverste enhed, beskrive cellen sortering fremgangsmåde og foreslår data analyse pakker. Vi desuden foreslå vigtige eksperimentelle kontrol og anvende de præsenterede arbejdsprocesser til de respektive prøve sæt.

Introduction

Mikroorganismer spiller en afgørende rolle i mange aspekter af menneskers live. De er de vigtigste biotiske faktorer af planeter kulstof, kvælstof, fosfor og svovl cykler1og fungere som nedværdigende2,3 samt syntese4 biokatalysatorer i forskellige industrier, såsom spildevandsrensning 5 eller bioteknologi-6. De udgør selv den human microbiome, som direkte påvirker menneskers sundhed og stofskifte7,8. Oplysninger om struktur og funktion og dynamiske opførsel af mikroorganismer, som svar på deres nærområder, er derfor nødvendigt, hvis vi skal forstår fuldt ud og manipulere disse systemer. Næste generation sequencing (NGS) er den etablerede teknologi til at løse microbiome struktur og funktion9. Analyse og evaluering af NGS data kan ikke give kvantitative oplysninger, og er stadig dyrt, tidskrævende og på ingen måde klar til at levere on-site resultater inden for ydeevne korridorer. Nogle bakterier vise generation tider under 1 h og forårsage konstant skiftende Fællesskabets strukturer i visse miljøer10. Efter sådanne dynamik, ville ved hjælp af sekventering metoder overstige mest videnskabelige labs finansielle og arbejdsstyrke kapacitet.

Derimod kan flowcytometri give Fællesskabet fingeraftryk svarende til NGS data, samtidig bevare en højere tid, arbejdskraft og omkostninger effektivitet. Vi præsenterer her, flow cytometric teknikker kan følge mikrobielle samfund dynamics på linjen på det enkelte celle niveau. I modsætning til NGS, flowcytometri giver ikke fylogenetiske tilhørsforhold eller oplysninger om funktionelle gener, men leverer kvantitative celle numre. Bruger flowcytometri, kan mikrobielle samfund løses i subcommunities med særskilte lysspredningen og fluorescens egenskaber (forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) giver indikationer af Cellestørrelse og granulering, henholdsvis). Den præsenterede tilgang udnytter overvejende celle størrelse - og DNA beløb relaterede oplysninger, der er knyttet til bestemte celletyper og fysiologiske (vækst) stater. DNA indhold kvantificeres ved hjælp af UV-overgearet 4', 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) farvestof, der bindes til A-T rige regioner af DNA og kan selv løse forskellige kromosomale niveauer. Ved at kombinere DAPI fluorescens og FSC kan mere end 50 subcommunities udmærkede og overvåges for at ændre mængder over tid11. Subcommunity overflod variationer kan være korreleret med ændringer i de mikro-miljømæssige omgivelser, såsom pH og produkt titers12, med globale parametre, såsom vejr13,14, eller i tilfælde af gut eller spyt microbiomes med visse medicinske behandlinger15. Disse korrelationer afsløre centrale subcommunities ansvarlig for særlige funktioner i den metaboliske netværk i hele Fællesskabet. De centrale subcommunities kan derefter specifikt forfremmet eller undertrykt ved at ændre de omkringliggende mikro-miljøer, eller sorteret for efterfølgende sekventering15 eller proteom undersøgelse16.

Men mikrobielle samfund flowcytometri er ikke endnu bredt etableret på grund af en forholdsvis lav antal flow cytometric enheder i stand til at løse mikrobielle populationer eller Fællesskaber korrekt. Endvidere kan manglen erfaring, Fællesskabets analyse rørledninger og effektiv datavurdering udgøre en adgangsbarriere for forskere microbiome analyse udfordringer. Vi har etableret omfattende arbejdsprocesser for at løse disse problemer. For at illustrere deres almene gyldighed, vil vi præsentere dem på tre eksemplariske prøve sæt (supplerende fil 1-S1), nemlig jeg) en ren kultur (PC) for bioteknologiske applikationer vokset i definerede klart medium (Pseudomonas putida KT 2440 på glukose), ii) en kompleks lab Fællesskabet i klare medium (aktiveret slam Fællesskabet (ASC) i syntetisk spildevand) og iii) et kompleks samfund fra naturlige miljøer i en tætte matrix (biogas Fællesskabet (BC) i majsensilage).

Flere faktorer påvirke protokol valg for hver af disse prøve sæt. Dyb indefrysning afkald på brugen af giftige kemikalier, men er for det meste begrænset til lab miljøer på grund af brugen af flydende nitrogen for chok frosting. Formaldehyd stabilisering og efterfølgende ethanol fiksering tillader bulk prøvetagning uden behov for alikvot forberedelse og har vist sig for at være stabilt over lange perioder. Protein-rige prøver såsom humant spyt15 kan dog problematisk, fordi protein flocs, denaturized af formaldehyd, kan forårsage ugunstige signal til støj forhold. Prøven tørring vil tage mest tid (ca. 1 time i alt) procedurerne i denne sammenligning, men kan udføres på stedet uden giftige kemikalier. Det giver stabile pellets i rør, som nemt kan sendes uden køling eller yderligere fare forholdsregler. Derudover har masser af alternative fiksering metoder blevet foreslåede11. Vi anbefaler for at teste opløsning og fiksering stabilitet af forskellige protokoller, når vi indfører et nyt sample sæt.

Vi brugte to forskellige flow cytometers til at analysere sæt: i) et meget sofistikeret og dyrt, forskning centreret celle sorteringsanlæg og ii) en ansøgning fokuseret bænk top analyzer, som synes at være mere passende for on-site program5. F.kr blev målt med bænk top analyzer, mens PC og ASC blev målt med celle sorteringsanlæg. Analysen af de tre eksemplarisk eksempel indstiller kræves forskellige procedurer for optimeret reproducerbarhed, prøve stabilitet og workflow bekvemmelighed. Følgende protokol vil angive afsnittene for de tre forskellige systemer.

Protocol

1. prøveudtagning og fiksering

  1. Ren kultur: dyb frysning15,17
    1. Tag 2 mL cellesuspension, centrifugeres i 5 min. ved stuetemperatur (RT) og 5.000 x g og supernatanten.
      Bemærk: De stikprøveudvalgte cellesuspension er beskrevet i supplerende fil 1-S1.
    2. Resuspend celler i 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl med bi-destilleret H2O, pH 7,2) Desuden indeholder 15% (v/v) glycerol som en cryoprotective agent.
    3. Der inkuberes i 10 min på is og chok fryse i flydende kvælstof til efterfølgende opbevaring ved-80 ° C.
      Bemærk: Protokollen kan pause her. Prøverne er stabil i mindst én måned.
  2. Aktiveret slam Fællesskabet: formaldehyd stabilisering + ethanol fiksering5,10,18
    1. Tag 4 mL cellesuspension, centrifugeres i 20 min. ved 15 ° C og 3.200 x g og supernatanten.
      Bemærk: De stikprøveudvalgte cellesuspension er beskrevet i supplerende fil 1-S1.
    2. Der tilsættes 4 mL 2% formaldehyd i PBS og inkuberes i 30 min. ved RT.
      1. Forberede 8% formaldehyd stamopløsning fra PARAFORMALDEHYD at undgå bevarelse tilsætningsstof methanol føjet til formaldehyd leveres i flydende form. Tilføje 4 g af PARAFORMALDEHYD til 50 mL PBS ved 70 ° C. Tilføje ca 125 µL af 10 M NaOH-opløsning. Rør indtil PARAFORMALDEHYD er helt opløst og lad det så køle ned til RT. Juster pH-værdi 7.0 med ca. 100 µL 37% HCl. fryse formaldehyd løsning i 15 mL alikvoter til opbevaring. Brug ikke optøet delprøver længere end 10 dage.
        Forsigtig: Formaldehyd skal håndteres og bortskaffes med omtanke på grund af dens giftige og mutagene egenskaber. Altid bære handsker under håndtering det. Brug en udstødning hood mens opløse PARAFORMALDEHYD for at forhindre udsættelse for giftige dampe.
    3. Centrifugeres prøve for 10 min. ved 15 ° C og 3.200 x g og supernatanten.
    4. Resuspend prøven i 4 mL af 70% ethanol og opbevares ved-20 ° C.
      Bemærk: Protokollen kan pause her. Prøverne er stabil i mindst 2 måneder. Afhængigt af egenskaberne prøven udføres centrifugering trin i 1.2.1 også for 10 min. ved 4 ° C for at spare tid.
  3. Biogas Fællesskabet: tørring
    1. Bruge en klippede 1.000 µL pipette tip til prøven 200 µL af den tyktflydende fermentat ind i et 2 mL rør.
    2. Tilføje 1.700 µL af PBS buffer og blandes grundigt.
    3. Sted rør i et ultralydsbad på 35 kHz og 80 W nytteeffekt power i 1 minut til at opløse store celle aggregater og frigør celler stikning til at plante celle rester.
    4. Proeven blandes grundigt, filtrere prøven gennem en 50 µL mesh-filter og opdele filtratet i fire delprøver af omkring 400 µL.
      Bemærk: Forberede delprøver på dette tidspunkt giver to store fordele. Første, mindre mængder er nemmere og hurtigere at afvande mekanisk (centrifugeres) og termisk (tørring), men kan være meget udfordrende, prøvetagning af små mængder fra normalt tyk biogas slam. Andet, ekstra prøver kan bruges til efterfølgende celle sortering, backup målinger eller kontrolelementer.
    5. Centrifugeres delprøver to gange i 10 min ved 10 ° C og 4.000 x g og supernatanten helt begge gange til mekanisk afvande prøven så grundigt som muligt.
    6. Tørre prøver i en opvarmet vakuum centrifugeres i 40 min. ved 35 ° C, ca-97 kPa og 2.500 x g at skabe stabile pellets. Gemme piller ved 4 ° C i mørke.
      Bemærk: Protokollen kan pause her. Pellets er stabil i mindst 6 måneder.

2. farvning

Bemærk: DAPI farvning har vist sig for at levere høj opløsning dot plots og er derfor særligt fordelagtigt, når du analyserer Fællesskaber. DAPI koncentration i Farvningsopløsningen skal optimeres for at garantere en celle gate fluorescens intensitet godt over støjniveauet men under perlerne. Optimalt afhænger instrument følsomhed og perle valget, kan variere mellem prøve sæt på grund af G/C indhold af mikroorganismer, som indeholdt, og generelt bør testes for nyindførte prøve sæt. Test koncentrationer mellem 0,24 µM DAPI og 1 µM DAPI anbefales til opsætningen præsenteres. Andre farvestoffer kan anvendes til specifikke programmer. Brug af en SYBR Green jeg farvning protokol skal underrettes, når absolut celle tælle nøjagtighed er prioriteret over fingeraftryk analyse (supplerende fil 1-S1)6,15. Det omfatter mindre prøve håndtering og centrifugering trin og er gældende med både faste og vitale celler. Brugen af vitale celler yderligere reducerer prøve håndtering trin ved at springe fiksering og dermed kræver kun én centrifugering for celle høst. Dette minimerer potentielle celletab og derfor systematisk målefejl. PBS, permeabilization buffer og farvning løsning anvendes under alle følgende trin skal filtreres gennem 0,2 µm sprøjte filtre til at begrænse flere partikel belastning i prøven. Farvning af en prøve, der indeholder Escherichia coli BL21 (DE3) som en biologisk standard med hver prøve pool tilrådes.

  1. Ren kultur
    1. Afrimning prøver, centrifugeres i 5 min på RT og 5.000 x g og supernatanten.
    2. Celle resuspenderes i iskolde PBS ved gentagne pipettering og justere OD700nm til 0,035 (sti længdekuvette = 0,5 cm).
    3. Forberede cellerne til farvning.
      1. 1 mL af justerede cellesuspension i 5 min på RT og 5.000 x g der centrifugeres og supernatanten.
      2. Resuspend celler i 1 mL af permeabilization buffer som indeholder 0.3 M citronsyre og 4.1 mM Tween20 og blandes grundigt.
      3. Inkuber prøve i 10 min på isen for at oprette gennemtrængelig cellemembraner for efterfølgende farvning.
      4. Centrifugeres prøven i 5 min på RT og 5.000 x g og supernatanten.
    4. Der tilsættes 1 mL af farvning løsning indeholdende 0,68 µM DAPI i 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffer (289 mM Na2HPO4, 128 mM NaH2PO4 med bi-destilleret H2O, pH 7), blandes og Inkuber i mindst 15 min. ved RT i mørke.
      Bemærk: Præcise OD justering er afgørende for at sikre sammenlignelige målinger, fordi DAPI fluorescens varierer med celle tæthed, hvis DAPI koncentration holdes konstant. Supernatanten bør fjernes omhyggeligt på grund af en generelt skrøbelige pellet at forhindre celletab.
      Forsigtig: Håndtere og bortskaffe DAPI med forsigtighed på grund af dens mutagene egenskaber.
  2. Aktiveret slam Fællesskabet
    1. Fast proeven blandes grundigt og 0,6 mL overføres til et glasrør. Tilføje 1,4 mL PBS og Rens med ultralyd i 10 min. ved RT som beskrevet i trin 1.3.3. Centrifugeres prøve for 10 min. ved 4 ° C og 3.200 x g og Fjern supernatanten. Der tilsættes 2 mL PBS og blandes grundigt. Læg instrumenterne i ultralydsbad i 5 min.
    2. Justere OD700nm til 0,035 (sti længdekuvette = 0,5 cm) med PBS.
    3. Forberede cellerne til farvning.
      1. Centrifugeres prøve for 10 min. ved 4 ° C og 3.200 x g og Fjern supernatanten.
      2. Resuspend celler i 1 mL af permeabilization buffer indeholdende 0,11 M citronsyre og 4.1 mM Tween20 og blandes grundigt.
      3. Ruger i 20 min. på RT for at oprette gennemtrængelig cellemembraner for efterfølgende farvning.
      4. Centrifugeres prøve igen i 10 min. ved 4 ° C og 3.200 x g og Fjern supernatanten.
    4. Der tilsættes 2 mL Farvningsopløsningen indeholdende 0,68 µM DAPI og 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffer, blandes grundigt og der inkuberes i mindst 60 min på RT i mørke.
      Bemærk: Brugen af glasrør anbefales, som visse mikroorganismer har tendens til at overholde plast rør vægge og kan gå tabt under processen. Inkubering er natten også muligt og normalt forenkler lab procedurer.
      Forsigtig: DAPI skal håndteres og bortskaffes med omtanke på grund af dens mutagene egenskaber.
  3. Biogas Fællesskabet
    1. Suspendere tørrede celle pellet i PBS.
      1. Tilføje 800 µL af PBS, blandes grundigt og lad pellet lægges i blød i 15 min.
      2. Opsug den flydende fase med 1.000 µL pipette og flytte den gennemblødt pellet til den cylindriske del af tube væg med pipette spids. Det bør holde sig der.
      3. Flytte pipetten spids i en cirkulær bevægelse at squash pellet langs røret vægge.
      4. Vaske den resulterende gylle fra tube væggene ved at fjerne den flydende fase fra pipette tip langs rørvæggen.
      5. Agitere suspensionen af sugning og suspendere det i pipetten tre gange.
    2. Vask prøve med PBS to gange.
      1. Der centrifugeres i 5 min. ved 10 ° C og 4.000 x g og supernatanten.
      2. Tilføje 1.500 µL af PBS og blandes grundigt.
      3. Gentag trinene to ovenfor én gang.
    3. Sted rør i et ultralydsbad for 1 min, som beskrevet i trin 1.3.3, og efterfølgende, filtrere hver prøve igennem en 50 µL mesh-filter i en individuel glasrør.
    4. 2 mL af prøven til OD700nm 0,035 fortyndes (sti længdekuvette = 0,5 cm) med PBS.
    5. Forberede cellerne farvning som forklaret i trin 2.2.3 ovenfor.
    6. Tilsættes 2 mL af Farvningsopløsningen indeholdende 0,24 µM DAPI og 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffer, blandes grundigt og der inkuberes natten på RT i mørke over.
      Forsigtig: DAPI skal håndteres og bortskaffes med omtanke på grund af dens mutagene egenskaber.

3. måling

Bemærk: De eksemplariske prøve sæt blev analyseret med to forskellige flow cytometers. PC og ASC blev analyseret med en mere kompleks, meget justerbar og let tilpasses, forskning centreret celle sorteringsanlæg. For PC analyse, denne enhed blev udstyret med en laser, sat op som beskrevet i tidligere publikation16, kort sagt en blå (488 nm, 400 mW) og en ultraviolet (334-364 nm, 100 mW) argon ion laser. For ASC analyse, nyere blå (488 nm, 400 mW) og ultraviolette (355 nm, 150 mW) halvleder lasere blev installeret. I begge tilfælde induceret den blå laser FSC (bandpass filter 488 nm ± 5 nm, neutralfiltre 1.9) og den videnskabelige Styringskomité (bandpass filter 488 nm ± 5 nm, neutralfiltre 1.9, udløser). Disse optiske egenskaber er relateret til Cellestørrelse og celle tæthed, henholdsvis. UV-lasere ophidset DAPI fluorescens (bandpass filter 450 nm ± 32,5 nm) til kvantificering af cellulære DNA indhold. Det fluidic system blev kørt på 56 psi (3,86 bar) med prøven overtryk på højst 0,3 psi og en 70 μm dyse. Alle parametre blev registreret som tophøjder i stedet for toparealer at forbedre måling opløsning. Langsigtet overvågning af Fællesskabets biogas blev udført med den mindre komplicerede, flow kuvette baseret, bænk top analyzer. En ultraviolet semiconductor laser (355 nm, 50 mW) blev brugt til at fremkalde FSC (bandpass filter 355 nm ± 5 nm) og SSC (bandpass filter 355 nm ± 5 nm, udløser) signaler og ophidse DAPI fluorescens (bandpass filter 455 nm C). Vandet bruges til kappe buffer på begge enheder var bi-destilleret og 0,1 µm filtreret. PBS bruges til prøveopløsning skal filtreres gennem 0,2 µm sprøjte filtre til at reducere partikel støj i målinger så meget som muligt.

  1. Ren kultur og aktiveret slam Fællesskabet
    1. Start instrument, laser, computer og software og forberede sig til prøven analyse.
      1. Tænd for lasere og køre i 15 min. at nå driftstemperaturen og sikre beam stabilitet.
      2. Fylde kappe tank med 10 x kappe buffer (19 mM KH2PO4, 38 mM KCl, 166 mM Na2HPO4, 1,39 M NaCl med bi-destilleret H2O) fortyndes med bi-destilleret H2O til en 0,2 x brugsopløsning (for celle sortering: 0,5 x brugsopløsning).
      3. Prime fluidic systemet med 56 psi over pres og den affald tank med ca 6 psi vakuum.
      4. Køre instrument til minimum 15 min i arbejdscentrene tilstand at skylle prøven port, rør og mundstykke.
    2. Kalibrere med standard perler.
      1. Forberede kalibrering i den lineære (1 μm blå + 2 μm gul-grøn fluorescerende) perle blander og logaritmiske vifte (0,5 μm og 1 μm blå fluorescerende). Fortynd perle suspension fra de oprindelige bestand suspensioner til at opnå lige store koncentrationer.
      2. Løbende måle lineær perle mix og passe perle toppe til en forudindstillet kalibrering skabelon ved at manipulere med dysen og laser optik holdninger til pre kalibrere instrument i det lineære område.
      3. Skift til den logaritmiske rækkevidde og løbende måle logaritmisk perle mix. Passe perle toppe til deres forudindstillede kalibrering skabelon at finindstille hardwaren i instrumentet. Foretage endelige justeringer perle position ved hjælp af indstillingen gevinst af photomultiplier rør (PMTs).
      4. Kontrollere placeringen af den instrumentale støj og eventuelt justere det til at passe skabelonen kalibrering.
        Bemærk: En fast kalibrering skabelon for placeringen af perlerne skal forberedes inden en måling projekt og kan ikke ændres (Se supplerende fil 1-S4)! Instrumental støj kan være fremkaldt af partikler i prøven eller elektronisk støj af PMTs og vil altid blive registreret til en vis grad. Det er ikke tilrådeligt at skjule støjen helt af gevinst justering eller plot forskydning. Den overflod og placering af hændelserne støj kan være en værdifuld kilde til oplysninger og skal derfor være indeholdt i de rå data. Meget partikel intensiv prøver kan nødvendiggøre den efterfølgende fjernelse af støj plotte og data analyse grunde. Styre kalibrering i regelmæssige intervaller under en måling dag at garantere instrument stabilitet og derfor prøve sammenlignelighed.
    3. Måle en prøve, der indeholder den biologiske standard som beskrevet i 2.1.4 (DAPI farves Escherichia coli BL21 (DE3), udtages og fast under den stationære fase (16 h) efter ASC protokol beskrevet i punkt 1.2). Kontrollere positionen peak i forhold til deres forudindstillede kalibrering skabelon (Se supplerende fil 1-S5).
      Bemærk: De rutinemæssige farvning og måling af den biologiske standard med hver pulje af prøver vil også fungere som en intern kontrol for proceduren farvning. Hvis enheden kalibreres ved hjælp af perler og den biologiske standard passer ikke sin forudindstillede kalibrering skabelon, skal farvning proceduren sandsynligvis gentages.
    4. Prøven erhvervelse.
      1. Køre Farvningsopløsningen i 10 min. Skyl prøven port og rør og sikre stabiliteten af DAPI fluorescens i efterfølgende prøver.
      2. Filtrer farves prøven med en 50 μm mesh-filter før måling til at forhindre tilstopning af forskellige dyse eller flow kapillær.
      3. Tilføje logaritmisk perle mix til stikprøve at overvåge instrument stabilitet og give mulighed for en retrospektiv kalibrering check. Prøverne bør indeholde mellem 1.000 og 2.500 begivenheder i hver af de to perle gates.
      4. Oprette en celle gate i instrument-softwaren under de første retssag målinger af et nyt sample sæt. Denne port skal indeholde de farvede celler og udelukke støj og perler.
      5. Bland prøverne og måle på en maksimal hastighed på 3.000 begivenheder s-1 indtil 250.000 celler (samfund) eller 50.000 celler (renkulturer) registreres i celle gate.
        Bemærk: Disse celletal er udvalgt på baggrund af erfaringer med prøve-sæt. Forskellige tal kan bruges til at skifte afvejningen mellem måling effektivitet og påvisning af lav overflod subcommunities i begge retninger.
        Fejlfinding: Pludselige intra-måling forskydninger af perlen og celle position kan være forårsaget af luftbobler fanget i dysen. Dette nødvendiggør fjernelse og rengøring af dysen og skylning af det fluidic system med kappe buffer. Instrumentet skal justeres efter remounting dyse (start med trin 3.1.2).
      6. Arbejdscentrene instrument grundigt med kappe buffer inden lukning og skifte prøver.
  2. Biogas Fællesskabet
    1. Opstart instrument, laser, computer og software til at forberede sig til prøven analyse.
      1. Arbejdscentrene mindst 6 mL af kappe buffer (bi-destilleret H2O) gennem slanger og prøven port ind i et løst tilknyttede rør ved hjælp af funktionen "kappe væske prime" instrument software.
      2. Måle bi-destilleret H2O på 5 µL s-1 til at skylle det fluidic system indtil mindre end 200 arrangementer s-1 er konstateret ved den regelmæssige strømningshastigheden af 0,5 µL s-1.
    2. Kalibrere systemet.
      1. Forberede perle mix (0,5 μm og 1 μm blå fluorescerende). Fortynd perle suspension fra de oprindelige lager løsninger for at opnå samme koncentrationer.
      2. Løbende måle perle mix i log4 rækkevidde og passer perle toppe til deres forudindstillede kalibrering skabelon ved at manipulere flow kuvette og laser optic positioner. Foretage endelige justeringer til positionen perle med indstillingen gevinst af PMTs.
    3. Styre kalibrering med den biologiske standard, som beskrevet i trin 3.1.3.
    4. Prøven erhvervelse.
      1. Fortyndes 400 µL af bejdset prøven i 1.600 µL af PBS, måle og overvåge hændelsesantal for at udføre en koncentration test.
        Bemærk: Justerede fortynding priser kan være nødvendigt for andre eksempelkilder. Hændelsesantallet bør ikke overstige 1.200 begivenheder s-1 i partikel rige prøver at undgå opløsning tab i den forward scatter (negative eksempel i supplerende fil 1-S2). Ren kulturer kan måles med op til 2.000 begivenheder s-1.
      2. Oprette en celle gate i instrument-softwaren under disse første retssag målinger. Denne port skal indeholde de farvede celler og udelukke støj og perler.
      3. Fortyndes prøven i henhold til resultaterne af koncentration testen til at køre på maksimalt 1.200 samlede begivenheder s-1 og tilføje perle mix til stikprøve at overvåge instrument stabilitet og give mulighed for en retrospektiv kalibrering check. Prøverne bør indeholde mellem 1.000 og 2.500 begivenheder i hver af de to perle gates.
      4. Bland og måle prøven indtil 250.000 celler (samfund) eller 50.000 celler (renkulturer) registreres i celle gate.
      5. Skyl grundigt hos bi-destilleret H2O før lukning og skifte mellem prøver.

4. celle sortering

Bemærk: Cellen sortering procedure kræver ekstra instrument oprettet og udføres ifølge publicerede protokoller12.

  1. Opstart og kalibrere instrumentet, som beskrevet i trin 3.1.1-3.1.3, men bruge en 0,5 x brugsopløsning af kappe buffer.
  2. Indstille DD frekvens og DD amplitude at finde break-off slipværktøj.
  3. Montere afbøjning plader, oplade dem og beslutte for 2 - eller 4-vejs form tilstand.
  4. Udføre interne drop forsinkelse kalibrering med 2 μm gul-grønne perler til at definere den tidsperiode, der tager en partikel eller celle til at rejse fra forhør pege den sidste dråbe knyttet til åen (laser hits celle).
  5. Sortere 6 gange 20 perler i et glas dias og tælle dem med et mikroskop for at kontrollere dråbe forsinkelse kalibrering.
  6. Forberede skabelonen sortering gate.
  7. Brug den "enkelt og one-drop mode: højeste renhed 99%" på en sats ikke højere end 2.500 total arrangementer s-1 for at sortere 500.000 celler i maksimalt 4 porte på et tidspunkt (4-vejs form tilstand).
  8. Høste cellerne ved centrifugering (20.000 x g, 6 ° C i 25 min) og fryse pellet ved-20 ° C til senere DNA isolation og sekventering.
    Bemærk: Undgå sortering celler i porte med mindre end 5% relativ overflod, som den sortering tid er omvendt proportional med den relative forekomst. De enkelte trin er beskrevet i detaljer i celle sorteringsanlæg manual. De krævede celle numre er stærkt afhængige af de respektive brugstilfælde og udvinding protokoller. Talrige metoder har været anvendt: ddPCR (1.000 celler17,19), 16S rDNA eller mcrA amplikon sekventering (500.000 celler6,10,15) og proteomics (op til 1,1 x 107 celler 16,17). Celle sortering vil være særligt fordelagtige, når kombineret med en metagenomics tilgang på grund af den lavere mangfoldighed i de sorterede subcommunities.
    Forsigtig: Berør ikke deflektor plader under sortering proceduren på grund af høje spændinger.

5. dataanalyse

Bemærk: Cytometric måling udbytter "flowcytometri standard".fcs datafiler med et generelt ensartet datastruktur. Men forskellige forskellige producenter bruger lidt tilpasset versioner og ældre instrumenter kan allerede bestod inden 2010 introduktion af den seneste FCS standard 3.1. Dette kan føre til dot plot skalering problemer, som forhindrer en direkte sammenligning af resultater indsamlet med forskellige instrumenter. De individuelle datapunkter gemmes altid i retning af en matrix med de respektive scatter og fluorescens intensitetsværdier i de forskellige kolonner. Præsenteres microbiome analyse rørledninger bruge den karakteristiske Cellestørrelse og DNA indhold til at beskrive mikrobielle subcommunities. Disse parametre er korreleret til FSC og DAPI fluorescens kanal intensiteter (celle sorteringsanlæg: FL-4, analyzer: FL-1) og resultat i subcommunity klynger når visualiseret i to-dimensionelle FSC vs DAPI fluorescens parceller. Disse dot parceller giver mulighed for fortolkning og analyse af flow flowcytometri data og skaleres normalt logaritmisk. De kan ses fra .fcs filer ved hjælp af proprietære forskellige software eller tredjeparts løsninger og er grundlaget for den automatiske (Cytometric Histogram billede sammenligning, smarte) og semi-automatiske (Cytometric Barcoding, CyBar) Fællesskabets analyse.

  1. Cytometric Histogram billede sammenligning
    Bemærk: Koden, detaljeret dokumentation og en manual for denne pakke er tilgængelig på http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. De har også været udgivet20.
    1. Installere og indlæse pakken R, sat den arbejdsmappe, der indeholder .fcs filer og oprette en filliste ved at udføre:
      > kilde ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Angive arbejdsmappen til stien hvor din FCS filer er placeret
      > # Skriv stien i anførselstegn
      > setwd("")
      > # Få en liste over filnavne af FCS-filer placeret i din arbejdsmappe
      > filer <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Få en liste over filnavne af FCS filerne til pakken
      > filer <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + fuld = TRUE, mønster = "*.fcs")
      > # Læse den første FCS fil som flowFrame
      > ramme < - Læs. FCS(files[1],alter.Names=true,transformation=False)
      > # Få en liste over navnene parameteren/kanal
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. Oprette billeder til cytometric rå data ved at udføre funktionen "fcs_to_img"-pakken:
      > # Oprette histogrammet billeder ved hjælp af standardparametre
      > fcs_to_img(files)
    3. Definere delmængder af histogrammet billeder ved at udføre funktionen "img_sub"-pakken:
      > # Oprette histogrammet billede delmængder ved hjælp af standardparametre
      > img_sub (filer, ch1 = "FS. Log",CH2="fl.4.log")
    4. Beregne værdierne for overlapning og XOR for at gennemføre billedanalyse af udfører funktionen "calculate_overlaps_xor" pakke:
      > # Gemme navnene på alle delmængde billeder som en liste
      > delmængder <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Beregne overlapning og XOR billeder og skrive værdier til to nye filer
      > resultater <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. Oprette ikke-metriske multidimensional scaling (NMDS) grunde til lighed analyse ved at udføre funktionen "plot_nmds"-pakken:
      > # Viser et NMDS plot af prøverne
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Cytometric stregkodesystem
    Bemærk: Koden, detaljeret dokumentation og en manual for denne pakke er tilgængelig på http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. De har også været udgivet11,12.
    1. Udvikle en master gate skabelon til brug på alle prøver.
      1. Indlæse .fcs filer i den analyse software ved hjælp af træk og slip-funktionalitet.
      2. Dobbeltklik på en måling og vælge x - og y - aksen parametre fra de respektive rullelister til at åbne en FSC vs DAPI fluorescens plot.
      3. Bruge polygonen tegning værktøj til at gengive celle gate tidligere brugt til at kontrollere antallet af analyserede celler i trin 3.1.4.5 og 3.2.4.4 og benævne sig i overensstemmelse hermed. Træk gate celleindtastning i listen over eksempler på gruppen alle prøver at samle det.
      4. Dobbeltklik på celle gate og rette akse tildeling for at visualisere celle gate begivenheder.
      5. Definere subcommunities fremherskende i stikprøven sæt med værktøjet elliptisk gates efter offentliggjort retningslinjer12 og bruge scanning af VSK eller en anden tredje parameter21 til at sikre integriteten af skabelonen gate. Pool, styre og justere subcommunity fordeling på de andre prøver.
    2. Eksportere disse relative subcommunity mængder i en .txt-fil til brug i scriptet Rasmussen.
      1. Åbn editor til med fanen Rediger.
      2. Tilføj kolonner for hver subcommunity, der blev defineret i trin 5.2.1.5 og indstille output statistik til "frekvens af overordnede" og navngive dem.
      3. Oprette tabellen i "tabel editoren" efter valget af spare-format og destination.
        Bemærk: Analyse software direkte giver relativ subcommunity mængder. De kan også opnås ved division af hændelsesantal i individuelle subcommunity gate af hændelsesantal i celle gate. Værdierne skal gemmes i en tabulatorsepareret matrix i en .txt-fil, der ikke kan indeholde nogen n.a. felter og skal opfylde nogle yderligere krav for at blive læst af R-kode (Se manual og FAQ for at få specifikke instruktioner).
    3. Installere og indlæse R pakke og indlæse data ved at udføre:
      > kilde ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Skriv stien i anførselstegn
      > setwd("")
      > # Belastning datasæt
      > data(Cell_number_sample)
      > # Vis data
      > Cell_number_sample [, -1]
    4. Normalisere de relative mængder af udfører funktionen "normalisere" pakke:
      # Normalisere data, udskrive 2 cifre
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],Digits=2)
    5. Oprette en stregkode af de normaliserede og en boxplot for de oprindelige relative mængder af udfører funktionen "cybar_plot"-pakken:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Plot med standardparametre
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. Oprette et NMDS plot af de oprindelige relative mængder.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMDS plot af normaliserede cel numre
      > nmds(Normalized_mean)
    7. Skabe sammenhæng analysen af de normaliserede relative mængder og andre parametre ved at udføre funktionen "korrelation" pakke:
      > # Belastning datasæt
      > data(Corr_data_sample)
      > # Vis korrelation værdier
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Kør korrelation analyse
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Bemærk: CHIC og CyBar stole på relative mængder. Flowcytometri kan også bestemme absolutte celle numre, som kunne være af stor interesse for bioteknologiske applikationer. For at bestemme det absolutte celle nummer, er antallet af celler i porten af interesse divideret med den analyserede prøve volumen. Den analyserede prøve volumen kan bestemmes ved at tilføje perle suspension med en kendt koncentration i stikprøven (formel i supplerende fil 1-S7). Bænk top analyzer er desuden udstyret med en ægte volumetriske optælling funktion, der direkte kvantificerer volumen i prøveglas under målingen. Det anbefales at bruge en SYBR Green jeg farvning protokol til celle optælling.

Representative Results

Følgende repræsentative resultater understrege nødvendigheden af replikater og eksemplificere forskellige data visualisering og analyse teknikker på hver af de tre prøve-sæt. De viser resultaterne af mulige data evaluering rørledninger egnet til besvarelse af standard forskningsspørgsmål om de respektive sæt. De præsenterede teknikker er imidlertid ikke eksklusivt til prøve-sæt, som de præsenteres med. Flow flowcytometri rå data blev gjort offentligt tilgængelige med FlowRepository ID FR-FCM-ZY46. Tidligere er uploadede ASC data tilgængelige under ID FR-FCM-ZYD7.

Biologiske og tekniske replikater blev taget, forberedt og analyseret ifølge publicerede protokoller11. Biologiske replikater fra PC og ASC blev taget fra tre parallelle kolber. Biologiske replikater af f.kr blev taget som tre efterfølgende prøveudtagninger på ét sted i en pilotstørrelse plante. Tre delprøver af en prøve var fast, farves og analyseres for at sikre tekniske reproducerbarhed. Metoder reproducerbarheden blev vurderet ud fra tidligere udgivne procedurer11. En gate skabelon for alle prøver af én prøve sæt (supplerende fil 1-S6) blev brugt til beregning af standardafvigelse (%) pr. port.

Til PC var den maksimale standardafvigelsen af den relative overflod 3.44%, mens den gennemsnitlige standardafvigelse var 2,13% (figur 1). For ASC og BC var de maksimale standardafvigelser af de relative mængder 1,27% og 0,88%, mens gennemsnittene af standardafvigelser var 2,13% og 0,21% (supplerende fil 1-S8).

En standardprocedure, når undersøger en ren stamme kultur, er forberedelsen af en vækstkurve analysere mellemliggende fase, generation gange og celle tæthed på særlige betingelser. Vi har kombineret denne procedure med flow cytometric analyse arbejdsprocessen til at opnå en dybere forståelse af systemet (figur 2). FSC vs DAPI fluorescens parceller afsløre cellecyklus stater af kultur på forskellige tidspunkter i batch kultur. En master gate skabelon (supplerende fil 1-S6) blev etableret for at kvantificere andelen af celler med en (c1n), to (c2n) og flere kromosomer (cXn, figur 2B). Den overvejende del af podede celler havde kun et kromosom (93,7% på 0 h). Dette ændret sig drastisk i løbet af eksponentiel vækst, hvor næsten alle celler indeholdt mere end én (99,6%, 4 h) og over halvdelen af befolkningen (53,1%) selv indeholdt mere end to kromosomer. Dette illustrerer P. putidas evne til at replikere sine kromosomer hurtigere end sin generationstid.

Flow cytometric analyse har vist sig meget nyttig til overvågning af udviklingen af mikrobielle samfund. Det kan følge EF dynamics meget tættere end de mere ressource intensive molekylære metoder5,10. Vi fremhævet disse dynamikker i en film og fik en oversigt over de aktiverede slam fællesskab Skift over tid. Hvert et sekund frame viser en FSC vs DAPI fluorescens plottet på en stikprøve (supplerende fil 2). En meget tydelig Skift mellem 0 og dag 4 blev efterfulgt af oprettelsen af en kerne samfund efter dag 7. Yderligere subcommunities kom op i dag 21. Vi etablerede en master gate skabelon (supplerende fil 1-S6), aktiveret vurdering af mikrobielle dynamics på et subcommunity niveau. De dominerende subcommunities i forskellige stadier af eksperimentet var klart identificeret ved hjælp af værktøjet CyBar (figur 3). Kombinerer det med frekvens fordelingen af de relative subcommunity mængder hjalp at vælge gates, der er interessant (betydelig ændring i overflod udløst på et afgørende tidspunkt) og levedygtige (over 5% relativ overflod) for sortering og yderligere analyse22.

Industriel skala bioreaktor applikationer kan klare potentielle rumlig heterogeneities på grund af agitation begrænsninger. De udsættes også ofte for skiftende operationelle parametre, som vekslen i kvaliteten af ikke-syntetiske substrater. BC repræsenterer et sådant system og blev udtaget fra forskellige lokaliteter i en dynamisk drevet plug flow reaktor. FSC vs DAPI fluorescens parceller (figur 4) af eksempelpunkterne for eksemplarisk vis kun lidt fysisk, men udtales tidsmæssige heterogenitet. F.kr blev yderligere undersøgt ved hjælp af både, fast-automatiseret CHIC og mere dybdegående master gate skabelon baseret CyBar tilgang.

Dens automatiseret, hurtig og saglig karakter, gør smarte særlig interessant for on-site kontrol af bioprocesser i en industriel indstilling. Det sammenligner raw .fcs data fra alle tilgængelige prøver. To af disse sammenligninger er vist i figur 5. Forskellighed resultatværdierne bekræfte de tidligere bemærkninger vedrørende rumlige og tidsmæssige heterogenitet. Formen NMDS parceller genereret smarte værktøjer forskellighed matrix (figur 6) yderligere underbygger dette resultat og visualiserer det i overensstemmelse hermed.

Derudover beregnet vi de relative mængder af 23 subcommunities af BC ved hjælp af en master gate skabelon (supplerende fil 1-S6). En korrelation analyse af 48 prøver fra en etårig periode blev udført for at forstå funktionelle relationer i den mikrobielle samfund. Dette kan bidrage til at identificere porte af interesse for yderligere undersøgelse (4 celle sortering). Stærke positive eller negative korrelationer med abiotiske parametre som produkt titers kan hjælpe til at forstå og optimere økosystemer og bioteknologiske processer. Den økologiske belastningsgraden inkluderet i denne sammenhæng (figur 7) eksemplificerer sådan en abiotiske parameter. G5, G4 og G10 udviser stærke positive korrelationer og kan eventuelt indeholde Fermentativ arter, mens den negative sammenhæng i G8 kan vink mod methanogeniske archaea.

Figure 1
Figur 1: reproducerbarhed af cytometric analyse af den ren kultur. FSC vs DAPI fluorescens parceller med kontrol perler (A, B) og bar parceller af 3 subcommunity mængderne [%] med fejllinjer repræsenterer ± én standardafvigelse (C, D). De relative mængder blev fastsat med skabelonen gate vist i supplerende fil 1-S6. Tre biologiske replikater A, B og C blev taget af vækstkurven på 4 h og tre tekniske replikater P1, P2, P3 var parate fra prøve A og måles tre gange, henholdsvis: M1, M2, M3, og får med deres respektive standardafvigelser. 50.000 begivenheder blev registreret i celle gate. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: cellecyklus analyse af ren kultur taget under en vækstkurve eksperimentere over 12 h. (A). FSC vs DAPI fluorescens parceller af bi-hver time prøveudtagninger, der udviser et skift i DNA-indhold under den eksponentielle vækstfase. Denne måling serie omfatter ikke perler (Se supplerende fil 1-S3). (B). optisk tæthed-baserede vækstkurven med fejllinjer repræsenterer ± én standardafvigelse og relative mængder i subcommunities over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: udviklingen i aktiverede slam Fællesskabets struktur over 24 dage. (A) flowCyBar med overliggende hyppighed distributioner visualiseret i boxplots for individuelle porte, der er arrangeret af ligheden mellem tendenserne, de tilsvarende farve nøglen (B) og en lighed analyse i en NMDS plot wit R < 0,001 () C). de underliggende parceller er vist i filmsekvens i supplerende fil 2. Relative mængder blev bestemt ved hjælp af skabelonen gate i supplerende fil 1 - S6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: rumlige og tidsmæssige heterogenitet af mikrobielle samfund struktur i industriel målestok sæt flow biogas reaktor. (A) sammenligningen af mikrobielle samfund struktur af fire prøveudtagning havne I-IV dag 223. (B) en sammenligning af tid afhængige Fællesskabets struktur variationer fra dag 0 til dag 384 i port II. Støjen er blevet skåret sent for at øge den visuelle effekt. 250.000 begivenheder blev målt i celle gate (supplerende fil 1-S6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Cytometric Histogram billede sammenligning-CHIC. Princippet om den smarte algoritme er eksemplificeret ved at sammenligne to stikprøver, som repræsenterer rumlige og tidsmæssige heterogenitet, henholdsvis. (i) smarte billeder er lavet fra .fcs filer efter at vælge to parametre for at vise (FSC vs DAPI fluorescens). Gråtoner (0 – 255) koder hændelsesantal i en pixel. (ii) smarte delmængder er genereret efter angiver det område, der indeholder celler (her: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR kombination billede er lavet ved at sammenligne pixel mellem delmængder. Ingen forskel er lig med 0 og vises som sort. Maksimale forskel er lig med 200 og vises som hvidt. Den tilsvarende XOR værdi beregnes ved at tilføje grå skala værdierne af alle pixel i billedet for XOR. (iv) kombination overlejringsbilledet er lavet ved at tilføje gråtoner værdier af pixels i af delmængder. Den tilsvarende overlay værdi beregnes ved at tælle et overlejringsbillede pixels, der ikke er lig med nul, og derfor indeholder oplysninger. (v) forskellighed værdier beregnes ved at dividere XOR og overlay værdier. Disse er grundlaget for NMDS plot i figur 6. Både forskellighed værdier og NMDS plot viser en ubetydelig rumlige- og en udtalt tidsmæssige Fællesskabet heterogenitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: CHIC baseret lighed analyse biogas Fællesskabets prøvernes. 0-dages prøve var udelukket fra dette plot på grund af sin ekstremt forskellige fællesskabsstruktur fordreje analyse (supplerende fil 1-S11). Handlingen NMDS bekræfter antagelsen om lav rumlige- og højere tidsmæssige heterogenitet lavet ved hjælp af værktøjet CHIK og forklarede i figur 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: sammenhæng analyse på biogas EF. Matricen blev beregnet ved hjælp af Spearmans rangorden koefficient og er baseret på de relative mængder af 23 subcommunities, der blev fastlagt med skabelonen master gate i supplerende fil 1-S6. De var korreleret med det organiske belastningsgraden (OLR) for 48 prøver fra en etårig periode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: lighed analyse af planktoniske (P) og slam baseret (S) samfund i spildevand. Prøverne blev taget fra den primære clarifier (PCL), aktiveret slam bassin (AS) og rådnetank tank (DT) i et fuldskala renseanlæg (dot parceller i supplerende fil 1-S10). Relative mængder blev bestemt ved hjælp af skabelonen gate vist i supplerende fil 1-S6. Disse subcommunity mængder blev også analyseret med værktøjet flowCyBar til at oprette en CyBar (supplerende fil 1-S10) og NMDS plot (F < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: fiksering stabilitet af ren kultur. Prøver fra vækst kurve eksperimentet taget på 0 h var lagret over 28 dage ved-80 ° C efter fiksering i 15% glycerol. FSC vs DAPI fluorescens parceller med kontrol perler er vist. Måling serien omfatter ikke perler (supplerende fil 1-S3). 50.000 begivenheder blev registreret i celle gate (supplerende fil 1-S6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

En vellykket analyse af mikrobielle populationer og samfund kræver godt tunet cytometers, et passende valg af celle parametre og en pålidelig arbejdsproces fra prøveudtagning og fiksering til måling og data evalueringen. Markerede celle parametre skal se de tilgængelige excitation bølgelængder. Vi bruger og anbefaler DAPI, som er meget følsomme ved lave koncentrationer; men skal være ophidset af en UV-laser, der ikke består normalt i standard forskellige set-ups. Andre farvestoffer, såsom SYBR Green jeg, også pletten hele befolkninger eller samfund men generelt levere ringere resolutioner. Vi anbefaler ikke brug af fisk procedurer eller levedygtighed test i mikrobielle samfund. Disse tilgange er umuligt at kvantificere, kontrollere og styre, fordi deres virkninger på enkelte arter i Fællesskabet er usikker. De kan ikke pålideligt testet, så længe en betydelig andel af de typiske Fællesskaber er stadig ikke tilgængelig som en ren kultur.

Kritiske trin i protokollen omfatte prøvetagnings-og fiksering samt celle sortering. Prøvetagningen kan blive kompliceret af tendensen af visse renkulturer og mikrobielle samfund til at aggregere til flocs eller overholde partikler af prøvematrixen. Det er vigtigt at sprede disse aggregater og separate celler i en prøve før at indføre dem til flow cytometric analyse til at sikre pålidelige resultater. Protokollerne præsenteres forberedelse var optimeret for at aktivere enkelt celle analyse. En sidste 50 µm filtrering er udført før måling til at fjerne enhver resterende aggregater og forhindre 70 µm dysen af celle sorteringsanlæg og flow kuvette af Analyseværktøjet fra tilstopning. Celle flocs fra renseanlæg er især rigelige, robust og vitale funktion af systemet. Vi undersøgte de planktoniske og slam baseret mikrobielle samfund i forskellige tanke af et fuldskala renseanlæg, til at teste den etableret protokol. Slammet danner celle aggregater var klart spredes og Fællesskabets sammensætning forblev stabil. Derudover udstillet planktoniske og slam-baseret samfund bemærkelsesværdig lighed mellem dem i alle tre stikprøven tanke (figur 8, supplerende fil 1-S10). Disse resultater blev kontrolleret af sammenlignende 16S rDNA-amplikon sekventering af en frisk-, en formaldehyd behandlede-, en formaldehyd og ethanol fikseret-, og sorterede prøve10. Ikke desto mindre kan særdeles udfordrende miljøprøver, som stærke biofilm og bakterier vokser i tæt forbundne kæder, være umuligt at sprede. Jordprøver kan være særligt problematisk, som de allestedsnærværende partikler vises i histogrammet og kan sløre cellerne af lutter overflod. I sådanne tilfælde skal traditionelle sekventering metoder anvendes.

Fiksering stabilitet af hver ny prøve sæt skal testes før designe eksperiment at sikre resultatet gyldighed. God fiksering stabilitet muliggør også poolede farvning og måling af flere eksempelpunkterne for tiden på en enkelt dag. Det giver desuden replikering målinger og retrospektiv celle sortering af afgørende tidspunkter efter konklusion og afsluttende evaluering af forsøget. Fiksering stabilitet af ren kultur blev bekræftet over 28 dage (figur 9). For on-site eksperimenter herunder prøve transport, bør fiksering stabilitet testes over længere perioder (i dette tilfælde 60 dage for Fællesskabets aktiveret slam 195 dage for Fællesskabets biogas, supplerende fil 1-S9).

Farvning er normalt ikke problematisk, men skal styres med en biologisk standard at tillade anvendelsen af bioinformatic evalueringsværktøjer. Vi brugte den forlorne stamme E. coli BL21 (DE3), som blev fikseret efter ASC protokol og oplagret til brug i alle farvning batch.

Bortset fra DAPI, SYBR Green jeg har været anvendt med succes til at løse mikrobielle samfund for flere år14,23,24,25,26. SYBR Green jeg kan løse Fællesskaber i høj- og lav nukleinsyre undersæt (HNA og LNA) ved hjælp af levende celler i en online modus. DAPI, men er mere specifik i sin binding til DNA og gør det muligt at skelne mellem over 50 subcommunities i én prøve sæt men kræver en fiksering skridt før farvning.

Celle sortering er et fremragende træk ved denne tilgang og kan anvendes, hvis visse subcommunities er yderligere interesse. Det skal understreges, at hverken PFA-(udført for kun 30 min) eller ethanol behandling eller DAPI farvning10 havde en negativ virkning på efterfølgende 16S amplikon sekvensering. Potentielle påvirkninger af fiksering og farvning procedurer på subcommunity metagenome analyser stadig nødt til at blive testet.

En masse oplysninger om Fællesskabets funktioner og trend dynamik kan opnås uafhængigt af den sortering tilgang når de vedrører bioinformatik værktøjer, der kan løse community funktionerne på en virtuel celle ved celle niveau og forbinde disse funktioner med abiotiske parametre.

For nylig en række nye Bioinformatik evalueringsværktøjer, alle nyttige for både SYBR grøn jeg og DAPI tilgange, er blevet udviklet for at løse cytometric Fællesskabet mønstre. Disse er FlowFP27, pakker anvendes i denne undersøgelse (flowCHIC20, flowCyBar28), en deconvolution model etableret med ferskvand Fællesskaber29 og et værktøj bruges til at diskriminere stammer ifølge deres fysiologiske egenskaber30. Derudover cytometric mangfoldighed kan være beslutsom25 og endda stabilitet egenskaber af mikrobielle samfund kan nu følges op med en online-værktøj10.

Således har flow cytometric analyser en kæmpe fordel, når det kommer til hurtig evaluering af mikrobielle samfund og mulige abiotiske parameter korrelationer. Der er dog stadig begrænsninger til metoden. Det kan ikke anvendes virkelig online med værktøjet flowCyBar, på grund af den erfarne baserede gate indstilling procedure. Desuden, ville udviklingen af skræddersyede, let at bruge flow cytometers stærkt videre spredning af flow cytometric microbiome analyse tilgang. Første skridt i denne retning er gennemført28.

Fremtidige anvendelser af mikrobielle flowcytometri kan forestillede i mikrobiel økologi, da det giver mulighed for høj frekvens overvågning inden for rækkevidde af bakteriel generation gange og det har vist sig at økologiske paradigmer er gældende for cytometric data5 ,10. Metoden er meget nyttigt for rutinemæssige screeninger af naturlige miljøer som obligatorisk drikkevand kontrolelementerne i Schweiz31. Det kan også være et værdifuldt redskab til medicinske applikationer som menneskelige15 eller animalske32 microbiome screening. Derudover kan seneste udvikling i bioinformatik aktiverer mikrobielle flowcytometri til at være en integreret sensor i proceskontrollen af administrerede mikrobielle systemer. Mikrobielle samfund flowcytometri giver også en screeningsværktøj til celle sortering, som giver mulighed for højere opløsning genomisk undersøgelser af specifikke EF undersæt.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.
 

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt Michael Jahn og Yuting Guo for den procedure og datasæt af ren kultur og det aktiverede slam samfund, henholdsvis. Vi takker yderligere Katrin Mörters til at analysere biogas Fællesskabet prøver. Dette arbejde blev finansieret af Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, projektet Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) på vegne af det tyske Forbundsministerium for fødevarer og landbrug (BMEL), det centrale innovationsprogram for små og mellemstore virksomheder (ZIM) af det føderale ministerium økonomi-og energi (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, Project On-demand Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), det tyske Forbundsministerium for uddannelse og Forskning (BMBF) (FZK 03XP0041G), og Helmholtz Association's Program-orienterede finansiering (POF III R31 emne 3 bioenergi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).

Tags

Miljøvidenskab sag 137 flowcytometri enkelt celle analytics mikrobielle samfund dynamics microbiome prøve forberedelse flowcytometri bioproces kontrol overvågning celle dynamics cytometric dataanalyse flowCHIC flowCyBar
Kendetegner Microbiome Dynamics – flowcytometri baseret arbejdsprocesser fra renkulturer naturlige samfund
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F.,… More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter