Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kännetecknar mikrobiomet Dynamics – flödescytometri baserade arbetsflöden från rena kulturer till naturliga samhällen

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

Flöde flödescytometrisk analys har visat sig vara värdefull för att utreda rena kulturer och övervakning mikrobiell gemenskapen dynamics. Vi presenterar tre omfattande arbetsflöden, från provtagning till analys av data, för rena kulturer och komplexa samhällen i tydlig medium samt som i utmanande matriser, respektive.

Abstract

Utredningen av rena kulturer och övervakning av mikrobiell gemenskapens dynamik är viktigt att förstå och kontrollera naturliga ekosystem och tekniska applikationer drivs av mikroorganismer. Nästa generation används allmänt sekvenseringsmetoder för att lösa microbiomes, men de är i allmänhet resurs och tid intensivt och leverera mestadels kvalitativ information. Flödesanalys flödescytometrisk mikrobiomet inte lider av dessa nackdelar och kan ge relativ subcommunity sammansättning och absolut cell nummer på-line. Även om det inte levererar direkt fylogenetiska information, kan det förbättra analys djup och upplösning av sekvensering metoder. I skarp kontrast till medicinska tillämpningar inom både forskning och rutin inställningar används flödescytometri fortfarande inte flitigt för mikrobiomet analys. Information saknas på prov förberedelse och data analys rörledningar kan skapa ett inträdeshinder för forskarna utmaningar mikrobiomet analys som ofta skulle vara lärobok flöde flödescytometri applikationer. Här presenterar vi tre omfattande arbetsflöden för rena kulturer, komplexa samhällen i rensa respektive medellång och komplexa samhällen i utmanande matriser. Vi beskriver enskilda förfaranden för provtagning och fixering och optimerad Färgprotokoll för de respektive provningssatser. Vi utarbeta flödescytometrisk analys med en komplex forskning centrerad och en ansökan fokuserad bänk översta enhet, beskriva cellen sortera förfarande och föreslå data analys paket. Vi vidare föreslå viktiga experimentella kontroller och gälla de respektive provningssatser presenterade arbetsflöden.

Introduction

Mikroorganismer spelar en viktig roll i många aspekter av mänskliga levande. De är de viktigaste biotiska drivkrafterna för de planeter kol, kväve, fosfor och svavel cykler1och lagen som förnedrande2,3 samt syntetisera4 biokatalysatorer i olika branscher, såsom behandling av avloppsvatten 5 eller bioteknik6. De utgör även den mänskliga microbiom, som direkt påverkar människors hälsa och metabolism7,8. Information om struktur, funktion och dynamiska beteende av mikroorganismer, som svar på deras närmiljö, därför nödvändigt om vi vill förstå och manipulera dessa system. Nästa generation sequencing (NGS) är den etablerade tekniken för att lösa mikrobiomet struktur och funktion9. Men, analys och utvärdering av NGS data inte kan ge kvantitativa uppgifter och är fortfarande dyrt, tidskrävande och ingalunda redo att ge Hotellets resultat inom prestanda korridorer. Vissa bakterier Visa generation gånger under 1 h och orsaken ständigt föränderliga samhällsstrukturer i vissa miljöer10. Efter sådan dynamik, skulle med sekvensering metoder överstiga den finansiella och arbetskraft kapaciteten av de flesta vetenskapliga laboratorier.

Flödescytometri kan däremot lämna gemenskapen fingeravtryck liknar NGS data, samtidigt som du behåller en tids-, arbets- och verkningsgrad. Här presenterar vi flödet flödescytometrisk tekniker kunna följa mikrobiell gemenskapen dynamics på-line på den enda cell-nivån. Till skillnad från NGS, flödescytometri ger inte fylogenetiska tillhörighet eller information om funktionella gener, men levererar kvantitativa cell nummer. Med hjälp av flödescytometri, kan mikrobiella samhällen lösas in subcommunities med distinkta ljusspridning och fluorescens egenskaper (framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) ger indikationer på Cellstorlek och kornighet, respektive). Den presenterade metoden använder huvudsakligen cell storlek - och DNA uppgå relaterad information som är associerade till vissa celltyper och fysiologiska (tillväxt) staterna. DNA innehållet kvantifieras med hjälp av UV-retbara 4', 6-diamidin-2'-fenylindol (DAPI) färgämne, som binder till A-T rika regioner av DNA och kan även lösa olika kromosomala nivåer. Genom att kombinera DAPI fluorescens och FSC kan mer än 50 subcommunities distingerat och övervakas för att ändra sammansättning över tid11. Subcommunity överflöd variationerna kan vara korrelerade med förändringar i mikro-miljön omgivningarna, såsom pH och produkten titrar12, med globala parametrar, såsom väder13,14, eller vid gut eller saliv microbiomes med vissa medicinska behandlingar15. Dessa korrelationer avslöja viktiga subcommunities ansvarar för särskilda funktioner i det metaboliska nätverket av hela samhället. De viktigaste subcommunities kan sedan särskilt främjas eller undertryckt genom att förändra de omgivande mikromiljöer, eller sorteras för efterföljande sekvensering15 eller proteomiska utredning16.

Dock är mikrobiell gemenskapen flödescytometri inte ännu allmänt etablerad på grund av ett ganska lågt antal flöde flödescytometrisk enheter kan lösa mikrobiella populationer eller samhällen ordentligt. Dessutom kan bristen på erfarenhet, gemenskapens analys pipelines och effektiva data utvärdering utgöra ett inträdeshinder för forskare mikrobiomet analys utmaningar. Vi har upprättat omfattande arbetsflöden för att hantera dessa frågor. För att illustrera deras allmänna tillämplighet, kommer vi att presentera dem på exemplariska tre provningssatser (kompletterande fil 1-S1), nämligen jag) en ren kultur (PC) för biotekniska tillämpningar vuxit i definierade tydliga medium (Pseudomonas putida KT 2440 på glukos), ii) en komplex lab gemenskap i tydlig medium (aktiverat slam gemenskapen (ASC) i syntetiskt avloppsvatten) och iii) en komplex gemenskap från naturliga miljöer i en tät matris (biogas gemenskapen (BC) i majs ensilage).

Flera faktorer påverkar protokollet valet för varje av dessa provningssatser. Djupfrysning avstår användning av giftiga kemikalier men är mestadels begränsad till labbmiljöer på grund av användningen av flytande kväve för chock glasyr. Den formaldehyd stabilisering och efterföljande etanol fixering tillåter bulk provtagning utan behov av alikvotens förberedelse och har visat sig vara stabil under långa perioder. Proteinrika prover såsom mänsklig saliv15 kan dock problematiskt, eftersom protein flockar, denaturized av formaldehyd, kan orsaka ogynnsamma signal till brus förhållande. Prov torkning tar mest tid (cirka 1 h totalt) av förfarandena i denna jämförelse, men kan utföras på plats utan giftiga kemikalier. Det ger stabil pellets i rör, som enkelt kan levereras utan kylning eller ytterligare fara försiktighetsåtgärder. Dessutom har gott om alternativ fixering metoder föreslagna11. Vi rekommenderar starkt för att testa olika protokoll upplösning och fixering stabilitet när man inför en ny provuppsättning.

Vi använde två olika flöde cytometers för att analysera uppsättningar: i) en mycket sofistikerade och dyra, forskning centrerad cell sorterare och ii) en ansökan fokuserade bänk topp analysator som förefaller mer lämpligt för hotellets ansökan5. BC mättes med bänk topp analyzer, medan PC och ASC mättes med cell Sorteraren. Analys av de tre exemplariskt provet fastställs olika förfaranden som krävs för optimerad reproducerbarhet, prov stabilitet och arbetsflöde bekvämlighet. Följande protokoll anger avsnitten för de tre olika systemen.

Protocol

1. provtagning och fixering

  1. Renkultur: djup frysning15,17
    1. Ta 2 mL cellsuspension, Centrifugera under 5 minuter i rumstemperatur (RT) och 5 000 x g och kasta bort supernatanten.
      Obs: Urvalet cellsuspensionen beskrivs i kompletterande fil 1-S1.
    2. Att resuspendera cellerna i 1 mL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl med bi-destillerat H2O, pH 7,2) Dessutom som innehåller 15% (v/v) glycerol som cryoprotective agent.
    3. Inkubera i 10 min på is och chock frysa i flytande kväve för efterföljande lagring vid-80 ° C.
      Obs: Protokollet kan pausas här. Proverna är stabila i minst en månad.
  2. Aktiverat slam gemenskapen: formaldehyd stabilisering + etanol fixering5,10,18
    1. Ta 4 mL cellsuspension, Centrifugera under 20 minuter vid 15 ° C och 3.200 x g och kasta bort supernatanten.
      Obs: Urvalet cellsuspensionen beskrivs i kompletterande fil 1-S1.
    2. Tillsätt 4 mL 2% formaldehyd i PBS och inkubera i 30 min på RT.
      1. Förbereda 8% formaldehyd stamlösning från PARAFORMALDEHYD att undvika bevara additiv metanol till formaldehyd som transporteras i flytande form. Tillsätt 4 g PARAFORMALDEHYD till 50 mL PBS vid 70 ° C. Tillsätt cirka 125 µL 10 M NaOH-lösning. Rör om tills PARAFORMALDEHYD har helt upplöst och låt det sedan svalna till RT. Justera pH-värdet till 7,0 med cirka 100 µL 37% HCl. frysa formaldehydlösning i 15 mL alikvoter för lagring. Använd inte tinad alikvoter längre än 10 dagar.
        FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd behöver hanteras och kasseras med vård på grund av dess giftiga och mutagena egenskaper. Använd alltid handskar vid hantering av den. Använd ett avgassystem huva samtidigt upplösa PARAFORMALDEHYD för att förhindra exponering för giftiga ångor.
    3. Centrifugera provet under 10 minuter vid 15 ° C och 3.200 x g och kasta bort supernatanten.
    4. Återsuspendera provet i 4 mL 70% etanol och förvaras vid-20 ° C.
      Obs: Protokollet kan pausas här. Proverna är stabila i minst 2 månader. Beroende på provets egenskaper, kan centrifugeringssteget i 1.2.1 också utföras under 10 minuter vid 4 ° C att spara tid.
  3. Biogas gemenskapen: torkning
    1. Använd en klippt 1000 µL pipettspetsen till prov 200 µL av den trögflytande biogödsel i en 2 mL tub.
    2. Tillsätt 1 700 µL av PBS-bufferten och blanda väl.
    3. Placera rören i ett ultraljudsbad i 35 kHz och 80 W effektiv uteffekt för 1 min att upplösa stora cell aggregat och lossa celler fastnar om växters cell rester.
    4. Blanda provet, filtrera provet genom en 50 µL nätfiltret och dela upp filtratet i fyra portioner av ca 400 µL.
      Obs: Förbereda alikvoter vid denna punkt ger två stora fördelar. Första, mindre volymer är enklare och snabbare att Avvattna mekaniskt (centrifug) och termiskt (torkning), men provtagning av små volymer från vanligtvis tjocka biogas slam kan vara mycket utmanande. Andra, extra prover kan användas för efterföljande cell sortering, backup mätningar eller kontroller.
    5. Centrifugera i alikvoter två gånger för 10 min vid 10 ° C och 4000 x g och kasta bort supernatanten helt båda gångerna att mekaniskt Avvattna provet så grundligt som möjligt.
    6. Torra proverna i en uppvärmd vakuum centrifug för 40 min vid 35 ° C, ca-97 kPa och 2 500 x g att skapa stabila pellets. Lagra pellets vid 4 ° C i mörker.
      Obs: Protokollet kan pausas här. Pellets är stabila i minst 6 månader.

2. färgning

Obs: DAPI färgning har visat sig leverera högupplöst dot tomter och därför är särskilt fördelaktig när man analyserar samhällen. DAPI koncentrationen i färglösningen måste optimeras för att garantera en cell gate fluorescensintensiteten väl över ljudnivån men under pärlorna. Optimaln beror på instrumentet känslighet och pärla val, kan variera mellan provningssatser på grund av G/C innehåll av de innehållna mikroorganismerna och allmänhet ska testas för nyintroducerade provningssatser. Testning koncentrationer mellan 0.24 µM DAPI och 1 µM DAPI rekommenderas för den presenterade setup. Andra färgämnen kan användas för specifika applikationer. Användning av en SYBR Green jag färgning protokoll rekommenderas då absolut cell räknar noggrannhet prioriteras framför de fingeravtryck analys (kompletterande fil 1-S1)6,15. Den innehåller mindre prov hantering och centrifugering steg och är tillämpligt med både fasta och vitala celler. Att använda vitala celler minskar ytterligare prov hantering steg genom att hoppa över fixering och därmed kräver endast en centrifugering för cellen skörd. Detta minimerar potentiella cellförlust och följaktligen systematiska mätfel. PBS, permeabilisering buffert och färgning lösning används under alla följande steg bör filtreras genom 0,2 µm spruta filter kan minska ytterligare partikel belastning i provet. Färgningen av ett prov som innehåller Escherichia coli BL21 (DE3) som en biologisk standard med varje prov pool rekommenderas.

  1. Ren kultur
    1. Avfrostning proverna, Centrifugera under 5 minuter på RT och 5 000 x g och kasta bort supernatanten.
    2. Återsuspendera cellpelleten i iskall PBS av upprepad pipettering och justera den OD700nm till 0,035 (sökvägen längdkyvetten = 0,5 cm).
    3. Förbereda cellerna för färgning.
      1. Centrifugera 1 mL av justerade cellsuspension för 5 min på RT och 5 000 x g och kasta bort supernatanten.
      2. Att resuspendera cellerna i 1 mL av permeabilisering buffert innehållande 0,3 M citronsyra och 4,1 mM Tween20 och blanda väl.
      3. Inkubera provet för 10 min på is att skapa genomsläppliga cellmembran för efterföljande färgning.
      4. Centrifugera provet för 5 min på RT och 5 000 x g och kasta bort supernatanten.
    4. Tillsätt 1 mL färgning lösning innehållande 0,68 µM DAPI i 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffert (289 mM Na2HPO4, 128 mM NaH2PO4 med bi-destillerat H2O, pH 7), blanda och Inkubera i minst 15 min på RT i mörkret.
      Obs: Exakt OD justering är avgörande för att garantera jämförbara mätningar eftersom DAPI fluorescensen varierar med cell densiteten om DAPI koncentrationen hålls konstant. Supernatanten avlägsnas noggrant på grund av en generellt bräcklig pellet att förhindra cellförlust.
      FÖRSIKTIGHET: Hanteras och kasseras DAPI med omsorg på grund av dess mutagena egenskaper.
  2. Aktiverat slam gemenskapen
    1. Blanda fast provet och överför 0,6 mL i ett glasrör. Lägg till 1,4 mL PBS och Sonikera i 10 min vid RT som beskrivs i steg 1.3.3. Centrifugera provet under 10 minuter vid 4 ° C och 3.200 x g och avlägsna supernatanten. Tillsätt 2 mL PBS och blanda väl. Sonikera under 5 minuter.
    2. Justera den OD700nm till 0,035 (sökvägen längdkyvetten = 0,5 cm) med PBS.
    3. Förbereda cellerna för färgning.
      1. Centrifugera provet under 10 minuter vid 4 ° C och 3.200 x g och avlägsna supernatanten.
      2. Att resuspendera cellerna i 1 mL av permeabilisering buffert innehållande 0,11 M citronsyra och 4,1 mM Tween20 och blanda väl.
      3. Inkubera i 20 min på RT att skapa genomsläppliga cellmembran för efterföljande färgning.
      4. Centrifugera provet igen för 10 min vid 4 ° C och 3.200 x g och avlägsna supernatanten.
    4. Tillsätt 2 mL av färglösningen som innehåller 0,68 µM DAPI och 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffert, blanda väl och inkubera minst 60 min på RT i mörkret.
      Obs: Användningen av glasrör rekommenderas, eftersom vissa mikroorganismer tenderar att följa plaströr väggarna och kan förloras under processen. Ruvar över natten är också möjligt och oftast förenklar lab förfaranden.
      FÖRSIKTIGHET: DAPI måste hanteras och kasseras med vård på grund av dess mutagena egenskaper.
  3. Biogas gemenskapen
    1. Centrifugerade torkade cell i PBS.
      1. Tillsätt 800 µL av PBS, blanda ordentligt och låt pelleten Blötlägg i 15 min.
      2. Aspirera med flytande fas 1000 µL pipett och flytta blöt pelleten till den cylindriska delen av rörväggen med pipettspetsen. Det bör hålla sig där.
      3. Flytta pipettspetsen i en cirkelrörelse squash pelleten längs röret väggarna.
      4. Tvätta den resulterande flytgödsel från tube väggarna genom att man avskaffar den flytande fasen från pipettspetsen längs rörväggen.
      5. Skaka suspensionen genom att aspirera och avbryta det in i pipetten trefalt.
    2. Tvätta provet med PBS två gånger.
      1. Centrifugera i 5 min på 10 ° C och 4000 x g och Kassera supernatanten.
      2. Tillsätt 1 500 µL av PBS och blanda väl.
      3. Upprepa de två stegen ovan när.
    3. Placera rören i ett ultraljudsbad för 1 min som beskrivs i steg 1.3.3 och, därefter, filtrera varje prov genom en 50 µL mesh-filter till en individuell glasrör.
    4. Späd 2 mL av provet OD700nm 0,035 (sökvägen längdkyvetten = 0,5 cm) med PBS.
    5. Förbereda cellerna för färgning som förklaras i steg 2.2.3 ovan.
    6. Tillsätt 2 mL av färglösningen som innehåller 0,24 µM DAPI och 417 mM Na2HPO4/NaH2PO4 buffert, blanda väl och inkubera över natten vid RT i mörkret.
      FÖRSIKTIGHET: DAPI måste hanteras och kasseras med vård på grund av dess mutagena egenskaper.

3. mätning

Obs: De exemplariska provningssatser analyserades med två olika flöde cytometers. PC och ASC analyserades med en mer komplex, mycket justerbar och lätt customizable, forskning centrerad cell sorterare. För PC analysen, denna enhet var utrustad med en laser ställa upp som beskrivs i föregående publikation16, kort sagt en blå (488 nm, 400 mW) och en ultraviolett (334 – 364 nm, 100 mW) argon ion laser. För ASC analys, nyare blå (488 nm, 400 mW) och ultraviolett (355 nm, 150 mW) halvledarlasrar installerades. I båda fallen inducerad blå laser FSC (bandpass filter 488 nm ± 5 nm, neutral densitet filter 1,9) och SSC (bandpass filter 488 nm ± 5 nm, neutral densitet filter 1,9, trigger). Dessa optiska egenskaper är relaterade till Cellstorlek och cell densiteten, respektive. UV lasrar upphetsad DAPI fluorescensen (bandpass filtrera 450 nm ± 32,5 nm) för kvantifiering av cellulär DNA-innehåll. Fluidic systemet kördes på 56 psi (3.86 bar) med prov Övertrycket vid maximalt 0,3 psi och en 70 μm-munstycke. Alla parametrar registrerades som peak höjder istället för peak områden att förbättra mätningen upplösning. Långsiktig övervakning av biogas gemenskapen genomfördes med den mindre komplex, flöde kyvetten baserat, bänk topp analyzer. Ett ultraviolett Halvledarlaser (355 nm, 50 mW) användes för att inducera FSC (bandpass filtrera 355 nm ± 5 nm) och SSC (bandpass filter 355 nm ± 5 nm, trigger) signaler och excitera DAPI fluorescensen (bandpass filter 455 nm C). Det vatten som används för slida bufferten för båda enheterna var bi-destillerade och 0.1 µm filtreras. PBS används för provspädning bör filtreras genom 0,2 µm spruta filter att minska partikel bullret i mätningar som möjligt.

  1. Renkultur och aktiverat slam gemenskapen
    1. Starta instrumentet, laser, dator och programvara och förbereda för provanalys.
      1. Slå på lasrar och kör för 15 min att nå driftstemperatur och se till att balken stabilitet.
      2. Fyll slida tanken med 10 x slida buffert (19 mM KH2PO4, 38 mM KCl, 166 mM Na2HPO4, 1.39 M NaCl med bi-destillerat H2O) utspädd med bi-destillerat H2O till en 0,2 x arbetslösning (för cell sortering: 0,5 x fungerande lösning).
      3. Prime fluidic systemet med 56 psi över trycket och avfallstanken med cirka 6 psi vakuum.
      4. Kör instrumentet för minsta 15 min kostnadsredovisning med bakåtavräkning för att skölj provet hamnen, slang och munstycke.
    2. Kalibrera med standard pärlor.
      1. Förbereda pärla mixar för kalibrering i den linjära (1 μm blå + 2 μm gul-grön fluorescerande) och logaritmisk utbud (0,5 μm och 1 μm blå fluorescerande). Späd den pärla avstängning från de ursprungliga lagerföra suspensioner att uppnå lika koncentrationer.
      2. Kontinuerligt mäta den linjära pärla mix och passar pärla topparna till en förinställd kalibrering mall genom att manipulera munstycket och laser optik positioner före kalibrera instrumentet i det linjära området.
      3. Växla till intervallet logaritmisk och kontinuerligt mäta den logaritmiska pärla mix. Passa pärla topparna till deras förinställda kalibrering-mall för att finjustera hårdvaran i instrumentet. Slutjustera pärla position använder känslighetsinställningen av Fotomultiplikatorrör (PMTs).
      4. Kontrollera positionen för instrumental buller och eventuellt justera för att passa mallen kalibrering.
        Obs: En fast kalibrering mall för placera av pärlorna måste förberedas innan en mätning projekt och kan inte ändras (se kompletterande fil 1-S4)! Instrumental buller kan induceras av partiklar i provet eller det elektroniska ljudet av PMTs och kommer alltid till viss del. Det är inte tillrådligt att dölja ljudet helt genom gain justering eller tomt offset. Överflöd och positionen för de buller händelserna kan vara en värdefull källa till information och bör därför ingå i rådata. Mycket partikel intensiv prover kan kräva det efterföljande avlägsnandet av buller för plottning och data analys skäl. Kontrollera kalibreringen i stamgästmellanrum under en mätning dag att garantera instrument stabilitet och därför prov jämförbarhet.
    3. Mäta ett prov som innehåller biologiska standarden enligt beskrivningen i 2.1.4 (DAPI målat Escherichia coli BL21 (DE3), provtas och fast under den stationära fasen (16 h) enligt ASC protokollet beskrivs i 1.2). Kontrollera peak position i förhållande till deras förinställda kalibrering mall (se kompletterande fil 1-S5).
      Obs: Den rutinmässiga färgning och mätning av biologiska standard med varje pool av prover kommer också fungera som en intern kontroll för färgningsproceduren. Om enheten kalibreras med pärlor och den biologiska standarden passar inte dess förinställda kalibrering mall, antagligen färgningsproceduren upprepas.
    4. Exempel förvärv.
      1. Kör färglösningen för 10 min till skölj provet hamnen och tube och säkerställa stabiliteten av DAPI fluorescensen i efterföljande prover.
      2. Filtrera färgas provet med en 50 μm mesh-filter innan mätningen att förhindra igensättning av cytometer munstycket eller flow kapillär.
      3. Tillsätt den logaritmiska pärla mix att övervaka instrument stabilitet och ger möjlighet för en retrospektiv kalibrering check. Proverna bör innehålla mellan 1 000 och 2 500 händelser i varje två pärla grindarna.
      4. Skapa en cell grind i programvaran instrument under de första rättegången mätningarna av en ny provuppsättning. Denna grind bör innehålla de färgade cellerna och utesluta buller och pärlor.
      5. Blanda proverna och mäta med en maximal hastighet på 3 000 händelser s-1 tills 250.000 celler (communities) eller 50.000 celler (rena kulturer) upptäcks inom cellen grinden.
        Obs: Dessa blodkroppar väljs utifrån erfarenheterna med provningssatser. Olika nummer kan användas att skifta avvägningen mellan mätning effektivitet och upptäckt av låg överflöd subcommunities i endera riktningen.
        Felsökning: Plötslig intra-mätning skift av kornet och cell position kan orsakas av luftbubblor som fastnar i munstycket. Detta nödvändiggör borttagning och rengöring av munstycket och Filtersköljningen fluidic systemet med slida buffert. Instrumentet behöver justeras efter remontering munstycket (börja med steg 3.1.2).
      6. Kostnadsredovisning med bakåtavräkning instrumentet noga med slida buffert före avstängning och byta prover.
  2. Biogas gemenskapen
    1. Starta upp instrumentet, laser, dator och programvara för att förbereda för provanalys.
      1. Kostnadsredovisning med bakåtavräkning åtminstone 6 mL slida buffert (bi-destillerat H2O) genom slangen och exempel port i ett löst bifogade rör med funktionen ”slida vätska prime” av programvaran instrument.
      2. Mäta bi-destillerat H2O på 5 µL s-1 att skölja fluidic systemet tills mindre än 200 evenemang s-1 är det vanliga flödet av 0,5 µL s-1.
    2. Kalibrera systemet.
      1. Förbereda den pärla mix (0,5 μm och 1 μm blå fluorescerande). Späd den pärla avstängning från de ursprungliga lagerföra lösningarna att uppnå lika koncentrationer.
      2. Kontinuerligt mäta pärla mixen i log4 rad och passa pärla topparna till deras förinställda kalibrering mall genom att manipulera de flöde kyvetten och laser optic positionerna. Slutjustera pärla ställning med känslighetsinställningen PMTs.
    3. Kontrollera kalibreringen med biologiska standard som beskrivs i steg 3.1.3.
    4. Exempel förvärv.
      1. Späd 400 µL av färgade prov i 1 600 µL av PBS, mäta och övervaka händelseantal för att utföra en koncentration test.
        Obs: Justerade utspädning priser kan vara nödvändigt för andra provkällor. Händelseantal bör inte överstiga 1200 händelser s-1 i partikel rika prover att förhindra förlust av upplösning i framåt scatter (negativa exempel i kompletterande fil 1-S2). Rena kulturer kan mätas med upp till 2 000 händelser s-1.
      2. Skapa en cell grind i programvaran instrument under dessa första rättegång mätningar. Denna grind bör innehålla de färgade cellerna och utesluta buller och pärlor.
      3. Späd provet enligt resultaten av koncentration testet körs vid maximal 1.200 totala händelser s-1 och lägga till bead mixen till provet övervaka instrument stabilitet och ger möjlighet för en retrospektiv kalibrering check. Proverna bör innehålla mellan 1 000 och 2 500 händelser i varje två pärla grindarna.
      4. Blanda och mäta provet tills 250.000 celler (communities) eller 50.000 celler (rena kulturer) upptäcks inom cellen grinden.
      5. Skölj grundligt med bi-destillerat H2O innan avstängning och byta prover.

4. cell sortering

Obs: Cellen sortera förfarande kräver ytterligare instrument inrättats och utförs enligt publicerade protokoll12.

  1. Starta upp och kalibrera instrumentet som beskrivs i steg 3.1.1-3.1.3, men Använd en 0,5 x fungerande lösning av slida bufferten.
  2. Ställ in DD frekvens och DD amplitud att hitta droplet-paus-off.
  3. Montera de nedböjning plattorna, ladda dem och bestämma för 2 - eller 4-vägs sorteringsläge.
  4. Utföra interna droppe dröjsmål kalibreringen med 2 μm gul-gröna pärlor att definiera det tidsspann som tar en partikel eller cell att resa från förhör peka (laser träffar cell) till sista droppen kopplad till ström.
  5. Sortera 6 gånger 20 pärlor på en glasskiva och räkna dem med ett mikroskop för att kontrollera droppe dröjsmål kalibreringen.
  6. Förbereda den sortering gate-mallen.
  7. Använd den ”enda och en-släpp läge: högsta renhet 99%” i en takt som inte är högre än 2 500 Summa händelser s-1 om du vill sortera 500.000 celler i maximalt 4 portarna samtidigt (4-vägs sorteringsläge).
  8. Skörda cellerna genom centrifugering (20 000 x g, 6 ° C, 25 min) och frysa pelleten vid-20 ° C för senare DNA isolering och sekvensering.
    Obs: Undvik sortering celler i grindarna med mindre än 5% relativa överflöd, som sortering tiden är omvänt proportionella till det relativa överflödet. De enskilda stegen beskrivs i detalj i cell sorterare manualen. Krävs cell nummer är starkt beroende av de respektive användningsfall och extraktion protokoll. Många metoder har tillämpats: ddPCR (1 000 celler17,19), 16S rDNA eller mcrA amplikon sekvensering (500.000 celler6,10,15) och proteomik (upp till 1,1 x 107 celler 16,17). Cell sorteringen kommer att vara särskilt fördelaktigt när det kombineras med ett metagenomik tillvägagångssätt på grund av lägre mångfalden i de sorterade subcommunities.
    Varning: Vid inte deflektor plattorna under sortering förfarandet på grund av höga spänningar.

5. dataanalys

Obs: Flödescytometrisk mätningen ger ”flödescytometri standard” .fcs datafiler med en generellt enhetliga datastruktur. Men olika cytometer tillverkare använder något anpassade versioner och äldre instrument kan föregår 2010 införandet av senaste FCS standard 3.1. Detta kan leda till dot plot skalning frågor som hindrar direkt jämförelse av de resultat som samlats in med olika instrument. Däremot lagras alltid de enskilda datapunkterna i raderna i en matris, med respektive scatter och fluorescens intensitetsvärden i olika kolumner. Presenterade mikrobiomet analys rörledningarna använda särskiljande Cellstorlek och DNA-innehåll för att beskriva mikrobiella subcommunities. Dessa parametrar är korrelerade till FSC och DAPI fluorescens kanal stödnivåerna (cell sorterare: FL-4, analyzer: FL-1) och resultatet i subcommunity kluster när visualiseras i tvådimensionella FSC vs. DAPI fluorescens tomter. Dessa dot tomter tillåta tolkning och analys av flödescytometri flödesdata och vanligtvis logaritmiskt skalas. De kan visas från .fcs filer med egenutvecklade cytometer programvara eller tredje parts lösningar och är grunden för den automatiserade (flödescytometrisk Histogram bild jämförelse, CHIC) och halvautomatisk (Cytometric Barcoding, CyBar) gemenskapens analys.

  1. Flödescytometrisk Histogram bild jämförelse
    Obs: Koden, detaljerad dokumentation och en handbok för detta paket finns på http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. De har också varit publicerad20.
    1. Installera och ladda R paketet, ange arbetskatalogen som innehåller .fcs filer och skapa en fil genom att köra:
      > källa (”https://bioconductor.org/biocLite.R”)
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Ange arbetskatalogen till sökvägen där din FCS-filerna finns
      > # Skriv sökvägen till citat
      > setwd("")
      > # Få en lista över filnamnen FCS filer i din arbetskatalog
      > filer <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Få en lista över filnamnen på FCS filerna som ingår i paketet
      > filer <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full = TRUE, mönster = ”*.fcs”)
      > # Läsa första FCS filen som flowFrame
      > ram < - Läs. FCS(Files[1],Alter.names=True,Transformation=false)
      > # Få en lista över namnen parametern/kanal
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. Skapa bilder för flödescytometrisk raw-data genom att köra funktionen ”fcs_to_img”-paketet:
      > # Skapa histogram bilder som standardparametrar
      > fcs_to_img(files)
    3. Definiera delmängder av histogrammet bilderna genom att köra funktionen ”img_sub”-paketet:
      > # Skapa histogrammet bild undergrupper som standardparametrar
      > img_sub (filer, ch1 = ”FS. Log",CH2="fl.4.log ”)
    4. Beräkna värdet överlappning och XOR för att genomföra bildanalys genom att köra funktionen ”calculate_overlaps_xor”-paketet:
      > # Spara namnen på alla delmängd bilder som en lista
      > grupper <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Beräkna överlappning och XOR bilder och skriva värden till två nya filer
      > resultat <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. Skapa icke-metriska multidimensionell skalning (NMDS) tomter för likheten analys genom att köra funktionen ”plot_nmds”-paketet:
      > # Visar en NMDS tomt av proverna
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Flödescytometrisk streckkodning
    Obs: Koden, detaljerad dokumentation och en handbok för detta paket finns på http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. De har också varit publicerad11,12.
    1. Utveckla en master gate mall för användning på alla prover.
      1. Ladda .fcs filer i analys programvara använda dra och släpp-funktioner.
      2. Dubbelklicka på en mätning och välj parametrarna som x - och y - axeln respektive nedrullningsbara listor för att öppna en FSC vs. DAPI fluorescens tomt.
      3. Använda polygonen ritverktyg för att reproducera cell grinden tidigare används för att styra antalet analyserade celler i steg 3.1.4.5 och 3.2.4.4 och namnge det med detta. Dra cellen gate posten i listan prov på gruppen alla prover för att samla den.
      4. Dubbelklicka på cell grinden och korrigera axis uppdraget att visualisera cell gate händelserna.
      5. Definiera de förhärskande i provuppsättning subcommunities med verktyget elliptical grindar efter publicerade riktlinjer12 och använda skanning av vetenskapliga Styrkommittén eller en annan tredje parametern21 för att säkerställa integriteten för mallen gate. Pool, kontrollera och justera subcommunity på andra prover.
    2. Exportera de relativa subcommunity sammansättning i en .txt-fil för användning i skriptet R.
      1. Öppna redigeraren med fliken Redigera.
      2. Lägga till kolumner för varje subcommunity som definieras i steg 5.2.1.5 och ange utdata statistik ”frekvensen av förälder” och namnge dem.
      3. Skapa tabellen i redigeraren ”tabell” efter att välja Spara format och destination.
        Obs: Programvaran analys direkt ger relativa subcommunity sammansättning. De kan också erhållas genom avdelningen för händelseantal i utfärda utegångsförbud för individuella subcommunity av händelseantal i utfärda utegångsförbud för cellen. Värdena måste sparas i en tabbavgränsad matris i en .txt-fil som inte kan innehålla någon n.a. fält och måste uppfylla vissa ytterligare krav för att läsas av R koden (se manual och FAQ för specifika instruktioner).
    3. Installera och ladda R paketet och Ladda data genom att köra:
      > källa (”https://bioconductor.org/biocLite.R”)
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Skriv sökvägen till citat
      > setwd("")
      > # Belastning datamängd
      > data(Cell_number_sample)
      > # Visa data
      > Cell_number_sample [, -1]
    4. Normalisera de relativa förekomsten genom att köra funktionen ”normalisera” paketet:
      # Normalisera data, skriva ut 2 siffror
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. Skapa en streckkod av den normaliserade och en boxplot av de ursprungliga relativa förekomsten genom att köra funktionen ”cybar_plot”-paketet:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Tomt med standardparametrar
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. Skapa en NMDS tomt de ursprungliga relativa förekomsten.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMDS tomt på normaliserade cel nummer
      > nmds(Normalized_mean)
    7. Skapa samband analysen av de normaliserade relativa förekomsten och andra parametrar genom att köra funktionen ”samband” paketet:
      > # Belastning datamängd
      > data(Corr_data_sample)
      > # Visa korrelation värden
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Kör korrelation analys
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Obs: CHIC och CyBar lita på relativa förekomsten. Flödescytometri kan dock också bestämma absoluta cell nummer, som kan vara av stort intresse för biotekniska tillämpningar. För att bestämma den absoluta mobilnummer, delas antalet celler i utfärda utegångsförbud för av intresse av analyserade provvolymen. Analyserade provvolymen kan bestämmas genom att lägga till bead fjädringen med en känd koncentration i provet (formel i kompletterande fil 1-S7). Bänk topp analysatorn är dessutom utrustad med en sann volymetriska räknande funktion som direkt kvantifierar volymen i provet röret under mätningen. Det rekommenderas att använda en SYBR Green I färgning protokoll för cell inventering.

Representative Results

Följande representativa resultat betona nödvändigheten av replikat och exemplifiera olika data visualisering och analystekniker på tre prov set. De visar resultaten av möjliga datapipelines utvärdering passar standard forskning frågor om de respektive. De presenterade teknikerna är dock inte exklusiva till prov som de presenteras med. Flöde flödescytometri rådata gjordes offentligt tillgängliga med den FlowRepository ID FR-FCM-ZY46. Tidigare är uppladdade ASC data tillgängliga under ID FR-FCM-ZYD7.

Biologiska och tekniska replikat togs, förberett och analyseras enligt publicerade protokoll11. Biologiska replikat från PC och ASC togs från tre parallella kolvar. Biologiska replikat av f.kr togs som tre efterföljande provtagningar på en plats i en pilotskala växt. Tre portioner av ett prov var fast, målat och analyseras för att säkerställa tekniska reproducerbarhet. Metoder reproducerbarhet bedömdes enligt tidigare publicerade förfaranden11. En gate mall för alla prover av en provuppsättning (kompletterande fil 1-S6) används för att beräkna standardavvikelsen (%) per grind.

För PC var maximal standardavvikelsen för det relativa överflödet 3,44%, medan den genomsnittliga standardavvikelsen var 2.13% (figur 1). För ASC och BC var de maximala standardavvikelserna för de relativa förekomsten 1,27% och 0,88%, medan genomsnittet av standardavvikelserna var 2.13% 0,21% (kompletterande fil 1-S8).

Ett standardförfarande, när du undersöker en ren stam kultur, är utarbetandet av en tillväxtkurva att analysera eftersläpning fas, generation gånger och celldensitet under särskilda förhållanden. Vi kombinerat detta förfarande med flöde flödescytometrisk analys arbetsflödet att uppnå en djupare förståelse av systemet (figur 2). The FSC vs. DAPI fluorescens tomter avslöja cellcykeln påstår av kulturen på olika punkter i den batch-kulturen. En master gate mall (kompletterande fil 1-S6) inrättades för att kvantifiera andelen celler med en (c1n), två (c2n) och flera kromosomer (cXn, figur 2B). Den dominerande andelen av inokulerade celler hade endast en kromosom (93,7% vid 0 h). Detta förändrats drastiskt under exponentiell tillväxt, där nästan alla celler innehöll mer än en (99,6%, 4 h) och över hälften av befolkningen (53,1%) även innehöll fler än två kromosomer. Detta illustrerar P. putidas möjlighet att replikera sina kromosomer snabbare än dess generationstid.

Flöde flödescytometrisk analys har visat sig mycket användbar för att övervaka utvecklingen av mikrobiella samhällen. Det kan följa gemenskapens dynamics mycket närmare än mer resurs intensiv molekylära metoder5,10. Vi belyst dessa dynamik i en film och fått en översikt över de aktiva slammet gemenskapen skiftar över tid. Varje sekunds bildruta visar en FSC vs. DAPI fluorescens tomt på en prov punkt kompletterande fil 2. En mycket distinkt övergång mellan dag 0 och dag 4 följdes av inrättandet av en kärna gemenskap efter dag 7. Ytterligare subcommunities kom upp på dag 21. Vi etablerade en master gate mall (kompletterande fil 1-S6) som aktiverade utvärderingen av mikrobiell dynamics på subcommunity nivå. De dominerande subcommunities i olika skeden av experimentet var tydligt med verktyget CyBar (figur 3). Att kombinera det med frekvens distribution av de relativa subcommunity sammansättning hjälpte att välja grindar som är intressant (betydande förändring i överflöd som utlöses vid en viktig tidpunkt) och livskraftiga (över 5% relativa överflöd) för sortering och vidare analys22.

Industriell skala bioreaktor applikationer kan möta potentiella rumsliga heterogeneitiesna på grund av agitation begränsningar. De utsätts också ofta för ändra operativa parametrar, som växlingen av icke-syntetiska substrat. BC representerar ett sådant system och samplades från olika orter i ett dynamiskt drivna plug flöde reaktorn. The FSC vs. DAPI fluorescens tomter (figur 4) av punkterna som exemplariskt prov visar bara lite rumsliga, men uttalad temporal heterogenitet. BC undersöktes ytterligare använder både, snabb, automatiserad CHIC och mer djupgående master gate mall baserat CyBar strategi.

Dess automatisk, snabb och opartisk natur, gör CHIC särskilt intressant för anläggningens kontroll av bioprocesser i en industriell miljö. Den jämför rå .fcs data av alla tillgängliga prover. Två av dessa jämförelser visas i figur 5. Olikhet resultatvärdena bekräfta de tidigare iakttagelser rörande rumsliga och temporal heterogenitet. Formuläret NMDS tomter genereras CHIC verktyg olikhet matrisen (figur 6) ytterligare konkretiserar detta resultat och visualiserar det med detta.

Dessutom beräknade vi de relativa förekomsten av 23 subcommunities f.kr med en master gate mall (kompletterande fil 1-S6). En korrelation av 48 prover från en ettårsperiod utfördes för att förstå funktionella relationer i mikrobiell gemenskapen. Detta kan bidra till att identifiera portarna till intresse för vidare utredning (4 Cell sortering). Starka positiva eller negativa korrelationer med abiotiska parametrar gillar produkten titrar kan hjälpa till att förstå och optimera ekosystem och biotekniska processer. Organic fisktätheten ingår i denna korrelation (figur 7) exemplifierar sådana en abiotiska parameter. G5, G4 och G10 uppvisar starka positiva korrelationer och kan möjligen innehålla fermentativa arter, medan den negativa korrelationen i G8 kanske tips mot metanbildande arkéer.

Figure 1
Figur 1: reproducerbarhet av flödescytometrisk analys av renkultur. FSC vs. DAPI fluorescens tomter med kontroll pärlor (A, B) och bar tomter de 3 subcommunity sammansättning [%] med felstaplar representera ± en standardavvikelse (C, D). De relativa förekomsten bestämdes med gate mallen visas i kompletterande fil 1-S6. Tre biologiska replikat A, B och C togs av tillväxtkurvan på 4 h och tre tekniska replikat P1, P2, P3 var beredda från prov A och mäts tre gånger, respektive: M1, M2, M3, och ges med deras respektive standardavvikelser. 50.000 händelser registrerades i utfärda utegångsförbud för cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: cellcykeln analys av ren kulturen tas under en tillväxtkurva experimentera över 12 h. (A). FSC vs. DAPI fluorescens tomter de bi-varje timme provtagningsserie som uppvisar en förskjutning av DNA innehållet under den exponentiella tillväxtfasen. Detta mätserier inkluderar inte pärlor (se kompletterande fil 1-S3). (B). optisk densitet-baserade tillväxtkurvan med felstaplar representera ± en standardavvikelse och relativa förekomsten i subcommunities över tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Evolution av aktiverat slam gemenskapens struktur under 24 dagar. (A) flowCyBar med överliggande frekvens distributioner visualiseras i boxplots för enskilda portarna som arrangeras av likheten av trenderna, motsvarande färg nyckel (B) och en likhet analys i en NMDS tomt vett R < 0,001 () C). de underliggande tomterna visas i sekvensen film i kompletterande fil 2. Relativa förekomsten bestämdes använder mallen gate i kompletterande fil 1 - S6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: rumsliga och temporal heterogenitet mikrobiell gemenskapens struktur i industriell skala Anslut flöde biogasreaktor. (A), jämförelse av mikrobiell gemenskapsstrukturen av fyra provtagning hamnar I-IV dag 223. (B), jämförelse av tid beroende av gemenskapens struktur variationerna från dag 0 till dag 384 i port II. Buller har skurits av sent för att förbättra visualisering. 250.000 händelser mättes i utfärda utegångsförbud för cell (kompletterande fil 1-S6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: flödescytometrisk Histogram bild jämförelse — CHIC. Principen om CHIC algoritmen exemplifieras genom att jämföra två prover som representerar rumsliga och temporal heterogenitet, respektive. (i) CHIC bilder skapas från .fcs filer när du har valt två parametrar för att visa (FSC vs. DAPI fluorescens). Gråskalan (0 – 255) koder händelseantal i en pixel. (ii) CHIC delmängder genereras efter att ange området som innehåller celler (här: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR kombination bilden skapas genom att jämföra pixlar mellan delmängder. Ingen skillnad är lika med 0 och visas som svart. Största skillnaden är lika med 200 och visas som vita. Motsvarande XOR värde beräknas genom att lägga till gråskala värdena av alla pixlar i bilden XOR. (iv) vybilden kombination skapas genom att lägga till gråskalevärden pixel i delmängder. Motsvarande overlay värde beräknas genom att räkna pixlar i en överlägg bild som inte är lika med noll och därför innehålla information. (v) olikhet värden beräknas genom att dividera värden XOR och överlägg. Detta är grunden för NMDS tomten i figur 6. Både värdena olikhet och NMDS tomt visar en försumbar rumsliga- och en uttalad temporal gemenskapen heterogenitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: CHIC baserat likheten analys av biogas gemenskapen proverna. 0-dagars provet uteslöts från denna tomt på grund av dess extremt annorlunda samhällsstruktur som snedvrider analysen (kompletterande fil 1-S11). NMDS handlingen bekräftar antagandet om låg spatial- och högre temporal heterogenitet görs med hjälp av verktyget CHIC och förklaras i figur 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: korrelation analys på biogas gemenskapen. Matrisen beräknades med hjälp av Spearmans rangordning koefficient och baseras på de relativa förekomsten av 23 subcommunities som fastställts med mallen master gate i kompletterande fil 1-S6. De var korrelerade med organic Fisktätheten (OLR) för 48 prover från en ettårsperiod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: likheten analysen av plankton (P) och slam baserad (S) samhällen i avloppsvatten. Prover togs från primära Hårblekningsmedel (PCL), aktiveras slambassäng (AS) och digestor tank (DT) av ett fullskaligt reningsverk (dot tomter i kompletterande fil 1-S10). Relativa förekomsten bestämdes med hjälp av gate mallen visas i kompletterande fil 1-S6. Dessa subcommunity sammansättning analyserades också med flowCyBar verktyg för att skapa en CyBar (kompletterande fil 1-S10) och NMDS tomt (R < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: fixering stabilitet i renkultur. Prover från tillväxt kurva experiment vid 0 h förvarades under 28 dagar vid-80 ° C efter fixering i 15% glycerol. FSC vs. DAPI fluorescens tomter med kontroll pärlor visas. Mätserier inkluderar inte pärlor (kompletterande fil 1-S3). 50.000 händelser registrerades i utfärda utegångsförbud för cell (kompletterande fil 1-S6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande fil 2: vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

En framgångsrik analys av mikrobiella populationer och samhällen kräver väl avstämd cytometers, ett lämpligt val av cell parametrar och ett pålitligt arbetsflöde från provtagning och fixering mot mätning och data utvärderingen. Markerade cellen parametrarna måste umgås med de tillgängliga excitation våglängderna. Vi använder och rekommenderar DAPI, som är mycket känsligt vid låga koncentrationer. men behöver vara upphetsad av en UV-laser, vilket inte är vanligtvis består i standard cytometer uppställningar. Andra färgämnen, såsom SYBR Green I, också fläcken hela befolkningar eller samhällen men generellt leverera sämre resolutioner. Vi rekommenderar inte med fisk förfaranden eller genomförbarhet tester i mikrobiella samhällen. Dessa strategier är omöjligt att kvantifiera, kontrollera och styra eftersom deras effekter på enskilda arter i gemenskapen är osäkert. Tillförlitligt de kan inte testas, så länge en betydande andel av de typiska samhällena är fortfarande inte tillgänglig som en ren kultur.

Kritiska steg i protokollet omfattar provtagnings-och fixering samt cell sortering. Provtagningen kan kompliceras av tendensen hos vissa rena kulturer och mikrobiella samhällen att aggregera till flockar eller följa partiklar av prov matris. Det är viktigt att skingra dessa aggregat och separata celler i ett prov innan att introducera dem till flöde flödescytometrisk analys att garantera tillförlitliga resultat. Presenterade förberedelse protokollen var optimerad för att aktivera enda cell analys. En sista 50 µm filtrering utförs före mätningen att avlägsna eventuella kvarvarande aggregat och förhindra 70 µm munstycket på cell Sorteraren och det flöde kyvetten av analyzer från igensättning. Cell flockar från reningsverken är särskilt riklig, robusta och avgörande för funktionen av systemet. Vi undersökte den plankton och slam baserad mikrobiella samhällen i olika tankar av en fullskalig avloppsreningsverket, att testa det etablerat protokollet. Det slam som bildas cell aggregat var tydligt skingras och gemenskapens sammansättning förblev stabil. Dessutom uppvisade plankton och slam-baserade samhällen anmärkningsvärd likhet mellan dem i alla tre samplade stridsvagnar (figur 8, kompletterande fil 1-S10). Dessa resultat var verifieras genom jämförande 16S rDNA amplikon sekvensering av en färsk-, en formaldehyd behandlade-, en formaldehyd och etanol fixerade-, och en sorterad prov10. Ändå kan det vara omöjligt att försvinna utomordentligt utmanande miljöprov, såsom stark biofilmer eller bakterier växer i tätt anslutna kedjor. Jordprover kan vara särskilt problematiskt, som allestädes närvarande partiklarna visas i histogrammet och kan dölja cellerna av ren överflöd. I sådana fall måste traditionella sekvenseringsmetoder tillämpas.

Varje ny provuppsättning fixering stabilitet bör testas innan utforma experimentet att garantera resultatet giltighet. Bra fixering stabilitet möjliggör också poolade färgning och mätning av flera tidpunkter för prov på en enda dag. Det kan vidare replikering mätningar och retrospektiv cell sortering av avgörande tidpunkter efter ingående och slutlig utvärdering av experimentet. Fixering stabiliteten i ren kultur kontrollerades under 28 dagar (figur 9). För hotellets experiment inklusive transport av prover, bör fixering stabilitet testas över längre perioder (i detta fall, 60 dagar för aktiva slammet gemenskapen, 195 dagar för biogas gemenskapen, kompletterande fil 1-S9).

Färgningen är oftast inte problematiskt men behöver styras med en biologisk standard att tillåta tillämpning av de bioinformatiska verktyg för utvärdering. Vi använde den mock stammen E. coli BL21 (DE3), som var fixerade enligt ASC protokollet och lagrade för användning i varje färgning batch.

Apart från DAPI, SYBR Green jag har framgångsrikt tillämpats lös mikrobiella samhällen för flera år14,23,24,25,26. SYBR Green jag kan lösa samhällen i hög- och låg nukleinsyra underuppsättningar (HNA och LNA) med hjälp av levande celler i en online modus. DAPI, men är mer specifikt i dess bindning till DNA och gör skillnaden av över 50 subcommunities i en provuppsättning men kräver en fixering steg före färgning.

Cell sortering är en utmärkande egenskap hos detta synsätt och kan användas om vissa subcommunities är av intresse. Det måste understrykas att varken PFA-(framförd i endast 30 min) eller etanol behandling eller DAPI färgning10 hade en negativ effekt på den efterföljande 16S amplikon sekvenseringen. Potentiella påverkan av fixering och färgning förfaranden på subcommunity metagenome analyser måste fortfarande testas.

En hel del information om gemenskapens funktioner och trend dynamics kan erhållas oberoende från metoden sortering när bioinformatiska verktyg som lösa community-funktioner på en virtuell cell för cell nivå och ansluta dessa funktioner med abiotiska parametrar.

Nyligen har ett antal nya bioinformatik utvärderingsverktyg, allt användbart för båda SYBR Green jag och DAPI metoder, har utvecklats för att lösa flödescytometrisk gemenskapen mönster. Dessa är FlowFP27, paketen används i denna studie (flowCHIC20, flowCyBar28), en avfaltning förebild som upprättats med färskvatten samhällen29 och ett verktyg som används för att diskriminera stammar enligt deras fysiologiska egenskaper30. Dessutom flödescytometrisk mångfald kan vara beslutsam25 och även stabiliteten boenden av mikrobiella samhällen kan nu följas med ett online-verktyg10.

Flödescytometrisk flödesanalyser har alltså en stor fördel när det gäller snabb utvärdering av mikrobiella samhällen och möjliga abiotiska parametern korrelationer. Dock finns det fortfarande begränsningar till metoden. Den kan inte tillämpas verkligen online med verktyget flowCyBar, på grund av erfarna baserat gate inställningsproceduren. Dessutom skulle utvecklingen av skräddarsydda, lätt att använda flöde cytometers kraftigt förväg spridning av metoden flöde flödescytometrisk mikrobiomet analys. Första stegen i denna riktning är företa sig28.

Framtida tillämpningar av mikrobiell flödescytometri kan vara tankegångarna i mikrobiell ekologi, eftersom det tillåter hög frekvens övervakning inom spänna av bakteriell generation gånger och det har visat att ekologiska paradigm är tillämpliga på flödescytometrisk data5 ,10. Metoden är mycket användbar för rutinmässig filmvisningar av naturliga miljöer som obligatoriska dricksvatten ljudkontroller i Schweiz31. Det kan också vara ett värdefullt verktyg för medicinska tillämpningar som mänskliga15 eller animaliska32 mikrobiomet screening. Senaste utvecklingen inom bioinformatik kan dessutom göra det möjligt för mikrobiell flödescytometri att vara en integrerad sensor i processen kontroller av hanterade mikrobiella system. Mikrobiell gemenskapen flödescytometri ger också ett screeningverktyg för cell sortering, vilket tillåter högre upplösning genomisk utredningar av specifika gemenskapen delmängder.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.
 

Acknowledgments

Vi erkänner tacksamt Michael Jahn och Yuting Guo för ger förfarandet och datamängder ren kultur och aktiverat slam gemenskapens, respektive. Vi tackar ytterligare Katrin Mörters för att analysera biogas gemenskapen proverna. Detta arbete finansierades av den Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, projektet Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) på vägnar det tyska federala ministeriet för livsmedel och jordbruk (BMEL), Central Innovation-programmet för små och medelstora företag (ZIM) av det federala departementet ekonomi-och energi (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), den Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, projektet behovsstyrd Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), det tyska federala ministeriet för utbildning och Finansiering av forskning (BMBF) (FZK 03XP0041G), och Helmholtz föreningens Program-orienterade (POF III R31 ämne 3 bioenergi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).

Tags

Miljövetenskap fråga 137 flödescytometri enda cell analytics mikrobiell gemenskapen dynamics microbiom prov förberedelse flödescytometri bioprocess control övervakning cell dynamics flödescytometrisk analys av data flowCHIC flowCyBar
Kännetecknar mikrobiomet Dynamics – flödescytometri baserade arbetsflöden från rena kulturer till naturliga samhällen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F.,… More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter