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Developmental Biology

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Abstract

Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles pertinents pour l’étude du cerveau humain. Une technologie émergente pour régler ce problème est l’utilisation de trois dimensions (3D) cellules neurales cultures, appelé « organoids » ou « sphéroïdes », pour la préservation à long terme des interactions intercellulaires, y compris les molécules d’adhérence extracellulaire. Toutefois, ces systèmes de culture sont longues et pas systématiquement généré. Ici, nous détaillons une méthode pour produire rapidement et uniformément des cocultures 3D des neurones et les astrocytes de pluripotentes humaines de cellules souches. Tout d’abord, différenciées des astrocytes et des progéniteurs neurones sont dissociées et comptés. Ensuite, les cellules sont combinées dans la sphère formant des plats avec un inhibiteur de la Rho-Kinase et à des rapports spécifiques pour produire des sphères de taille reproductible. Après plusieurs semaines de culture comme des sphères flottantes, cocultures (« astéroïdes ») sont finalement sectionnés pour immunostaining ou plaquées sur baies multiélectrodes pour mesurer la force et la densité synaptique. En général, il est prévu que ce protocole donnera 3D sphères neurones qui affichent des marqueurs de type cellule mature restreint, forment des synapses fonctionnelles et montrent une activité éclatement spontané réseau synaptique. Ensemble, ce système permet de dépistage des drogues et des enquêtes sur les mécanismes de la maladie dans un modèle plus approprié par rapport à des cultures monocouches.

Introduction

Avec une variété de responsabilités fonctionnelles au-delà de soutien structurel, les astrocytes sont un type de cellules gliales très abondante dans le système nerveux central (CNS). Par le biais de la sécrétion de facteurs solubles synaptogenic et constituants de la matrice extracellulaire (ECM), astrocytes aident à la mise en place et le regroupement des synapses matures au cours du développement1. Ils jouent un rôle essentiel dans le maintien de la santé et la plasticité des synapses à extracellulaire signalisation2,3,4,5aussi et contribuent à la stabilité à long terme de l’homéostasie environnements en régulant le potassium extracellulaire et glutamate, ainsi que la sécrétion de substrats énergétiques et ATP6,7,8. Enfin, ils peuvent contribuer à la neurotransmission en influant sur les courants extrasynaptic9et peuvent influencer indirectement l’activité à travers d’autres types de cellules, telles que la promotion de la myélinisation10. Ce qui est important, car l’anomalie ou dysfonctionnement des astrocytes peut conduire à de nombreux syndromes neurodéveloppementaux et neuropathologie adulte, il y a un besoin évident d’inclure aux côtés de neurones dans l’ingénierie réseaux de neurones, les astrocytes dans l’ordre pour une meilleure modèle de l’environnement de cerveau endogène. Une caractéristique intégrale des astrocytes est leur capacité à forme dynamique des interactions avec les synapses neuronales1,11,12. En l’absence des cellules gliales, les neurones forment un nombre limité de synapses, ce qui en général aussi le manque de maturité fonctionnelle13.

Astrocytes humains présentent des caractéristiques morphologiques, transcriptionnelles et fonctionnels, tels que l’augmentation de la taille et la complexité du branchements, ainsi que des gènes — qui ne sont pas récapitulée dans rongeurs12,14, 15. Ainsi, des études utilisant les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-des cellules neuronales dérivées sont largement acceptés comme un moyen d’examiner les maladies liées à la CNS in vitro tout en développant de nouveaux traitements, modèles de lésion et paradigmes de la culture16 ,,17. En outre, hPSCs permettre l’étude de la formation des synapses humaines et de la fonction sans la nécessité pour le tissu principal18,19.

Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles appropriés du cerveau humain. Il y a un besoin pour une plate-forme appropriée récapituler ses réseaux synaptiques avec haute fidélité et de la reproductibilité. Récemment, l’intérêt a émergé dans la production de systèmes de culture 3D (généralement connu comme « organoids », « sphéroïdes », ou « mini cerveaux »)20 pour modéliser le complexe en trois dimensions (3D) structures au niveau cellulaire et macro. Systèmes de culture 3D conservent des interactions ECM et les cellules qui sont normalement absents ou limités au cours de la co-culture 2D typique paradigmes21,22. Une abondance de techniques existent pour la culture des sphéroïdes neurale 3D23,24,25; Cependant, beaucoup exigent des périodes de culture longue (mois à années) pour le développement spontané et préservation de la couche, avec l’utilisateur présentant très peu de contrôle sur la sortie.

Ici, nous illustrons une méthode systématique pour rapidement et constamment des interactions neuronales bioingénieur parmi plusieurs types de cellules (différenciée des neurones et les astrocytes) dérivé de hPSCs en assemblant des cellules dans les cocultures sphère (« astéroïdes »)26 qui récapitulent les complexités morphologiques spécifiques à l’humain en 3D. Ce système neural haute densité génère des sous-types neurales-répartie qui prennent matures propriétés au fil du temps et peuvent être projetés ou dosés de manière à haut débit. Nous montrons pour la première fois que les astrocytes humains induisent réseau synaptique rafale activité dans ces cocultures 3D. En outre, le présent protocole est facilement adaptable pour générer des sphères de différentes tailles, d’utiliser des cellules spécifiées à différentes identités régionales du SNC et pour étudier les interactions de plusieurs autres types de cellules comme vous le souhaitez.

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Protocol

1. Culture et préparation du réactif de cellules

Remarque : Les protocoles dans cette section sont écrits dans l’ordre dans lequel ils apparaissent dans le protocole de différenciation (section 2). Voir la Table des matières pour les matériaux et les numéros de catalogue.

  1. Préparer des plaques de revêtement pour la culture cellulaire.
    1. Diluer la solution de revêtement de la matrice extracellulaire (ECM) avec médias DMEM/F12 pour préparer un 1 mg/mL solution. Aliquote l’ECM dilué dans 30 tubes coniques de 3 mL de chaque solution-mère et stocker immédiatement à-20 ° C. Pour une solution de travail, remettre en suspension les 3 mL du stock de l’ECM dans 33 mL préalablement réfrigérées DMEM/F12 médias, ce qui porte le total à 36 mL pour une concentration de 80 µg/mL.
    2. Couche 1 mL par puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits avec une solution d’ECM. Ajouter 1 mL supplémentaire DMEM/F12 / puits (si nécessaire) pour s’assurer que la surface du puits est entièrement couverte. Permettent à la cellule de 6 puits enduite plaques de culture de s’asseoir à la température ambiante pendant au moins 1 h avant utilisation.
      Remarque : Les plaques revêtues peuvent être conservés dans l’incubateur ou à 4 ° C pendant 2 semaines.
  2. Préparer les médias formulations, facteurs de croissance et petites molécules.
    1. Pour préparer 500 mL d’humains ou de cellules souches (hPSC) moyenne27, ajouter 20 x et 500 x suppléments selon les instructions du fabricant.
    2. Pour préparer 500 mL de milieu neuronal (NM), ajoute l’héparine à une concentration finale de 2 mg/mL, 1 x solution antibiotique/antimycosiques, 1 Supplément de x B27 ou 1 x N2 supplément pour une bouteille de 500 mL de DMEM/F12 avec supplément de L-glutamine comme précédemment détaillées28.
    3. Pour préparer un 10 mM (1, 000 x) de l’inhibiteur de la Rho-Kinase Y27632 (Y) de solution mère, ajouter 10 mg de poudre dans 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Filtre à stériliser, partie aliquote et conserver à-20 ° C. Utiliser à une concentration de travail 10 µM dans les médias.
    4. Pour préparer un 20 mM (10, 000 x) solution mère de SB431542, ajouter 10 mg de poudre dans 1,3 mL du diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour préparer une de 2 mM (1, 000 x) solution mère de DMH1, ajouter 10 mg de poudre dans 13,1 mL de DMSO. Filtre aliquote, les stériliser et stocker chaque solution à-20 ° C. Utiliser chacun à une concentration de travail 2 µM dans les médias (NM + SB431542 + DMH1).
      Remarque : Ce protocole recommande 2 concentrations de travail µM de deux SB431542 et DMH1 basé sur nos observations et de rapports émanant d’autres29 indiquant que cette concentration favorise efficacement l’induction neurale de hPSCs. Des concentrations plus élevées ont également été signalés30. En outre, avec les médias alternatifs, il a également été démontré que les petites molécules ne sont pas nécessaires pour haute conversion neurale31. Ainsi, les concentrations de travail variera selon les milieux de culture cellulaire alternatif et concentrations optimales doivent être testées par des chercheurs.
    5. Pour préparer la bouteille de 100 µg/mL (10, 000 x) des solutions mères de facteur de croissance épidermique (EGF) et facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF2), ajouter 1 mg de chacune dans 10 mL de PBS + 0,1 % de BSA. EGF aliquote et FGF2 stock solutions dans 50 µL d’extraits et conserver à-80 ° C. Utiliser chacun à une concentration de travail 10 ng/mL dans les médias ; par exemple, ajouter 5 µL EGF et 5 µL FGF2 à 50 mL de NM (NM + FGF2, EGF).
    6. Pour préparer une solution mère de chlorhydrate de doxycycline (Dox), d’abord dissoudre la poudre dans le DMSO à 100 mg/mL et conserver à-20 ° C. Diluer davantage pour en faire un 2 mg/mL (1, 000 x) stock solution dans du PBS et conserver à-20 ° C. Utiliser à une concentration de travail 2 µg/mL dans les médias ; par exemple, ajouter 50 µL Dox à 50 mL de NM (NM + Dox).
      Remarque : Ne pas recongeler des solutions après décongélation.

2. génération de neurones sous-types de cellules humaines pluripotentes induites (hPSCs)

Remarque : Toutes les cultures de cellules doivent être maintenus dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 ° C. Ces cultures sont maintenus aux niveaux de l’oxygène chambre, bien que plus faibles peuvent être utilisés.

  1. Générer et maintenir des progéniteurs astrocyte (hAstros) de hPSCs.
    Remarque : Cette section fournit un protocole de différenciation brève et simplifiée. Pour une description détaillée (avec formation de corps embryoïdes, sélection de rosette et étapes de la structuration régionale) se référer au protocole décrit précédemment28 (Figure 1 a, pointillé case verte).
    1. Grappes de graines de hPSCs (Figure 1 b) sur des plaques de 6 puits ECM-enduit (voir étape 1.1) avec 2 mL de milieu hPSC + Y / puits. Nourrir les cellules souches tous les jours jusqu'à ce qu’ils sont environ 50 % confluentes ou fendus selon les besoins.
      1. Pour fractionner hPSCs, ajouter 1 mL de réactif de passage dans les puits et aspirer après 1 min. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min, ajouter 1 mL de milieu hPSC et diviser les agrégats 01:10 sur nouveaux puits ECM-enduit dans 2 mL de milieu hPSC + Y / puits.
    2. Conserver les cellules souches jusqu'à ce qu’ils sont environ 50 % anastomosé, puis changement multimédia NM + SB431542 + DMH1 pour induire la différenciation neuronale (jour 0). Lorsque les cellules sont environ 95 % anastomosé, scindée en 1:6 nouveaux puits ECM-enduit dans le même milieu.
    3. Le 14e jour, dissocier les cellules avec la solution de détachement et transférer dans un ballon non couché avec Y pour promouvoir la formation d’agrégats.
      Remarque : L’ajout de Y sert à promouvoir la formation de survie et de la sphère de cellules mais n’est pas inclus au cours de chaque aliment.
    4. Pour la génération des progéniteurs neurones et les neurones (hNeurons), utiliser ces cellules J14 tel que décrit ci-dessous. Vous pouvez également utiliser ces cellules à des moments plus tard des cultures monocouches ou sphère avant maturation neuronale se produit ou gliogenesis commence.
      Remarque : Par défaut, ce protocole produit astrocytes dorsale-cortical. Toutefois, sous-types astrocyte peuvent être régionalement spécifiés par l’addition de structuration morphogènes si vous le souhaitez28,32,,33. L’acide rétinoïque (AR) peut être ajouté pour caudalize des cellules dans la moelle épinière, phénotypes, tandis que sonic hedgehog (SHH), lissées agoniste (SAG), ou purmorphamine pour produire des phénotypes ventrales.
    5. Pour la génération des progéniteurs des astrocytes et des astrocytes dans formé spontanément des agrégats 3D (hAstrospheres), passez à l’EGF, NM + FGF2 et nourrir chaque semaine (ou au besoin afin de s’assurer que le pH stable) comme précédemment détaillées34.
      1. Doucement se dissocient hAstro agrégats avec solution de détachement lorsque centres sombres apparaissent et supprimer les sphères qui s’attachent spontanément. Casser sphères doucement une fois par semaine pour entretenir la santé de la sphère et pour éviter les carottes nécrotiques.
        Remarque : Ne dépassez pas 5 min de traitement avec la solution de détachement.
      2. Après 4 à 6 mois d’expansion, confirmez cellule identité et soit congeler en moyenne de cryoconservation (conformément aux instructions du fabricant) ou de stockage de remplacement conditions de conservation à long terme dans l’azote liquide, ou l’utilisation immédiatement à expérimentation.
    6. Pour décongeler un stock congelé de hAstrospheres, rapidement décongeler à température ambiante, transfert le contenu dans un tube à vide 15 mL conique et centrifuger à 300 x g pendant 1 min. aspirer le surnageant, laver soigneusement avec DMEM/F12 et répéter pour un total de deux lavage dans une cuvette étapes. Verser dans une fiole de T25 avec un volume total de 6 mL de NM, EGF, FGF2 + Y (ou intensifier si nécessaire).
  2. Générer et maintenir les neurones inductibles (iNeurons) de hPSCs.
    1. Semences transgéniques hPSCs (avec un neurogenin doxycycline-inducible stable 2 transgène35) sur ECM-enduit de plaques 6 puits avec 2 mL de milieu hPSC + Y / puits (comme décrit ci-dessus pour les lignes non transgéniques). Nourrir tous les jours avec 2 mL de médias / puits jusqu'à ce qu’ils sont prêts à lever à la confluence de 70 %. Fractionner les cellules, comme indiqué au point 2.1.2.
    2. Lorsque les cellules sont environ 35 % confluentes, ajouter NM + Dox pour induire la différenciation en iNeurons. Maintenir une culture monocouche avec NM + Dox pendant 2 jours avant de passer à l’étape 3.2.
      Remarque : Les cellules seront transition dans des progéniteurs neurones mais ne sera pas encore étendre neurites (Figure 1).

3. la préparation et l’entretien de la sphère 3D Cocultures

  1. Dissocier les hAstros des agrégats 3D en suspension (tel que décrit à l’étape 2.1.5.1).
  2. Dissocier les hNeurons ou iNeurons d’une monocouche 2D.
    1. Retirez le support de plaque 6 puits et ajouter 500 µL de solution de détachement à chaque cupule contenant des cultures monocouches. Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter doucement 2 à 3 mL DMEM/F12 pour enlever les cellules attachées.
    2. Recueillir des cellules et des médias dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 1 min. aspirer le surnageant, ajouter 1 mL de supports neufs et Pipeter monte et descend doucement avec une micropipette 1 000 µL pour réaliser une suspension monocellulaire.
  3. Forme des sphères 3D à l’aide de plaques de microtitration culture.
    1. Préparer la plaque en ajoutant 0,5 mL de solution de lavage anti-adhésion à chaque puits de la plaque de microtitration. Centrifuger la plaque à 2 000 x g pendant 5 min. solution de lavage aspiration, ajouter 1 mL de DMEM/F12 dans chaque puits pour laver et aspirer à nouveau.
      Remarque : Vérifiez toujours que la centrifugeuse est équilibrée pendant l’utilisation.
    2. Compter chaque type de cellule à l’aide d’un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées. Ajouter ratio désiré des hAstros dissociées et hNeurons ou iNeurons dans chaque puits dans un volume total de 2 mL de NM + Y (incluez Dox si iNeurons sont utilisés). Centrifuger la plaque à 100 x g pendant 3 min et remettez dans l’incubateur.
      Remarque : les plaques 24 puits microwell (voir la Table des matières) contiennent 300 puits par puits. Ajouter un minimum de 6 x 105 cellules (pour des sphères de 2 x 103 cellules chaque) et un maximum de 6 x 106 cellules (pour des sphères de 2 x 104 cellules chaque) dans 2 mL de médias par puits. Les sphères viable d’une densité spécifique dans ce secteur, utilisez une quantité définie de cellules et diviser par 300 pour calculer le nombre de cellules par sphère. Autre sphère formant des méthodes et des outils aussi peut être utilisée que si vous le souhaitez. Suivez les instructions du fabricant pour les plages acceptables de la densité des cellules.
    3. Permettre aux cellules de s’auto-assembler en sphères au sein des plaques microwell au cours des 2 prochains jours (Figure 2 a). Remplacer le support de 50 % si la culture est jaunissement.
      NOTE : Échangez des médias que la moitié et Pipeter délicatement en retirant et en ajoutant des médias pour ne pas déranger les sphères. Sphères peuvent soulever des micropuits et fusionnent avec une force supérieure.
    4. Après 2 jours, retirez délicatement les sphères des micropuits avec une micropipette 1 000 µL (Figure 1). Légèrement forcer sur le fond du puits avec les médias pour enlever toute autres sphères collés. Laissez les sphères s’installer dans un tube conique de 15 mL, aspirer les anciens médias et ajouter des supports neufs.
  4. Mettre en place le système de bioréacteur flask spinner pour former des sphères 3D.
    1. Nettoyer la surface d’une plaque d’agitation magnétique avec l’éthanol à 70 %, placez-le dans un incubateur de culture cellulaire. Flacons de spinner individuels autoclave pour stériliser.
    2. Ajouter des sphères avec un minimum de 50 à 60 mL de milieu dans chaque fiole de fileur (Figure 1, encart). Placer le ballon sur la plaque d’agitation magnétique fixé à 60 t/mn. Sphères de la culture dans des flacons de la casserole jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour la collecte de données.
      NOTE : Un minimum de 3 semaines de culture est nécessaire pour la formation des synapses. Si le système de bioréacteur flask spinner n’est pas souhaité, sphères peuvent être cultivées dans des conditions stationnaires dans les flacons de culture cellulaire ou de la vaisselle. Sphères peuvent également être incorporées dans l’ECM ou hydrogel.

4. mesure de la physiologie synaptique direct avec baies multiélectrodes (AME)

  1. Préparer les AME pour la culture cellulaire.
    1. Nettoyez la surface de chaque ame avec 1 mL de détergent pendant 1 h. rincer avec l’eau désionisée stérile de (DI), rincer avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser et puis l’air sec en biosécurité armoire sous la lumière UV.
      Remarque : Montants éligibles maximum peut être stockés dans l’eau distillée à 4 ° C dans des conditions stériles jusqu'à utilisation.
    2. Préparer une solution de 0,5 mg/mL de poly-ornithine (OLP) en dissolvant 50 mg d’OLP dans 100 mL de tampon d’acide borique. Recouvrir la surface de chaque ame avec 1 mL de l’OLP pour rendre la surface hydrophile et incuber à 37 ° C pendant au moins 4 h. supprimer l’OLP, laver la surface avec de l’eau distillée, ajouter 1 mL d’ECM (voir étape 1.1.1) et incuber à 37 ° C pendant au moins 4 h.
    3. Enlever les ECM et placer des sphères dans 1,5 mL de support sur une surface MEA, veiller à ce que les sphères sont positionnés sur le dessus du tableau de l’électrode (Figures 3 a, 3 a '). Permettent d’adhérer pour 2 jours. Changer la moitié des médias tous les 2 – 3 jours (ou plus souvent si nécessaire), veiller à ce que les sphères ne sont pas perturbés.
      NOTE : Addition de facteurs de croissance peut-être améliorer la maturation et la survie de la culture.
  2. Mesurer l’activité électrique des neurones sphères.
    1. Mis en place un système multi-électrodes tableau (MEA) avec un préamplificateur à température contrôlée. Créer un logiciel avec un filtre passe-haut à 5 Hz et un filtre passe-bas de 200 Hz et un seuil de pointe de 5 x la déviation standard (SD).
    2. Placez la MEA sur l’activité électrique spontanée préamplificateur et enregistrement (Figure 3 bB'). Enregistrer les données brutes y compris spike fréquence et l’amplitude pour l’analyse statistique.
      NOTE : Un système de perfusion peut être utilisé avec la MEA pour ajouter des agents pharmacologiques ou pour augmenter le débit des supports neufs pour les enregistrements longue durée. Post-traitement supplémentaire d’épis peut-être être effectué comme désiré36,37.

5. mesure de la densité synaptique avec immunocytochimie

  1. Préparer des réactifs.
    1. Pour apporter une solution mère de 500 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA), ajouter 400 mL de solution 1 PBS x à un bécher en verre ou une assiette de remuer sous une hotte ventilée. Ajouter la barre d’agitation et de la chaleur à 60 ° C sous agitation ; ne pas faire bouillir. Ajouter 20 g de poudre de l’IFP à la solution de PBS chauffée et amener le pH à 6,9 en ajoutant lentement NaOH N 1 goutte à goutte.
      NOTE : solution PFA à 4 % peut être aliquotés et stockés à 4 ° C pour environ un mois.
    2. Ajouter 20 g ou 30 g de saccharose pour 100 mL de PBS pour faire des solutions de saccharose, 20 % et 30 % respectivement.
    3. Ajouter 1 mL de détergent dans 10 mL de PBS, afin de préparer une solution 10 %. Retourner plusieurs fois pour homogénéiser.
    4. Ajouter 250 µL de solution détergente 10 % (concentration finale de 0,25 %) et 500 µL de chaque de chèvre et âne sérums (concentration finale de 5 % chacun) à 10 mL de PBS pour préparer le premier tampon de blocage.
    5. Ajouter 100 µL de chaque de chèvre et âne sérums (concentration finale de 1 % chacun) à 10 mL de PBS pour préparer le tampon de blocage secondaire.
  2. Préparer les échantillons.
    1. Transférer les sphères dans un tube conique de 15 mL, permettez-leur de s’installer au fond du tube et aspirer les anciens médias. Rincer les sphères avec 500 µL de PBS, laisser reposer et aspirer le PBS. Ajouter 500 µL de 4 % PFA (ou suffisamment pour couvrir des sphères) et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    2. Aspirer la PFA et délicatement laver deux fois avec du PBS. Ajouter la solution de sucrose à 20 % et incuber à 4 ° C pendant plusieurs heures ou toute la nuit. Aspirer soigneusement, ajoutez la solution de 30 % de saccharose et incuber à 4 ° C pendant plusieurs heures ou pendant la nuit.
      Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C en PBS ou saccharose jusqu'à 1 semaine avant de passer à l’étape suivante. Si ce n’est pas trancher, maintenir comme des sphères 3D (Figure 4 a-C) dans un tube de 1,5 mL et passez à l’étape 5.3.
    3. Si couper les sphères, transvaser avec soin les sphères à un enrobage moule cryogénique sur le dessus de la glace sèche. Aspirer la solution de saccharose 30 % et verser lentement le tissu, intégration de solution dans le moule jusqu'à ce qu’il recouvre entièrement l’échantillon, en évitant les bulles d’air. Attendez que la solution se fige et stocker à-80 ° C jusqu’au cryostat tranchage.
    4. À l’aide d’un cryostat à-20 ° C, tranche les blocs incorporés en 30 µm sections (ou comme vous le souhaitez) et transfert à lames en verre. Stocker à-80 ° C jusqu’au moment de la tache.
  3. Réagissent les sphères.
    1. Contournez les bords des lames avec un stylo PAP hydrophobe pour éviter toute fuite de liquide. Préparer des solutions de blocage primaires et secondaires avec des anticorps (voir la Table des matières). Ajouter 500 µL de tampon de blocage principal pour chaque diapositive ou le tube et laisser incuber à température ambiante pendant 30 min.
    2. Retirer le liquide, ajouter 500 µL de tampon de blocage primaire frais avec des anticorps primaires dilués à chaque diapositive ou le tube et incuber une nuit à 4 ° C. Enlever la solution de l’anticorps primaire et laver 3 x avec PBS pendant 10 min chaque.
    3. Ajouter 500 µL de tampon de blocage secondaire avec l’anticorps secondaires dilués à chaque diapositive ou le tube et incuber à 4 ° C pendant 1 h. Retirez la solution d’anticorps secondaire et laver 3 x avec PBS pendant 10 min chaque.
      NOTE : Une liste des anticorps recommandées est fournie dans la Table des matières. Autres anticorps ou les colorants peuvent être utilisés comme vous le souhaitez. N’exposez pas les échantillons fluorescents à la lumière (étape 5.3.3 à partir).
    4. Ajouter 50 µL de solution goutte à goutte pour couvrir la surface et placez-la un lamelle couvre-objet sur la diapositive, en évitant les bulles de montage. Laisser les lames à sécher à température ambiante pendant 24h et conserver à 4 ° C.
  4. Les diapositives de l’image.
    1. Utiliser un microscope à fluorescence confocal ou deux photons avec un 63 X objectif à immersion d’huile à l’image avant et abondance de la protéine post-synaptiques et colocalisation dans les tranches de la sphère (Figure 4). Utilisez un 20 X ou 40 X objectif de visualiser les caractéristiques morphologiques de la hAstros.
    2. Fichiers image de fluorescence ouvert avec logiciels ImageJ. Compter les pré- et post-punctums synaptique manuellement en utilisant le plug-in, compteur de cellules en utilisant une méthode de comptage impartiale comme précédemment détaillées38, ou à d’autres méthodes.

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Representative Results

Lorsqu’ont été exécutés correctement, ce protocole va produire des populations définies des cocultures fonctionnelles d’astrocytes28,33,34 et neurones35 produit de hPSCs (Figure 1 a-1C), comme détaillées précédemment26 et étapes 2.1 à 2.2 décrites ici. Cette procédure pas à pas, avec l’utilisation de plaques de microtitration, devrait donner des sphères neurales 3D de taille uniforme et la forme (étape 3.3 ; La figure 1) avec cellules dispersées uniformément et sans des signes de mort cellulaire. Une gamme d’à partir de la densité des cellules, avec un ratio désiré de types de cellules, produira des sphères de différentes tailles. En l’absence de plaques microwell, cellules seront combinent pour former des agrégats de nettement plus grandes et non uniformes dont diamètre (> 2 mm) dépasse la limite de diffusion (Figure 2 a-2 b). Il est prévu que l’utilisation d’un bioréacteur de fiole ou équivalent de spinner va maintenir l’uniformité entre les sphères et réduire la fusion (étape 3.4 ; La figure 2). Cependant, tandis que les flacons de spinner permettent la culture des sphères pendant des semaines, leur utilisation n’est pas nécessaire.

Stabiliser les cocultures pour analyse électrophysiologique, ECM-imitant les substrats permettent de sphères d’adhérer facilement tout en conservant leur structure 3D (Figure 3 a, 3 a '). Lors des enregistrements, sphères sains d’iNeurons placé sur ame seront spontanément susciter des pointes de tension supérieure à ± 40 µV avec cuisson uniforme des fréquences (mesures 4.1 – 4.2 ; Figure 3 b -C, 3F). Sphères de coculture devraient afficher une plus grande connectivité réseau avec la présence de hAstros, résultant en une augmentation de salves de réseau synchrone de pointes (Figure 3 b« C -3 »). L’application de CNQX35,39,40, un antagoniste des récepteurs AMPA postsynaptique, réduit le réseau rafale synchronie dans les sphères de la co-culture (Figure 3D'-3E').

Marqueurs protéiques type cellulaire neuronal restreint démontrent visuellement l’arrangement uniformément dispersée et la maturité des astrocytes et les neurones dans les sphères 3D. Une projection maximale de branchement et de la morphologie de l’astrocyte est représentée dans la Figure 4 a dans une sphère 3D représentante avec hAstros faiblement marquées avec membrane-bondissent GFP. HAstros matures expriment des marqueurs dont GFAP (Figure 4 b) et S100B Glt134, tandis que hNeurons et iNeurons expriment la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2 ; La figure 4) et tubuline beta 3 (Tuj1/TUBB3). Enfin, bien qu’iNeurons expriment des protéines préalables- et post-synaptiques dont 1 synapsine (Syn1) et Homère ou PSD95, respectivement, densité synaptique est significativement augmentée par la présence de hAstros dans la co-culture (Figure 4)26. Le cas échéant, l’utilisation alternative de cerveau microscopie de nappe de lumière et de techniques de compensation permettra à imagerie rapide des sphères intacts.

Pris ensemble, l’expression des marqueurs neuronaux matures ainsi que de l’activité électrique spontanée confirment le succès du protocole détaillé ci-dessus en produisant des cocultures 3D de microcircuits synaptiques fonctionnelles.

Figure 1
Figure 1 : représentation par étapes de la différenciation et la formation de sphères neurales 3D dérivée de hPSCs. (A) chronologie des étapes clés dans le protocole. (B) des populations pures de cellules nerveuses peuvent être générées à partir des cellules souches humaines pluripotentes induites (hPSCs). Pour la génération des progéniteurs astrocyte (zone verte en pointillés), voir étape 2.1 ainsi que Ref28. (C) les neurones inductible (iNeurons ; Voir la section 2.2) générés à partir des hPSCs transgéniques via surexpression induite de neurogenin 2 montrent une morphologie neuronale sur ECM 2D (jour 7) et sont positifs pour MAP2 (encadré). (D) sphères retirés des plaques microwell (voir étapes 3.1 – 3.3) démontrent une taille uniforme pour le criblage à haut débit. Sphères peuvent être cultivées dans un bioréacteur de fiole spinner (encart ; Voir l’étape 3.4) si vous le souhaitez afin d’éviter la fusion. Echelle = 50 µm (C, encart). Barreaux de l’échelle = 200 µm (A, D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : génération systématique et reproductible des sphères neurale 3D bioengineered. (A) plaques de microtitration (µ-puits) culture servent à former des sphères neurales 3D de la densité souhaitée et des ratios de neurone-à-astrocyte de manière systématique et spécifiée par l’utilisateur, ce qui donne la forme et taille uniforme. Images sont affichées 1 jour après la formation sphère. Barreaux de l’échelle = 200 µm. (B) une gamme d’à partir de la densité des cellules (de 4 x 103 à 2 x 104 cellules / puits) produit des sphères de différentes tailles. En l’absence de plaques microwell, hPSCs se combinent pour former des agrégats de nettement plus grandes et non uniformes dont les diamètres dépassent la limite de diffusion après une semaine (n = 6-14 sphères par point de groupe et le temps). (C) pbhill sphères cultivées dans une fiole de spinner à 80 tr/mn exposé moins fusion et donc étaient significativement plus petits, plus uniforme et exposée circularité de plus par rapport à ceux en culture stationnaire sur une période de trois semaines (n = 6-51 sphères par point de groupe et le temps). Parcelles représentent la moyenne ± écart type ; * indique l’importance (p < 0,05) entre les groupes, déterminée à l’aide bilatérale t-tests. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : représentante direct physiologie synaptique des sphères neurones sur baies multiélectrodes (AME). (A, A') AME est utilisées pour mesurer les vivant physiologie synaptique des neurones sphères. Sphères d’iNeurons (A) ou cocultures d’iNeurons et hAstros (A') peuvent être cultivés sur des surfaces MEA avec ECM-imitant des substrats (voir point 4.1). (B, B') Raster parcelles représentant activité électrique spontanée, mesurée à travers toutes les électrodes (axe vertical) pendant une fenêtre d’enregistrement (axe horizontal). Après 4 semaines de culture neurophysiologiques basale moyenne41, pbhill sphères (B) affichée des pointes spontanée, tout en sphères de co-culture (B') a révélé une augmentation réseau rafales de tir synchrone patrons (flèches orange). (C, C') Histogramme de pointes mesurées pendant windows enregistrement MEA d’électrodes représentatifs. (D, D') Parcelles de pixellisation de l’activité électrique spontanée mesurés à travers toutes les électrodes après l’application de 50 µM CNQX, un antagoniste des récepteurs AMPA (même échelle de temps comme B, B'). CNQX éliminé la présence de rafales synchrones des pics observés dans les cocultures (D').  (E, E') histogramme de pointes mesurées pendant windows enregistrement MEA d’électrodes représentant après application de CNQX 50 µM (échelle en même temps que C, C »). (F) carte des tracés d’enrichissements des sphères pbhill de toutes les électrodes au fil du temps (à gauche). Démonstratif électrode unique affichant plusieurs traces en cluster au fil du temps (au milieu) ; traces d’enrichissements individuels peuvent être triées et analysés individuellement (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : immunohistochimie caractéristique des microcircuits synaptiques. (A) une membrane-bondissent à GFP (mGFP) journaliste est utile pour l’examen de l’arrangement et la morphologie des hAstros dans les sphères neurales 3D. (B) hAstros dissociés hPSCs infectés par le GFAP. (C) sphères contenant hAstros et iNeurons peuvent être visualisées et analysées à l’aide de marqueurs de cellules protéines de type restreints tels que GFAP et carte2. Barreaux de l’échelle = 50 µm. (D) images représentatives des densités de pré- et post-synaptiques (Syn1 et PSD95, respectivement) dans les domaines d’iNeurons sans (gauche) et avec (à droite) Co-cultivées hAstros. Une densité significativement accrue d’épididymaire Syn1 et PSD95 a été observée dans les sphères de coculture contre pbhill sphères au jour 35, démontrant la capacité du hAstros pour induire la formation des synapses (n = 3 répétitions indépendantes chacun ; données tiré de Ref 26 avec la permission). Barreaux de l’échelle = 10 µm. parcelle représente moyenne ± SEM ; des différences significatives (* indique p < 0,05 ; ** indique p < 0,01) entre les groupes ont été déterminées à l’aide bilatérale t-tests. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode systématique pour la production des sphères 3D des cocultures neuronales. Les sphères sont composées des astrocytes et les neurones, qui sont dérivées de manière indépendante de hPSCs. Bien que pas l’objectif du présent protocole, la génération des populations pures des astrocytes du hPSCs28 est une étape cruciale et peut être techniquement difficile si effectuée sans expérience préalable. Cette première étape de la génération de ces microcircuits synaptiques doit être effectuée avec le minutage méticuleux et souci du détail. Une limitation de l’utilisation de dérivés hPSC astrocytes est le processus de différenciation longue ; Toutefois, la production de grandes quantités de cellules qui peuvent être congelés pour avenir utiliser et décongelés à la période d’expérimentation (voir étape 2.1.5) élimine la nécessité d’entamer le processus de la phase initiale de hPSC. Bien que les iNeurons produits de hPSCs transgéniques sont synaptogenic et ont la capacité d’exposer des courants électriques postsynaptiques spontanés, ces deux caractéristiques sont notamment stimulées par la présence de cellules gliales12,35— y compris les hAstros détaillées dans le présent protocole. Ainsi, il est à noter que le choix du type de cellule, nombre et le stade de développement ou échéance est un élément essentiel du présent protocole, et ajustements peuvent entraîner des variations dans l’activité électrique ou la visualisation de la synapse. Toutefois, ce protocole permet aussi manipulation de densité cellulaire ou les rapports d’une manière qui reflète la souplesse des conditions possibles ou les résultats de la chercheur individuel.

Comme décrit ci-dessus, nous profitons des outils de bio-ingénierie pour produire une solution de rechange à42,méthodes neuronaux organoïde43, avec l’avertissement que ce système ne pas récapituler les phénotypes de l’auto-organisation et la superposition de organoïdes qui peut être désiré20,44. L’utilisation simultanée de plaques microwell culture26 et un cône d’hélice fiole bioréacteur45,46 assurer la reproductibilité, rationalisation ainsi non seulement la production, mais aussi l’examen et l’analyse des microcircuits neurones avec une variété d’essais de culture de cellules. Il convient de souligner que l’utilisation d’un bioréacteur de fiole ou équivalent de spinner est facultative, une culture stationnaire des sphères en contact étroit peut entraîner leur fusionnant, donc limite de nutriments et d’oxygène au-delà de la limite de diffusion dans le centre des sphères47. Notamment, l’utilisation de 3D mini-bioréacteurs imprimés ont été signalés comme une approche de débit plus élevée par rapport aux bioréacteurs grands46.

Les outils traditionnels pour mesurer la formation synaptique incluent méthodes physiologiques telle cellule entière patch serrage ame36,48,49et calcium imagerie50. Ici, nous choisissons décrire l’utilisation des AME, car ils fournissent un examen simple et haut débit de l’activité électrique dans les sphères sur une échelle de temps courte. Toutefois, autres techniques peuvent également être utilisés.

Une limitation de l’utilisation des plaques microwell dans le présent protocole est le nombre maximum de sphères (~ 300) et cellules / sphère (~ 2 x 104) qui sont autorisées dans chaque puits. Outils de formation sphère alternatifs peuvent être utilisés pour un plus grand nombre ; Cependant, un nombre plus élevé de cellules sera requis au point de départ. Le format de 24 puits a été choisi ici pour sa capacité à générer de grandes sphères qui peuvent être manipulés pour analyse et visible par le œil, tout en limitant la mort des cellules dans le Centre des sphères. Dans l’ensemble, l’ajout de cette étape du protocole assurera une production fiable et évolutive des sphères 3D uniformes.

Notre protocole revendique également la possibilité d’ajuster le nombre et la proportion de chaque type de cellule, ainsi que la possibilité d’introduire des autres types de cellules dans les sphères 3D d’une manière contrôlée, définie. L’utilisation de neurones spécifiques à la région et sous-types astrocyte permet l’étude des microcircuits synaptiques de différentes régions du système nerveux central. Ces coculture sphères peuvent également être soudées51 afin d’étudier la migration cellulaire et signalisation de longue portée. L’ajout des oligodendrocytes, cellules endothéliales ou les microglies pourrait se révéler ces sphères 3D un modèle instructif cerveau avec une complexité accrue, comme orientation avenir prometteuse pour cette méthode. Enfin, en plus des maladies et des blessures de modélisation, ce système permet d’étudier des approches thérapeutiques, tels que la thérapie de remplacement cellulaire ou de développement de médicaments, d’améliorer la neurogenèse.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Dr. Erik Ullian (UCSF) pour un apport intellectuel sur la conception de ces procédures, Dr Michael Ward (NIH) pour des conseils techniques sur la différenciation des rudolfinho et Saba Barlas d’analyse d’images préliminaires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

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Biologie du développement numéro 138 cellules souches neurones Astrocytes Synapses organoïde Coculture bioréacteur tableau multiélectrodes
Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines
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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

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