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Developmental Biology

मानव Pluripotent स्टेम सेल से Astrocytes और न्यूरॉन्स की 3डी Cocultures के साथ Synaptic Microcircuit मॉडलिंग

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम असंबद्ध मानव pluripotent स्टेम सेल व्युत्पंन ंयूरॉंस और 3 डी क्षेत्र cocultures में एक साथ astrocytes, मुक्त अस्थाई स्थितियों में इन क्षेत्रों को बनाए रखने के संयोजन के लिए एक reproducible विधि का वर्णन है, और बाद में immunoanalysis और multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग के साथ क्षेत्रों के synaptic सर्किट गतिविधि को मापने.

Abstract

कैसे विभिंन प्रकार के सेल और संकेतों को synaptic सर्किट समारोह में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक मॉडलों की कमी है । एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए तीन आयामी (3 डी) तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों का उपयोग है, ' organoids ' या ' spheroids ', extracellular आसंजन अणुओं सहित सेलुलर बातचीत के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए । हालांकि, इन संस्कृति प्रणालियों समय लेने और व्यवस्थित नहीं उत्पंन कर रहे हैं । यहां, हम विस्तार से एक तरीका तेजी से और लगातार मानव pluripotent स्टेम सेल से ंयूरॉंस और astrocytes के 3 डी cocultures का उत्पादन । पहले, पूर्व विभेदित astrocytes और न्यूरॉन progenitors असंबद्ध और गिना जाता है । अगले, कोशिकाओं के क्षेत्र में संयुक्त कर रहे है एक Rho-कळेनासे अवरोध करनेवाला और विशिष्ट अनुपात में reproducible आकार के क्षेत्रों के उत्पादन के साथ व्यंजन बनाने । चल क्षेत्रों के रूप में संस्कृति के कई हफ्तों के बाद, cocultures (' क्षुद्रग्रहों ') अंत में immunostaining के लिए खोदी या multielectrode arrays पर चढ़ाया synaptic घनत्व और शक्ति को मापने के लिए कर रहे हैं । सामांय में, यह उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल 3 डी तंत्रिका क्षेत्रों है कि परिपक्व सेल प्रकार प्रतिबंधित मार्करों प्रदर्शन उपज, कार्यात्मक synapses फार्म का, और प्रदर्शन सहज synaptic नेटवर्क फट गतिविधि होगा । एक साथ, इस प्रणाली monolayer संस्कृतियों की तुलना में एक अधिक उपयुक्त मॉडल में रोग के तंत्र में दवा जांच और जांच परमिट ।

Introduction

Astrocytes संरचनात्मक समर्थन से परे कार्यात्मक जिंमेदारियों की एक किस्म के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में glial कोशिका प्रकार हैं । घुलनशील synaptogenic कारकों और extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों के स्राव के माध्यम से, astrocytes स्थापना में सहायता और परिपक्व synapses के विकास के दौरान clustering1. उंहोंने यह भी extracellular संकेतन2,3,4,5के माध्यम से synapses के स्वास्थ्य और प्लास्टिक की व्यवस्था को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और समस्थिति की दीर्घकालिक स्थिरता के लिए योगदान extracellular पोटेशियम और ग्लूटामेट को विनियमित करके वातावरण, साथ ही ऊर्जा सब्सट्रेट और एटीपी6,7,8का स्राव । अंत में, वे extrasynaptic धाराओं9को प्रभावित करने के द्वारा neurotransmission के लिए योगदान कर सकते हैं, और अप्रत्यक्ष रूप से myelination10को बढ़ावा देने के रूप में अन्य सेल प्रकार के माध्यम से गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात, क्योंकि विषमता या astrocytes की शिथिलता कई neurodevelopmental सिंड्रोम और वयस्क neuropathology के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वहां एक स्पष्ट करने के लिए इंजीनियर के भीतर न्यूरॉन्स के साथ astrocytes शामिल करने की जरूरत है तंत्रिका नेटवर्क के लिए आदेश में एक बेहतर अंतर्जात मस्तिष्क पर्यावरण के मॉडल । astrocytes की एक अभिंन विशेषता के लिए अपने ंयूरॉंस synapses1,11,12के साथ गतिशील बातचीत के फार्म की क्षमता है । glia के अभाव में, न्यूरॉन्स synapses की एक सीमित संख्या है, जो सामान्य रूप में भी कार्यात्मक परिपक्वता13कमी के रूप में.

मानव astrocytes प्रदर्शन रूपात्मक, transcriptional, और कार्यात्मक विशेषताओं-जैसे वृद्धि हुई आकार और शाखाओं में जटिलता के रूप में अच्छी तरह से प्रजातियों के रूप में विशेष जीन है कि कुतर12,14, में recapitulated नहीं कर रहे हैं, 15. नतीजतन, अध्ययन मानव pluripotent स्टेम सेल का उपयोग (hPSC)-तंत्रिका कोशिकाओं व्युत्पंन हो व्यापक रूप से सीएनएस में संबंधित रोगों की जांच के एक साधन के रूप में स्वीकार किए जाते है जबकि उपंयास उपचार, चोट मॉडल, और संस्कृति मानदंड16 विकसित ,17. इसके अलावा, hPSCs प्राथमिक ऊतक18,19के लिए की आवश्यकता के बिना मानव synapse गठन और समारोह के अध्ययन की अनुमति ।

कैसे विभिंन प्रकार के सेल और संकेतों को synaptic सर्किट समारोह में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा मानव मस्तिष्क के प्रासंगिक मॉडलों की कमी है । उच्च निष्ठा और reproducibility के साथ अपने synaptic नेटवर्क दोहराऊंगा करने के लिए एक उपयुक्त मंच की आवश्यकता है । हाल ही में, ब्याज 3 डी संस्कृति प्रणालियों के उत्पादन में उभरा है (मोटे तौर पर ' के रूप में जाना जाता organoids, ' ' spheroids, ' या ' मिनी दिमाग ')20 से मॉडल परिसर में तीन आयामी (3d) संरचनाओं सेलुलर और स्थूल स्तर पर । 3 डी संस्कृति प्रणालियों ECM और सेल सेल बातचीत है कि सामांय रूप से अनुपस्थित या ठेठ 2d coculture मानदंड21,22के दौरान सीमित है बनाए रखने के । तकनीक का एक बहुतायत संवर्धन 3 डी तंत्रिका spheroids23,24,25के लिए मौजूद; हालांकि, कई लंबे समय तक संस्कृति की आवश्यकता होती है (महीने साल के लिए) सहज विकास और परत संरक्षण के लिए, उत्पादन पर बहुत कम नियंत्रण प्रदर्शन उपयोगकर्ता के साथ ।

यहां, हम तेजी से और लगातार इंजन के लिए एक व्यवस्थित विधि वर्णन एकाधिक कोशिका प्रकार के बीच तंत्रिका बातचीत (पूर्व विभेदित न्यूरॉन्स और astrocytes) hPSCs से व्युत्पंन में कोशिकाओं द्वारा कोडांतरण क्षेत्र cocultures (' क्षुद्रग्रहों ')26 कि 3 डी में मानव विशिष्ट रूपात्मक जटिलताओं दोहराऊंगा । इस उच्च घनत्व तंत्रिका प्रणाली समान रूप से फैलाया तंत्रिका उपप्रकार है कि समय के साथ परिपक्व संपत्तियों पर ले और जांच की जा सकती है या एक उच्च प्रवाह तरीके से परख उत्पंन करता है । हम पहली बार है कि मानव astrocytes इन 3 डी cocultures में synaptic नेटवर्क फट गतिविधि प्रेरित के लिए प्रदर्शित करते हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आसानी से विभिंन आकारों के क्षेत्रों उत्पंन करने के लिए अनुकूलनीय है, सीएनएस के विभिंन क्षेत्रीय पहचान करने के लिए निर्दिष्ट कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए, और कई अंय प्रकार के सेल के संपर्क का अध्ययन करने के लिए वांछित के रूप में ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति और एजेंट की तैयारी

नोट: इस अनुभाग में प्रोटोकॉल में वे भिंनता प्रोटोकॉल (खंड 2) में प्रकट होने के क्रम में लिखे गए हैं । सामग्री और कैटलॉग संख्या के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. सेल संस्कृति के लिए लेपित प्लेटें तैयार करें ।
    1. पतला extracellular मैट्रिक्स (ECM) कोटिंग समाधान DMEM/F12 मीडिया के साथ एक 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए । Aliquot पतला ECM शेयर समाधान के 30 शंकु ट्यूबों में 3 मिलीलीटर प्रत्येक और तुरंत में स्टोर-20 ° c । एक काम समाधान के लिए, ECM स्टॉक के 3 मिलीलीटर पूर्व ठंडा DMEM के ३३ मिलीलीटर में resuspend/F12 मीडिया, ८० µ g/एमएल की एकाग्रता के लिए कुल मात्रा ३६ मिलीलीटर लाने के लिए ।
    2. कोट ECM काम समाधान के साथ एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर । एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर DMEM/F12 प्रति अच्छी तरह से जोड़ें (यदि आवश्यक हो) के लिए सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह की सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है । उपयोग करने से पहले लेपित 6-well सेल कल्चर प्लेटों को कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें ।
      नोट: लेपित प्लेटें मशीन में या 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. मीडिया योगों, विकास कारकों, और छोटे अणुओं को तैयार करें ।
    1. ५०० मिलीलीटर मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) मध्यम27तैयार करने के लिए, निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार 20x और 500x की खुराक जोड़ें ।
    2. तंत्रिका मध्यम (एनएम) के ५०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, 2 मिलीग्राम की अंतिम एकाग्रता के लिए हेपरिन जोड़ें/एमएल, एंटीबायोटिक/antimycotic समाधान, 1x B27 अनुपूरक या 1x N2 पूरक के एक ५०० मिलीलीटर की बोतल के लिए DMEM/F12 के साथ एल glutamine पूरक के रूप में पहले से विस्तृत28।
    3. एक 10 मिमी तैयार करने के लिए (1, 000x) Rho के शेयर समाधान-कळेनासे अवरोध करनेवाला Y27632 (वाई), फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 3 मिलीलीटर में पाउडर के 10 मिलीग्राम जोड़ें. फ़िल्टर बंध्याकरण, aliquot, और स्टोर पर-20 ° c । एक 10 µ एम मीडिया में एकाग्रता काम कर का उपयोग करें ।
    4. SB431542 के 20 मिमी (10, 000x) स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, dimethyl sulfoxide (DMSO) के १.३ मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम पाउडर जोड़ें । एक 2 मिमी (1, 000x) DMH1 के शेयर समाधान तैयार करने के लिए, DMSO के १३.१ मिलीलीटर में पाउडर के 10 मिलीग्राम जोड़ें । प्रत्येक समाधान को-20 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर करें, aliquot, और संग्रहीत करें । मीडिया में 2 µ m काम एकाग्रता में प्रत्येक का उपयोग करें (एनएम + SB431542 + DMH1) ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल की सिफारिश की 2 µ एम दोनों SB431542 और DMH1 के कार्य सांद्रता हमारी टिप्पणियों और दूसरों से रिपोर्टों पर आधारित29 बताते हुए कि इस एकाग्रता को प्रभावी ढंग से hPSCs से तंत्रिका प्रेरण को बढ़ावा देता है । उच्च सांद्रता भी30सूचित किया गया है । इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक मीडिया के साथ, यह भी दिखाया गया है कि छोटे अणुओं उच्च तंत्रिका रूपांतरण31के लिए आवश्यक नहीं हैं । इस प्रकार, कार्य सांद्रता वैकल्पिक सेल संस्कृति के वातावरण के आधार पर भिंन होगा, और इष्टतम सांद्रता व्यक्तिगत शोधकर्ताओं द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए ।
    5. १०० µ जी/एमएल (10, 000x) एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF) और fibroblast वृद्धि फैक्टर-2 (FGF2) के शेयर समाधान तैयार करने के लिए, प्रत्येक के 10 मिलीलीटर में 1 मिलीग्राम जोड़ें + ०.१% BSA । Aliquot EGF और FGF2 स्टॉक समाधान में ५० µ एल aliquots और स्टोर-८० डिग्री सेल्सियस पर । मीडिया में एक 10 एनजी/मिलीलीटर काम एकाग्रता में प्रत्येक का उपयोग करें; उदा., 5 µ l EGF और 5 µ l FGF2 को ५० मिलीलीटर (nm + EGF + FGF2) में जोड़ें ।
    6. doxycycline हाइडरोक्लॉराइड (Dox) का एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, पहले DMSO में पाउडर भंग करने के लिए १०० मिलीग्राम/एमएल और स्टोर पर-20 ° c । इसके अलावा यह एक 2 मिलीग्राम/एमएल (1, 000x) पंजाब और स्टोर में स्टॉक समाधान-20 डिग्री सेल्सियस बनाने के लिए पतला । मीडिया में 2 µ g/mL कार्य एकाग्रता का उपयोग करें; उदा., ५० µ l Dox को ५० मिलीलीटर (एनएम + Dox) में जोड़ें ।
      नोट: गल जाने के बाद समाधान फिर से फ़्रीज़ न करें.

2. मानव प्रेरित Pluripotent कोशिकाओं से तंत्रिका उपप्रकार की पीढ़ी (hPSCs)

नोट: सभी सेल संस्कृतियों ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक मशीन में बनाए रखा जाना चाहिए । इन संस्कृतियों कमरे ऑक्सीजन के स्तर पर बनाए रखा है, हालांकि निचले स्तर का उपयोग किया जा सकता है ।

  1. उत्पन्न और hPSCs से astrocyte progenitors (hAstros) बनाए रखने.
    नोट: यह अनुभाग एक संक्षिप्त और सरलीकृत विभेदक प्रोटोकॉल प्रदान करता है । (embryoid शरीर गठन, rosette चयन और क्षेत्रीय पैटर्न कदम के साथ) एक विस्तृत विवरण के लिए पहले वर्णित प्रोटोकॉल28 को देखें (आंकड़ा 1a, बिंदीदार हरा बॉक्स) ।
    1. hPSCs के बीज समूहों (चित्रा 1b) पर ECM-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटें (१.१ कदम देखें) के साथ hPSC मध्यम के 2 मिलीलीटर + अच्छी तरह से प्रति Y । हर दिन स्टेम सेल फ़ीड जब तक वे के बारे में ५०% धाराप्रवाह और विभाजन की जरूरत के रूप में कर रहे हैं ।
      1. hPSCs को विभाजित करने के लिए, 1 मिनट के बाद कुओं और महाप्राण के लिए passaging रिएजेंट की १ मिलीलीटर जोड़ें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं, hPSC मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और भाजित समुच्चय 1:10 पर नए ECM-लेपित कुओं में hPSC मध्यम के 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से + Y ।
    2. स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने जब तक वे के बारे में ५०% धाराप्रवाह हैं, तो एनएम के लिए मीडिया को बदलने + SB431542 + DMH1 तंत्रिका भेदभाव प्रेरित करने के लिए (0 दिन) । जब कोशिकाओं के बारे में ९५% धाराप्रवाह हैं, एक ही माध्यम में नए ECM-लेपित कुओं में 1:6 भाजित ।
    3. 14 दिवस पर, टुकड़ी समाधान और वाई के साथ एक गैर लेपित कुप्पी को हस्तांतरण के साथ कोशिकाओं को समुच्चय के गठन को बढ़ावा देने के अलग कर देना ।
      नोट: वाई के अलावा सेल अस्तित्व और क्षेत्र गठन को बढ़ावा देने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन हर फ़ीड के दौरान शामिल नहीं है ।
    4. न्यूरॉन progenitors और न्यूरॉन्स (hNeurons) की पीढ़ी के लिए, नीचे वर्णित के रूप में इन दिन-14 कोशिकाओं का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, monolayer या क्षेत्रः संस्कृतियों से बाद में समय अंक पर इन कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले ंयूरॉन परिपक्वता होती है या gliogenesis शुरू ।
      नोट: डिफ़ॉल्ट रूप से, इस प्रोटोकॉल पृष्ठीय-cortical astrocytes पैदा करता है । हालांकि, astrocyte उपप्रकार क्षेत्र morphogens पैटर्न के अलावा द्वारा निर्दिष्ट किया जा सकता है यदि वांछित28,३२,३३। Retinoic एसिड (आरए) को रीढ़ की हड्डी phenotypes में caudalize कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है, जबकि सोनिक हेज हॉग (श्श्श), smoothened एगोनिस्ट (सग), या purmorphamine ventral phenotypes का उत्पादन करेंगे ।
    5. सहज में astrocyte progenitors और astrocytes की पीढ़ी के लिए 3 डी समुच्चय (hAstrospheres) का गठन, एनएम + EGF + FGF2 के लिए स्विच और साप्ताहिक फ़ीड (या के रूप में स्थिर पीएच सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक) के रूप में पहले से विस्तृत३४।
      1. धीरे अलग कर देना टुकड़ी समाधान के साथ hAstro समुच्चय जब अंधेरे केंद्र दिखाई देते है और क्षेत्रों है कि अनायास हटा देते हैं । क्षेत्र के स्वास्थ्य को बनाए रखने और गल कोर से बचने के लिए एक सप्ताह में एक बार धीरे तोड़ क्षेत्रों ।
        नोट: टुकड़ी समाधान के साथ उपचार के 5 मिनट से अधिक नहीं है ।
      2. विस्तार के 4-6 महीने के बाद, सेल पहचान की पुष्टि करें और या तो cryopreservation माध्यम में फ्रीज (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) या वैकल्पिक भंडारण शर्तों तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक संरक्षण के लिए, या के लिए तुरंत उपयोग प्रयोग.
    6. hAstrospheres के जमे हुए स्टॉक गल करने के लिए, जल्दी से एक शीशी कमरे के तापमान पर गल, एक खाली 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण, और 1 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से महाप्राण supernatant, DMEM के साथ धो/F12, और दो धोने की कुल के लिए दोहराएं चरणों. एनएम के 6 मिलीलीटर + EGF + FGF2 + Y (या जरूरत के रूप में पैमाने ऊपर) की कुल मात्रा के साथ एक T25 कुप्पी में जोड़ें ।
  2. उत्पन्न और hPSCs से inducible न्यूरॉन्स (iNeurons) को बनाए रखने.
    1. बीज ट्रांसजेनिक hPSCs (एक स्थिर doxycycline के साथ-inducible neurogenin 2 transgene३५) पर ECM-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटें के साथ hPSC मध्यम के 2 मिलीलीटर + Y (के रूप में गैर ट्रांसजेनिक लाइनों के लिए ऊपर वर्णित) । अच्छी तरह से प्रति मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ हर रोज फ़ीड जब तक वे ७०% पर प्रवाह उठाने के लिए तैयार हैं । चरण 2.1.2 में बताए अनुसार कक्ष विभाजित करें ।
    2. जब कोशिकाओं के बारे में ३५% धाराप्रवाह हैं, एनएम जोड़ें + Dox iNeurons में भिंनता पैदा करने के लिए । ३.२ कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 2 दिनों के लिए एनएम + Dox के साथ एक monolayer संस्कृति के रूप में बनाए रखें ।
      नोट: कोशिकाओं को न्यूरॉन progenitors में संक्रमण होगा, लेकिन अभी तक neurites (चित्रा 1C) का विस्तार नहीं होगा.

3. तैयारी और 3 डी क्षेत्रः Cocultures के रखरखाव

  1. निलंबन में 3d समुच्चय से अलग कर देना hAstros (जैसा चरण 2.1.5.1 में वर्णित है) ।
  2. एक 2d monolayer से अलग कर देना hNeurons या iNeurons ।
    1. 6-खैर प्लेट से मीडिया को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त monolayer संस्कृतियों के लिए टुकड़ी समाधान के ५०० µ एल जोड़ें । 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन धीरे जोड़ें 2-3 mL DMEM/संलग्न कक्षों को निकालने के लिए F12 ।
    2. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं और मीडिया लीजिए और 1 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant महाप्राण, ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और एक १,००० µ एल micropipette के साथ धीरे ऊपर और नीचे पिपेट एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  3. फार्म 3 डी microwell कल्चर प्लेट का उपयोग क्षेत्रों ।
    1. microwell प्लेट की प्रत्येक अच्छी तरह से विरोधी पालन धोने के समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़कर थाली तैयार करते हैं । 5 min. महाप्राण धोने समाधान के लिए २,००० x g पर प्लेट केंद्रापसारक, एक अच्छी तरह से धोने के लिए DMEM/F12 के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर से महाप्राण ।
      नोट: हमेशा सुनिश्चित करें कि उपयोग के दौरान केंद्रापसारक संतुलित है ।
    2. hemocytometer या स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके प्रत्येक कक्ष प्रकार की गणना करें । असंबद्ध hAstros और hNeurons या iNeurons की एक कुल मात्रा में एक अच्छी तरह से एनएम के 2 मिलीलीटर + Y का वांछित अनुपात जोड़ें (Dox अगर iNeurons का उपयोग कर रहे हैं) शामिल हैं । १०० एक्स जी में 3 मिनट और मशीन को वापस करने के लिए प्लेट केंद्रापसारक ।
      नोट: 24-well microwell प्लेट्स ( सामग्री की तालिकादेखें) में अच्छी तरह से प्रति ३०० microwells होते हैं । 6 x 105 कोशिकाओं की एक ंयूनतम जोड़ें (2 x 103 कोशिकाओं के क्षेत्रों के लिए प्रत्येक) और 6 x 106 कोशिकाओं की एक अधिकतम (2 x 104 कोशिकाओं के क्षेत्रों के लिए प्रत्येक) अच्छी तरह से प्रति मीडिया के 2 मिलीलीटर में । इस रेंज के भीतर एक विशिष्ट घनत्व के व्यवहार्य क्षेत्रों के लिए, कोशिकाओं की एक निर्धारित मात्रा का उपयोग करें और ३०० द्वारा विभाजन प्रति क्षेत्र कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए । वैकल्पिक क्षेत्र बनाने के तरीकों और उपकरण भी अगर वांछित उपयोग किया जा सकता है । कक्ष घनत्व की स्वीकार्य श्रेणियों के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    3. अगले 2 दिनों (चित्रा 2a) पर microwell प्लेटों के भीतर घनी पैक क्षेत्रों में स्व-इकट्ठा करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें । ५०% मीडिया की जगह अगर संस्कृति तेजाब है ।
      नोट: विनिमय केवल आधा मीडिया और पिपेट धीरे जब हटाने और मीडिया जोड़ने के क्रम में नहीं क्षेत्रों परेशान करने के लिए । क्षेत्रों microwells से उठा और उच्च शक्ति के साथ एक साथ फ्यूज कर सकते हैं ।
    4. 2 दिनों के बाद, धीरे से एक १,००० µ l micropipette (चित्रा 1 डी) के साथ microwells से क्षेत्रों को हटा दें । हल्के से किसी भी अतिरिक्त पालन क्षेत्रों को हटाने के लिए मीडिया के साथ microwells के तल पर बल लागू होते हैं । क्षेत्रों एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में बसा, पुराने मीडिया महाप्राण, और ताजा मीडिया जोड़ सकते हैं ।
  4. 3 डी क्षेत्रों के गठन के लिए स्पिनर कुप्पी प्रतिक्रिया प्रणाली सेट करें ।
    1. ७०% इथेनॉल के साथ एक चुंबकीय हलचल प्लेट की सतह साफ, यह एक कोशिका संस्कृति मशीन में जगह है । आटोक्लेव व्यक्तिगत स्पिनर कुप्पी को निष्फल करते हैं.
    2. प्रत्येक स्पिनर कुप्पी (चित्रा 1 डी, इनसेट) के लिए 50-60 मिलीलीटर मीडिया की एक ंयूनतम के साथ क्षेत्रों जोड़ें । चुंबकीय हलचल ६० rpm पर सेट प्लेट पर कुप्पी प्लेस । संस्कृति स्पिनर कुप्पी में जब तक वे डेटा संग्रह के लिए तैयार कर रहे है क्षेत्रों ।
      नोट: संस्कृति में 3 सप्ताह की एक ंयूनतम synapse गठन के लिए आवश्यक है । यदि स्पिनर कुप्पी के साथ प्रतिक्रियात्मक प्रणाली वांछित नहीं है, क्षेत्रों सेल संस्कृति की कुप्पी या बर्तन में स्टेशनरी की स्थिति में संस्कृति हो सकता है । क्षेत्रों में भी ECM या hydrogel में एंबेड किया जा सकता है ।

4. Multielectrode arrays के साथ लाइव Synaptic फिजियोलॉजी का मापन (रहत)

  1. कोशिका संस्कृति के लिए रहत तैयार करें.
    1. प्रत्येक विदेश मंत्रालय की साफ सतह 1 के लिए डिटर्जेंट की मिलीलीटर के साथ बाँझ के साथ कुल्ला (DI) पानी, ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला करने के लिए निष्फल, और फिर हवा में शुष्क यूवी प्रकाश के तहत सुरक्षा कैबिनेट ।
      नोट: उपयोग तक बाँझ शर्तों के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर DI पानी में रहत संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. पीएलओ के ५० मिलीग्राम बोरिक एसिड बफर के १०० मिलीलीटर में भंग करके पाली-ornithine (पीएलओ) के एक ०.५ मिलीग्राम/एमएल समाधान तैयार करें । कोट पीएलओ के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक विदेश मंत्रालय की सतह के लिए सतह हाइड्रोफिलिक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 ज की एक ंयूनतम के लिए मशीन प्रदान करते हैं । पीएलओ निकालें, DI पानी के साथ सतह धो, ECM के 1 मिलीलीटर जोड़ें (1.1.1 कदम देखें), और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी 4 ज की एक ंयूनतम के लिए ।
    3. मीडिया के १.५ मिलीलीटर में ECM और जगह क्षेत्रों मेे सतह पर निकालें, सुनिश्चित करना है कि क्षेत्रों इलेक्ट्रोड सरणी के शीर्ष पर तैनात कर रहे है (आंकड़े 3 ए, 3ए) । 2 दिनों के लिए पालन करने की अनुमति दें । परिवर्तन हर 2-3 दिन मीडिया के (या अधिक बार अगर जरूरत है), सुनिश्चित करना है कि क्षेत्रों परेशान नहीं कर रहे हैं ।
      नोट: विकास कारकों के अलावा संस्कृति जीवन रक्षा और परिपक्वता में सुधार हो सकता है ।
  2. तंत्रिका क्षेत्रों के विद्युत गतिविधि को मापने ।
    1. तापमान नियंत्रित headstage के साथ एक multielectrode सरणी (मेे) प्रणाली को स्थापित करें । एक 5 हर्ट्ज उच्च पास फिल्टर, और एक २०० हर्ट्ज कम पास फिल्टर, और 5x मानक विचलन (एसडी) की एक कील दहलीज के साथ एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम बनाएँ ।
    2. मेे जगह पर headstage और रिकार्ड सहज विद्युत गतिविधि (आंकड़ाबी.बी. ') । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कील आवृत्ति और आयाम सहित रॉ डेटा सहेजें ।
      नोट: एक छिड़काव प्रणाली विदेश मंत्रालय के साथ उपयोग किया जा सकता है औषधीय एजेंटों को जोड़ने या दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए ताजा मीडिया का प्रवाह बढ़ाने के लिए । अतिरिक्त के बाद spikes के प्रसंस्करण के रूप में वांछित३६,३७प्रदर्शन किया जा सकता है ।

5. Immunocytochemistry के साथ Synaptic घनत्व का मापन

  1. रिएजेंट तैयार करें ।
    1. 4% paraformaldehyde (पीएफए) का एक ५०० मिलीलीटर स्टॉक समाधान करने के लिए, एक गिलास चोंच या हवादार हुड में एक हलचल थाली के लिए 1x पंजाबियों के ४०० मिलीलीटर जोड़ें । हलचल बार और ६० डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी सरगर्मी जबकि जोड़ें; फोड़ा न करें । गरम पंजाब समाधान के लिए पीएफए पाउडर के 20 ग्राम जोड़ें और धीरे 1 N NaOH dropwise जोड़ने से ६.९ के लिए पीएच बढ़ा ।
      नोट: 4% पीएफए समाधान एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर aliquoted और संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. सुक्रोज के 20% और 30% समाधान बनाने के लिए सुक्रोज के १०० मिलीलीटर के 20 ग्राम या 30 ग्राम जोड़ें ।
    3. 10% स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए पंजाब के 10 मिलीलीटर में डिटर्जेंट की 1 मिलीलीटर जोड़ें । पलटने को कई बार homogenize.
    4. जोड़ें २५० µ 10% डिटर्जेंट स्टॉक समाधान के एल (अंतिम एकाग्रता की ०.२५%) और ५०० µ l बकरी और गधा सीरम के प्रत्येक (अंतिम एकाग्रता 5% प्रत्येक) के लिए 10 मिलीलीटर पंजाबियों प्राथमिक अवरुद्ध बफर तैयार करने के लिए ।
    5. जोड़ें १०० µ एल बकरी और गधा सीरम के प्रत्येक (1% प्रत्येक के अंतिम एकाग्रता) के लिए 10 मिलीलीटर पंजाब माध्यमिक अवरुद्ध बफर तैयार करने के लिए ।
  2. नमूनों को तैयार करें ।
    1. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में क्षेत्रों स्थानांतरण, उन्हें ट्यूब के नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं, और पुराने मीडिया महाप्राण । पंजाब के ५०० µ के साथ कुल्ला क्षेत्रों, चलो बसा, और महाप्राण पंजाबियों । 4% पीएफए (या क्षेत्रों को कवर करने के लिए पर्याप्त) और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के ५०० µ एल जोड़ें ।
    2. महाप्राण पीएफए और धीरे से दो बार पंजाबियों के साथ धो लो । कई घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% सुक्रोज समाधान और मशीन जोड़ें । ध्यान से महाप्राण, 30% सुक्रोज समाधान जोड़ें, और कई घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: नमूने अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले 1 सप्ताह तक या तो पंजाब या सुक्रोज में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किए जा सकते हैं । टुकड़ा करने की क्रिया नहीं है, तो 3 डी क्षेत्रों के रूप में बनाए रखने (चित्र 4a-C) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में और ५.३ कदम के लिए आगे बढ़ना ।
    3. अगर क्षेत्रों टुकड़ा करने की क्रिया, सावधानी सूखी बर्फ के शीर्ष पर एक embedding क्रायोजेनिक मोल्ड करने के लिए क्षेत्रों स्थानांतरण । महाप्राण 30% सुक्रोज समाधान और धीरे से ढालना में ऊतक embedding समाधान डालना जब तक यह पूरी तरह से नमूना शामिल है, हवा के बुलबुले से परहेज । समाधान जमा देता है और जब तक प्रतीक्षा-८० ° c cryostat टुकड़ा करने की क्रिया तक ।
    4. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat का उपयोग कर, 30 µm वर्गों (या वांछित के रूप में) में एम्बेडेड ब्लॉक स्लाइस और ग्लास स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण । पर स्टोर-८० ° c जब तक दाग के लिए तैयार ।
  3. Immunostain क्षेत्रों ।
    1. तरल छलकने को रोकने के लिए एक hydrophobic पीएपी पेन के साथ स्लाइड के किनारों को बाह्यरेखांकित करें । एंटीबॉडी के साथ प्राथमिक और माध्यमिक अवरुद्ध समाधान तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रत्येक स्लाइड या ट्यूब के लिए प्राथमिक ब्लॉकिंग बफर के ५०० µ एल जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    2. तरल निकालें, प्रत्येक स्लाइड या ट्यूब के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ताजा प्राथमिक अवरुद्ध बफर के ५०० µ एल जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 10 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाबियों के साथ 3x धो लो ।
    3. प्रत्येक स्लाइड या ट्यूब के लिए पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ माध्यमिक अवरुद्ध बफर के ५०० µ एल जोड़ें और 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 10 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाबियों के साथ 3x धो लो ।
      नोट: अनुशंसित एंटीबॉडी की एक सूची सामग्री की तालिकामें प्रदान की जाती है । अंय एंटीबॉडी या रंजक वांछित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रकाश करने के लिए फ्लोरोसेंट नमूनों का पर्दाफाश नहीं (कदम 5.3.3 आगे) ।
    4. बढ़ते समाधान dropwise के ५० µ एल जोड़ें सतह को कवर और ध्यान से स्लाइड पर एक coverslip जगह है, बुलबुले से परहेज । स्लाइड्स को 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  4. स्लाइड छवि ।
    1. एक फोकल या दो फोटॉन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ छवि पूर्व और बाद synaptic प्रोटीन बहुतायत और क्षेत्र स्लाइसें (चित्रा 4d) के भीतर colocalization का प्रयोग करें । hAstros की रूपात्मक सुविधाओं की कल्पना करने के लिए किसी 20X या 40X उद्देश्य का उपयोग करें ।
    2. ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ प्रतिदीप्ति छवि फ़ाइलें खोलें । गणना पूर्व और बाद synaptic puncta मैंयुअल रूप से सेल काउंटर का उपयोग प्लग में, पहले से विस्तृत३८के रूप में एक निष्पक्ष गिनती विधि का उपयोग कर, या वैकल्पिक तरीकों के साथ ।

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Representative Results

जब ठीक से प्रदर्शन किया, इस प्रोटोकॉल astrocytes28,३३,३४ और hPSCs से उत्पंन३५ न्यूरॉन्स के कार्यात्मक cocultures की आबादी परिभाषित उत्पादन होगा (आंकड़ा 1a-1C), के रूप में पहले26 विस्तृत और कदम में यहां वर्णित 2.1 – 2.2 । इस stepwise प्रक्रिया, microwell प्लेटों के उपयोग के साथ, अनुरूप आकार और आकार के 3 डी तंत्रिका क्षेत्रों उपज की उंमीद है (कदम ३.३; चित्र 1 d) समान रूप से फैलाया कोशिकाओं के साथ और कोशिका मृत्यु के महत्वपूर्ण लक्षण के बिना. सेल घनत्व शुरू करने की एक श्रृंखला, सेल प्रकार के एक वांछित अनुपात के साथ, अलग आकार के क्षेत्रों का उत्पादन होगा । microwell प्लेटों के अभाव में, कोशिकाओं को काफी बड़ा और गैर वर्दी समुच्चय जिसका व्यास (> 2 मिमी) प्रसार की सीमा को पार (आंकड़ा 2a-२ बी) के रूप में गठबंधन होगा । यह प्रत्याशित है कि एक स्पिनर कुप्पी या समकक्ष प्रतिक्रिया के उपयोग क्षेत्रों के बीच एकरूपता बनाए रखने और फ्यूजन को कम करेगा (कदम ३.४; चित्र 2c). हालांकि, जबकि स्पिनर कुप्पी सप्ताह के लिए क्षेत्रों की संस्कृति के लिए अनुमति देते हैं, उनके उपयोग आवश्यक नहीं है ।

electrophysiological विश्लेषण के लिए cocultures को स्थिर करने के लिए, ECM-नकल करने वाले सब्सट्रेट अपने 3d संरचना (आंकड़ा 3ए, 3ए) को बनाए रखते हुए आसानी से पालन करने की अनुमति देते हैं । रिकॉर्डिंग के दौरान, iNeurons पर रखा स्वस्थ क्षेत्रों सहज रूप से लगातार फायरिंग आवृत्तियों के साथ ± ४० µV की तुलना में अधिक वोल्टेज spikes को कम करना होगा, (कदम 4.1 – 4.2; चित्र बी -सी, 3F) । Coculture क्षेत्रों hAstros की उपस्थिति के साथ अधिक से अधिक नेटवर्क कनेक्टिविटी प्रदर्शित करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं, spikes के तुल्यकालिक नेटवर्क फटने की वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा3बी '). CNQX३५,३९,४०, एक postsynaptic AMPA रिसेप्टर प्रतिपक्षी के आवेदन coculture क्षेत्रों (चित्रा 3 डी'-3E ') में नेटवर्क फट synchrony कम कर देता है.

तंत्रिका कोशिका प्रकार प्रतिबंधित प्रोटीन मार्करों नेत्रहीन 3 डी क्षेत्रों के भीतर समान रूप से फैलाया व्यवस्था और astrocytes और न्यूरॉन्स की परिपक्वता प्रदर्शित करता है । astrocyte आकृति विज्ञान और शाखाओं का एक अधिकतम प्रक्षेपण hAstros के साथ एक प्रतिनिधि 3d क्षेत्र में चित्रा 4a में दिखाया गया है विरल-बाउंड GFP के साथ लेबल । परिपक्व hAstros एक्सप्रेस मार्करों सहित GFAP (चित्रा 4B), S100B, और Glt1३४, जबकि hNeurons और iNeurons एक्सप्रेस microtubule-जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2; चित्र 4c) और tubulin बीटा 3 (Tuj1/TUBB3) । अंत में, हालांकि iNeurons एक्सप्रेस पूर्व और बाद synaptic Synapsin 1 (Syn1) और होमर या PSD95, क्रमशः synaptic घनत्व सहित प्रोटीन काफी hAstros (चित्रा 4d)26में coculture की उपस्थिति से बढ़ा है । यदि उपलब्ध है, मस्तिष्क समाशोधन तकनीक और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के वैकल्पिक उपयोग को बरकरार क्षेत्रों की तेजी से इमेजिंग सक्षम हो जाएगा ।

एक साथ लिया, सहज विद्युत गतिविधि के साथ परिपक्व तंत्रिका मार्करों की अभिव्यक्ति कार्यात्मक synaptic microcircuits के 3 डी cocultures उत्पादन में ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि करें ।

Figure 1
चित्रा 1: भेदभाव और 3 डी तंत्रिका hPSCs से व्युत्पंन क्षेत्रों के गठन के Stepwise चित्रण । (क) प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों की समयरेखा । (ख) तंत्रिका कोशिकाओं की शुद्ध आबादी मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से उत्पंन किया जा सकता है । astrocyte progenitors (डॉटेड ग्रीन बॉक्स) की जनरेशन के लिए, चरण २.१ के साथ ही रेफरी28देखें । (ग) Inducible न्यूरॉन्स (iNeurons; देखें धारा २.२) से उत्पन्न ट्रांसजेनिक hPSCs के माध्यम से प्रेरित neurogenin 2 2d ECM (दिन 7) पर न्यूरॉन आकृति विज्ञान का प्रदर्शन और MAP2 (इनसेट) के लिए सकारात्मक हैं. (D) microwell प्लेटों से निकाले गए गांववासी (देखें चरण 3.1 – 3.3) उच्च-प्रवाह जांच के लिए सुसंगत आकार को प्रदर्शित करते हैं । क्षेत्र एक स्पिनर कुप्पी (इनसेट; ३.४ कदम देखें) अगर फ्यूजन को रोकने के लिए वांछित में संस्कृति हो सकती है । स्केल बार = ५० µm (C, इनसेट) । स्केल पट्टियां = २०० µm (A, D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: व्यवस्थित और reproducible उत्पादन में इंजीनियरी 3 डी तंत्रिका क्षेत्रों । (क) Microwell (µ-वेल) कल्चर प्लेट्स का उपयोग एक व्यवस्थित और उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट तरीके से वांछित घनत्व और न्यूरॉन-टू-astrocyte अनुपात के 3डी तंत्रिका क्षेत्रों के रूप में किया जाता है, जो सुसंगत आकार और आकार को पावरफुल बनाते हैं । चित्र क्षेत्रः गठन के बाद 1 दिन दिखाए जाते हैं । स्केल पट्टियां = २०० µm. (B) सेल घनत्व शुरू करने की एक सीमा (4 x 103 से 2 x 104 microwell प्रति कोशिकाओं) बदलती आकार के क्षेत्रों का उत्पादन । microwell प्लेटों के अभाव में, hPSCs काफी बड़ा और वर्दी समुच्चय जिसका व्यास एक सप्ताह के बाद प्रसार की सीमा को पार (n = 6-14 समूह और समय बिंदु प्रति क्षेत्रों) के रूप में गठबंधन । (ग) iNeuron ८० rpm पर एक स्पिनर कुप्पी में प्रसंस्कृत क्षेत्रों कम संलयन प्रदर्शन किया और इस तरह काफी छोटे थे, और अधिक समान, और तीन सप्ताह की अवधि में स्थिर संस्कृति में उन की तुलना में अधिक से अधिक प्रचलन का प्रदर्शन (n = 6-51 समूह और समय बिंदु के अनुसार क्षेत्रों) । भूखंडों मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं; * दो-पुच्छीय t-परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किए गए समूहों के बीच महत्व (p < ०.०५) इंगित करता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि लाइव multielectrode arrays पर तंत्रिका क्षेत्रों के synaptic फिजियोलॉजी (रहत) । (a, a ') रहत तंत्रिका क्षेत्रों के लाइव synaptic फिजियोलॉजी को मापने के लिए उपयोग किया जाता है । iNeurons (क) या iNeurons और hAstros (ए ') के cocultures क्षेत्रों मेे ECM-नकल करने वाले सब्सट्रेट के साथ सतहों पर कल्चरित किया जा सकता है (४.१ कदम देखें). (b, b ') प्रतिनिधि सहज विद्युत गतिविधि के रैस्टर भूखंडों एक रिकॉर्डिंग विंडो (क्षैतिज अक्ष) के दौरान सभी इलेक्ट्रोड (ऊर्ध्वाधर अक्ष) भर में मापा. neurophysiological बेसल मध्यम४१में संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद, iNeuron क्षेत्रों (ख) सहज spikes प्रदर्शित, जबकि coculture क्षेत्रों (बी ') तुल्यकालिक फायरिंग पैटर्न (नारंगी तीर) की वृद्धि हुई नेटवर्क फटने का पता चला । (ग, ग ') प्रतिनिधि इलेक्ट्रोड से मेे रिकॉर्डिंग windows के दौरान मापा spikes के हिस्टोग्राम । (डी, डी ') ५० µ एम CNQX, एक AMPA रिसेप्टर प्रतिपक्षी (बी, बी के रूप में एक ही समय पैमाने पर) के आवेदन के बाद सभी इलेक्ट्रोड भर में मापा सहज विद्युत गतिविधि के रैस्टर भूखंडों. CNQX cocultures (डी ') में मनाया spikes के तुल्यकालिक फटने की उपस्थिति को समाप्त ।  (e, e ') ५० µ एम CNQX आवेदन (एक ही समय के रूप में सी, सी, सी ') के बाद प्रतिनिधि इलेक्ट्रोड से मेे रिकॉर्डिंग खिड़कियों के दौरान मापा spikes के हिस्टोग्राम । (च) समय के साथ सभी इलेक्ट्रोड से iNeuron क्षेत्रों के स्पाइक tracings का नक्शा (बाएँ). समय के साथ कई संकुल निशान प्रदर्शित प्रदर्शन एकल इलेक्ट्रोड (मध्य); व्यक्तिगत कील निशान हल किया जा सकता है और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण (सही) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: synaptic microcircuits की विशेषता immunohistochemistry । (क) एक झिल्ली बंधे GFP (mGFP) रिपोर्टर 3 डी तंत्रिका क्षेत्रों में व्यवस्था और hAstros की आकृति विज्ञान की जांच के लिए उपयोगी है । (ख) hPSCs से hAstros विभेद GFAP-धनात्मक हैं. (ग) hAstros और iNeurons युक्त क्षेत्रों visualized जा सकता है और GFAP और MAP2 के रूप में सेल प्रकार प्रतिबंधित प्रोटीन मार्करों का उपयोग कर विश्लेषण । स्केल पट्टियां = ५० µm. (D) पूर्व और पश् synaptic घनत्व (Syn1 और PSD95, क्रमशः) के प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और (दाएं) iNeurons cocultured के बिना hAstros के क्षेत्रों में । colocalized Syn1 और PSD95 की एक काफी वृद्धि हुई घनत्व coculture क्षेत्रों में iNeuron क्षेत्रों की तुलना में दिन ३५ में मनाया गया था, hAstros गठन प्रेरित करने के लिए synapse की क्षमता का प्रदर्शन (एन = 3 स्वतंत्र प्रत्येक प्रतिकृति; डेटा Ref से पुनर्मुद्रित 26 अनुमति के साथ) । स्केल सलाखों = 10 µm. Plot मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है; महत्वपूर्ण अंतर (* इंगित करता है p < ०.०५; * * इंगित करता है p < ०.०१) समूहों के बीच दो पुच्छ t-परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम तंत्रिका cocultures के 3 डी क्षेत्रों के उत्पादन के लिए एक व्यवस्थित विधि का वर्णन । क्षेत्रों astrocytes और न्यूरॉन्स, जो स्वतंत्र रूप से hPSCs से प्राप्त कर रहे हैं से बना रहे हैं. हालांकि इस प्रोटोकॉल का ध्यान नहीं,28 hPSCs से astrocytes की शुद्ध आबादी की पीढ़ी के एक महत्वपूर्ण कदम है और तकनीकी रूप से अगर पूर्व अनुभव के बिना प्रदर्शन चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इन synaptic microcircuits की पीढ़ी में यह पहला कदम सावधानीपूर्वक समय और विस्तार के लिए ध्यान के साथ किया जाना चाहिए । hPSC के उपयोग की एक सीमा-व्युत्पंन astrocytes लंबा भेदभाव प्रक्रिया है; हालांकि, कोशिकाओं है कि भविष्य के उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता है की बड़ी मात्रा का उत्पादन और प्रयोग के समय गल (चरण 2.1.5 देखें) प्रारंभिक hPSC चरण से प्रक्रिया शुरू करने की आवश्यकता समाप्त । हालांकि ट्रांसजेनिक hPSCs से उत्पंन iNeurons synaptogenic है और सहज postsynaptic विद्युत धाराओं प्रदर्शन करने की क्षमता है, दोनों विशेषताओं विशेष रूप से12glia,३५की उपस्थिति से बढ़ा रहे है- इस प्रोटोकॉल में विस्तृत hAstros शामिल है । इस प्रकार, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेल प्रकार, संख्या, और विकास की अवस्था या परिपक्वता के चुनाव इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण घटक है, और समायोजन विद्युत गतिविधि या synapse दृश्य में बदलाव का परिणाम हो सकता है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी सेल घनत्व या अनुपात में एक तरह से है कि संभव शर्तों या व्यक्तिगत शोधकर्ता से परिणामों के लचीलेपन को दर्शाता में हेरफेर परमिट ।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, हम के लिए एक विकल्प का उत्पादन करने के लिए इंजीनियरिंग उपकरण का लाभ लेने के तंत्रिका organoid तरीकों४२,४३, के साथ चेतावनी है कि इस प्रणाली के स्व-संगठन और लेयरिंग phenotypes नहीं दोहराऊंगा organoids कि वांछित20,४४हो सकता है । microwell संस्कृति के एक साथ प्रयोग26 और एक स्पिनर कुप्पी४५,४६ सुनिश्चित reproducibility, इस प्रकार न केवल उत्पादन को सरल बनाने पर भी परीक्षा और तंत्रिका microcircuits का विश्लेषण सेल संस्कृति परख की एक किस्म के साथ । यह बल दिया जाना चाहिए कि हालांकि एक स्पिनर कुप्पी या समकक्ष के उपयोग के प्रतिक्रिया के वैकल्पिक, निकट संपर्क में क्षेत्रों की एक स्थिर संस्कृति है उनके एक साथ मना करने में परिणाम, इस प्रकार पोषक तत्वों और केंद्र में प्रसार की सीमा से परे ऑक्सीजन सीमित हो सकता है ४७क्षेत्रों की । विशेष रूप से, 3 डी मुद्रित मिनी-प्रतिक्रिया के उपयोग के लिए एक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण के रूप में सूचित किया गया है बड़े विरोधी४६की तुलना में ।

पारंपरिक उपकरण synaptic गठन को मापने के लिए शारीरिक तरीकों ऐसे पूरे सेल पैच clamping, रहत३६,४८,४९, और कैल्शियम इमेजिंग५०शामिल हैं । यहाँ, हम एक संक्षिप्त समय पैमाने पर क्षेत्रों में विद्युत गतिविधि के एक सरल और उच्च प्रवाह परीक्षा प्रदान करते हैं के रूप में रहत के उपयोग का वर्णन करने के लिए चुनते हैं. हालांकि, अंय तकनीकों का भी उपयोग किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में microwell प्लेटों के उपयोग की एक सीमा क्षेत्र (~ ३००) और प्रति क्षेत्र (~ 2 x 104) है कि एक अच्छी तरह से अनुमति दी जाती है क्षेत्रों की अधिकतम संख्या है । वैकल्पिक क्षेत्र गठन उपकरण एक बढ़ी हुई संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, प्रारंभिक बिंदु पर कक्षों की अधिक संख्या की आवश्यकता होगी । 24-अच्छी तरह से प्रारूप को बड़े क्षेत्रों है कि विश्लेषण और आंख से दिखाई के लिए नियंत्रित किया जा सकता है उत्पंन करने की क्षमता के लिए यहां चुना गया था, जबकि क्षेत्रों के केंद्र के भीतर सेल मौत सीमित । कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल के लिए इस कदम के अलावा वर्दी 3 डी क्षेत्रों की एक मजबूत और स्केलेबल उत्पादन सुनिश्चित करेगा ।

हमारे प्रोटोकॉल भी संख्या और प्रत्येक कोशिका प्रकार के अनुपात के रूप में अच्छी तरह से एक नियंत्रित, परिभाषित तरीके से 3 डी क्षेत्रों में अन्य कोशिका प्रकार शुरू करने की संभावना को समायोजित करने का लचीलापन समेटे हुए है. क्षेत्र विशिष्ट न्यूरॉन और astrocyte उपप्रकार के उपयोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिन्न क्षेत्रों के synaptic microcircuits के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. इन coculture क्षेत्रों में भी एक साथ जुड़े हो सकता है५१ सेलुलर प्रवास और लंबी दूरी के संकेत का अध्ययन करने के लिए । oligodendrocytes, endothelial कोशिकाओं, या microglia के अलावा इन 3 डी क्षेत्रों में वृद्धि की जटिलता के साथ एक जानकारीपूर्ण मस्तिष्क मॉडल, इस पद्धति के लिए एक आशाजनक भविष्य की दिशा के रूप में साबित हो सकता है । अंत में, रोग और चोट मॉडलिंग के अलावा, इस प्रणाली को neuroregeneration बढ़ाने के लिए सेलुलर प्रतिस्थापन थेरेपी या दवा विकास के रूप में, चिकित्सीय दृष्टिकोण के अध्ययन परमिट ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इन प्रक्रियाओं के डिजाइन पर बौद्धिक इनपुट के लिए डॉ एरिक Ullian (UCSF) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ माइकल वार्ड (NIH) iNeuron भेदभाव पर तकनीकी सलाह के लिए, और साबा बरलास प्रारंभिक छवि विश्लेषण के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३८ स्टेम सेल न्यूरॉन्स Astrocytes Synapses Organoid Coculture प्रतिक्रियाकर्ता Multielectrode सरणी
मानव Pluripotent स्टेम सेल से Astrocytes और न्यूरॉन्स की 3डी Cocultures के साथ Synaptic Microcircuit मॉडलिंग
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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. … More

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

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