Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/58034

Summary

I denne protokollen, vi tar sikte på å beskrive en reproduserbar metode for å kombinere dissosiert menneskelige pluripotent stilk cellen avledet nevroner og astrocyttene sammen i 3D sphere cocultures, opprettholde disse kuler i gratis flytende forhold, og senere måle synaptic krets aktivitet av kulene med immunoanalysis og multielectrode matrise innspillinger.

Abstract

En barriere til vår forståelse av hvordan ulike celletyper og signaler bidrar til synaptic krets funksjon er mangelen på aktuelle modeller for å studere den menneskelige hjernen. En ny teknologi som løser dette problemet er bruk av tre-dimensjonale (3D) nevrale cellekulturer, kalt 'organoids' eller 'spheroids', for langsiktig bevaring av intercellulære interaksjoner inkludert ekstracellulære vedheft molekyler. Disse kultur systemene er imidlertid tidkrevende og ikke systematisk generert. Her vi detalj en metode for å raskt og konsekvent produserer 3D cocultures av neurons og astrocyttene fra menneskelige pluripotent stamceller. Første, pre differensiert astrocyttene neuronal progenitors avstand og telt. Deretter celler kombineres i sfæren-forming retter med en Rho-Kinase inhibitor og spesifikke formater å produsere sfærer av reproduserbar størrelse. Etter flere uker med kultur som flytende sfærer, er cocultures ("asteroider") delt for immunostaining eller belagt på multielectrode matriser for å måle synaptic tetthet og styrke. Generelt er det forventet at denne protokollen vil gi 3D nevrale sfærer som vise eldre celle-type begrenset markører, danne funksjonelle synapser og utstillingen spontan synaptic burst nettverksaktivitet. Sammen tillater dette systemet narkotikarelaterte screening og etterforskning mekanismer av sykdom i en mer passende modell sammenlignet monolayer kulturer.

Introduction

Astrocyttene er en svært rikt glial celle type i sentralnervesystemet (CNS) med en rekke funksjonelle ansvar utover strukturell støtte. Gjennom sekresjon av løselig synaptogenic faktorer og ekstracellulær matrix (EFM) komponenter, astrocyttene hjelp i etableringen og klynger av modne synapser under utvikling1. De også spille en avgjørende rolle i å opprettholde helse og plastisitet av synapser gjennom ekstracellulære signalnettverk2,3,4,5, og bidra til langsiktig stabilitet av homøostatisk miljøer ved å regulere ekstracellulære kalium og glutamat, samt utskillelsen av energi underlag og ATP6,7,8. Til slutt, de kan bidra til neurotransmission ved å påvirke extrasynaptic strøm9og kan indirekte påvirke aktivitet gjennom andre celletyper som fremmer myelination10. Viktigst, fordi unormalt eller dysfunksjon av astrocyttene kan føre til mange neurodevelopmental syndromer og voksen neuropathology, er det et åpenbart behov inkludere astrocyttene sammen med nevroner i utvikling neural nettverk for at en forbedret modell av endogene hjernen miljøet. En integrert karakteristisk for astrocyttene er deres evne til skjemaet dynamisk interaksjoner med neuronal synapser1,11,12. I fravær av glia danne nerveceller et begrenset antall synapser, som generelt mangler også funksjonelle modenhet13.

Menneskelige astrocyttene vise morfologiske, transcriptional og funksjonelle egenskaper-som økt størrelsen og kompleksiteten av forgrening, samt artsspesifikke gener-det er ikke recapitulated i Red12,14, 15. Resultatet studier utnytte menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede neural celler har blitt allment akseptert som et middel til å undersøke CNS-relaterte sykdommer i vitro samtidig utvikle romanen terapi, skader modeller og kultur paradigmer16 ,17. Videre at hPSCs studiet av menneskelig synapse dannes og funksjon uten behov for primære vev18,19.

En barriere til vår forståelse av hvordan ulike celletyper og signaler bidrar til synaptic krets funksjon er mangelen på relevante modeller av den menneskelige hjernen. Det er behov for en passende plattform å recapitulate synaptic klyngeutvikling med Hi-Fi og reproduserbarhet. Nylig interesse har dukket opp i produksjonen av 3D kultur systemer (bredt kjent som 'organoids', 'spheroids' eller 'mini hjerner')20 modell komplekse tredimensjonale (3D) strukturer på mobilnettet og makro. 3D kultur systemer beholder ECM og celle-celle interaksjoner som normalt fraværende eller begrenset i typisk 2D coculture paradigmer21,22. Det finnes en rekke teknikker for dyrking 3D nevrale spheroids23,24,25; men mange krever lengre kultur perioder (måneder til år) for spontane utvikling og lag bevaring, med brukeren viser svært liten kontroll over resultatet.

Her vi illustrerer en systematisk metode for å raskt og konsekvent bioengineer nevrale interaksjon mellom flere celletyper (pre differensiert nevroner og astrocyttene) avledet fra hPSCs ved å sette sammen cellene i området cocultures ("asteroider")26 som recapitulate menneske-spesifikke morfologiske kompleksiteten i 3D. Høy tetthet nevrale systemet genererer jevnt spredt nevrale undertypene som ta på eldre egenskaper over tid og kan vist eller assayed på en høy gjennomstrømming måte. Vi viser for første gang at menneskelige astrocyttene induserer synaptiske nettverksaktivitet brast i disse 3D cocultures. I tillegg er denne protokollen lett tilpasses generere sfærer av forskjellige størrelser, utnytte celler angitt for ulike regionale identiteten til CNS og studere interaksjoner av flere andre celletyper som ønsket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur og forberedelse av reagenser

Merk: Protokollene i denne delen er skrevet i rekkefølgen de vises i differensiering protokollen (inndeling 2). Se Tabellen for materiale for materialer og katalogfilene tall.

  1. Forberede belagt plater cellekultur.
    1. Fortynne ekstracellulær matrix (EFM) belegg løsning med DMEM/F12 media å forberede en 1 mg/mL lagerløsning. Aliquot utvannet ECM lagerløsning inn 30 konisk rørene 3 ml og umiddelbart lagre i 20 ° C. For en fungerende løsning, resuspend 3 mL ECM lager i 33 mL pre kjølt DMEM/F12 medier, bringe det totale volumet til 36 mL for en konsentrasjon av 80 µg/mL.
    2. Coat 1 mL per brønn av en 6-vel celle kultur plate med ECM fungerende løsning. Legge til en ekstra 1 mL DMEM/F12 per brønn (hvis nødvendig) for å sikre at overflaten av brønnen er fullstendig dekket. Tillate belagt 6-vel cellen kultur plater å sitte ved romtemperatur for minst 1 time før bruk.
      Merk: Belagt plater lagres i inkubator eller 4 ° C 2 uker.
  2. Forberede medier formuleringer, vekstfaktorer og små molekyler.
    1. For å forberede 500 mL menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) middels27, Legg 20 x og 500 x kosttilskudd i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. For å forberede 500 mL nevrale medium (NM), legge heparin til en siste konsentrasjon av 2 mg/mL, 1 x antibiotika/antimycotic løsning, 1 x B27 supplement eller 1 x N2 supplement til en 500 mL flaske DMEM/F12 med L-glutamin supplement som tidligere detaljert28.
    3. Forberede en 10 mM (1 000 x) lagerløsning Rho-Kinase Inhibitor Y27632 (Y), legge til 10 mg pulver i 3 mL fosfat bufret saltvann (PBS). Filteret sterilisere, aliquot, og lagre på 20 ° C. Bruke en 10 µM arbeider konsentrasjon i media.
    4. Forberede en 20 mM (10 000 x) lager løsning av SB431542, legge til 10 mg pulver til 1,3 mL dimethyl sulfoxide (DMSO). Forberede en 2 mM (1 000 x) lager løsning av DMH1, legge til 10 mg pulver til 13,1 mL DMSO. Filteret sterilisere, aliquot, og lagre hver løsning på 20 ° C. Bruk hver på en 2 µM arbeider konsentrasjon i media (NM + SB431542 + DMH1).
      Merk: Denne protokollen anbefaler 2 µM arbeider konsentrasjoner av både SB431542 og DMH1 basert på våre observasjoner og rapporter fra andre29 sier at denne konsentrasjonen effektivt fremmer neural induksjon fra hPSCs. Høyere konsentrasjoner har også vært rapportert30. I tillegg med alternative medier, har det også vist at små molekyler ikke er nødvendig for høy nevrale konvertering31. Dermed jobbe-konsentrasjonene varierer alternativ celle kultur miljøer og optimal konsentrasjoner bør testes av enkelte forskere.
    5. Å forberede personlige 100 µg/mL (10 000 x) lager løsninger av epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekst faktor-2 (FGF2), legge til 1 mg hver i 10 mL PBS + 0,1% BSA. Aliquot EGF og FGF2 lager løsninger til 50 µL dele og lagre på-80 ° C. Bruk på en 10 ng/mL arbeider konsentrasjon i media. f.ekslegge 5 µL EGF og 5 µL FGF2 til 50 mL av NM (NM + EGF + FGF2).
    6. For å forberede en lagerløsning av doxycycline hydrochloride (Dox), først oppløse pulver i DMSO til 100 mg/mL og lagre på 20 ° C. Videre fortynne det til å gjøre en 2 mg/mL (1 000 x) lagerløsning i PBS og butikk på 20 ° C. Bruke 2 µg/mL arbeider konsentrasjon i media. f.ekslegge 50 µL Dox til 50 mL av NM (NM + Dox).
      Merk: Nytt Frys løsninger etter tining.

2. generasjon av Neural subtyper fra menneskelige indusert Pluripotent celler (hPSCs)

Merk: Alle cellekulturer bør opprettholdes i en inkubator med 5% CO2 på 37 ° C. Disse kulturene vedlikeholdes på rommet oksygen nivåer, men lavere nivåer kan benyttes.

  1. Generere og opprettholde astrocytter progenitors (hAstros) fra hPSCs.
    Merk: Denne delen gir en kort og forenklet differensiering-protokoll. En detaljert beskrivelse (med embryoid kroppen formasjon, rosett utvalg og regionale mønstre trinn) refererer til de tidligere beskrevet protokollen28 (figur 1A, prikket grønne boksen).
    1. Frø klynger av hPSCs (figur 1B) på ECM-belagt 6-vel plater (se trinn 1.1) med 2 mL hPSC medium + Y per brønn. Mate stamceller hver dag til de er ca 50% confluent og delt etter behov.
      1. For å dele hPSCs, Legg 1 mL av passaging reagens brønner og Sug opp etter 1 min. Incubate celler ved romtemperatur for 5 min, Legg 1 mL av hPSC medium, og dele aggregater 1:10 til nye ECM-belagt brønner i 2 mL hPSC medium + Y per brønn.
    2. Opprettholde stamceller til de er ca 50% confluent, og endre media til NM + SB431542 + DMH1 å indusere nevrale differensiering (dag 0). Når cellene er ca 95% confluent, delt 1:6 i nye ECM-belagt brønner i samme medium.
    3. På dag 14, distansere cellene med løsgjøring løsning og overføre til en ikke-belagt kolbe y å fremme dannelsen av aggregater.
      Merk: Tillegg av Y benyttes for å fremme celle overlevelse og sfære formasjon, men er ikke inkludert i hver feed.
    4. For generering av neuronal progenitors og neurons (hNeurons), bruker du disse dag-14 cellene som beskrevet nedenfor. Alternativt bruke disse cellene på senere tidspunkt fra monolayer eller sfære kulturer før neuronal modning oppstår eller gliogenesis starter.
      Merk: Standard denne protokollen gir dorsal-kortikale astrocyttene. Imidlertid spesifiseres astrocytter subtyper regionalt ved tilsetning av mønstre morphogens hvis ønsket28,32,33. Retinsyre (RA) kan legges for å caudalize celler i ryggmargen fenotyper, mens soniske pinnsvin (SSH), smoothened Agonistiske (SAG) eller purmorphamine vil produsere ventrale fenotyper.
    5. For generering av astrocytter progenitors og astrocyttene i spontant dannet 3D aggregater (hAstrospheres), Bytt til NM + EGF + FGF2 og feed ukentlig (eller som trengs for å sikre stabil pH) som tidligere detaljert34.
      1. Forsiktig distansere hAstro aggregat med løsgjøring løsning når mørke vises og fjerne kuler som spontant fester. Bryte kuler forsiktig ukentlig sfære helsen og unngå nekrotisk kjerner.
        Merk: Ikke overstige 5 min behandling med løsgjøring løsning.
      2. Etter 4-6 måneder av utvidelse, bekrefte fryse celle identitet og enten i kryonisk bevaring middels (i henhold til produsentens instruksjoner) eller alternativ lagringen betingelser for langsiktig bevaring i flytende nitrogen, eller bruk umiddelbart for eksperimentering.
    6. Tin en frossen lager av hAstrospheres, raskt tine ampuller i romtemperatur, overføre innholdet i en tom 15 mL konisk rør og sentrifuger 300 x g i 1 nøye Sug opp nedbryting vask med DMEM/F12 og gjenta for totalt to vask trinn. Legge til en T25 kolbe med et totalt volum på 6 mL av NM + EGF + FGF2 + Y (eller skalere opp etter behov).
  2. Generere og opprettholde induserbart neurons (iNeurons) fra hPSCs.
    1. Frø transgene hPSCs (med en stabil doxycycline-induserbart neurogenin 2 transgene35) på ECM-belagt 6-vel plater med 2 mL hPSC medium + Y per brønn (som beskrevet ovenfor for ikke-transgene linjer). Feed hver dag med 2 mL media per brønn til de er klare til å løfte på 70% confluency. Dele cellene som beskrevet i trinn 2.1.2.
    2. Når cellene er ca 35% confluent, legge til NM + Dox å indusere differensiering inn iNeurons. Opprettholde som en monolayer kultur med NM + Dox for 2 dager før du går videre til trinn 3.2.
      Merk: Celler vil overgangen til nevronale progenitors men ikke ennå utvide neurites (figur 1 c).

3. forberedelse og vedlikehold av 3D-sfære Cocultures

  1. Distansere hAstros fra 3D mengdefunksjoner i suspensjon (som beskrevet i trinn 2.1.5.1).
  2. Distansere hNeurons eller iNeurons fra en 2D monolayer.
    1. Fjern medier fra 6-vel plate og legge 500 µL av avdeling løsning til hver godt med monolayer kulturer. Ruge på 37 ° C for 5 min. forsiktig legge 2-3 mL DMEM/F12 å fjerne tilknyttede celler.
    2. Samle celler og medier i en 15 mL konisk rør og sentrifuger 300 x g i 1 leveringstanken nedbryting, legge til 1 mL av fersk media og Pipetter opp og ned forsiktig med 1000 µL brønnene å oppnå en enkeltcelle suspensjon.
  3. Skjemaet 3D Sfærer bruker microwell kultur plater.
    1. Klargjør platen ved å legge til 0,5 mL av anti-overholdelse av skyllingsprosess løsning i hver brønn av microwell plate. Sentrifuge tallerken 2000 x g for 5 min. leveringstanken skyllingsprosess løsning, Legg 1 mL av DMEM/F12 i hver brønn vask og Sug opp igjen.
      Merk: Sørg for at sentrifuge balanseres under bruk.
    2. Telle hver celle type bruke en hemocytometer eller automatisert celle teller. Legge til ønsket forholdet mellom dissosiert hAstros og hNeurons eller iNeurons i hver brønn i et totalt volum på 2 mL NM + Y (inkluderer Dox hvis iNeurons benyttes). Sentrifuge plate på 100 x g for 3 min og tilbake til inkubator.
      Merk: 24-vel microwell plater (se Tabell for materiale) inneholder 300 microwells per brønn. Legg til minst 6 x 105 celler (for sfærer av 2 x 103 celler hver) og maksimum 6 x 106 celler (for sfærer av 2 x 104 celler hver) i 2 mL av media per brønn. For levedyktig sfærer av en bestemt tetthet innenfor dette området, bruke definerte celler og dele med 300 til å beregne antall celler per kule. Alternative sfære metoder og verktøy kan også benyttes hvis ønskelig. Følg produsentens instruksjoner for akseptabel celleområder celle tettheter.
    3. Tillate at celler selv montere i tettpakkede områder innen microwell plater de neste 2 dager (figur 2A). Bytt ut 50% media hvis kulturen er gulfarging.
      Merk: Bytter bare halve medier og Pipetter forsiktig når fjerne og legge til medier for ikke å forstyrre kuler. Kuler kan løfte opp fra microwells og sikring med høyere makt.
    4. Etter 2 dager, forsiktig fjerne kuler fra microwells med 1000 µL brønnene (figur 1 d). Lett bruk kraft til bunnen av microwells med media å fjerne alle ekstra adhered kuler. La kuler bosette seg i en 15 mL konisk tube Sug opp den gamle mediet og legge til nye medier.
  4. Definere spinner kolbe bioreactor systemet for å danne 3D Sfærer.
    1. Rengjøre en magnetic røre plate med 70% etanol, Legg den i en celle kultur inkubator. Autoclave personlige spinner kolber å sterilisere.
    2. Legge til kuler med minimum 50-60 mL media hver spinner kolbe (figur 1 d, innfelt). Plass kolbe på magnetic røre platen satt på 60 rpm. Kultur kuler i spinner flasker til de er klare for datainnsamling.
      Merk: Minst 3 uker i kultur er nødvendig for synapse formasjon. Hvis systemet spinner kolbe bioreactor ikke er ønskelig, kan kuler kultivert i stasjonære forhold i celle kultur flasker eller retter. Kulene kan også bygges i ECM eller hydrogel.

4. måling av Live Synaptic fysiologi med Multielectrode matriser (tiltak)

  1. Forberede tiltak cellekultur.
    1. Rengjør overflate Royalton med 1 mL rengjøringsmiddel for 1 h. skyll med sterilt deionisert (DI) vann, skyll med 70% etanol å sterilisere, og deretter lufttørke i biosikkerhet regjering under UV-lys.
      Merk: Tiltak kan lagres i DI vann 4 ° C sterile forhold til bruk.
    2. Forbered en 0,5 mg/mL løsning av poly-ornithine (PLO) ved oppløsning 50 mg PLO til 100 mL borsyre buffer. Coat overflaten av Royalton med 1 mL av PLO til å gjengi overflaten hydrofile og ruge på 37 ° C i minst 4 h. Fjern PLO, vaske overflaten med Ionisert vann, tilsett 1 mL av ECM (se trinn 1.1.1), og Inkuber på 37 ° C i minst 4 timer.
    3. Fjern ECM og plasser kuler i 1,5 mL av medier på en MEA overflate, sikre at kulene er plassert på toppen av elektroden matrisen (tall 3A, 3A'). Tillat for å følge i 2 dager. Endre halvparten av media hver 2-3 dager (eller mer ofte om nødvendig) sikrer at kulene ikke er forstyrres.
      Merk: Tillegg av vekstfaktorer kan forbedre kultur overlevelse og modning.
  2. Måler elektrisk aktivitet i nevrale kuler.
    1. Definere en multielectrode matrise (MEA) system med en temperatur-kontrollert headstage. Opprett et program med en 5 Hz høypass-filteret, og en 200 Hz low pass-filteret, og en topp terskelen på 5 x standardavviket (SD).
    2. Plass MEA på headstage og post spontan elektrisk aktivitet (figur 3BB'). Lagre rådata inkludert spike frekvens og amplitude for statistisk analyse.
      Merk: En perfusjonsmåling system kan benyttes med MEA legge farmakologiske agenter eller for å øke flyten av fersk media for langsiktig opptak. Ytterligere etterbehandling av toppene kan utføres som ønsket36,37.

5. måling av Synaptic tetthet med Immunocytochemistry

  1. Forberede reagenser.
    1. For å gjøre en 500 mL lager løsning av 4% paraformaldehyde (PFA), legge til 400 mL 1 x PBS et glass beger eller en røre plate i ventilert hette. Legge rør bar og varme til 60 ° C stirring; ikke koke. Legge til 20 g PFA pulver til oppvarmet PBS løsning og heve pH til 6,9 ved sakte legger 1 N NaOH dropwise.
      NOTE 4% PFA løsning kan være aliquoted og lagret på 4 ° C i opptil en måned.
    2. Legge til 20 g eller 30 g av sukrose 100 mL PBS gjøre 20% og 30% løsninger av sukrose, henholdsvis.
    3. Legge 1 mL av vaskemiddel til 10 mL PBS å forberede en 10% lagerløsning. Invertere flere ganger til homogenize.
    4. Legge til 250 µL av 10% lager såpevann (siste konsentrasjon av 0,25%) og 500 µL hver av geit og esel serum (siste konsentrasjon på 5% hver) 10 mL PBS å forberede primær blokkerer buffer.
    5. Legge til 100 µL hver av geit og esel serum (siste konsentrasjon av 1% hver) 10 mL PBS til å klargjøre sekundære blokkerer bufferen.
  2. Forberede prøvene.
    1. Overføre kulene til en 15 mL konisk tube, få slå seg ned på bunnen av røret og Sug opp den gamle mediet. Skyll kuler med 500 µL av PBS, utligne og Sug opp PBS. Legge til 500 µL av 4% PFA (eller nok til å dekke kuler) og Inkuber på 4 ° C i 30 min.
    2. Sug opp PFA og forsiktig vaske to ganger med PBS. Legge til 20% sukrose løsning og ruge på 4 ° C i flere timer eller over natten. Nøye Sug opp, legge til 30% sukrose løsning, og ruge på 4 ° C i flere timer eller over natten.
      Merk: Utvalg lagres på 4 ° C i PBS eller sukrose for opptil 1 uke før du fortsetter til neste trinn. Hvis ikke kutting, vedlikeholde som 3D Sfærer (figur 4A-C) i en 1,5 mL tube og videre til trinn 5.3.
    3. Hvis kutting kulene, nøye overføre kuler til en innebygging kryogene mold på tørris. Sug opp 30% sukrose løsningen og sakte hell vev innebygging løsning i mold til det fullt ut dekker utvalget, unngå luftbobler. Vent til fryser og lagre-80 ° c til kryostaten kutting.
    4. Bruker en kryostaten på 20 ° C, slice innebygde blokkene i 30 µm deler (eller som ønsket) og overføring til glass lysbilder. Lagre på-80 ° C helt klar til å flekken.
  3. Immunostai kulene.
    1. Skissere kantene på lysbildene med en hydrofobe PAP å hindre væske søl. Forberede primære og sekundære blokkerer løsninger med antistoffer (se Tabell for materiale). Legg til 500 µL av primær blokkerer buffer i hvert lysbilde eller rør og ruge ved romtemperatur for 30 min.
    2. Fjern væsken legge 500 µL av fersk primær blokkerer buffer med fortynnet primære antistoffer til hvert lysbilde eller rør og ruge over natten på 4 ° C. Fjerne primære antistoff løsning og vask 3 x med PBS i 10 min.
    3. Legge til 500 µL sekundære blokkerer bufferen med fortynnet sekundære antistoffer i hvert lysbilde eller rør og ruge på 4 ° C for 1 h. fjerne sekundære antistoff løsning og vask 3 x med PBS i 10 min.
      Merk: En liste over anbefalte antistoffer er gitt i Tabellen for materiale. Andre antistoffer eller fargestoffer kan brukes som ønsket. Ikke utsett fluorescerende prøver til lys (trinn 5.3.3 videre).
    4. Legge til 50 µL av montering løsning dropwise dekker overflaten og forsiktig plassere en dekkglassvæske over lysbildet unngå bobler. Gi lysbildene tørr ved romtemperatur for 24t og lagre på 4 ° C.
  4. Bilde lysbildene.
    1. Bruke AC confocal eller to-fotonet fluorescerende mikroskop med en 63 X nedsenking oljeobjektiv bildet pre og post synaptic protein overflod og colocalization innenfor sfære stykker (Figur 4 d). Bruk en 20 X eller 40 X mål for å visualisere morfologiske funksjoner i hAstros.
    2. Åpne fluorescens bildefiler med ImageJ programvare. Telle pre- og post synaptic puncta manuelt ved hjelp av cellen telleren plug-in, bruke en upartisk telling metoden tidligere detaljert38eller med alternative metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når utført riktig, vil denne protokollen produsere definerte bestander av funksjonelle cocultures astrocyttene28,33,34 og neurons35 generert fra hPSCs (figur 1A-1C), som detaljert tidligere26 og beskrevet her i trinn 2.1-2.2. Dette trinnvis prosedyre, med bruk av microwell plater, forventes å gi 3D nevrale sfærer av konsekvent størrelse og form (trinn 3.3; Figur 1 d) med jevnere fordelt celler og uten betydelige tegn til celledød. En rekke starter celle tettheter, med ønsket forholdet celletyper, vil produsere kuler av varierende størrelse. I fravær av microwell plater, celler vil kombinere til skjemaet betydelig større og uensartet aggregat som diameter (> 2 mm) overskrider grensen på diffusjon (figur 2A-2B). Det er forventet at bruk av en spinner kolbe eller tilsvarende bioreactor vil opprettholde ensartet kuler og redusere fusion (trinn 3.4; Figur 2C). Men mens spinner kolber tillater kultur av kuler i uker, er deres bruk ikke nødvendig.

For å stabilisere cocultures for elektrofysiologiske analyse, ECM-mimicking underlag tillate å gjerne overholde samtidig opprettholde sin 3D struktur (figur 3A, 3A'). Under opptak, vil sunn sfærer av iNeurons plassert på tiltak spontant elicit spenning toppene større enn ± 40 µV med konsekvent avfyring frekvenser (trinn 4.1-4.2; Figur 3B C, 3F). Coculture kuler forventes å vise større nettverkstilkobling med tilstedeværelse av hAstros, noe som resulterer i en økning av synkron nettverk bursts av toppene (figur 3B"-3 C"). Anvendelse av CNQX35,39,40, en postsynaptic AMPA reseptor antagonist, reduserer nettverk burst synkronisering på coculture områder (figur 3D'-3E').

Nevrale celle-type begrenset protein markører demonstrere synlig jevnere fordelt plasseringen og modenhet av astrocyttene og neurons i 3D Sfærer. En maksimal projeksjon av astrocytter morfologi og forgrening er vist i figur 4A i en representant 3D-sfære med hAstros tynt merket med membran-bundet GFP. Eldre hAstros express indikatorer inkludert GFAP (figur 4B), S100B og Glt134, mens hNeurons og iNeurons express microtubule-assosiert protein 2 (MAP2; Figur 4C) og tubulin beta 3 (Tuj1/TUBB3). Til slutt, selv om iNeurons express pre og post synaptic proteiner inkludert Synapsin 1 (Syn1) og Homer eller PSD95, henholdsvis, synaptic tetthet er betydelig forbedret av tilstedeværelsen av hAstros i coculture (Figur 4 d)26. Hvis alternative bruk av hjernen clearing teknikker og lys ark mikroskopi kan rask bildebehandling med intakt kuler.

Samlet uttrykk for eldre nevrale markører sammen med spontan elektrisk aktivitet bekrefte suksessen med protokollen beskrevet ovenfor produsere 3D cocultures av funksjonelle synaptic microcircuits.

Figure 1
Figur 1: gradvis skildring av differensiering og dannelsen av 3D nevrale sfærer avledet fra hPSCs. (A) tidslinje over viktige trinn i protokollen. (B) ren bestander av neural celler kan genereres fra menneskelige indusert pluripotent stamceller (hPSCs). For generering av astrocytter progenitors (stiplet grønn boks), kan du se trinn 2.1 samt Ref28. (C) induserbart neurons (iNeurons, se delen 2.2) fra transgene hPSCs via indusert overuttrykte neurogenin 2 demonstrere neuronal morfologi på 2D ECM (dag 7) og er positivt for MAP2 (innfelt). (D) kuler fjernet fra microwell plater (se trinnene 3.1-3.3) viser konsekvent størrelse for høy gjennomstrømming screening. Kulene kan kultivert i en spinner kolbe bioreactor (innfelt, se trinn 3.4) Hvis du ønsker å hindre blanding. Skala bar = 50 µm (C, innfelt). Skalere barer = 200 µm (A, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: systematisk og reproduserbar generasjon bioengineered 3D nevrale sfærer. (A) Microwell (μ-vel) kultur plater brukes til 3D nevrale sfærer ønsket tetthet og Nevron til astrocytter forholdstall på en systematisk og brukerdefinert måte, gir konsistente størrelse og form. Bilder vises én dag etter kule formasjon. Skalere barer = 200 µm. (B) en rekke starte cellen tettheter (fra 4 x 103 til 2 x 104 celler per microwell) produserer kuler av varierende størrelse. I fravær av microwell plater, hPSCs kombinere til skjemaet betydelig større og uensartet aggregat som diameter overskrider grensen på diffusjon etter en uke (n = 6-14 kuler per gruppe og tid punkt). (C) iNeuron kuler kultivert i en spinner kolbe 80 RPM utstilt mindre fusion og dermed var betydelig mindre, mer enhetlig og utstilt større sirkularitet i forhold til de stasjonære kultur over en periode på tre uker (n = 6-51 kuler per gruppe og tid punkt). Tomter representerer gjennomsnittlig ± SD; * Angir betydning (p < 0,05) mellom grupper, ved hjelp av tosidige t-tester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant live synaptic fysiologi av nevrale kuler på multielectrode matriser (tiltak). (, A') Tiltak benyttes for å måle live synaptic fysiologi av nevrale kuler. Sfærer av iNeurons (A) eller cocultures iNeurons og hAstros (A ") kan bli kultivert på MEA overflater med ECM-mimicking underlag (se trinn 4.1). (B, B') Raster tomter representant spontan elektrisk aktivitet målt over alle elektroder (loddrett akse) under et opptak vindu (vannrett akse). Etter 4 uker med kultur i nevrofysiologiske basale middels41, iNeuron kuler (B) vises spontan pigger, mens coculture kuler (B') viste økt nettverk bursts av synkron avfyring mønstre (oransje piler). (C, C') Histogrammet av toppene målt under MEA opptak windows fra representant elektroder. (D, D') Raster flater av spontane elektrisk aktivitet målt over alle elektroder etter 50 µM CNQX, en AMPA reseptor antagonist (samme tidsskalaen som B, B'). CNQX eliminert tilstedeværelsen av synkron bursts av toppene i cocultures (D').  (E, E') Histogram av toppene målt under MEA opptak windows fra representant elektroder etter 50 µM CNQX program (samtidig skala som C, C "). (F) kart over spike tracings med iNeuron kuler fra alle elektroder over tid (venstre). Demonstrative enkel elektrode viser flere gruppert spor over tid (midten); individuelle spike spor sorteres og analysert individuelt (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: karakteristiske immunhistokjemi av synaptic microcircuits. (A) en membran-bundet GFP (mGFP) reporter er nyttig for å undersøke plasseringen og morfologi av hAstros i 3D nevrale sfærer. (B) hAstros differensiert fra hPSCs er GFAP-positive. (C) kuler som inneholder hAstros og iNeurons kan bli visualisert og analysert ved hjelp av celle type-begrenset protein markører som GFAP og MAP2. Skalere barer = 50 µm. (D) representant bilder av pre- og post synaptic tettheter (Syn1 og PSD95, henholdsvis) i sfærer av iNeurons uten (venstre) og med (høyre) cocultured hAstros. En betydelig økt tetthet av colocalized Syn1 og PSD95 ble observert i coculture kuler sammenlignet iNeuron kuler i dag 35, demonstrere evnen til hAstros å skape synapse (n = 3 uavhengige gjentak hver; data gjengitt fra Ref 26 med tillatelse). Skalere barer = 10 µm. Plot representerer gjennomsnittlig ± SEM; betydelige forskjeller (* angir p < 0,05; ** angir p < 0,01) mellom grupper ble bestemmes ved hjelp av tosidige t-tester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen beskriver vi en systematisk metode for produksjon av 3D Sfærer av nevrale cocultures. Kulene er sammensatt av astrocyttene og neurons, som er avledet uavhengig fra hPSCs. Om ikke fokusere denne protokollen, generering av ren bestander av astrocyttene fra hPSCs28 er et kritisk punkt og kan være teknisk utfordrende hvis utført uten tidligere erfaring. Dette første trinnet i generasjon av disse synaptic microcircuits skal utføres med grundig timing og oppmerksomhet på detaljer. En begrensning av bruk av hPSC-avledet astrocyttene er lengre differensiering prosessen; men produksjon av store mengder celler som kan fryses for fremtid bruk og tint på tidspunktet for eksperimentering (se trinn 2.1.5) eliminerer behovet for å starte prosessen fra første hPSC scenen. Om iNeurons som er generert fra transgene hPSCs er synaptogenic og muligheten til å vise spontan postsynaptic elektrisk strøm, begge egenskaper er spesielt forsterket av tilstedeværelsen av glia12,35- inkludert hAstros beskrevet i denne protokollen. Dermed bør det bemerkes at valget av celle type, nummer og utviklingsstadiet eller forfallsdato er en kritisk komponent i denne protokollen, og justeringer kan medføre variasjoner i elektrisk aktivitet eller synapse visualisering. Men tillater denne protokollen også behandling av cellen tetthet eller prosenter på en måte som gjenspeiler fleksibiliteten til mulige betingelser eller utfall personlige forsker.

Som beskrevet ovenfor, tar vi nytte av bioteknologi verktøy å produsere et alternativ til nevrale organoid metoder42,43, med forbeholdet at dette systemet ikke recapitulate av selv-organisering og lagdeling fenotyper av organoids som kan være ønsket20,44. Bruke microwell kultur plater26 og en spinner kolbe bioreactor45,46 sikre reproduserbarhet, dermed strømlinjeforme ikke bare produksjonen, men også undersøkelse og analyse av nevrale microcircuits med en rekke celle kultur analyser. Det bør understrekes at selv om bruk av en spinner kolbe eller tilsvarende bioreactor er valgfritt, en stasjonær kultur av kuler i nær kontakt kan føre deres smelte sammen, dermed begrenser næringsstoffer og oksygen utover grensen spredning i midten av kuler47. Spesielt, bruk av 3D trykt mini-bioreactors har blitt rapportert som en høyere produksjon sammenlignet med store bioreaktorer46.

Tradisjonelle verktøy til å måle synaptic formasjon inkluderer fysiologiske metoder slik hele celle oppdateringen clamping, tiltak36,48,49og kalsium imaging50. Her, vil vi beskrive bruken av tiltak som de gir en enkel og høy gjennomstrømming undersøkelse av elektrisk aktivitet i sfærer i kort tidsskala. Men kan andre teknikker også benyttes.

En begrensning av bruk av microwell plater i denne protokollen er maksimalt antall kuler (~ 300) og celler per kule (~ 2 x 104) som er tillatt i hver brønn. Alternative sfære formasjon verktøy kan brukes til flere; et høyere antall celler vil imidlertid være nødvendig på startpunktet. 24-vel formatet ble valgt her for sin evne til å generere større kuler som kan håndteres for analyse og synlig av øyet, samtidig som du begrenser celledød i midten av kulene. Generelt vil tillegg av dette trinnet til protokollen sikre en robust og skalerbar produksjon av uniform 3D Sfærer.

Våre protokollen har også fleksibilitet til å justere tall og forholdet mellom hver celle type samt muligheten til å introdusere andre celletyper i 3D kulene på en kontrollert, definert måte. Bruk av region-spesifikke neuronal og astrocytter subtyper tillater studiet av synaptic microcircuits i forskjellige regioner i det sentrale nervesystemet. Disse coculture kuler kan også være smeltet sammen51 for å studere mobilnettet migrasjon og lang rekkevidde signalering. Tillegg av oligodendrocytes, endotelceller eller microglia kunne bevise disse 3D Sfærer skal en informativ hjernen modell med økt kompleksitet, som en lovende fremtid retning for denne metoden. Til slutt, sykdom og skade modellering, dette systemet tillater studiet av terapeutiske metoder, for eksempel mobilnettet erstatning terapi eller narkotika utvikling, å forbedre neuroregeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Dr. Erik Ullian (UCSF) for intellektuell inndata på utformingen av disse prosedyrene, Dr. Michael Ward (NIH) for tekniske råd om iNeuron differensiering og Saba Barlas for foreløpige bildeanalyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 μM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 138 stilk celler Neurons astrocyttene synapser Organoid Coculture Bioreactor Multielectrode matrise
Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. More

Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter