Summary
In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.
Abstract
De mechanische eigenschappen van de kern bepalen haar reactie op mechanische krachten gegenereerd in cellen. Omdat de kern moleculair continu met het cytoskelet is, zijn methoden nodig om de sonde van het mechanische gedrag in Adherente cellen. Hier bespreken we de directe werking sonde (DFP) als een instrument om het geweld zich rechtstreeks wenden tot de kern in een levende aanhangend cel. We hechten een smalle micropipet aan de nucleaire oppervlak afzuigen. De micropipet is vertaald uit de buurt van de kern, waardoor de kern te vervormen en te vertalen. Wanneer het herstel kracht gelijk aan de zuigkracht is, de kern wordt verbroken en elastisch ontspant. Omdat de zuigdruk precies bekend is, is de kracht op het nucleaire oppervlak bekend. Deze methode is gebleken dat de nano-schaal krachten volstaan om te vervormen en vertalen van de kern in Adherente cellen, en geïdentificeerd cytoskeletal elementen waarmee de kern krachten weerstaan. De DFP kan worden gebruikt voor het ontleden van de bijdragen van cellulaire en nucleaire componenten nucleaire mechanische eigenschappen in levende cellen.
Introduction
Ziektebeelden zoals kanker impliceren wijzigingen aan nucleaire vorm en structuur1,2, die over het algemeen vergezeld gaan van een 'verzachtende' van de kern3,4. Nucleaire weerstand aan mechanische vervorming in het algemeen gekenmerkt door een kracht naar geïsoleerde kernen5.
De kern in cellen is het moleculair verbonden met het cytoskelet door de Linker van Nucleoskeleton en het cytoskelet (LINC) complexe6,,7,,8,9. Dientengevolge, is de kern mechanisch geïntegreerd met het cytoskelet en, door middel van cel-substraat verklevingen, de extracellulaire matrix. Mechanisch sonderen de kern binnen Adherente cellen kan inzicht geven in deze mechanische integratie. Methoden voor het manipuleren van de kernen in levende cellen omvatten micropipet aspiratie10,11, en atomic force microscopie12,13,14. We onlangs beschreven een directe kracht-sonde (DFP) toepassing van mechanische krachten direct bij de kern in een levende aanhangend cel15.
We schetsen hier, de procedure voor het gebruik van een systeem van microinjection dat is vaak beschikbaar in microscopie faciliteiten toe te passen een bekende, nano-schaal mechanische kracht direct op de kern in een aanhangend cel. Een femtotip (0,5 µm diameter micropipet tip) is gemonteerd en aangesloten op het systeem van microinjection door een buis. De tip, geplaatst in een hoek van 45° ten opzichte van het oppervlak van de cultuur schotel, is verlaagd tot grenzend aan het nucleaire oppervlak. De buis is vervolgens verbroken en opengesteld voor de sfeer, die wordt gemaakt van een negatieve zuigdruk op het nucleaire oppervlak en bezegelt het uiteinde van de micropipet tegen de nucleaire oppervlak. Door middel van vertaling van de micropipet tip, is de kern vervormd en uiteindelijk (afhankelijk van de omvang van de uitgeoefende kracht), los van de micropipet. Dit detachement treedt op wanneer herstel (weerstand) krachten, uitgeoefend door de celkern en cel, gelijk de zuigkracht toegepast door de micropipet. Analyse kan worden uitgevoerd door het meten van de verplaatsing van de kern, de lengte stam (vergelijking 1) of de stam van de ruimte (figuur 1A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding cellen van Imaging
Opmerking: De directe werking sonde (DFP) kan worden gebruikt voor elk celtype aanhangend. Hier, worden NIH 3T3 muis fibroblasten gebruikt als de cellijn model voor dit protocol.
- Cultuur NIH 3T3 fibroblast cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% donor runderserum en 1% penicilline-streptomycine op een 35-mm glazen bodem schotel tot gewenste confluentie. Houden cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Zorg ervoor dat alle gerechten van de onderkant van de 35-mm glas met 5 µg/mL fibronectine (of soortgelijke ECM eiwit), vóór het zaaien van NIH 3T3 cellen voor imaging jas.
Opmerking: De cellen moeten worden volledig verspreiden en aanhangend op de schotel voor het experiment. Er zijn niet alle beperkingen op het gebied van confluentie DFP de methode werken.
- Zorg ervoor dat alle gerechten van de onderkant van de 35-mm glas met 5 µg/mL fibronectine (of soortgelijke ECM eiwit), vóór het zaaien van NIH 3T3 cellen voor imaging jas.
- Wassen onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, de cellen tweemaal met PBS gevolgd door een enkel wassen met volledige groeimedium.
- Voeg 3 mL van volledige groeimedium aan de glazen bodem schotel.
2. microscopie en beeldacquisitie
Opmerking: Een omgekeerde fluorescentie Microscoop (of equivalent) met micromanipulator op de zijarm, volgens de aanbevelingen van de fabrikant geïnstalleerd. De Microscoop moet ook worden uitgerust met een milieu kamer om de temperatuur bij 37 ° C, en 5% CO2 niveau te handhaven. Er is ook een micromanipulator en microinjector gekoppeld aan de Microscoop vereist. Een olie-immersie 40 x / 1.3 nb of 60 x / 1,49 NB (of gelijkwaardige doelstellingen) worden aanbevolen voor de experimenten. De Microscoop moet worden gemonteerd op een vibratie isolatie tafel.
Figuur 1 . Nucleaire vervorming en het concentreren van de Microscoop
A. maximale nucleaire vervorming en ontspanning van nucleaire vervorming. Voor de berekening maximale nucleaire vervorming, waren de rug randen van de nucleaire vormen eerst viel samen om te corrigeren voor de vertaling van misvormde nucleus. De vorm van de kern op het moment van micropipet tip detachement was die op de aanvankelijke nucleaire shape worden bedekt voordat trekken. Het verschil in ruimte tussen de twee shapes werd gemeten als Δeen1. De maximale nucleaire vervorming werd gedefinieerd als ΔA1 gedeeld door de oorspronkelijke nucleair gebied. Ook een tweede parameter, ΔA2, kan worden gedefinieerd door te bedekken de eindtoestand steady nucleaire vorm na micropipet detachement op de oorspronkelijke nucleaire vorm. B. richten de cel in een vliegtuig en verplaats het brandvlak tot vliegtuig B te vinden de tip van micropipet. Tijdens imaging, werd de micropipet vertaald naar rechts (richting van oranje pijl). Dit cijfer is gewijzigd van Neelam et al. 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Inschakelen van de microinjector per protocol van de fabrikant.
- Met behulp van een onderdompeling olie druppelaar, toepassing een druppel van onderdompeling olie op de top van het objectief.
- Klem de schotel strak in de schotel-houder en de houder van de schotel op het podium te laden.
Opmerking: De cellen moeten op 37 ° C en 5% CO2 gedurende het gehele experiment worden gehouden. - Pas de hoogte van de doelstelling om de cellen in focus (vliegtuig A, figuur 1B).
- Verplaats het stadium van de Microscoop te vinden van een cel van belang.
- Draai de joystick op het micromanipulator om de pipet houder naar de bovenste positie. Laad de 0,5 µm diameter tip micropipet op de houder van de pipet.
- Om te voorkomen dat de cel adhesie aan de micropipet, vooraf behandelen de micropipet tip met 0,3 mg/mL PLL-g-PEG oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Testen op hechting door de micropipet aan de kern zonder enige zuigdruk aan te raken, en dan het vertalen van de micropipet uit de buurt van de kern. Het gebrek aan hechting kan worden onderscheiden van een compleet gebrek aan nucleaire vervorming en vertaling.
Opmerking: Volg vervaardiging suggesties te openen van het pakket.
- Om te voorkomen dat de cel adhesie aan de micropipet, vooraf behandelen de micropipet tip met 0,3 mg/mL PLL-g-PEG oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Testen op hechting door de micropipet aan de kern zonder enige zuigdruk aan te raken, en dan het vertalen van de micropipet uit de buurt van de kern. Het gebrek aan hechting kan worden onderscheiden van een compleet gebrek aan nucleaire vervorming en vertaling.
- Het objectieve brandvlak boven vlak A en de bovenkant van de cel naar vliegtuig B verhogen door de fijne controle aan te passen (figuur 1B, zie stap 2.4).
- Stel de micromanipulator op grof controle. Breng langzaam het micropipet tot vliegtuig B door te kijken voor het silhouet van de micropipet, totdat de micropipet volledig in focus komt.
- Zodra de micropipet tip in focus is, stel de micromanipulator op fijne controle.
- De doelstelling van het equatoriale vlak van de cel (vliegtuig A, figuur 1B) lager en lager van de micropipet tot ongeveer 15 µm boven vlak A (figuur 1B, onderbroken micropipet).
- De compensatie druk (Pc) instellen op de microinjector aan de gewenste druk; Wacht enkele seconden voor de druk om te stabiliseren.
Opmerking: De optimale druk instelpunt hangt zowel celtype en de specifieke doelstellingen van het experiment. Voor de meeste gevallen zou 300 hPa een goed uitgangspunt. - Zorg ervoor dat de micropipet niet met behulp van de Clean -instelling op het paneel van micromanipulator en controleren om ervoor te zorgen dat er luchtbellen ontstaan uit de micropipet tip is verstopt.
- Breng de tip in de cel door de micropipet geleidelijk te verlagen tot de tip is de nucleaire oppervlak licht aanraken.
Opmerking: Wanneer de micropipet te verlagen, het silhouet van de micropipet tip zal duidelijk worden als het komt in focus. Voordat de micropipet de kern raakt, het verhogen van de objectieve focus en uitlijnen van de micropipet tip bij nucleus (dezelfde x-y-coördinaat, hogere z-plane). Terugkeer van de focus terug naar het equatoriale vlak van de kern (vliegtuig A, figuur 1B) en geleidelijk lager de micropipet tip. - Maak een afdichting tussen het uiteinde van de micropipet en het kernmembraan door los te koppelen van de druk-levering-buis uit het systeem van microinjection, waardoor het openen van het uiteinde van de buis van de micropipet aan de sfeer. Deze stap maakt een negatieve druk gelijk is aan Pc op het nucleaire oppervlak.
- Verwerven van beelden met de microscopen afbeelding collectie software. Een avi-acquisitie (video) of nd-acquisitie (afbeeldingen) in de afbeelding collectie software instellen.
Opmerking: Voor elke imaging software verwerven, real-time video imaging of instellen time-lapse afbeelding overnames met een korte tijdsinterval. - Schakelen om de overeenkomstige TL imaging kanaal (dat wil zeggen, GFP, RFP, etc.) en imaging beginnen.
- Vertalen van het micropipet uiteinde van het lichaam van de cel (aan de rechterkant, figuur 1B) totdat de kern is losgekoppeld van de micropipet.
Opmerking: Trek de tip langs de positieve x-richting (naar rechts in het gezichtsveld). Het trekken tarief kan worden geprogrammeerd en gecontroleerd door de computer of de joystick handmatig kan worden verplaatst. Hebben we niet gevonden geen correlatie tussen het trekken tarief en nucleaire vervorming15 suggereren een voornamelijk elastische reactie te dwingen.
3. de gegevensanalyse
- Beeld analyses uitvoeren met het enige fundamentele beeld-verwerkende software beschikbaar. De omvang van de nucleaire vervorming kan worden gekwantificeerd door de lengte stam (Ɛ) of de stam van de ruimte (figuur 1A). Kwantificeren van lengte stam met behulp van vergelijking 1, waar L en L0 vertegenwoordigen de lengtes van de kern op maximale vervorming en de aanvangspositie, respectievelijk.
(Vergelijking 1)
(Vergelijking 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2A toont het dwingen van een NIH 3T3 muis fibroblast nucleus. Zoals de tip micropipet is vertaald naar het recht, de kern vervormt en uiteindelijk het micropipet uiteinde losgekoppeld. De stam van de lengte van de kern wordt gezien om te verhogen met toenemende zuigkracht (figuur 2B). De voorste rand van de kern (micropipet trekken van de rand) vormt een nucleaire uitsteeksel en de afvallende flank wordt verplaatst van de oorspronkelijke positie. De lengte van het uitsteeksel is veel groter dan de achterrand verplaatsing (figuur 2C), suggereren een nauwe integratie tussen de kern en het omliggende cytoplasma. De termijnen zijn kort voor versoepeling van de nucleaire voorkant (< 1 s), en de nucleaire terug rand (< 2 s) (figuur 2D).
Figuur 2 . Karakterisering van de nucleaire vervorming
Vervorming en verplaatsing van de kern in een levend, aanhangend cel door de DFP. De kern van een NIH 3T3 fibroblast werd getrokken met 6 nN kracht. De afbeeldingen tonen de nucleaire vorm op de aangegeven tijd. Schaal bar: 5 µm B. nucleaire vervorming werd gekwantificeerd door lengte stam. De nucleaire vervorming verhoogd met toegepaste krachten. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM); n > 6. C. de verplaatsing op de voorrand is groter dan de verplaatsing op de achterrand. D. de lengte stam ontspanning is veel sneller dan de achterste rand ontspanning. P < 0.05; Foutbalken geven SEM; n = 10. Dit cijfer is gewijzigd van Neelam et al. 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
We hebben de DFP-methode gebruikt om te bepalen hoe cytoskeletal troepen bijdragen aan nucleaire weerstand tegen vervorming in de cel. Terwijl geen significante verschillen in nucleaire vervorming of vertaling werden gevonden na de F-actine (door cytochalasin-D) of verstoring van de microtubuli (door nocodazole), resulteerde vermindering van de vimentin expressie via siRNA gebaseerde knockdown in aanzienlijk grotere nucleaire vertaling en vervorming (Figuur 3). Dit suggereert dat de intermediaire filamenten vimentin in fibroblasten zijn het belangrijkste cytoskeletal element waarmee de kern lokale kracht te weerstaan.
Figuur 3 . Fluorescerende beelden van de nucleaire vervorming
DFP werd gebruikt voor het bepalen van de bijdrage van cytoskeletal krachten aan nucleaire vervorming. De kern werd gekleurd met de SYTO 59 kleurstof. Fluorescerende beelden tonen de overlay van de kern voor (, pseudo-rood) en na (groen, pseudo-kleur) op de aangegeven voorwaarde. CTRL, cellen; CYTO-D, cellen behandeld met cytochalasin-D; NOC, cellen behandeld met nocodazole; SCRAM, cellen transfected met gecodeerde siRNA; vim siRNA, transfected cellen met siRNA gericht op vimentin. Dit cijfer is gewijzigd van Neelam et al. 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meten van de mechanische integratie van de kern met het cytoskelet is een uitdaging voor de meest actuele methoden, zoals micropipet aspiratie16, omdat ze beide geïsoleerde kernen (waar de kern is van het cytoskelet ontkoppelde) vereisen of kernen in zwevende cellen (waar de extracellulaire krachten, zoals tractie krachten, zijn afwezig is). Kracht is vereffend met de nucleus door biaxial stam toe te passen op cellen aanhanger naar een membraan17,18; Deze techniek wordt echter beperkt door het feit dat de kracht op de kern onbekend is. Atomaire kracht microscopie (AFM) sondes zijn gebruikt voor het inspringen van de kern in onbeschadigde cellen; Deze bieden het voordeel dat ze de mechanische eigenschappen van de kern terwijl het onthullen is geïntegreerd met het cytoskelet. Te voegen aan bestaande in vivo technieken voor het karakteriseren van de kern12,13,14, we hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld om mechanisch sonde de kern in een levende aanhangend cel terwijl het blijft geïntegreerd in het omliggende cytoskelet. Een belangrijk kenmerk van deze techniek is dat de kracht op de kern is precies bekend en gecontroleerd.
Door het toepassen van de DFP, schatten we dat de nano-newton schaal krachten volstaan te vervormen en te vertalen van de kern in levende, Adherente cellen. Bovendien, door middel van systematische studies van de bijdragen van de verschillende cytoskeletal elementen, we hebben ontdekt dat vimentin gebaseerde intermediaire filamenten de belangrijkste component van de cellulaire cytoskelet verantwoordelijk voor verstijving van de kern in de cel 15.
Sommige waarschuwingen van toepassing met deze experimenten. Het is belangrijk om regelmatig te controleren de micropipet tip voor de verstopping of breuk tijdens experimenten, aangezien beide verstopping van de micropipet of fractuur van de tip onbekende wijzigingen in de zuigdruk toegepast op de cel veroorzaken zou. Om te controleren als de micropipet verstopt is, gebruik de Clean -instelling op de manipulator naar maximale druk uitoefenen en controleer op luchtbellen uit de micropipet-tip. Als de micropipet tip is gebroken of gebroken, vervangen door de micropipet voordat u begint met het volgende experiment. Ook, is het belangrijk om te bevestigen dat de nucleaire stam met de kracht varieert, en nul bij nul kracht (Zie Neelam et al. 15). als dit niet wordt nageleefd in experimenten, dan is het mogelijk dat niet-specifieke hechting tussen het uiteinde van de micropipet en de nucleaire oppervlak (ondanks behandeling met PLL-PEG) verantwoordelijk voor nucleaire vervorming zijn kan. Een andere beperking van de techniek is dat het inbrengen van de micropipet in de cel zelf sommige lokale verstoring van de cytoskeletal structuren kan veroorzaken.
Het is nuttig om te testen voor de correlaties tussen de omvang van de nucleaire vervorming/vertaling en densiteit. Het ontbreken van een correlatie zou impliceren een voornamelijk elastische weerstand. Inderdaad, dit is wat we hebben gevonden het geval voor fibroblast kernen15. De methode terwijl de kracht op de kern is bekend, niet toe dat de berekening van de parameters, zoals de Youngs modulus. We hebben het voornamelijk gebruikt om te ontleden bijdragen van cellulaire structuren aan de weerstand tegen nucleaire vervorming en vertaling in de cel. Terwijl wij hebben gemeld tweedimensionale nucleaire vormen15,19, is het wellicht nuttig te kwantificeren van de volledige driedimensionale vorm van de kern onder kracht.
De zuigdruk in het micropipet is bekend, maar het is groter dan de werkelijke druk toegepast op de nucleaire oppervlakte due te stromen van water door poriën10. We hebben echter aangetoond dat het verzet tegen de nucleaire poriën doorstromen is veel groter door het micropipet (Zie ondersteunende informatie voor berekeningen in Neelam et al. 15) voor redelijke membraan oppervlaktepermeabiliteiten en micropipet afmetingen. Daarom moet de druk aan de buitenmembraan oppervlakte gelijk is aan de zuigdruk ondanks het bestaan van stroom.
Kortom, kan de DFP de gebruiker te kwantificeren van de mechanische reactie van de geïntegreerde nucleus-cytoskelet in een aanhangend cel op een bekende en gecontroleerde kracht. Deze methode kan worden gebruikt om het ontleden van de bijdragen van moleculaire componenten in de kern en het cytoplasma naar het mechanische gedrag van de kern binnen de cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
