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Biochemistry

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58038

Summary

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Abstract

Die mechanischen Eigenschaften des Kerns bestimmen seine Reaktion auf mechanische Kräfte, die in den Zellen erzeugt. Da der Kern mit dem Zytoskelett Molekular kontinuierlich ist, werden Methoden benötigt, das mechanische Verhalten in adhärenten Zellen zu untersuchen. Hier diskutieren wir die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) als Instrument zur Kraft direkt in den Zellkern in lebenden adhärente Zellen anwenden. Wir legen einen schmalen Mikropipette zur nuklearen Oberfläche mit Absaugung. Die Mikropipette wird vom Nucleus, übersetzt, was bewirkt, den Kern dass zu verformen und zu übersetzen. Wenn die Rückstellkraft der Saugkraft entspricht, wird der Kern löst und elastisch entspannt. Da der Saugdruck genau bekannt ist, wird die Kraft auf die nukleare Oberfläche bezeichnet. Diese Methode hat ergeben, dass Nano-Maßstab Kräfte ausreichen, um zu verformen und übersetzen den Zellkern in adhärenten Zellen und identifiziert Zellskelett Elemente, mit die den Kern Kräften widerstehen können. Die DFP kann verwendet werden, um die Beiträge der zellulären und nuklearen Komponenten zur nuklearen mechanischen Eigenschaften in lebenden Zellen zu sezieren.

Introduction

Krankheiten wie Krebs betreffen Änderungen an nuklearen Form und Struktur1,2, die in der Regel von einer Erweichung der Kern3,4begleitet werden. Nukleare Widerstand gegen mechanische Verformung hat in der Regel durch Krafteinwirkung auf isolierten Kernen5gekennzeichnet.

Kern in Zellen ist Molekular mit dem Zytoskelett der Linker Nucleoskeleton und Cytoskelett (LINC) komplexe6,7,8,9verbunden. Infolgedessen ist der Kern mechanisch mit dem Zytoskelett und durch Zelle-Substrat Verwachsungen, die extrazelluläre Matrix integriert. Mechanisch sondieren des Kerns im Inneren adhärente Zellen bieten einen Einblick in diese mechanischen Integration. Methoden der Kerne in lebenden Zellen zu manipulieren zählen Mikropipette Anspruch10,11und atomic Force Microscopy12,13,14. Wir beschrieben vor kurzem eine unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP), die mechanische Kräfte direkt auf den Kern in einem lebendigen adhärente Zellen15gilt.

Hier beschreiben wir das Verfahren für die Nutzung einer Mikroinjektion Systems, die häufig in Mikroskopie Einrichtungen, eine bekannte, Nano-Maßstab mechanische Kraft direkt in den Zellkern in eine adhärente Zellen anzuwenden. Ein Femtotip (0,5 µm Durchmesser Mikropipette Spitze) ist montiert und die Mikroinjektion System durch ein Rohr verbunden. Der Tipp, positioniert in einem 45° Winkel relativ zur Oberfläche der Kulturschale sinkt bis angrenzend an der nuklearen Oberfläche. Das Rohr ist dann nicht getrennt und die Atmosphäre, die schafft eines negativen Saugdruck an der nuklearen Oberfläche und dichtet die Mikropipette Spitze gegen die nukleare Oberfläche eröffnet. Durch die Übersetzung der Mikropipette Spitze ist der Kern verformt und schließlich (abhängig von der Größe der Krafteinwirkung), losgelöst von der Mikropipette. Diese Abteilung tritt auf, wenn die Rückstellkräfte (widerstehen), ausgeübt durch den Kern und die Zelle, die Saugkraft durch die Mikropipette aufgetragen gleich. Analyse kann erfolgen durch die Verschiebung des Kerns, Messung der Länge Dehnung (Gleichung 1) oder der Bereich Belastung (Abb. 1A).

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Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung

Hinweis: Die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) kann für adhärente Zelltypen jeglicher Art verwendet werden. Hier werden NIH-3 t 3-Maus-Fibroblasten als die Modell-Zell-Linie für dieses Protokoll verwendet.

  1. Kultur NIH-3 t 3-fibroblastenzellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % Spender Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin auf einem 35-mm-Glasboden Schale bis zum gewünschten Konfluenz. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten.
    1. Achten Sie darauf, alle 35 mm unten Glasschalen mit 5 µg/mL Fibronektin (oder ähnliche ECM-Protein), Mantel vor der Aussaat NIH-3 t 3-Zellen für die Bildgebung.
      Hinweis: Die Zellen müssen vollständig verteilt und Anhänger auf dem Teller für das Experiment. Es gibt keine Einschränkungen in Bezug auf die Konfluenz für die DFP-Methode zu arbeiten.
  2. Unmittelbar vor dem Experiment waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS gefolgt von einem einzigen waschen mit vollständigen Wachstumsmedium.
  3. Die untere Glasschale 3 mL komplette Wachstumsmedium hinzufügen.

2. Mikroskopie und Bildaufnahme

Hinweis: Ein umgekehrtes Fluoreszenz Mikroskop (oder Äquivalent) mit Mikromanipulator auf den Seitenarm, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers installiert. Das Mikroskop sollte auch mit einer Klimakammer weiterhin die Temperatur bei 37 ° C und CO-2 -Ebene mit 5 % ausgestattet werden. Ein Mikromanipulator und Microinjector mit dem Mikroskop verbunden ist ebenfalls erforderlich. Ein Öl-Immersion 40 X / 1,3 NA oder 60 X / 1,49 NA (oder gleichwertige Ziele) werden empfohlen für die Experimente. Das Mikroskop sollte auf einem Rütteltisch isoliert montiert werden.

Figure 1
Abbildung 1 . Nukleare Verformung und Mikroskop mit Schwerpunkt
A. maximale nukleare Verformung und Entspannung der nuklearen Verformung. Vor der Berechnung maximale nukleare Deformation, wurden die hinteren Kanten der nuklearen Formen zuerst fiel um für die Übersetzung von deformierten Kern zu korrigieren. Die Form des Kerns zum Zeitpunkt der Mikropipette Tipp Ablösung war vor dem abziehen auf nukleare Ausgangsform überlagert. Der Unterschied im Bereich zwischen den beiden Formen als Δ gemessen wurdeeine1. Die maximale nukleare Verformung wurde als ΔA1 geteilt durch die ursprünglichen nuklearen Bereich definiert. Auch ein zweiter Parameter, Δ2, kann durch die Überlagerung der endgültigen Steady-State nuclear Form nach Mikropipette Ablösung auf die nukleare Originalform definiert werden. B. konzentrieren sich die Zelle auf der Fläche A und Verschieben der Brennebene bis Ebene B Mikropipette Tipp zu finden. Während der Aufnahme, wurde die Mikropipette nach rechts (Richtung oranger Pfeil) übersetzt. Diese Zahl wurde von Neelam Et al.modifiziert. 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Schalten Sie die Microinjector pro des Herstellers Protokoll.
  2. Tragen Sie mit einer eintauchen Öl Pipette einen einzigen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv.
  3. Klemmen Sie die Schüssel fest in die Schale Halter und laden Sie die Schale Halter auf die Bühne.
    Hinweis: Die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 während des Experiments einzuhalten.
  4. Passen Sie die Höhe des Ziels, die Zellen in den Fokus (Ebene A, Abbildung 1 b) bringen.
  5. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, eine Zelle von Interesse zu finden.
  6. Drehen Sie den Joystick auf der Mikromanipulator, pipettieren Halter an die oberste Position zu bewegen. Laden Sie die 0,5 µm Durchmesser Spitze Mikropipette auf den Halter pipettieren.
    1. Zur Vermeidung von Zelladhäsion, die Mikropipette Vorbehandeln der Mikropipette Spitze mit 0,3 mg/mL PLL-g-PEG-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur. Haftung durch Berühren der Mikropipette in den Zellkern ohne Saug Druck, und dann übersetzen die Mikropipette vom Nucleus testen. Keine Haftung kann von einem völligen Mangel an nuklearen Verformung und Übersetzung erkannt werden.
      Hinweis: Führen Sie Herstellung Vorschläge, um das Paket zu öffnen.
  7. Erhöhen die objektiven Brennebene über Flugzeug A und am oberen Rand der Zelle nach Flugzeug B durch die Feinsteuerung einstellen (Abbildung 1 b, siehe Punkt 2.4).
  8. Legen Sie die Mikromanipulator auf grob Kontrolle. Bringen Sie langsam die Mikropipette bis Flugzeug B durch die Beobachtung für die Silhouette des mikropipette, bis die Mikropipette voll ins Blickfeld kommt.
  9. Sobald die Mikropipette Tipp korrekt ausgerichtet ist, soll der Mikromanipulator Feinsteuerung .
  10. Senken Sie das Ziel, die äquatorialebene der Zelle (Ebene A, Abbildung 1 b) und senken Sie die Mikropipette bis etwa 15 µm über Ebene A (Abb. 1 b, gestrichelten Mikropipette).
  11. Die Entschädigung Druck (P-c) auf die Microinjector auf den gewünschten Druck einstellen; warten Sie einige Sekunden für den Druck zu stabilisieren.
    Hinweis: Der optimale Druck-Sollwert richtet sich nach Zelltyp und die spezifischen Ziele des Experiments. In den meisten Fällen wäre 300 hPa ein guter Ausgangspunkt.
  12. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipette nicht verstopft ist, mit Hilfe der Clean -Einstellung im Feld Mikromanipulator und überprüfen, um sicherzustellen, dass Luftblasen aus der Mikropipette Spitze entstehen.
  13. Führen Sie die Spitze in die Zelle durch eine schrittweise Senkung der Mikropipette bis die Spitze die nuklearen Oberfläche leicht berührt.
    Hinweis: Wenn die Mikropipette absenken, die Silhouette der Mikropipette Spitze wird klar, wie es in den Fokus kommt. Bevor die Mikropipette den Kern berührt, erhöhen Sie den Objektive Fokus zu und richten Sie die Mikropipette Spitze mit Kern (gleichen X-y-Koordinate, höheren Z-Ebene). Im Mittelpunkt der Äquatorebene des Kerns (Ebene A, Abbildung 1 b) zurück wieder und senken Sie allmählich die Mikropipette Spitze.
  14. Erstellen Sie eine Dichtung zwischen der Mikropipette Spitze und die Kernmembran durch das Trennen der Druck-Zuleitung von der Mikroinjektion System, und eröffnet damit die Mikropipette Rohrende in die Atmosphäre. Dieser Schritt schafft einen negativen Druck gleich Pc an der nuklearen Oberfläche.
  15. Bilder mit den Mikroskopen Bild Datenerfassungs-Software zu erwerben. Eine Avi-Erwerb (Video) oder Nd-Erwerb (Bilder) in der Bild-Datenerfassungs-Software einrichten.
    Hinweis: Für jede Imaging Software zu erwerben, eingerichtet in Echtzeit video Bildgebung oder Zeitraffer Bild Akquisitionen mit einem kurzen Zeitintervall.
  16. Umschalten auf das entsprechende Leuchtstoff imaging Channel (z. B. GFP, RFP, etc.) und Bildgebung zu beginnen.
  17. Übersetzen die Mikropipette Spitze vom Körper der Zelle (nach rechts, Abbildung 1 b) bis der Kern aus der Mikropipette löst.
    Hinweis: Ziehen Sie die Spitze entlang der positiven X-Richtung (nach rechts in das Blickfeld). Die ziehende Rate kann programmiert und gesteuert durch Computer oder der Joystick kann manuell verschoben werden. Haben wir nicht gefunden, eine Korrelation zwischen der ziehen-Rate und nukleare Verformung15 schlägt eine in erster Linie elastische Reaktion zu zwingen.

(3) Datenanalyse

  1. Führen Sie Bildanalyse mit grundlegenden Bildverarbeitungs-Software zur Verfügung. Das Ausmaß der nuklearen Verformung kann durch die Länge Belastung (Ɛ) oder der Bereich Belastung (Abbildung 1A) quantifiziert werden. Quantifizieren, Länge Belastung mit Formel 1, wo L und L0 darstellen bzw. die Länge des Kerns auf maximale Deformation und die ursprüngliche Position.
    Equation 1(Gleichung 1)

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Representative Results

Abbildung 2A zeigt einem NIH-3 t 3 Maus Fibroblasten Kern zu zwingen. Die Mikropipette Spitze auf der rechten Seite übersetzt wird, der Kern verformt sich und löst sich schließlich von der Mikropipette Spitze. Die Länge Belastung des Kerns wird gesehen, mit zunehmender Saugkraft (Abb. 2 b) zu erhöhen. Die Vorderkante des Kerns (Mikropipette Kante ziehen) bildet eine nukleare Vorwölbung und die Hinterkante ist von seiner ursprünglichen Position verschoben. Die Länge des Vorsprungs ist viel größer als die Hinterkante Verschiebung (Abbildung 2), was auf eine enge Integration zwischen dem Kern und den umgebenden Zytoplasma. Die Zeitskalen sind kurz für Entspannung der nuklearen Vorderkante (< 1 s), und der nuklearen Hinterkante (< 2 s) (Abb. 2D).

Figure 2
Abbildung 2 . Charakterisierung der nuklearen Verformung
Verformung und Verschiebung des Kerns in einer lebendigen, anhaftende Zelle durch die DFP. Ein NIH-3 t 3-Fibroblasten-Kern wurde mit 6 nN Kraft gezogen. Die Bilder zeigen die atomare Form zur angegebenen Zeit. Maßstab: 5 µm B. Nuclear Verformung wurde durch Länge Belastung quantifiziert. Die nukleare Verformung mit anliegenden Kräfte erhöht. Fehlerbalken zeigen Standardfehler des Mittelwertes (SEM); n > 6. C. die Verschiebung an der Vorderkante ist größer als die Verschiebung an der Hinterkante. D. die Länge Belastung Entspannung ist viel schneller als Hinterkante Entspannung. P < 0,05; Fehlerbalken zeigen SEM; n = 10. Diese Zahl wurde von Neelam Et al.modifiziert. 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Wir haben die DFP-Methode verwendet, um festzustellen, wie Zellskelett Kräfte zur nuklearen Widerstand gegen Verformung in der Zelle beitragen. Keine signifikanten Unterschiede im nuklearen Verformung oder Übersetzung nach F-Aktin (durch Cytochalasin-D) oder Störungen der Mikrotubuli (durch Nocodazole) gefunden wurden, doch wegen Reduzierung Vimentin Ausdruck durch SiRNA basierenden Zuschlag deutlich größer nukleare Übersetzung und Verformung (Abbildung 3). Dies legt nahe, dass Vimentin intermediate Filamente in Fibroblasten sind das Zellskelett Hauptelement, die helfen, den Zellkern lokale Kraft zu widerstehen.

Figure 3
Abbildung 3 . Fluoreszierende Bilder der nuklearen Verformung
DFP wurde verwendet, um den Beitrag des Zytoskeletts Kräfte zur nuklearen Deformation zu bestimmen. Der Kern war mit SYTO 59 Farbstoff gefärbt. Fluoreszierende Bilder zeigen die Überlagerung des Kerns vor (rot, Pseudo-Farbe) und nach (grün, Pseudo-Farbe) auf den angegebenen Zustand. STRG, Kontrollzellen; Zyto-D, Zellen mit Cytochalasin-D behandelt; NOC, Zellen mit Nocodazole behandelt; Hau ab, transfizierten Zellen mit Rührei SiRNA; Vim SiRNA transfizierten Zellen mit SiRNA targeting Vimentin. Diese Zahl wurde von Neelam Et al.modifiziert. 15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Messung der mechanischen Integration des Kerns mit dem Zytoskelett ist eine Herausforderung für die aktuellsten Methoden, z. B. Mikropipette Anspruch16, weil sie entweder einzelne Kerne erfordern (wo ist der Kern von dem Zytoskelett entkoppelt) oder Kerne in den suspendierten Zellen (wo extrazelluläre Kräften wie Zugkräfte, fehlen). Auf den Kern wurde Kraft angewandt, indem biaxiale Beanspruchung auf Zellen Anhänger auf eine Membran17,18; Allerdings ist diese Technik durch die Tatsache begrenzt, dass die Kraft auf den Zellkern unbekannt ist. Atomic Force Microscopy (AFM) Sonden wurden verwendet, um den Kern in intakten Zellen Einrücken; Diese bieten der Vorteil, dass sie die mechanischen Eigenschaften des Kerns während es zeigen mit dem Zytoskelett integriert ist. Hinzufügen zu vorhandenen in Vivo Techniken zur Charakterisierung der Kern12,13,14, entwickelten wir eine einfache und robuste Methode, um den Kern in einen lebenden adhärente Zellen mechanisch Sonde, während es bleibt in den umliegenden Zytoskelett integriert. Ein wesentliches Merkmal dieser Technik ist, dass die Kraft auf den Kern genau bekannt und kontrolliert wird.

Durch die Anwendung der DFP, schätzen wir, dass Nano-Newton-Skala-Kräfte ausreichen, verformen und Kern in lebenden, adhärente Zellen zu übersetzen. Darüber hinaus durch systematische Untersuchungen der Beiträge der verschiedenen Zellskelett Elemente fanden wir, dass Vimentin-basierte intermediate Filamente die Hauptkomponente des zellulären Zytoskeletts zur Versteifung der Zellkern in der Zelle verantwortlich sind 15.

Einige Einschränkungen gelten mit diesen Experimenten. Es ist wichtig, regelmäßig die Mikropipette Tipp für Verstopfung oder Bruch während der Experimente, da beide verstopfen der Mikropipette oder Bruch der Spitze unbekannte Änderungen an der Saugdruck auf die Zelle angewendet führen würde. Um zu überprüfen, ob die Mikropipette verstopft ist, verwenden Sie die Clean -Einstellung auf dem Manipulator Maximaldruck anwenden und überprüfen Sie, ob Luftblasen aus der Mikropipette Spitze. Wenn die Mikropipette Spitze defekt oder gebrochen ist, ersetzen Sie die Mikropipette vor Beginn der nächsten Experiment. Es ist auch wichtig zu bestätigen, dass die nukleare Belastung mit der Kraft variiert und NULL mit Null Kraft (siehe Neelam Et Al. 15). wenn dies ist nicht in Experimenten beobachtet, dann ist es möglich, dass unspezifische Haftung zwischen der Mikropipette Spitze und der nuklearen Oberfläche (trotz Behandlung mit PLL-PEG) für nukleare Verformung verantwortlich sein kann. Eine weitere Einschränkung der Technik ist, dass die Einfügung der Mikropipette in die Zelle selbst einige lokale Störungen des Zytoskeletts Strukturen verursachen kann.

Es ist nützlich, um Korrelationen zwischen dem Ausmaß der nuklearen Verformung/Übersetzung und raumbelastung zu testen. Fehlender Korrelation würde bedeuten, dass in erster Linie elastischen Widerstand. In der Tat ist dies, was wir gefunden haben, der Fall für Fibroblasten Kerne15sein. Während die Kraft auf den Kern bekannt ist, erlaubt die Methode nicht die Berechnung der Parameter wie des Elastizitätsmoduls. Wir haben in erster Linie verwendet, um Beiträge von Zellstrukturen, die Beständigkeit gegen nukleare Verformung und Übersetzung in der Zelle zu sezieren. Während wir zweidimensionale koexistierender Formen15,19berichtet haben, es möglicherweise sinnvoll, die vollständige dreidimensionale Form des Kerns unter Krafteinwirkung zu quantifizieren.

Der Saugdruck in die Mikropipette ist bekannt, aber es ist größer als der tatsächliche Druck auf die nukleare Oberfläche soll fließen des Wassers durch10Poren. Wir haben jedoch gezeigt, dass der Strömungswiderstand durch die Kernporen viel größer durch die Mikropipette (siehe Begleitinformationen für Berechnungen in Neelam Et al. 15) für angemessene Membran-Permeabilitäten und Mikropipette Dimensionen. Daher sollte der Druck an der äußeren Membranoberfläche der Saugdruck trotz des Vorhandenseins des Flusses entsprechen.

Abschließend ermöglicht die DFP dem Benutzer, das mechanische Verhalten des integrierten Kern-Zytoskeletts in eine adhärente Zellen zu einer bekannten und kontrollierte Kraft zu quantifizieren. Diese Methode kann verwendet werden, die Beiträge von molekularen Bestandteilen im Zellkern und Zytoplasma, das mechanische Verhalten des Kerns innerhalb der Zelle zu zergliedern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH R01 EB014869 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FluoroDish WPI FD35
SYTO 59 ThermoFisher Scientific S11341
Femtotips  Eppendorf 930000043
InjectMan NI2 Eppendorf NA discontinued, current equivalent model: InjectMan 4
FemtoJet Eppendorf NA Current model FemtoJet 4i
Plan Fluor oil immersion 40x Nikon NA
Apo TIRF oil immersion 60x Nikon NA
Donor Bovine Serum (DBS) ThermoFisher Scientific 16030074 NIH 3T3 serum
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) Mediatech cellgro MT10013CVRF NIH 3T3 medium
Penicillin-Streptomycin  Mediatech MT30004CIRF NIH 3T3 medium supplement
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing Nikon 77007 Immersion oil for objective lens 

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References

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Zhang, Q., Tamashunas, A. C., Lele,More

Zhang, Q., Tamashunas, A. C., Lele, T. P. A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (137), e58038, doi:10.3791/58038 (2018).

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