Summary
I denne protokollen beskriver vi en brønnene metode for å direkte bruke en kontrollert kraft på kjernen i en levende celle. Denne analysen kan avhør av kjernefysiske mekaniske egenskaper i levende, tilhenger cellen.
Abstract
Mekaniske egenskaper for kjernen bestemme sitt svar på mekaniske krefter generert i celler. Kjernen er molecularly kontinuerlig med cytoskjelett, for metoder å undersøke sin mekanisk oppførsel i tilhenger celler. Her diskuterer vi direkte force sonden (DFP) som et verktøy for å bruke makt direkte til kjernen i en levende tilhenger celle. Vi legger smale brønnene til kjernefysiske overflaten med sugekraft. Brønnene er oversatt fra kjernen, som forårsaker kjernen å deformere og oversette. Når gjenopprette er lik sugekraft styrken, kjernen løsner og slapper elastisk. Fordi inntaks press er nøyaktig kjent, er styrken på kjernefysiske overflaten kjent. Denne metoden har avdekket at nano-skala styrker er tilstrekkelig å deformere og oversette kjernen i tilhenger celler, og identifisert cellen cytoskjelett elementer som aktiverer kjernen å motstå styrker. DFP kan brukes å analysere bidrag av mobilnettet og kjernefysiske komponenter kjernefysiske mekaniske egenskaper i levende celler.
Introduction
Patologi som kreft innebære endringer i kjernefysiske form og struktur1,2, som er vanligvis ledsaget av en "mykgjøringen" av kjernen3,4. Kjernefysiske motstand mot mekanisk deformasjon har vært generelt karakterisert ved å bruke en isolert kjerner5.
Kjernen i celler er molecularly knyttet til cytoskjelett Linker av Nucleoskeleton og Cytoskeleton (LINC) komplekse6,7,8,9. Resultatet er kjernen mekanisk integrert med cytoskjelett, og gjennom celle-undergrunnen adhesjon, den ekstracellulære matrisen. Mekanisk prøvende kjernen i tilhenger cellene kan gi innsikt i mekanisk integrering. Metoder for å manipulere kjerner i levende celler inkluderer brønnene aspirasjon10,11og atomic force mikroskopi12,13,14. Vi har nylig beskrevet en direkte force sonde (DFP) som gjelder mekaniske krefter på kjernen i en levende tilhenger celle15.
Her skissere vi fremgangsmåten for å bruke et microinjection system som er allment tilgjengelig i mikroskopi anlegg å bruke en kjent, nano-skala mekanisk kraft direkte på kjernen i en tilhenger celle. En femtotip (0,5 µm diameteren brønnene tips) er montert og koblet til microinjection systemet med et rør. Spissen, plassert i en vinkel på 45 grader i forhold til overflaten av kultur fatet, senkes til ved siden av kjernefysiske overflaten. Røret er deretter koblet og åpnet i atmosfæren, som skaper en negativ inntaks press på kjernefysiske overflaten og sel brønnene spissen mot kjernefysiske overflaten. Gjennom oversettelse brønnene tips, er kjernen deformert og til slutt (avhengig av omfanget av kraften), løsrevet fra brønnene. Denne avdeling oppstår når de gjenopprette (motstå) styrkene, utøves av kjernen og celle, lik sugekraft kraften fra brønnene. Analyse kan utføres ved å måle forskyvning av kjernen, lang stamme (formel 1) eller området belastningen (figur 1A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør celler for Imaging
Merk: Direkte force sonden (DFP) kan brukes for en tilhenger celle type. Her brukes NIH 3T3 musen fibroblaster som modell cellen linje for denne protokollen.
- Kultur NIH 3T3 fibroblast celler i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 10% donor bovin serum og 1% Penicillin-Streptomycin på en 35 mm glass bunn rett til ønsket confluency. Opprettholde cellene på 37 ° C og 5% CO2.
- Husk å coat alle 35 mm glass bunn retter med 5 µg/mL fibronectin (eller lignende ECM protein), før såing NIH 3T3 celler for bildebehandling.
Merk: Cellene må være fullt spre og tilhenger på parabolen for eksperimentet. Det er ikke begrensninger når det gjelder confluency for metoden DFP å arbeide.
- Husk å coat alle 35 mm glass bunn retter med 5 µg/mL fibronectin (eller lignende ECM protein), før såing NIH 3T3 celler for bildebehandling.
- Umiddelbart før eksperimentet, vask cellene to ganger med PBS etterfulgt av en enkel vask med komplett vekst medium.
- Legge til 3 mL komplett oppblomstringen medium glass bunnen rett.
2. mikroskopi og bilde
Merk: En invertert fluorescens mikroskopet (eller tilsvarende) med micromanipulator installert siden armen, i henhold til produsentens anbefalinger. Mikroskopet skal også være utstyrt med en miljømessig kammer å opprettholde temperaturen på 37 ° C og CO2 -nivå på 5%. Det kreves også en micromanipulator og microinjector knyttet til mikroskopet. En olje nedsenking 40 x / 1.3 NA eller 60 x / 1.49 NA (eller tilsvarende mål) anbefales for eksperimenter. Mikroskopet skal monteres på en vibrasjon isolasjon tabell.
Figur 1 . Kjernefysisk deformasjon og mikroskopet fokus
A. maksimal kjernefysiske deformasjon og avslapning av kjernefysiske deformasjon. Før du beregner maksimal kjernefysiske deformasjon, tilbake kantene av kjernefysiske figurene ble først falt sammen til rette for oversettelsen av deformert kjernen. Formen på kjernen i øyeblikket av brønnene tips avdeling ble plassert på den kjernefysiske formen før dra. Forskjellen i området mellom de to figurene ble målt som Δ1. Maksimal kjernefysiske deformasjon ble definert som ΔA1 delt opprinnelige kjernefysiske området. Tilsvarende en andre parameter, ΔA2, kan defineres ved å legge siste steady state kjernefysiske figuren etter brønnene avdeling på kjernefysiske originalfiguren. B. fokusere cellen på plan A, og flytt deretter fokalplanet til planet B å finne brønnene spissen. Under bildebehandling, ble brønnene oversatt til høyre (oransje pilens retning). Dette tallet er endret fra Neelam et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Slå på microinjector per produsentens protokollen.
- Bruker en nedsenkning olje dropper, bruke en eneste dråpe neddyppingsolje på linsen.
- Klemme parabolen tett inn i rett-holderen og belaste retten holderen på scenen.
Merk: Cellene må opprettholdes på 37 ° C og 5% CO2 hele eksperimentet. - Juste høyden på som mål å bringe cellene i fokus (plan A, figur 1B).
- Flytte mikroskop scenen for å finne en celle rundt.
- Rotere styrespaken på micromanipulator å flytte Pipetter abonnenten til topplassering. Last 0,5 µm diameter tips brønnene på Pipetter abonnenten.
- For å unngå celle vedheft til brønnene, pre-spandere brønnene spissen med 0,3 mg/mL PLL-g-pinne løsning for 1t ved romtemperatur. Teste vedheft ved å berøre brønnene til kjernen uten noen inntaks press, og deretter oversette brønnene fra kjernen. Fravær av vedheft kan skjelnes fra en fullstendig mangel på kjernefysiske deformasjon og oversettelse.
Merk: Følg produksjon forslag å åpne pakken.
- For å unngå celle vedheft til brønnene, pre-spandere brønnene spissen med 0,3 mg/mL PLL-g-pinne løsning for 1t ved romtemperatur. Teste vedheft ved å berøre brønnene til kjernen uten noen inntaks press, og deretter oversette brønnene fra kjernen. Fravær av vedheft kan skjelnes fra en fullstendig mangel på kjernefysiske deformasjon og oversettelse.
- Heve objektive fokalplanet over flyet A og toppen av cellen plan b ved å justere mulighetene (figur 1B, se trinn 2.4).
- Angi micromanipulator som grov styrer. Sakte bringe brønnene ned flyet B ved å se silhuetten av brønnene, før brønnene kommer fullt ut i fokus.
- Når brønnene spissen er i fokus, kan du angi micromanipulator for bedre kontroll.
- Senk målet på ekvator planet i cellen (plan A, figur 1B) og lavere brønnene til rundt 15 µm over flyet A (figur 1B, stiplet brønnene).
- Angi kompensasjon trykket (Pc) på microinjector til ønsket press; Vent noen sekunder til press for å stabilisere.
Merk: Settpunkt optimalt press avhenger både celle type og spesifikke mål av eksperimentet. For de fleste tilfeller ville 300 hPa være et godt utgangspunkt. - Kontroller at brønnene ikke er tett ved å bruke innstillingen rene i micromanipulator-panelet og kontrollerer at luftbobler dukke fra brønnene spissen.
- Stikk inn i cellen ved å gradvis redusere brønnene til spissen lett berører kjernefysiske overflaten.
Merk: Når senking av brønnene, silhuetten av brønnene spissen vil bli klart som det kommer i fokus. Før brønnene berører kjernen, heve objektive fokus og justere brønnene spissen med kjernen (samme XY koordinatsystem, høyere z-fly). Redusere brønnene spissen hjem fokus tilbake til ekvator flyet av kjernen (plan A, figur 1B). - Opprette en forsegling mellom brønnene spissen og de kjernefysiske membranen av press-forsyning røret Frakople microinjection systemet, og dermed åpne slutten av brønnene røret til atmosfæren. Dette trinnet oppretter en negative trykket lik Pc på kjernefysiske overflaten.
- Hente bilder med mikroskop bildet samling programvare. Sette opp en avi-kjøp (video) eller nd kjøp (bilder) i bildet samling programvare.
Merk: For noen imaging anskaffe programvare, satt opp sanntid video avbildning eller time-lapse bilde oppkjøp med et kort tidsintervall. - Veksle til den tilsvarende fluorescerende imaging kanal (dvs. GFP, RFP, etc.) og begynne bildebehandling.
- Oversette brønnene tipset fra selve cellen (til høyre, figur 1B) til kjernen løsner fra brønnene.
Merk: Dra spissen positiv x-retning (til høyre i synsfeltet). Dra hastigheten kan programmert og kontrolleres av datamaskinen eller styrespaken kan flyttes manuelt. Vi har ikke funnet noen sammenheng mellom trekke rate og kjernefysiske deformasjon15 foreslå et primært elastisk Svar å tvinge.
3. dataanalyse
- Utføre bildeanalyser med grunnleggende bildebehandling programvare tilgjengelig. Omfanget av kjernefysiske deformasjon kan kvantifiseres lang stamme (Ɛ) eller området belastningen (figur 1A). Kvantifisere lang stamme med formel 1, der L og L0 representerer lengden på kjernen på maksimal deformasjon og utgangsposisjon, henholdsvis.
(Formel 1)
(Formel 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A viser tvang av en NIH 3T3 musen fibroblast kjernen. Brønnene spissen er oversatt til høyre, kjernen deformerer og til slutt løsner fra brønnene spissen. Lengde belastningen av kjernen er sett å øke med økende sugekraft force (figur 2B). Fronten av kjernen (brønnene dra kanten) danner en kjernefysisk protrusion og den etterfølgende kanten er fordrevet fra sin opprinnelige posisjon. Lengden på protrusion er mye større enn etterfølgende kanten forskyvning (figur 2C), tyder på en tett integrering mellom kjernen og omkringliggende cytoplasma. Tidsskalaer er forkortelse for avslapning av kjernefysiske stolpen (< 1 s), og den kjernefysiske bakkant (< 2 s) (figur 2D).
Figur 2 . Karakteristikk av kjernefysiske deformasjon
Deformasjon og forskyvning av kjernen i en levende, tilhenger celle ved DFP. En NIH 3T3 fibroblast kjerne ble trukket med 6 nN kraft. Bildene viser kjernefysiske figuren på den angitte tiden. Skala bar: 5 µm B. kjernefysiske deformasjon ble kvantifisert ved lang stamme. Kjernefysisk deformasjon økt med anvendt styrker. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt (SEM); n > 6. C. forskyvning i forkant er større enn forskyvning på etterfølgende kanten. D. lengde belastning avslapning er mye raskere enn bakkant avslapning. P < 0,05; feilfelt viser SEM; n = 10. Dette tallet er endret fra Neelam et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vi har brukt DFP metoden for å avgjøre hvordan cellen cytoskjelett styrker bidra til kjernefysiske motstand mot deformasjon i cellen. Mens ingen betydelige forskjeller i kjernefysiske deformasjon eller oversettelse ble funnet etter F-utgangen (ved cytochalasin-D) eller microtubule avbrudd (av nocodazole), resulterte redusere vimentin uttrykk gjennom siRNA-baserte knockdown i betydelig større kjernefysisk oversettelsen og deformasjon (Figur 3). Dette tyder på at vimentin intermediære filamenter i fibroblaster er hovedelementet cellen cytoskjelett som kjernen motstå lokale kraft.
Figur 3 . Fluorescerende bilder av kjernefysiske deformasjon
DFP ble brukt til å finne ut bidrag av cellen cytoskjelett styrker til kjernefysiske deformasjon. Kjernen var farget med SYTO 59 fargestoff. Fluorescerende bildene viser overlegg av kjernen før (rød, pseudo farge) og etter (grønn, pseudo fargen) på den angitte betingelsen. CTRL, kontroll celler. CYTO-D, cellene behandles med cytochalasin-D; NOC, cellene behandles med nocodazole; SCRAM, celler transfekterte med stekte siRNA; Vim siRNA, celler transfekterte med siRNA målretting vimentin. Dette tallet er endret fra Neelam et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måle mekanisk integrering av kjernen med cytoskeleton er en utfordring for nyeste metoder, for eksempel brønnene aspirasjon16, fordi de krever enten isolert kjerner (der kjernen er avparet fra cytoskeleton) eller kjerner i suspendert celler (der ekstracellulære styrker, som trekkraft styrker, er fraværende). Force utlignet til kjernen ved å bruke biaxial belastning celler tilhenger til en membran17,18; men er denne teknikken begrenset av det faktum at på kjernen er ukjent. Atomic force mikroskopi (AFM) sonder har blitt brukt til å rykke inn kjernen i intakt celler. disse tilbud fordelen at avslører de mekaniske egenskaper for kjernen mens den er integrert med cytoskeleton. For å legge til eksisterende i vivo teknikker for å karakterisere kjernen12,13,14, har vi utviklet en enkel og robust metode å mekanisk undersøke kjernen i en levende tilhenger celle mens det er integrert til omkringliggende cytoskjelett. Et særtrekk ved denne teknikken er at styrken på kjernen er nettopp kjent og kontrollert.
Ved bruk av DFP, anslår vi at nano-newton skala styrker er tilstrekkelig å deformere og oversette kjernen i levende, tilhenger celler. Videre gjennom systematiske studier av bidrag av ulike cellen cytoskjelett elementer, har vi funnet at vimentin-baserte intermediære filamenter er den primære delen av mobilnettet cytoskeleton ansvarlig for stiffening kjernen i cellen 15.
Noen begrensninger gjelder med disse eksperimentene. Det er viktig å regelmessig sjekk brønnene spissen for tilstopping eller brudd under eksperimenter, som begge tilstopping av brønnene eller brudd i spissen vil forårsake ukjent endringer inntaks press på cellen. For å sjekk hvis brønnene er tett, kan du bruke innstillingen Clean på manipulatoren bruke maksimalt trykk og sjekk for luftbobler fremvoksende fra brønnene spissen. Hvis brønnene er ødelagt eller brukket, erstatte brønnene før du starter neste eksperimentet. Det er også viktig å bekrefte at kjernefysisk belastningen varierer med makt, og null på null kraft (se Neelam et al. 15). Hvis dette ikke er observert i eksperimenter, så det er mulig at ikke-spesifikke vedheft mellom brønnene spissen og kjernefysiske overflaten (til tross for behandling med PLL-pinne) kan være ansvarlig for kjernefysisk deformasjon. En annen begrensning av teknikken er at innsetting av av brønnene i formelcellen kan forårsake noen lokale avbrudd av cellen cytoskjelett strukturer.
Det er nyttig å teste sammenhenger mellom omfanget av kjernefysiske deformasjon/oversettelse og overføringshastighet. Et fravær av sammenhengen ville innebære en hovedsakelig elastisk motstand. Dette er faktisk hva vi har funnet for å være tilfelle for fibroblast kjerner15. Mens styrken på kjernen er kjent, tillater ikke metoden beregningen av parametere som den unge modulus. Vi har først og fremst brukt det for å dissekere bidrag av cellulære strukturer til motstanden mot kjernefysiske deformasjon og oversettelse i cellen. Mens vi har rapportert todimensjonale kjernefysiske figurer15,19, kan det være nyttig å kvantifisere full tredimensjonal form av kjernen under kraft.
Suge-press i brønnene er kjent, men den er større enn det faktiske trykket på kjernefysiske overflaten forfaller å flyte av vann gjennom porene10. Men har vi vist at motstanden mot strømme gjennom kjernefysiske porene er mye større gjennom brønnene (se støtteinformasjon for beregninger i Neelam et al. 15) for rimelig membran permeabilities og brønnene dimensjoner. Derfor bør presset på ytre membran overflaten være lik inntaks press til tross for eksistensen av flyt.
Avslutningsvis tillater i DFP brukeren å kvantifisere mekanisk svaret i integrert kjerne-cytoskeleton i en tilhenger celle en kjent og kontrollert kraft. Denne metoden kan brukes til å analysere bidrag av molekylære komponenter i kjernen og i cytoplasma i mekanisk virkemåten til kjernen i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
