Summary
En este protocolo, se describe un método de la micropipeta para aplicar directamente una fuerza controlada al núcleo en una célula viva. Este ensayo permite interrogatorio de nucleares propiedades mecánicas en la célula viva, adherente.
Abstract
Las propiedades mecánicas del núcleo determinan su respuesta a fuerzas mecánicas generadas en las células. Porque el núcleo es molecularmente continuo con el citoesqueleto, se necesitan métodos para sondear su comportamiento mecánico en las células adherentes. Aquí, discutimos la sonda fuerza directa (DFP) como una herramienta para aplicar la fuerza directamente al núcleo en una célula adherente de viva. Atribuimos una micropipeta estrecha a la superficie nuclear con la succión. La micropipeta es traducida fuera del núcleo, que hace que el núcleo se deforman y traducir. Cuando la fuerza restauradora es igual a la fuerza de succión, el núcleo se separa y elásticamente se relaja. Porque precisamente se conoce la presión de succión, se conoce la fuerza en la superficie nuclear. Este método ha revelado que las fuerzas de la nano-escala son suficientes para deformar y traducir el núcleo de las células adherentes e identificaron elementos citoesqueléticos que permiten el núcleo resistir las fuerzas. El DFP puede utilizarse para analizar las contribuciones de los componentes celulares y nucleares para propiedades mecánicas nucleares en las células vivas.
Introduction
Patologías como el cáncer implican alteraciones nuclear forma y estructura1,2, que generalmente están acompañados por una descalcificación de los núcleo3,4. Nuclear resistencia a la deformación mecánica se ha caracterizado generalmente por aplicación de una fuerza en núcleos aislados5.
El núcleo en las células está conectado molecularmente con el citoesqueleto por el vinculador del nucleoesqueleto y citoesqueleto (LINC) complejo6,7,8,9. Como resultado, el núcleo está integrado mecánicamente con el citoesqueleto y, a través de adherencias de sustrato celular, la matriz extracelular. Mecánicamente el núcleo interior de las células adherentes de sondeo puede proporcionar la penetración en esta integración mecánica. Los métodos para manipular los núcleos en las células vivas incluyen micropipeta aspiración10,11y microscopía de fuerza atómica12,13,14. Recientemente hemos descrito un sondeo de la fuerza directa (DFP) que aplica fuerzas mecánicas directamente sobre el núcleo de una vida celular adherente15.
Aquí describiremos el procedimiento para utilizar un sistema de microinyección que está comúnmente disponible en las instalaciones de microscopía para aplicar una fuerza mecánica de nano-escala conocida, directamente al núcleo en una célula adherente. Un femtotip (punta de micropipeta del diámetro del μm 0,5) es montado y conectado al sistema de microinyección por un tubo. La punta, colocada en un ángulo de 45° con respecto a la superficie de la placa de cultivo, se baja hasta adyacente a la superficie nuclear. El tubo entonces se desconecta y abierto a la atmósfera, que crea una presión negativa de succión en la superficie nuclear y sella la punta de la micropipeta contra la superficie nuclear. A través de la traducción de la punta de una micropipeta, el núcleo es deforme y eventualmente (dependiendo de la magnitud de fuerza aplicada), separado de la micropipeta. Esta separación se produce cuando las fuerzas de restauración (resistencia), ejercidas por el núcleo y la célula, igualan a la fuerza de la succión aplicada por la micropipeta. Análisis se pueden realizar midiendo el desplazamiento del núcleo, la cepa de longitud (ecuación 1), o la deformación de la zona (figura 1A).
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Protocol
1. preparar las células para la proyección de imagen
Nota: La punta de prueba de fuerza directa (DFP) se puede utilizar para cualquier tipo de células adherentes. Aquí, fibroblastos de ratón 3T3 NIH se utilizan como la línea celular de modelo para este protocolo.
- Células de fibroblastos 3T3 NIH la cultura en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino de donante y 1% de penicilina-estreptomicina en un fondo de cristal de 35 mm plato hasta confluencia deseada. Mantener las células a 37 ° C y 5% CO2.
- Asegúrese de cubrir todos platos de fondo de cristal de 35 mm con 5 μg/mL de fibronectina (o proteína similar de ECM), antes de sembrar las células 3T3 de NIH para la proyección de imagen.
Nota: Las células deben ser completamente extendidas y adherente en el plato para el experimento. No hay restricciones en cuanto a la confluencia del método DFP trabajar.
- Asegúrese de cubrir todos platos de fondo de cristal de 35 mm con 5 μg/mL de fibronectina (o proteína similar de ECM), antes de sembrar las células 3T3 de NIH para la proyección de imagen.
- Inmediatamente antes del experimento, se lavan las células dos veces con PBS, seguido de un lavado solo con medio de cultivo completo.
- Añadir 3 mL de medio de cultivo completo en el plato de fondo de vidrio.
2. microscopia y adquisición de imágenes
Nota: Un invertido fluorescencia microscopio (o equivalente) con instrumental quirúrgico instalado en el brazo lateral, según las recomendaciones del fabricante. El microscopio también debe ser equipado con una cámara de medio ambiente para mantener la temperatura a 37 ° C y el nivel de CO2 al 5%. También se requiere un instrumental quirúrgico y microinyector conectado al microscopio. Una inmersión de aceite 40 x / 1.3 NA o 60 x / 1.49 NA (u objetivos equivalentes) se recomiendan para los experimentos. El microscopio debe montarse sobre una tabla de aislamiento de vibración.
Figura 1 . Deformación nuclear y enfoque del microscopio
A. máxima deformación nuclear y relajación de la deformación nuclear. Antes de calcular la máxima deformación nuclear, los bordes posteriores de las formas nucleares fueron primero coincidió para corregir para la traducción de núcleo deformado. La forma del núcleo en el momento de desprendimiento de la punta de una micropipeta se superpuestos en la forma nuclear inicial antes de tirar. Se midió la diferencia de área entre las dos formas como ΔA1. La máxima deformación nuclear se define como ΔA1 dividido por el área nuclear original. Del mismo modo, un segundo parámetro, ΔA2, puede ser definido por la superposición de la forma nuclear de estado estacionario final después del desprendimiento de la micropipeta en la forma nuclear original. B. centrar el celular en el plano A y luego mover el plano focal hasta plano B para encontrar la punta de la micropipeta. Durante la proyección de imagen, la micropipeta fue traducida a la derecha (dirección de la flecha naranja). Esta figura ha sido modificada de Neelam et al. 15. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Encienda la microinyectora según el protocolo del fabricante.
- Utilizando un gotero de aceite de inmersión, aplique una sola gota de aceite de inmersión sobre la lente del objetivo.
- Sujete el plato firmemente en el soporte del plato y el soporte de plato en la etapa de carga.
Nota: Las células deben mantenerse a 37 ° C y 5% de CO2 durante todo el experimento. - Ajuste la altura del objetivo para traer las células en el foco (A plano, figura 1B).
- Mover la platina del microscopio para encontrar una célula de interés.
- Gire la palanca de mando en el micromanipulador para mover el soporte de la pipeta a la posición superior. Carga de la micropipeta de punta de 0,5 μm de diámetro en el soporte de pipeta.
- Para evitar la adherencia de la célula a la micropipeta, tratamiento previo de la punta de la micropipeta con 0,3 mg/mL solución de PLL-g-PEG durante 1 h a temperatura ambiente. Prueba de adherencia tocando la micropipeta al núcleo sin ninguna presión de succión, y luego traducir la micropipeta lejos del núcleo. La falta de adherencia se puede discernir de una completa falta de deformación nuclear y traducción.
Nota: Por favor, siga las sugerencias de la fabricación para abrir el paquete.
- Para evitar la adherencia de la célula a la micropipeta, tratamiento previo de la punta de la micropipeta con 0,3 mg/mL solución de PLL-g-PEG durante 1 h a temperatura ambiente. Prueba de adherencia tocando la micropipeta al núcleo sin ninguna presión de succión, y luego traducir la micropipeta lejos del núcleo. La falta de adherencia se puede discernir de una completa falta de deformación nuclear y traducción.
- Levantar el plano focal objetivo sobre el plano A y la parte superior de la celda al plano B ajustando el control de estabilidad (figura 1B, consulte el paso 2.4).
- Establezca el instrumental quirúrgico para controlar el grueso . Lentamente llevar la micropipeta hasta plano B observando la silueta de la micropipeta, hasta que la micropipeta se quede totalmente enfocada.
- Una vez que la punta de la micropipeta está en foco, establezca el micromanipulador para controlar bien .
- Bajar el objetivo para el plano ecuatorial de la célula (plano A, figura 1B) y baje la micropipeta a alrededor de 15 μm sobre plano A (figura 1B, micropipeta discontinua).
- Ajuste la presión de compensación (Pc) en la microinyectora a presión deseada; Espere unos segundos para estabilizar la presión.
Nota: El punto de ajuste de la presión óptima depende de tipo de la célula y los objetivos específicos del experimento. Para la mayoría de los casos, 300 hPa sería un buen punto de partida. - Asegúrese de que no esté obstruida la micropipeta utilizando el ajuste de limpiar en el panel de instrumental quirúrgico y comprobación para asegurarse de que las burbujas de aire surgen desde la punta de la micropipeta.
- Inserte la punta en la célula reduciendo gradualmente la micropipeta hasta que la punta es tocar ligeramente la superficie nuclear.
Nota: Al bajar la micropipeta, la silueta de la punta de la micropipeta se convertirá en clara ya que viene en foco. Antes de la micropipeta toca el núcleo, aumentar el foco objetivo y alinear la punta de la micropipeta con núcleo (misma coordenada de x-y, z-plano superior). Volver la atención hacia el plano ecuatorial del núcleo (A plano, figura 1B) y poco a poco baje la punta de la micropipeta. - Desconectar el tubo de suministro de presión del sistema de microinyección, abriendo así el extremo del tubo una micropipeta a la atmósfera para crear un sello entre la punta de la micropipeta y la membrana nuclear. Este paso crea una presión negativa igual a Pc en la superficie nuclear.
- Adquisición de imágenes con el software de colección de imágenes de microscopios. Establezca una adquisición de avi (video) o nd-adquisición (imágenes) en el software de colección de la imagen.
Nota: Para cualquier adquisición de software de imágenes, crear imágenes de video en tiempo real o adquisiciones de Time-lapse de imágenes con un intervalo de tiempo corto. - Alternar al fluorescente correspondiente canal la proyección de imagen (es decir, GFP, RFP, etc.) y comienza la proyección de imagen.
- Traducir la punta de la micropipeta lejos del cuerpo de la célula (a la derecha, figura 1B) hasta que el núcleo se desprende de la micropipeta.
Nota: Tire de la punta a lo largo de la dirección de x positiva (a la derecha en el campo de visión). El tipo de tracción puede ser programado y controlado por la computadora o el joystick puede ser movido manualmente. No hemos encontrado ninguna correlación entre la tracción velocidad y deformación nuclear15 sugiriendo una respuesta elástica principalmente a la fuerza.
3. Análisis de los datos
- Realizar análisis de imagen con cualquier software de procesamiento de imágenes básica disponible. El grado de deformación nuclear puede cuantificarse por la cepa de longitud (Ɛ) o la deformación de la zona (figura 1A). Cuantificar la tensión longitud utilizando la ecuación 1, donde L y L0 representan las longitudes del núcleo de deformación máxima y la posición inicial, respectivamente.
(Ecuación 1)
(Ecuación 1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 2A muestra el forzamiento de un núcleo de fibroblasto de ratón NIH 3T3. Como la punta de la micropipeta es traducida a la derecha, el núcleo se deforma y finalmente se separa de la punta de la micropipeta. La tensión de la longitud del núcleo se considera que aumentan con el aumento de fuerza de la succión (figura 2B). El borde delantero del núcleo (micropipeta tirando borde) forma una protuberancia nuclear y el borde de fuga es desplazado de su posición original. La longitud de la protuberancia es mucho mayor que el desplazamiento del borde de salida (figura 2), sugiriendo una estrecha integración entre el núcleo y el citoplasma circundante. Las escalas de tiempo están corto para relajación de la parte delantera nuclear (< 1 s) y el borde trasero nuclear (< 2 s) (Figura 2D).
Figura 2 . Caracterización de la deformación Nuclear
Deformación y desplazamiento del núcleo en una célula viva, adherente por el DFP. Un núcleo de fibroblastos 3T3 NIH fue tirado con fuerza 6 de nN. Las imágenes muestran la forma nuclear en el momento indicado. Barra de escala: 5 μm Nuclear B. deformación se cuantificó por la tensión de la longitud. La deformación nuclear aumentó con fuerzas aplicadas. Barras de error indican el error estándar de la media (SEM); n > 6. C. el desplazamiento en el borde de ataque es mayor que el desplazamiento en el borde de fuga. D. la relajación de la tensión de longitud es mucho más rápida que la relajación de la parte trasera. P < 0.05; barras de error indican SEM; n = 10. Esta figura ha sido modificada de Neelam et al. 15. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Hemos utilizado el método DFP para determinar fuerzas como citoesqueleto contribuyen a nuclear resistencia a la deformación en la célula. Mientras que no hubo diferencias significativas en deformación nuclear o traducción fueron encontrados después de la F-actina (por la Citocalasina-D) o alteración de microtúbulos (por nocodazole), reducción de la expresión de vimentina a través de siRNA basado en caída resultó en significativamente mayor traducción de nuclear y de la deformación (figura 3). Esto sugiere que filamentos intermedios de vimentina en los fibroblastos son el principal elemento citoesqueleto que el núcleo Ayude a resistir la fuerza local.
Figura 3 . Imágenes fluorescentes de la deformación Nuclear
DFP se utilizó para determinar la contribución de fuerzas citoesqueleto nuclear deformación. El núcleo fue teñido con tinte de SYTO 59. Imágenes fluorescentes muestran el recubrimiento del núcleo antes de (color rojo, pseudo) y después (verde, pseudo color) en la condición indicada. CTRL, células de control; CYTO-D, las células tratadas con Citocalasina D; NOC, las células tratadas con nocodazole; SCRAM, las células transfected con siRNA codificado; siRNA de VIM, las células transfected con siRNA contra vimentin. Esta figura ha sido modificada de Neelam et al. 15. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Medición de la integración mecánica del núcleo con el citoesqueleto es un reto para métodos más actuales, como la micropipeta aspiración16, porque requieren cualquiera de los dos núcleos aislados (donde el núcleo es desacoplado de citoesqueleto) o núcleos en células suspendidas (donde están ausentes las fuerzas extracelulares, tales como las fuerzas de tracción,). Fuerza se ha aplicado al núcleo mediante la aplicación de tensión biaxial a adherente de las células a una membrana17,18; sin embargo, esta técnica está limitada por el hecho de que la fuerza en el núcleo es desconocida. Fuerza atómica (AFM) la microscopia sondas se han utilizado para aplicar una sangría el núcleo en las células intactas; Estos ofrecen la ventaja que muestran las propiedades mecánicas del núcleo mientras que está integrada con el citoesqueleto. Para añadir a las existentes en vivo técnicas para caracterizar el núcleo12,13,14, hemos desarrollado un método simple y robusto a prueba mecánicamente el núcleo en una célula adherente viva mientras se mantiene integrado para el citoesqueleto circundante. Una característica clave de esta técnica es que la fuerza en el núcleo es precisamente conocida y controlada.
Aplicando el DFP, estimamos que newton nano escala fuerzas son suficientes para deformar y traducir el núcleo en las células vivas, adherentes. Además, a través de estudios sistemáticos de las contribuciones de diversos elementos citoesqueléticos, hemos encontrado que los filamentos intermedios de vimentina-basado son el componente principal del citoesqueleto celular responsable de la rigidez del núcleo en la célula 15.
Algunas advertencias aplican con estos experimentos. Es importante revisar regularmente la punta de la micropipeta para obstrucción o rotura durante los experimentos, ya que ambas obstrucciones de la micropipeta o fractura de la punta desconocidos cambios en la presión de succión aplicada a la célula. Para comprobar si está obstruida la micropipeta, utilice el ajuste de limpiar en el manipulador para aplicar presión máxima y busque las burbujas de aire saliendo de la punta de la micropipeta. Si la punta de la micropipeta es rota o fracturada, vuelva a colocar la micropipeta antes de comenzar el experimento siguiente. Además, es importante confirmar que la tensión nuclear varía con la fuerza y es cero en el cero fuerza (ver Neelam et al. 15). Si esto no se observa en los experimentos, entonces es posible que la adherencia no específica entre la punta de la micropipeta y la superficie nuclear (a pesar del tratamiento con PEG de PLL) puede ser responsable de la deformación nuclear. Otra limitación de la técnica es que la inserción de la micropipeta en la célula sí mismo puede causar algunos trastornos locales de estructuras citoesqueléticas.
Es útil probar las correlaciones entre el grado de deformación nuclear, traducción y tasa de carga. Una ausencia de correlación implicaría una resistencia fundamentalmente elástica. De hecho, esto es lo que hemos encontrado para ser el caso de núcleos de fibroblastos15. Aunque se conoce la fuerza en el núcleo, el método no permite el cálculo de parámetros como el módulo de Young. Principalmente se han utilizado para disecar las contribuciones de las estructuras celulares para la resistencia a la deformación nuclear y traducción en la célula. Si bien hemos informado formas bidimensionales nuclear15,19, puede ser útil cuantificar la forma tridimensional completa del núcleo bajo fuerza.
La presión de succión en la micropipeta es conocida, pero es más grande que la presión real aplicada al nuclear superficial debido al flujo de agua a través de los poros del10. Sin embargo, hemos demostrado que la resistencia al flujo a través de los poros nucleares es mucho mayor a través de la micropipeta (ver información de apoyo para los cálculos de Neelam et al. 15) para permeabilidades razonable de membrana y las dimensiones de la micropipeta. Por lo tanto, la presión en la superficie de la membrana externa debe ser igual a la presión de aspiración a pesar de la existencia de flujo.
En conclusión, el DFP permite cuantificar la respuesta mecánica del núcleo-citoesqueleto integrado en una célula adherente a una fuerza conocida y controlada. Este método podría utilizarse para diseccionar las contribuciones de los componentes moleculares en el núcleo y el citoplasma para el comportamiento mecánico del núcleo dentro de la célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los NIH R01 EB014869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
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