Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

رصد غير تدميري التنمية القابلة للتحلل القائم على سقالة هندسيا أنسجة الأوعية الدموية باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

doi: 10.3791/58040 Published: October 3, 2018

Summary

بروتوكول خطوة بخطوة لغير تدميري وفترة طويلة رصد عملية إعادة عرض الأوعية الدموية وتدهور سقالة في الثقافة في الوقت الحقيقي القابلة للتحلل الحيوي البوليمرية المستندة إلى سقالة الأنسجة المهندسة الأوعية الدموية مع تحفيز نابض باستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية هو الموصوفة هنا.

Abstract

ومن المتوقع لتلبية الطلب المتزايد على تجاوز الشرياني هندسيا ترقيع الأوعية الدموية مع الخصائص الهيكلية والميكانيكية مشابهة للأوعية الدموية الطبيعية. وصف ديناميات النمو وعملية إعادة تشكيل للبوليمرات القابلة للتحلل القائم على سقالة هندسيا أنسجة الأوعية الدموية (تيبفس) مع تحفيز نابض أمر حاسم لهندسة الأنسجة الوعائية. تقنيات التصوير الضوئي تبرز بوصفها أدوات فعالة لرصد الأوعية الدموية لهندسة الأنسجة مما يتيح التصوير عالي الدقة في الثقافة في الوقت الحقيقي. يوضح هذه الورقة التصوير استراتيجية لرصد النمو غير تدميري وسريعة في الوقت الحقيقي وإعادة عرض من تيبفس في ثقافة طويلة الأجل باستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT). يتم تقييم التشكل الهندسي، بما في ذلك عملية إعادة تشكيل الأوعية الدموية، وسمك الجدار، ومقارنة لسمك تيبف في نقاط زمنية مختلفة الثقافة ووجود التحفيز نابض. وأخيراً، توفر الإمكانيات العملية للمراقبة في الوقت الحقيقي من تدهور البوليمر في إعادة بناء الأنسجة تحت التحفيز نابض أكتوبر أو لا وفي كل قطعة من السفينة، بالمقارنة مع تقييم استخدام البوليمر تدهور مسح microscopic(SEM) إلكترون ومجهر مستقطب.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إجراء هندسة عكسية أنسجة الأوعية الدموية (تيبفس) من المواد الواعدة كوسيلة مثالية الاختلاس الأوعية الدموية1. بغية وضع الطعوم سريرياً مفيدة مع الخصائص الهيكلية والوظيفية المماثلة كسفن الأصلي، قد صممت تقنيات متعددة للحفاظ على وظيفة الأوعية الدموية2،3. رغم أنه كانت هناك سفن هندسيا مع معدلات مقبولة سالكيه خلال غرس وفي "المرحلة الثالثة من" الدراسة السريرية4، ثقافة طويلة الأجل وعالية التكلفة أيضا إظهار ضرورة رصد تطور تيبفس. فهم عمليات النمو ويعيد البناء، والتكيف matrix(ECM) خارج الخلية في تيبفس في البيئة الميكانيكية والكيماوي المحاكاة البيولوجية يمكن أن توفر معلومات حيوية لتطوير هندسة الأنسجة الوعائية.

ينبغي أن تكون استراتيجية مثالية تتبع تطور سفن المهندسة الصغيرة قطرها5 غير تدميري، عقيمة، والطولي، ثلاثي الأبعاد والكمية. ويمكن تقييم تيبفس تحت ظروف ثقافة مختلفة بهذه الطريقة التصوير، حتى بما في ذلك التغييرات قبل وبعد زرع الأوعية الدموية. هناك حاجة إلى استراتيجيات لوصف السمات لسفن المعيشة إجراء هندسة عكسية. تسمح تقنيات التصوير الضوئي للتصور والتقدير الكمي لترسب الأنسجة والمواد الحيوية. المزايا الأخرى هي إمكانية تمكين تصوير الأنسجة العميقة وخالية من التسمية مع دقة عالية6،7. ومع ذلك، الجزيئات الخاصة بالصورة، والمعدات البصرية أقل سهولة للرصد في الوقت الحقيقي هو عائقا عمليا كبيرا، يحد من التوسع في تطبيق الفحص المجهري الضوئي غير الخطية. التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) نهج بصرية بطريقة التصوير داخل الأوعية كأداة سريرية المستخدمة على نطاق واسع لتوجيه العلاج التدخلي القلب8. في الأدب ذكر طريقة أكتوبر كوسيلة لتقييم سمك الجدار تيبفس9،10، مقترنة بطرائق التصوير الإيجابي لبحوث هندسة الأنسجة الوعائية. في حين، هندسة القوى المحركة للأوعية الدموية النمو ويعيد البناء لم يلاحظ.

في هذه المخطوطة، نحن بالتفصيل إعداد القابلة للتحلل الحيوي البوليمرية تيبفس القائم على سقالة للثقافة أربعة أسابيع. توسيع نطاق خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية الشرايين الحبل السري البشري (هواسمكس) والمصنف إلى سقالات حمض (PGA) بوليجليكوليك القابلة للتحلل مسامية في مفاعل حيوي. وتلعب الدور في ركيزة مؤقتة لهندسة الأنسجة البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي بعض تدهور معدل11. بغية ضمان تطابق مناسبة بين تدهور سقالة وتشكيل النسيج الجدد، السقالات إدارة المحتوى في المؤسسة والمنظمة عوامل حاسمة لفعالية إعادة عرض الأوعية الدموية. نظام التروية يحاكي المكروية النشاط الحيوي للسفن الأصلية وتحتفظ تشوه يتمشى تحت ضغط التحفيز.

وهدف البروتوكول المقدم وصف استراتيجية بسيطة نسبيا وغير تدميري تيبفس التصوير والرصد طويل الأجل للثقافة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور تغييرات الشكلية وقياسات سمك السفن هندسيا تحت ظروف ثقافة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليلات لتدهور المواد المستندة إلى البوليمر في الأنسجة الهندسة السقالات لتحديد. عن طريق الجمع بين أساليب المسح الإلكترون microscopic(SEM) والاستقطاب المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول والارتباط والتحديد الكمي لتوزيع المصفوفة خارج الخلية وتدهور الشبكة أن أمكن، التي يمكن أن تيسر تقييم سقالة تدهور جنبا إلى جنب مع تصوير OCT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. التحلل الشبكة سقالة على أساس "الثقافة سفن" هندسة الأنسجة

  1. تصنيع السقالة الشبكة
    1. خياطة شبكة البرلمانيين (19 مم وسمكه 1 مم) حول أنابيب سيليكون تعقيمها بأكسيد الإيثيلين (طول 17 سم وقطرها 5.0 مم 0.3 مم) باستخدام خياطة 5-0.
    2. خياطة تترافلوروايثيلين (ابتفي، طول 1 سم) مع خياطة 4-0 على كل نهاية لشبكة البرلمانيين وتتداخل من 2 مم.
    3. تراجع السقالات الشبكة باليد في 1 مول/لتر هيدروكسيد الصوديوم لمدة 1 دقيقة ضبط الهيكل المكاني للشبكة ونقع مع زراعة الأنسجة الصف المياه ثلاث مرات لكل 2 دقيقة. بات بلطف جاف السقالة مع ورقة الأنسجة في كل مرة. ثم تجف السقالات في غطاء مع منفاخ ح 1.
  2. الجمعية من مفاعل حيوي و Y-ملتقى لتصوير أكتوبر
    1. نقع مفاعل حيوي أسطواني الزجاج نمواً ذاتيا (قطرها 10 سم و 11.7 سم في الارتفاع مع الشفاه الأربعة داخل وأربعة أذرع جانبية خارج المفاعل كما هو مبين في الشكل رقم 1)، الشبكة السقالات، أنبوب سيليكون (القطر الخارجي 5 مم، سمك 0.3 مم)، أنابيب متوافق حيويا والموصلات، بار ضجة ومعدات للجمعية في خزان إيثانول 95% ح 2.
    2. سحب سقالة الشبكة عن طريق الأسلحة الجانبية لمفاعل حيوي متصل بجانب واحد مع موصل، فضلا عن جانب آخر مع Y-مفترق الطرق المستخدمة لتسليم أكتوبر جويديويري. تجميع سقالة الشبكة آخر في مفاعل حيوي نفس الطريقة. يرجى الرجوع إلى الشكل 1.
    3. احتواء ابتفي الشفاه مفاعل حيوي بتشديد مع خيوط 4-0.
    4. وضع في مفاعل حيوي في خزان الإيثانول مرة أخرى ح 1 وتجف بين عشية وضحاها في هود مع منفاخ في.
  3. بذر هواسمكس وتكييف مفاعل حيوي ثابت
    1. عزل هواسمكس من شرايين الحبل السري البشري عن طريق تقنيات explant القياسية.
    2. قم بتوسيع، والحفاظ على الخلايا في العضلات الملساء الخلية النمو المتوسطة تتألف من المتوسطة دميم، 20% مصل بقرى الجنين، 2.36 مغ/مل حبيس، 100 يو/مليلتر البنسلين G، 50 ميكروغرام/مل برولين، 20 ألانين ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل جليكاين، 1.5 ميكروغرام/مل CuSO4، وحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل ، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية نانوغرام/مل 10 و 10 نانوغرام/مل عامل النمو المشتقة من الصفيحات.
    3. هواسمكس البذور بتركيز × 10 56 خلايا/مل في المتوسط الثقافة أعلاه على السقالات الشبكة.
    4. وضع ضجة بار (طول 1.5 سم) مفاعل حيوي. إدراج أنبوب تغذية واحد (بقطر 5 ملم، وطول 15 سم)، وثلاثة أجزاء الأنابيب قصيرة (قطرها 5 مم، وطول 7 سم) لتبادل الغازات عن طريق غطاء سداده سيليكون.
    5. إرفاق PTFE 0.22 ميكرون المرشحات لكل أنبوب تغير الجو وكاب الهيبارين واحد لأنبوب تغذية. ضبط شريط إثارة مع التحريك بسرعة 13 طلقة في الدقيقة الواحدة. تجميع الزجاج مفاعل حيوي وغطاء سداده السيليكون وسقالة الشبكة في نظام الثقافة.
    6. السماح هواسمكس على الالتزام لمدة 45 دقيقة قبل يميل مفاعل حيوي كل 15 دقيقة مع حامل، إلى اليسار واليمين. منافذ المفاعل والمفاصل كلها مختومة مع الفيلم البارافين.
    7. الاتصال لوه-يي مضخة، حقيبة برنامج تلفزيوني، برنامج التشغيل بواسطة أنابيب متوافق حيويا كنظام التروية. افتح محرك الأقراص لملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني.
    8. مكان مفاعل حيوي عموما في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. ملء قاعة الثقافة مع 450 مل متوسط الثقافة هواسمكس.
    9. اضغط على زر إيقاف وتشغيل إيقاف الطاقة لجهاز محرك الأقراص. تنمو السقالات المصنف ضمن ثقافة ثابتة لمدة أسبوع واحد.
    10. تغيير المتوسطة الثقافة كل 3-4 أيام قبل يسفط نصف المتوسط القديم عن طريق التغذية اﻷنبوبية وإعادة الملء المفاعل بمبلغ معادل من جديد الثقافة المتوسطة.
  4. إعداد نظام التروية لتصوير أكتوبر
    1. مضخة سوائل في كيس برنامج تلفزيوني أن تعمم عن طريق أنابيب متوافق حيويا والعودة إلى الحقيبة.
    2. فتح السلطة من برنامج التشغيل وتنظيم وضع المضخة بتردد 60 نبضة في الدقيقة والإخراج systolic ضغط 120 ملم زئبق. ضبط معلمات الميكانيكية وفقا لاحتياجات زراعة الأنسجة الوعائية الهندسية.
    3. انقر فوق الزر تشغيل لجعل نظام التروية العمل. توفير التحفيز نابض ثابتة أعلاه للسفن لمدة 3 أسابيع بشكل تكراري الضغط أنابيب متوافق حيويا10،12 بعد أسبوع الثقافة ثابتة.

2-القيام بالتصوير الضوئي مع أكتوبر

  1. استخدام مصدر ضوء لضمان حل محوري 10-20µm وعمق صورة 1-2 مم لتحديد هيكل تيبف استناداً مجال التردد أكتوبر منتثر داخل الأوعية التصوير النظام9.
  2. قم بتشغيل مفتاح الطاقة وفتح برنامج التقاط الصور.
  3. قم بتوصيل الألياف البصرية التصوير القسطرة تحكم محرك الأقراص والحركية والبصرية (DOC) مع القسطرة معتكف التلقائي وظيفة.
  4. تعيين معلمات معدل اقتناء الصورة إلى 10 الإطارات في الثانية مع بسرعة انسحاب تلقائي من 10 مم/s.
  5. إرفاق القسطرة التصوير إلى تقاطع Y عن طريق كاب الهيبارين مع إبرة 18 جرام.
  6. وضع القسطرة في أنبوب السيليكون وتحديد ضيق خياطة لشبكة البرلمانيين قبل تحميل سقالة المنظمة على مفاعل حيوي.
  7. تلميح مكان القسطرة فوق المنطقة للفائدة. ضبط الجهاز الانسحاب والتحقق من جودة الصورة8.
  8. الحصول على الصور في 1، 4، 7، 10، 14، 17، 21، 28 يوما في الثقافة لكل تيبف الفردية وحفظ التسلسل مع مراقبة الوقت الحقيقي من المجهرية تيبف، بما في ذلك مورفولوجيا السطحية والبنية الداخلية وتكوينها.
  9. كرر قياس 3 مرات للحصول على قياس موثوق بها السفن هندسيا في كل مرة. التقاط سلسلة من الصور في جميع أنحاء الاختبار باستخدام برامج التقاط الصور.

3-تصوير التحليل

  1. استخدام برمجيات تحليل الصورة لقياس سمك الجدار تيبف. قم بتحديد الصورة ليتم تحليلها. انقر فوق أداة التتبع التعرف على الجانب الداخلي من تيبف من البرنامج تلقائياً ويدويًا رسم الجانب الخارجي. رسم تخطيطي لسمك سوف تظهر على الشاشة.
  2. كرر قياس 5 مرات للحصول على قياس موثوق بها من بنيات. تحليل أكتوبر أجرى من قبل اثنين من المحققين المستقلين أعمى للمعلومات التي تم الحصول عليها.

4-الحصاد تيبف وتجهيز الأنسجة

  1. فتح غطاء سداده سيليكون وضعها فوق مفاعل حيوي عند الانتهاء من الثقافة وتجاهل المتوسطة الثقافة. قم بفك ابتفي من مفاعل حيوي الشفاه وقطع أنابيب سيليكون من الجانب الخارجي من ابتفي مع المقص. حصاد تيبفس من مفاعل حيوي وقطع إلى أقسام لمسح فحص المجهر الإلكتروني.
  2. أخذ ما تبقى تيبفس ومقطعة 4 ميكرومتر سميكة المقاطع. سحب أنبوب سيليكون الداعمة وإصلاح الأجزاء مع بارافورمالدهيد 4%. أداء روتينية النسيجي تلطيخ من ماسون في تريتشرومي وسيريوس الأحمر دراسة مورفولوجية الكولاجين والشبكة10،،من1314.
  3. تقييم محتوى الشبكة والكولاجين المكون، مراقبة عينات نسيجية مع سيريوس الأحمر تلطيخ مجهر مستقطب. مخلفات الشبكة يتم تحديدها ومن الواضح من خلال إنكسار مزدوج ومنطقة بقايا يمكن قياسها كمياً على أساس مساحة مقطعية10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد يتألف من دائرة الثقافة في مفاعل حيوي ونظام التروية مع10،دورة السائل مغلقة13 (الشكل 1). القسطرة التصوير أكتوبر إدراجها في نهاية ص-التقاطع القاصي وانسحبت في أنبوب السيليكون للتصوير. كان أول من استخدم التصوير أكتوبر لتحديد هيكلية توصيف القابلة للتحلل الحيوي البوليمرية تيبفس القائم على سقالة أثناء زراعة مفاعل حيوي.

الرقم 2 وأظهرت عملية إعادة عرض الأوعية الدموية هندسيا من خلال هذه المقطعية التصوير من الأنسجة المجهرية في الوقت الحقيقي. وجرى تقييم التشكل الهندسي، بما في ذلك سمك الجدار ومحتوى الشبكة القابلة للتحلل، ومقارنة سمك تيبف في نقاط زمنية مختلفة الثقافة، فضلا عن وجود التحفيز نابض. كان ينظر اتجاه تناقص سمك والتغييرات في هندسة الأنسجة خلال الأسبوعين الأولين من ثقافة هائلة، مما يشير إلى التدهور التدريجي للشبكة الغنية بالإشارات وهيكل الأنسجة الجديدة من فضفاضة لضيق. في 21 يوما في الثقافة، شكلت المفرج بنية سلس مع المصفوفة خارج الخلية موزعة بالتساوي ومكونات الإشارة عالية تبدد معظمها. زيادة سمك الجدار تيبفس مع إشارة حتى تدريجيا بعد ثلاثة أسابيع ثقافة. إعادة عرض هذا حدث في وقت سابق والتغييرات الشكلية يتجلى أكثر وضوحاً في المجموعة الحيوية (الشكل 3). وبالتالي تمكن أكتوبر تصوير مورفولوجيا الأوعية الدموية هندسيا تصور في الموقع وفي الوقت الحقيقي أثناء فترة طويلة الثقافة.

مقارنة الرقم 4 أكتوبر الصور مع نسيجية ويرى من تيبف بعد 4 أسابيع ثقافة. تلوين ماسون 's trichrome يوضح ألياف الكولاجين التي وزعت في اتجاه معين إلى جانب بقايا الشبكة في طبقة وسائل الإعلام تصميم السفن (الشكل 4 باء). تلطيخ سيريوس الأحمر كشفت مخلفات الشبكة والكولاجين المكون باستخدام مجهر مستقطبة (الشكل 4). وقورنت المسح الإلكترون ميكروجرافس السفن هندسيا مع ضغط المجهرية مع التقييم النسيجي (الشكل 4). وأظهرت الصور أكتوبر مجتمعة، كانت الشبكة بأحجام مختلفة وهيكل الشبكة المسامية. هيكل سقالة الشبكة قد لا تغير واضح وتورم بالاتصال المباشر مع الثقافة المتوسطة في مرحلة مبكرة من الثقافة. ولكن تم تخفيض كثافة إشارة الشبكة. مكونات الشبكة وتفككت والاستعاضة عنه مع الخلايا والمصفوفة خارج الخلية. وشوهدت أجزاء أقل على مدى فترة أربعة أسابيع. الصور SEM سفن هندسيا مقطعية أظهرت تمزق الألياف إلى تمديد فترة الحضانة. وكانت المصفوفة خارج الخلية والمواد المركبة في بنية شبيهة بقرص العسل بشفافية أكثر تركيزاً وأقل.

Figure 1
الشكل 1 . التخطيطي من الأنسجة هندسة نظام الثقافة والأوعية الدموية، التي تتألف من دائرة الثقافة في مفاعل حيوي ونظام التروية لتصوير OCT. مضخة نابض توفير تدفق السائل استقرارا محاكاة المكروية النشاط الحيوي. قسطرة تصوير أكتوبر انسحبت في أنبوب سيليكون في قاعة الثقافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . هندسة المجهرية لانسجة الأوعية الدموية خلال الثقافة- وبمرور الوقت الثقافة، الغنية بإشارة الشبكة تدريجيا المتدهورة وكان هيكل الأنسجة الجديدة من فضفاضة لضيق. وقد تيبفس سلس مصفوفة خارج الخلية السطحية ووفيرة موزعة بالتساوي بعد أربعة أسابيع ثقافة. قد أظهرت عملية إعادة عرض الأوعية الدموية هندسيا من خلال الصور المقطعية في الوقت الحقيقي. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشن، جورج وآخرون. 10 سمك أنبوب سيليكون المستخدمة هنا 0.8 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . مقارنة لتغيير سمك الجدار تيبف أثناء إعادة عرض الأوعية الدموية في المجموعات الديناميكية والثابتة التي تم الحصول عليها من قياسات OCT. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشن، جورج وآخرون. 10 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . التصوير القابلة للتحلل الحيوي المستندة إلى البوليمر هندسيا أنسجة الأوعية الدموية- (أ) أكتوبر صورة تيبف بعد أربعة أسابيع ثقافة. م: متوسط الثقافة؛ S: أنبوب سيليكون؛ سمك أنبوب سيليكون المستخدمة هنا 0.8 مم. وأشار السهم الأبيض إلى تيبف. وأشار السهم الأحمر إلى جزء الشبكة. (ب (ماسون تلطيخ trichrome أثبتت ألياف الكولاجين منظمة تنظيماً جيدا جنبا إلى جنب مع المحتوى المتبقية للشبكة في طبقة وسائل الإعلام تصميم السفن. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) سيريوس الأحمر المصبوغة كشفت المنظمة المخلفات باستخدام مجهر مستقطب. يشير السهم الأخضر إلى جزء الشبكة. شريط الحجم: 100 ميكرومتر-(د) المسح الإلكترون ميكروجرافس سفينة هندسيا مع المجهرية المدمجة قد أظهرت مقارنة مع التقييم النسيجي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لإنشاء تصميم السفن مع الهيكلية والميكانيكية خصائص مماثلة لتلك التي الأصلي الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى تقصير وقت الاستخدام السريري وهو الهدف النهائي للهندسة والأوعية الدموية. تقنيات التصوير الضوئي يسمح التصور من الأنسجة المهندسة مكونات محددة الأوعية الدموية، التي لا يمكن رصد ثوابت الفردية في جميع أنحاء الطعوم الثقافة والتعرض لبيئة ثقافة دون المساس بالعقم7. في هذه المقالة، يتم فصل دائرة الثقافة من نظام التروية. ويضمن النظام نضح مستقلة نسبيا انخفاض خطر التلوث من خلال الثقافة ووضع جويديويري أكتوبر. وفي الوقت نفسه اعتمدت intraluminal هذا التصوير طريقة سهلة ورصد سلامة تيبفس في مكان مع اقتراب عالية الدقة التي وأجرت تقييما لحالة النمو تيبف عملي أكثر من الأنسجة، وبل كان يتوقع استخدامها قبل أو بعد موضع الزرع.

البروتوكول الحالي يشير إلى استراتيجية تصوير متاحة، وسريعة في الوقت الحقيقي وغير تدميري لتقييم التنمية القابلة للتحلل السفينة هندسيا المستندة إلى البوليمر استخدام OCT المستندة إلى القسطرة. من خلال مراقبة هذه العملية الدينامية، بعض العوامل الرئيسية التي تؤثر في الهندسة والأوعية الدموية، مثل التلوث أو لا مثيل لها التفاعل مواد الخلية أدت إلى خسارة الأنسجة، يمكن تمييز مع الكشف المبكر. وتشمل خطوات حاسمة لضمان فعالية البروتوكول تلفيق سقالة المنظمة تعديل هيدروكسيد الصوديوم، نجاح البذر من هواسمكس في السقالة ونظام فصل الثقافة العقيمة من نظام الرصد، سريعة وعملية عملية القسطرة المهرة .

ويمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم تدهور الدول والبنية المعقدة للمنظمة السقالات المخلوطة مع أنسجة جديدة. سقالة البوليمرية مع هيكل الشبكة المسامية ويتحلل تدريجيا وتسيطر على عملية إعادة عرض الأوعية الدموية في الأسابيع الثلاثة الأولى، وهامة لالتصاق الخلية وترسب المصفوفة خارج الخلية بهيكل من ثلاثة أبعاد تبادل المغذيات كإشارة الناقل15،16. للتحديد الكمي لمخلفات المنظمة في تصميم السفن بوضوح قبل سيريوس الصور الملطخة بالأحمر، واستخدام المجاهر الاستقطاب17 في الهندسة الأوعية القابلة للتحلل القائم على سقالة له إمكانية أن يصبح التقييم القياسية بعد زراعة. ومن ثم يمكن تصوير أكتوبر جنبا إلى جنب مع مجهر مستقطب بمثابة الأساليب الكمية والنوعية لتقييم تدهور الشبكة في الهندسة والأوعية الدموية.

وجود قيود على هذا الأسلوب هو حد القرار لتقييم التفاعل خلية انتشار وتوزيع وخلية خلية والخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة خلال إعادة عرض الأوعية الدموية هندسيا. ونأمل أن يجد طريقة مناسبة للتحقيق في تيبفس المجهرية على المستوى الخلوي أو سوبسيلولار18 وتحديدها كمياً حركية النمو. مع التحليل الكمي للإشارات الضوئية متوسط لتصوير OCT، قد نكون أكثر إدراكا للآلية للتدهور المادي في الهندسة والأوعية الدموية. يجري النظر في مثل هذه التجارب لدراساتنا المستقبلية.

عموما، نتائجنا تظهر أن أكتوبر التصوير استراتيجية لرصد النمو متاحة، وسريعة في الوقت الحقيقي وغير تدميري ويعيد البناء من تيبفس. أنها تستخدم لوصف السمات الهيكلية المعمارية وعملية يعيد البناء طويلة الأجل سفن هندسيا. قد يكون من المفيد لتقييم تدهور سقالة جنبا إلى جنب مع تصوير أكتوبر تطبيق مجهر الاستقطاب الذي قدم أدلة تكميلية للتحديد الكمي لمخلفات البوليمرية في تصميم السفن. أخذت معا، البروتوكول الحالي يحمل قيمة واعدة من أكتوبر لتطبيقه في هندسة الأنسجة الوعائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونود أن نعترف بالعلم والتكنولوجيا مشروع التخطيط "مقاطعة قوانغدونغ الصينية" (2016B070701007) لدعم هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PGA mesh Synthecon
silicone tube Cole Parmer
connector Cole Parmer
intravascular OCT system St. Jude Medical, Inc ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic Philips FEI Philips XL-30
polarized microscope Olympus Olympus BX51
sutures Johnson & Johnson
pulsatile pump Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software St. Jude Medical, Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
  2. Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
  3. Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
  4. Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
  5. Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
  6. Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
  7. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 3335-3339 (2010).
  8. Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
  9. Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
  10. Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
  11. Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
  12. Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
  13. Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
  14. Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
  15. Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
  16. Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
  17. Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
  18. Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).
رصد غير تدميري التنمية القابلة للتحلل القائم على سقالة هندسيا أنسجة الأوعية الدموية باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).More

Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter