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Bioengineering

Contrôles non destructifs suivi du développement de dégradable axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins à l’aide de la tomographie à cohérence optique

doi: 10.3791/58040 Published: October 3, 2018

Summary

Un protocole étape par étape pour les essais non destructifs et longue période suivi le processus de remodelage vasculaire et la dégradation de l’échafaudage en culture en temps réel de biodégradables polymériques axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins avec stimulation pulsatile à l’aide de la tomographie par cohérence optique est décrite ici.

Abstract

Ingénierie des greffons vasculaires aux propriétés structurelles et mécaniques similaires à des vaisseaux sanguins naturels sont censés satisfaire la demande croissante de pontage artériel. Caractérisation de la dynamique de croissance et le processus de remodelage des polymères dégradables axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins (TEBVs) avec une stimulation pulsatile sont cruciales pour l’ingénierie des tissus vasculaires. Les techniques d’imagerie optiques se démarquent comme de puissants outils pour surveiller la vascularisation du tissu machiné permettant l’imagerie haute résolution en culture en temps réel. Cet article démontre une non destructive et rapide en temps réel d’imagerie stratégie pour surveiller la croissance et la rénovation des TEBVs dans les cultures à long terme en utilisant la tomographie par cohérence optique (OCT). La morphologie géométrique est évaluée, y compris le processus de remodelage vasculaire, épaisseur de paroi et comparaison de l’épaisseur de la TEBV à des moments différents de la culture et de la présence de stimulation pulsatile. Enfin, les PTOM fournit des possibilités pratiques pour l’observation en temps réel de la dégradation du polymère dans les tissus reconstituante profonde sous stimulation pulsatile ou pas et dans chaque segment du navire, par contre l’évaluation de l’utilisation de dégradation du polymère balayage électronique microscopic(SEM) et microscope polarisé.

Introduction

Tissulaire des vaisseaux sanguins (TEBVs) est le matériau plus prometteurs comme une prothèse vasculaire idéal1. Afin de développer les greffes pour être cliniquement utile avec des propriétés structurales et fonctionnelles similaires comme navires indigènes, plusieurs techniques ont été conçus pour maintenir les fonctions vasculaires2,3. Bien qu’il y a eu des navires conçus avec des taux de perméabilité acceptable pendant l’implantation et à l' étude clinique de Phase III4, culture à long terme et des coûts élevés montrent également la nécessité de suivre le développement de TEBVs. Compréhension des processus matrix(ECM) extracellulaire de croissance, remodelage et l’adaptation en TEBVs dans l’environnement de chimio-mécanique biomimétiques peut fournir des informations cruciales pour le développement de l’ingénierie des tissus vasculaires.

La stratégie idéale pour suivre le développement de vaisseaux machiné de petit diamètre5 devrait être non destructive, stérile, longitudinal, tridimensionnelle et quantitative. TEBVs dans des conditions de culture différente pourraient être évaluées par cette modalité d’imagerie, y compris même les changements avant et après la transplantation vasculaire. Stratégies pour décrire les caractéristiques des navires de vie conçue sont nécessaires. Techniques d’imagerie optiques permettent la visualisation et la quantification des dépôts de tissu et des biomatériaux. Autres avantages sont la possibilité d’activer l’imagerie des tissus profonds et sans étiquette avec haute résolution6,7. Cependant, les molécules d’image spécifique et des équipements optiques moins facilement accessible pour surveiller en temps réel est un obstacle pratique, qui a limité l’application extensive de la microscopie optique non linéaire. Tomographie par cohérence optique (OCT) est une approche optique avec un système d’imagerie intravasculaire comme outil clinique largement utilisé pour guider la thérapie interventionnelle cardiaque8. Dans la littérature, la méthode de OCT a été signalée comme un moyen d’évaluer l’épaisseur de la paroi de TEBVs9,10, couplé avec affirmatives modalités d’imagerie pour la recherche en génie tissu vasculaire. Considérant que, la dynamique de l’ingénierie vasculaire croissance et remodelage observe pas.

Dans ce manuscrit, nous détaillons la préparation du TEBVs d’axée sur l’échafaud polymères biodégradables pour la culture de quatre semaines. Les cellules musculaires lisses vasculaires des artères ombilicale humaine (HUASMCs) sont élargies et ensemencés dans un échafaudages de (PGA) l’acide polyglycolique dégradable poreux dans le bioréacteur. Polymères biodégradables jouent un rôle dans un substrat temporaire pour l’ingénierie tissulaire et ont une certaine dégradation taux11. Afin d’assurer une correspondance appropriée entre la dégradation de l’échafaudage et formation des neo-tissus, ECM et PGA échafaudages sont des facteurs cruciaux pour un remodelage vasculaire efficace. Le système de perfusion simule le microenvironnement biomécanique des vaisseaux natifs et maintient une déformation uniforme sous la stimulation de la pression.

Le protocole présenté vise à décrire une stratégie relativement simple et non destructive pour TEBVs d’imagerie et de surveillance à long terme de la culture. Ce protocole peut être utilisé pour la visualisation des changements morphologiques et mesures d’épaisseur de navires conçus dans des conditions de culture différente. En outre, les analyses de la dégradation des matériaux à base de polymères dans les tissus techniques échafaudages peuvent être exécutées pour l’identification. En combinant les méthodes de balayage électronique microscopic(SEM) et polarisée microscope utilisé dans ce protocole, la corrélation et la quantification de la distribution de la matrice extracellulaire et de la dégradation de la PGA sont possibles, qui peuvent faciliter l’évaluation d’échafaudage dégradation, combiné avec l’imagerie OCT.

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Protocol

1. dégradable PGA échafaudage base tissulaire navires Culture

  1. Fabrication de l’échafaudage de la PGA
    1. Coudre maille PGA (diamètre de 19 mm et 1 mm d’épaisseur) autour de tubes en silicone stérilisé par l’oxyde d’éthylène (longueur 17 cm, diamètre 5,0 mm et 0,3 mm d’épaisseur) à l’aide de la suture de 5-0.
    2. Coudre en polytétrafluoroéthylène (ePTFE, 1cm de longueur) avec suture 4-0 sur chaque extrémité de la maille PGA et se chevauchent de 2 mm.
    3. Tremper les échafaudages PGA avec la main en 1 mol/L, NaOH pendant 1 min pour ajuster la structure spatiale de la maille et le faire tremper avec de l’eau de la culture de tissus grade trois fois pendant 2 min de chaque. Doucement pat sécher l’échafaud avec un papier de soie chaque fois. Puis s’assécher les échafaudages sous une hotte avec un souffleur pendant 1 h.
  2. Assemblée du bioréacteur et la jonction en Y pour l’imagerie de l’OCT
    1. Faire tremper le bioréacteur cylindrique verre self-developed (10 cm de diamètre et 11,7 cm de hauteur avec quatre lèvres à l’intérieur et quatre armes de poing à l’extérieur du réacteur, tel qu’illustré à la Figure 1), le PGA échafaudages, le tube de silicone (diamètre extérieur 5 mm, épaisseur 0. 3 mm), tubes biocompatibles, connecteurs, remuer bar et matériel pour l’assemblage dans un réservoir d’éthanol 95 % pendant 2 h.
    2. Tirez l’échafaud PGA grâce à des armes de poing du bioréacteur relié à un côté avec un connecteur, mais aussi un autre côté avec la jonction en Y pour l’acheminement du guide OCT. Assembler un autre échafaudage de PGA dans le bioréacteur de la même manière. Veuillez vous reporter à la Figure 1.
    3. Monter en ePTFE à lèvres bioréacteur en serrant avec des sutures de 4-0.
    4. Mettez le bioréacteur dans le réservoir de l’éthanol à nouveau pendant 1 h et sécher durant la nuit dans la hotte avec ventilateur.
  3. Semis de HUASMCs et de conditionnement de bioréacteur statique
    1. Isoler les HUASMCs des artères ombilicales humaines par des techniques standard d’explant.
    2. Développer et maintenir les cellules en milieu de culture de cellules musculaires lisses composées de milieu DMEM, 20 % sérum de veau fœtal, 2,36 mg/mL, HEPES, 100 U/mL de pénicilline G, 50 proline µg/mL, 20 µg/mL alanine, glycine 50 de µg/mL, 1,5 µg/mL CuSO4, 50 µg/mL d’acide ascorbique , facteur de croissance de 10 ng/mL basique des fibroblastes et 10 facteur de croissance dérivé des plaquettes ng/mL.
    3. Graines HUASMCs à une concentration de 5 × 106 cellules/mL dans le milieu de culture ci-dessus sur les échafaudages de la PGA.
    4. Mettre un émoi bar (1,5 cm de long) dans le bioréacteur. Insérer un tube d’alimentation (diamètre 5 mm, longueur 15 cm) et trois segments de tuyau court (5 mm de diamètre, 7 cm de longueur) pour les échanges gazeux à travers le couvercle bouchon en silicone.
    5. Fixez PTFE 0,22 µm filtres à chaque changement de tuyau et cap une héparine à le œsophage. Ajustez la barre de remuer avec une vitesse d’agitation de 13 coups par minute. Assembler le bioréacteur de verre, couvercle bouchon en silicone et échafaudage de PGA dans le système de culture.
    6. Permettre aux HUASMCs d’adhérer pendant 45 min en vous penchant le bioréacteur toutes les 15 min avec socle, à gauche et à droite. Les ports de réacteur et les joints sont tous scellés avec le film de paraffine.
    7. Connectez le Luo-Ye pompe, sac de PBS, le pilote avec tubes biocompatibles comme le système de perfusion. Ouvrez le lecteur de remplir les tubes de PBS.
    8. Placez le bioréacteur global dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C. Remplir la chambre de culture avec 450 mL de milieu de culture HUASMCs.
    9. Appuyez sur le bouton arrêter et mettre hors tension de l’appareil d’entraînement. Cultiver les échafaudages semées sous culture statique pendant une semaine.
    10. Changer le milieu de culture tous les 3-4 jours en aspirant la moitié du vieux milieu à travers le tube d’alimentation et au rechargement du réacteur par une quantité équivalente de milieu de culture frais.
  4. Préparation du système de perfusion pour l’imagerie de l’OCT
    1. Pomper des fluides dans le sac de PBS de circuler à travers les tubes biocompatibles et retour au sac.
    2. Ouvrez la puissance du pilote et réglementer le réglage de la pompe avec une fréquence de 60 battements par minute et de sortie tension systolique de 120 mmHg. Ajustez les paramètres mécaniques selon les besoins de la culture vasculaire génie tissulaire.
    3. Cliquez sur le bouton Exécuter pour faire fonctionner le système de perfusion. Fournir la stimulation pulsatile fixe ci-dessus aux navires pendant 3 semaines en pressurisant itérativement biocompatible tubes10,12 après 1 semaine de culture statique.

2. effectuer une imagerie optique par OCT

  1. Utiliser une source de lumière pour assurer la résolution axiale du 10-20µm et la profondeur de l’image de 1 à 2 mm pour identifier la structure de TEBV issu du domaine fréquentiel OCT intravasculaire d’imagerie système9.
  2. Allumez l’interrupteur et ouvrez le logiciel de capture d’image.
  3. Connecter la sonde d’imagerie optique de fibre pour le contrôleur de moteur d’entraînement et d’optique (DOC) avec fonction de retraite automatique de cathéter.
  4. Définir les paramètres de fréquence d’acquisition des images à 10 images par seconde avec une vitesse de recul automatique 10 mm/s.
  5. Fixez cathéter d’imagerie à Y-jonction via le cap de l’héparine avec une aiguille 18G.
  6. Placer la sonde dans le tube de silicone et d’identifier l’étanchéité de la suture de maille PGA avant de charger l’échafaudage de PGA sur le bioréacteur.
  7. Placez l’extrémité du cathéter sur la région d’intérêt. Ajuster le dispositif de recul et vérifier la qualité d’image8.
  8. Acquisition d’images à 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 jours de culture pour chaque TEBV individuel et économisez séquentiellement avec observation en temps réel de la microstructure de la TEBV, dont la morphologie de la surface, structure interne et la composition.
  9. Recommencez la mesure 3 fois obtenir une mesure fiable des navires conçus chaque fois. Capturer une série d’images au cours de tests en utilisant le logiciel de capture d’image.

3. imagerie analyse

  1. Logiciel d’analyse image permet de mesurer l’épaisseur de la paroi TEBV. Sélectionnez l’image à analyser. Cliquez sur l’outil de suivi pour identifier la face interne du TEBV par le logiciel automatiquement et manuellement esquisser le côté extérieur. Un diagramme d’épaisseur s’affiche sur l’écran.
  2. Recommencez la mesure pendant 5 fois obtenir une mesure fiable des constructions. L’analyse de OCT a été réalisée par deux chercheurs indépendants aveuglés à l’information obtenue.

4. la récolte du TEBV et du traitement de tissus

  1. Ouvrir le couvercle bouchon en silicone placé sur le bioréacteur lorsque la culture est terminée et jeter le milieu de culture. Desserrer l’ePTFE lèvres bioréacteur et couper les tubes de silicone du côté extérieur du ePTFE avec des ciseaux. Prises en TEBVs de bioréacteur et couper en sections pour examen au microscope électronique à balayage.
  2. Prendre le reste de TEBVs et y découper 4 µm de coupes épaisses. Sortir le support tube de silicone et fixez les sections avec paraformaldéhyde à 4 %. Effectuer des courants histologique tacher de Masson trichrome et Sirius rouge pour étudier la morphologie de collagène et PGA10,13,14.
  3. Pour évaluer le contenu PGA et composant de collagène, observer des échantillons histologiques avec Sirius rouge taches provoquées par un microscope polarisé. Restes de la PGA sont clairement délimitées par le biais de biréfringence et la zone reste peut être quantifiée basé sur la section transversale de10.

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Representative Results

Le système de culture en trois dimensions se composait d’une chambre de culture dans le bioréacteur et le système de perfusion avec un cycle fermé de fluide10,13 (Figure 1). Le cathéter d’imagerie OCT a été inséré dans l’extrémité distale de la jonction en Y et tiré vers l’arrière dans le tube de silicone pour l’imagerie. L’imagerie OCT a été utilisée pour délimiter la caractérisation structurale de biodégradables polymériques axée sur l’échafaudage TEBVs pendant la culture de bioréacteur.

Figure 2 montre le processus de remodelage vasculaire machiné à travers ces transversales d’imagerie de la microstructure tissulaire en temps réel. Morphologie géométrique a été évaluée, y compris les épaisseur de paroi, dégradable PGA contenu et comparaison de l’épaisseur de la TEBV à des moments différents de la culture ainsi que la présence d’une stimulation pulsatile. Une tendance d’épaisseur décroissante et de façon spectaculaire les changements d’ingénierie tissulaire dans les deux premières semaines de la culture a été vu, ce qui suggère la dégradation graduelle de signal-rich PGA et la structure d’un nouveau tissu de lâches à serré. À 21 jours de culture, le système vasculaire a formé une structure lisse avec la matrice extracellulaire uniformément distribués et composants de signal élevé principalement dissipées. L’épaisseur de paroi de TEBVs avec le même signal augmenté graduellement après trois semaines de culture. Ce remodelage est survenue plus tôt et les changements morphologiques qui se manifestent plus clairement dans ce groupe dynamique (Figure 3). Ainsi OCT permet l’imagerie de la morphologie vasculaire machinée à visualiser in situ et en temps réel dans le cadre de la culture de longue durée.

Figure 4 comparé images OCT avec découvertes histopathologiques de TEBV après 4 semaines de culture. Coloration trichrome de Masson illustre les fibres de collagène distribuées dans une certaine direction, ainsi que des restes de la PGA en couche de médias d’ingénierie navires (Figure 4 b). Sirius rouge coloration révèle restes de PGA et composant de collagène à l’aide d’un microscope polarisé (Figure 4). Microscopie électronique balayage navires machinés avec microstructure compacte ont été comparés à l’évaluation histologique (Figure 4). Pris ensemble, images OCT a montré que PGA était avec différentes tailles et la structure du réseau poreux. La structure de l’échafaudage de la PGA n’a aucun changement évident et gonflé d’un contact direct avec le milieu de culture à un stade précoce de la culture. Mais l’intensité du signal du PGA a été réduite. Composants de PGA était désintégré et remplacés par des cellules et la matrice extracellulaire. Moins des fragments ont été vus plus de quatre semaines. Images de SEM de navires ingénieries transversales démontré rupture de fibre à l’extension de la période d’incubation. Composites à matrice extracellulaire et de matériel ont été dans la structure en nid d’abeille avec une transparence plus compacte et moins.

Figure 1
Figure 1 . Schéma du système vasculaire de la culture, qui se composait d’une chambre de culture dans le bioréacteur et le système de perfusion pour l’imagerie OCT en génie tissulaire. La pompe pulsatile fourni un écoulement de fluide stable simulant le microenvironnement de la biomécanique. Cathéter d’imagerie OCT a été tiré vers l’arrière dans le tube de silicone dans la chambre de culture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . La microstructure du tissu machiné des vaisseaux sanguins durant la culture. Au fil du temps de culture, riche en signal PGA progressivement dégradée et la structure d’un nouveau tissu de lâche à serré. TEBVs avait une lisse surface et abondante la matrice extracellulaire répartie après quatre semaines de culture. Il a montré le processus de remodelage vasculaire machiné par le biais des images en coupe en temps réel. Ce chiffre a été modifié par Chen, w. et al. 10 l’épaisseur du tube de silicone utilisé ici est de 0,8 mm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Comparaison des TEBV mur épaisseur changement au cours de remodelage vasculaire chez les groupes dynamiques et statiques obtenues des mesures OCT. Barres d’erreur indiquent erreur standard. Ce chiffre a été modifié par Chen, w. et al. 10 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Imagerie des biodégradables à base de polymère tissulaire des vaisseaux sanguins. (A) image OCT de TEBV après quatre semaines de culture. M : milieu de culture ; S: tube de silicone ; l’épaisseur du tube de silicone utilisé ici est de 0,8 mm. Flèche blanche indique TEBV. Flèche rouge indique le fragment de la PGA. (B) coloration trichrome de Masson ont démontré des fibres de collagène bien organisé ainsi que la teneur résiduelle en couche media des vaisseaux machiné PGA. Echelle = 100 µm. (C) Sirius rouge coloration révélée PGA restes à l’aide d’un microscope polarisé. Flèche verte indique le fragment de la PGA. Echelle : 100 µm. (D) balayage micrographies du navire machiné avec microstructure compacte ont montré à comparer avec l’évaluation histologique. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour générer conçu navires avec structure et propriétés mécaniques similaires à ceux des natifs des vaisseaux sanguins peuvent entraîner pour raccourcir le temps pour l’usage clinique et sont le but ultime de l’ingénierie vasculaire. Les techniques d’imagerie optiques permettent la visualisation de l’ingénierie des tissus vasculaires composants spécifiques, qui ne peut pas contrôler des constructions individuelles tout au long des greffes de la culture et de l’exposition à un milieu de culture sans compromettre la stérilité7. Dans cet article, la chambre de culture est séparée du système de perfusion. Le système de perfusion relativement indépendant garantit le risque de diminution de la pollution au cours de la culture et la mise en place du Guide de l’OCT. En attendant cette intraluminal modalité d’imagerie adopté facile et contrôle de la sécurité des TEBVs dans le situs avec haute résolution s’approcher que de l’histopathologie, qui fait l’évaluation de l’état de croissance TEBV plus pratique et était même censé être utilisé avant ou après le placement de l’implant.

Le protocole actuel indique une stratégie d’imagerie facilement disponible, en temps réel rapide et non destructive pour évaluer le développement de navires machiné polymères dégradables à l’aide de OCT à base de cathéter. Grâce à l’observation du processus dynamique, des principaux facteurs affectant la génie vasculaire, comme la contamination ou inégalée interaction cellule-matériau conduite à la perte de tissu, on peut distinguer avec détection précoce. Les étapes essentielles pour garantir l’efficacité du protocole comprennent la fabrication de l’échafaudage de NaOH modifiés PGA, réussie d’ensemencement des HUASMCs dans l’échafaudage, le système de culture stériles de séparation du système de surveillance, rapide et le processus de fonctionnement de cathéter qualifiés .

Cette technique peut être utilisée pour évaluer des États de dégradation et de la structure complexe des échafaudages PGA mélangé dedans avec nouveaux tissus. L’échafaudage polymérique avec la structure du réseau poreux se dégrade progressivement et domine le processus de remodelage vasculaire dans les trois premières semaines, qui sont importants pour l’adhésion cellulaire et le dépôt de la matrice extracellulaire avec une structure en trois dimensions pour échange de nutriments et comme un signal porteur15,16. Pour la quantification des restes de la PGA en ingénierie navires clairement identifiés par Sirius images colorées au rouge, l’utilisation de microscopes polarisée17 dégradable génie vasculaire axée sur l’échafaud a le potentiel pour devenir l’évaluation standard après culture. D'où imagerie OCT combiné avec microscope polarisé pourrait servir de méthodes qualitatives et quantitatives permettant d’évaluer la dégradation de la PGA en génie vasculaire.

Une limitation de cette technique est la limite de résolution à évaluer cellule prolifération, distribution, cellule-cellule et cellule-ECM interaction au cours de remodelage vasculaire machiné. Nous espérons trouver une méthode appropriée pour étudier la microstructure TEBVs au niveau cellulaire ou subcellulaire18 et quantifier la cinétique de croissance. Avec l’analyse quantitative des signaux optiques moyens d’imagerie OCT, nous pourrions être plus conscients des mécanismes de dégradation du matériel en génie vasculaire. De telles expériences sont envisagés pour nos futures études.

Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les OCT est un facilement disponibles, en temps réel rapide et non destructive d’imagerie stratégie pour surveiller la croissance et la rénovation des TEBVs. Il est utilisé pour caractériser les structures architecturales et le processus de remodelage à long terme des navires conçus. L’application du microscope polarisé qui a fourni des éléments de preuve supplémentaires pour la quantification des restes polymériques en ingénierie navires pourrait être utile pour évaluer la dégradation de l’échafaudage combinée avec l’imagerie OCT. Pris ensemble, le protocole actuel détient valeur prometteuse de OCT pour son application dans l’ingénierie des tissus vasculaires.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier la Science et la technologie de planification de projet de la Province du Guangdong en Chine (2016B070701007) pour soutenir ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PGA mesh Synthecon
silicone tube Cole Parmer
connector Cole Parmer
intravascular OCT system St. Jude Medical, Inc ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic Philips FEI Philips XL-30
polarized microscope Olympus Olympus BX51
sutures Johnson & Johnson
pulsatile pump Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software St. Jude Medical, Inc

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References

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Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).More

Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).

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