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Bioengineering

Non distruttive monitoraggio dello sviluppo del vaso sanguigno tessutale basati su Scaffold degradabile usando la tomografia a coerenza ottica

doi: 10.3791/58040 Published: October 3, 2018

Summary

Un protocollo di passo dopo passo per controlli non distruttivi e di lungo periodo monitoraggio del processo di rimodellamento vascolare e la degradazione di impalcatura nella cultura in tempo reale di biodegradabili polimerici basati su impalcatura tessutale vasi sanguigni con stimolazione pulsatile usando la tomografia ottica di coerenza è descritto qui.

Abstract

Gli innesti vascolari ingegnerizzati con proprietà strutturali e meccaniche simili ai vasi sanguigni naturali sono tenuti a soddisfare la crescente domanda per bypass arterioso. Caratterizzazione della dinamica di crescita e il processo di rimodellamento dei polimeri biodegradabili basate su impalcatura tessutale vasi sanguigni (TEBVs) con stimolazione pulsatile è cruciale per l'ingegneria del tessuto vascolare. Tecniche di imaging ottici si distinguono come potenti strumenti per il monitoraggio di vascolarizzazione del tessuto ingegnerizzato abilitazione imaging ad alta risoluzione in tempo reale cultura. Questa carta dimostra un non distruttivo e veloce in tempo reale strategia per monitorare la crescita di imaging e rimodellamento del TEBVs in coltura a lungo termine mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). Morfologia geometrica viene valutata, tra cui il processo di rimodellamento vascolare, spessore della parete e confronto di spessore TEBV in intervalli di tempo di diversa cultura e presenza di stimolazione pulsatile. Infine, OCT fornisce possibilità pratiche per l'osservazione in tempo reale della degradazione del polimero nei tessuti ricostruzione sotto stimolazione pulsatile o non e in ogni segmento di vaso, di rispetto con la valutazione dell'utilizzo di degradazione polimerica scanning electron microscopic(SEM) e microscopio polarizzato.

Introduction

Tessutale di vasi sanguigni (TEBVs) è il materiale più promettenti come un innesto vascolare ideale1. Al fine di sviluppare gli innesti per essere clinicamente utile con le simili proprietà strutturali e funzionali come vasi nativi, tecniche multiple sono state progettate per mantenere la funzione vascolare2,3. Anche se ci sono stati derivati dal vasi con tassi di pervietà accettabile durante l'impianto e in studio clinico di fase III4, coltura a lungo termine e l'alto costo mostrano anche la necessità di monitoraggio dell'evoluzione della TEBVs. Comprensione dei processi di crescita, rimodellamento e adattamento matrix(ECM) extracellulare in TEBVs nell'ambiente di chemio-meccanica di biomimetica può fornire informazioni cruciali per lo sviluppo dell'ingegneria di tessuto vascolare.

La strategia ideale per seguire l'evoluzione delle navi derivati dal piccolo diametro5 dovrebbe essere non distruttivo, sterile, longitudinale, tridimensionale e quantitativa. Questa modalità di formazione immagine, tra cui anche cambiamenti prima e dopo trapianto vascolare potrebbe essere valutato TEBVs sotto differenti condizioni di coltura. Sono necessarie strategie per descrivere le caratteristiche dei vasi vivente ingegnerizzato. Tecniche di imaging ottici consentono la visualizzazione e quantificazione di deposizione tissutale e biomateriali. Altri vantaggi sono la possibilità di abilitare imaging dei tessuti profondi e privo di etichetta con alta risoluzione6,7. Tuttavia, immagine specifiche molecole e apparecchiature ottiche meno facilmente accessibile per il monitoraggio in tempo reale è un ostacolo pratico significativo, che ha limitato l'applicazione estesa della microscopia ottica non lineare. Tomografia a coerenza ottica (OCT) è un approccio ottico con modalità di formazione immagine intravascolare come strumento clinico ampiamente usato per guidare la terapia interventistica cardiaca8. Nella letteratura il metodo dell'OCT è stato segnalato come un modo per valutare lo spessore della parete di TEBVs9,10, accoppiato con modalità di imaging affermativa per ricerca di ingegneria del tessuto vascolare. Considerando che, le dinamiche di engineered vascolare crescita ed il ritocco non è stata osservata.

In questo manoscritto, dettagliamo la preparazione del TEBVs basato su scaffold polimerici biodegradabili per la cultura di quattro settimane. Cellule muscolari lisce vascolari arterie ombelicali umane (HUASMCs) sono espanse e teste di serie un impalcature di acido (PGA) poroso poliglicolico degradabile nel bioreattore. Polimeri biodegradabili il ruolo in un substrato temporaneo per l'ingegneria tissutale e hanno un certo degrado tasso11. Al fine di garantire una corrispondenza appropriata tra degrado dell'impalcatura e formazione di neo-tessuto, ECM e PGA ponteggi sono fattori cruciali per il rimodellamento vascolare efficace. Il sistema di perfusione simula il microambiente biomeccanico dei vasi nativi e mantiene una deformazione costante sotto stimolazione di pressione.

L'obiettivo del protocollo presentato è quello di descrivere una strategia relativamente semplice e non distruttiva per TEBVs di imaging e monitoraggio a lungo termine della cultura. Questo protocollo può essere utilizzato per la visualizzazione dei cambiamenti morfologici e misure di spessore dei derivati dal vasi sotto differenti condizioni di coltura. Inoltre, l'analisi del degrado di materiali polimerici nel tessuto impalcature di ingegneria possono essere eseguite per l'identificazione. Combinando metodi di scansione elettrone microscopio polarizzato utilizzati in questo protocollo, la correlazione e la quantificazione di distribuzione di matrice extracellulare e la degradazione di PGA e microscopic(SEM) può essere fatto, che può facilitare la valutazione dell'impalcatura degradazione combinato con formazione immagine OCT.

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Protocol

1. degradabile PGA impalcatura basato tessutale vasi cultura

  1. Fabbricazione di Scaffold PGA
    1. Cucire le maglie di PGA (diametro 19 mm e 1 mm di spessore) nei dintorni di tubazione del silicone sterilizzata con ossido di etilene (17 centimetri di lunghezza, diametro 5,0 mm e 0,3 mm di spessore) usando il 5-0 suturare.
    2. Cucire il politetrafluoroetilene (ePTFE, 1cm di lunghezza) con il 4-0 suturare su ciascuna estremità della maglia di PGA e sovrapposta da 2 mm.
    3. Immergere ponteggi PGA con la mano in 1 mol/L di NaOH per 1 min per regolare la struttura spaziale della mesh e bagnare con acqua di grado di coltura del tessuto tre volte per 2 minuti ciascuno. Delicatamente asciugare il patibolo con una velina ogni volta. Quindi asciugare impalcature in un cappuccio con un soffiatore per 1 h.
  2. Assemblea del bioreattore e Y-bivio per formazione immagine OCT
    1. Immergere il vetro self-developed bioreattore cilindrici (diametro di 10 cm e 11,7 cm di altezza con quattro labbra all'interno e quattro bracci laterali di fuori del reattore come mostrato nella Figura 1), PGA impalcature, tubo in silicone (diametro esterno 5mm, spessore 0.3 mm), biocompatibile tubi, connettori, ancoretta e attrezzature per il montaggio in un serbatoio di etanolo 95% per 2 h.
    2. Impalcatura di PGA di tirare attraverso bracci laterali del bioreattore collegato ad un lato con un connettore come pure un altro lato con la Y-giunzione usati per fornire filo guida OCT. Montare un'altra impalcatura PGA nel bioreattore nello stesso modo. Fare riferimento alla Figura 1.
    3. Montare in ePTFE per labbra bioreattore serrando con suture 4-0.
    4. Mettete il bioreattore nel serbatoio dell'etanolo ancora per 1 h e asciugare durante la notte in cappa con ventilatore su.
  3. La semina del HUASMCs e statico bioreattore condizionata
    1. Isolare HUASMCs da arterie ombelicali umane mediante tecniche di espianto standard.
    2. Espandere e mantenere le cellule nel mezzo di crescita delle cellule di muscolo liscio è composto da mezzo DMEM, 20% siero bovino fetale, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL di penicillina G, prolina di 50 µ g/mL, 20 µ g/mL alanina, glicina di 50 µ g/mL, 1,5 µ g/mL CuSO4, 50 µ g/mL di acido ascorbico , fattore di crescita del fibroblasto base ng/mL 10 e 10 ng/mL piastrina-derivato di fattore di crescita.
    3. Semi HUASMCs ad una concentrazione di 5 × 106 cellule/mL nel terreno di coltura sopra su impalcature PGA.
    4. Mettere un ancoretta (1,5 cm di lunghezza) nel bioreattore. Inserire un tubo per l'alimentazione (diametro 5 mm, lunghezza 15 cm) e tre segmenti di tubo corto (diametro 5 mm, lunghezza 7 cm) per lo scambio di gas attraverso il coperchio tappo in silicone.
    5. Collegare filtri in PTFE da 0,22 µm ad ogni cambiamento per l'aria e tappo di uno eparina a tubo per l'alimentazione. Regolare l'ancoretta con una velocità dell'agitatore di 13 colpi al minuto. Montare il vetro bioreattore, coperchio tappo in silicone e impalcatura PGA nel sistema cultura.
    6. Consentire HUASMCs di aderire per 45 min di pendente del bioreattore ogni 15min con stand, a sinistra e a destra. I porti di reattore e le articolazioni sono tutti sigillati con film di paraffina.
    7. Collegare il Luo-Ye pompa, sacchetto di PBS, il driver con tubi biocompatibili come il sistema di perfusione. Aprire l'unità per riempire i tubi con PBS.
    8. Posto del bioreattore complessivo in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C. Riempire la camera di cultura con 450 mL di terreno di coltura di HUASMCs.
    9. Premere il tasto stop e spegnere l'alimentazione del dispositivo in auto. Crescere i ponteggi seminati sotto coltura statica per una settimana.
    10. Cambiare il terreno di coltura ogni 3-4 giorni aspirando la metà del mezzo vecchio attraverso il tubo di alimentazione e ricarica il reattore con una quantità equivalente di terreno di coltura fresco.
  4. Preparazione del sistema di perfusione per imaging OCT
    1. Pompare liquidi nella borsa PBS a circolare attraverso tubi biocompatibile e torna alla borsa.
    2. Aprire l'alimentazione del driver e regolare la taratura della pompa con una frequenza di 60 battiti al minuto e uscita pressione sistolica di 120 mmHg. Regolare i parametri meccanici secondo le esigenze della coltura vascolare ingegneria del tessuto.
    3. Fare clic sul pulsante eseguire per far funzionare il sistema di perfusione. Forniscono la stimolazione pulsatile fissa sopra ai vasi per 3 settimane di pressurizzazione in modo iterativo biocompatibile tubi10,12 dopo 1 settimana di coltura statica.

2. esecuzione di Imaging ottico con OCT

  1. Utilizzare una fonte di luce per assicurare la risoluzione assiale del 10-20 µm e la profondità di immagine di 1-2 mm per identificare la struttura del TEBV basato sul dominio della frequenza OCT intravascolare imaging sistema9.
  2. Accendere l'interruttore di alimentazione e aprire il software di acquisizione immagine.
  3. Collegare il catetere di imaging ottico di fibra al controllore motore di azionamento e ottico (DOC) con funzione di ritiro automatico del catetere.
  4. Impostare i parametri di velocità di acquisizione di immagini a 10 frame al secondo con una velocità di ritiro automatico di 10 mm/s.
  5. Fissare catetere imaging Y-giunzione tramite tappo di eparina con un ago da 18G.
  6. Inserire il catetere nel tubo di silicone e identificare la strettezza di sutura della mesh PGA prima del caricamento dell'impalcatura di PGA sul bioreattore.
  7. Posizionare la punta del catetere sopra la regione di interesse. Regolare il dispositivo di pullback e verificare per la qualità di immagine8.
  8. Acquisire immagini a 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 giorni nella cultura per ogni TEBV individuali e salvare in sequenza con l'osservazione in tempo reale della microstruttura TEBV, tra cui morfologia superficiale, la struttura interna e la composizione.
  9. Ripetere la misurazione per 3 volte ottenere la misura affidabile dei derivati dal vasi ogni volta. Acquisire una serie di immagini nel corso di test utilizzando il software di acquisizione immagine.

3. imaging analisi

  1. Utilizzare software di analisi di immagine per misurare lo spessore TEBV. Selezionare l'immagine da analizzare. Fare clic sullo strumento di rilevamento per identificare il lato interno del TEBV dal software automaticamente e manualmente schizzo sulla parte esterna. Un diagramma di spessore apparirà sullo schermo.
  2. Ripetere la misurazione per 5 volte ottenere misurazioni affidabili dei costrutti. L'analisi di OCT è stata effettuata da due ricercatori indipendenti accecati per le informazioni ottenute.

4. raccolta di TEBV e di processazione dei tessuti

  1. Aperto il coperchio del tappo in silicone posizionata sopra il bioreattore quando la cultura è finita e scartare il terreno di coltura. Allentare ePTFE dalle labbra di bioreattore e tagliare i tubi in silicone dal lato esterno del ePTFE con le forbici. Raccogliere TEBVs da bioreattore e tagliato in sezioni per la microscopia di scansione.
  2. Prendere il resto della TEBVs e tagliate in 4 sezioni di spessore µm. Estrarre il supporto tubo in silicone e difficoltà sezioni con paraformaldeide al 4%. Eseguire routine macchiatura istologica di Masson tricromica e Sirius rosso per esaminare la morfologia del collagene e PGA10,13,14.
  3. Per valutare il contenuto di PGA e componente di collagene, osservare i campioni istologici con Sirius rosso la colorazione di un microscopio polarizzato. Resti di PGA sono chiaramente delimitati attraverso birifrangenza e la zona di residuo può essere quantificata sulla base l' area della sezione trasversale10.

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Representative Results

Il sistema tridimensionale cultura consisteva di una camera di coltura in bioreattore e il sistema di perfusione con un ciclo fluido chiuso10,13 (Figura 1). Il catetere di imaging OCT è stato inserito nell'estremità distale della Y-giunzione e tirato indietro nel tubo in silicone per l'imaging. Formazione immagine OCT fu usata per delineare la caratterizzazione strutturale di TEBVs basati su scaffold polimerici biodegradabili durante la coltivazione del bioreattore.

Figura 2 ha mostrato il processo di rimodellamento vascolare ingegnerizzati attraverso questi a sezione trasversale di formazione immagine della microstruttura del tessuto in tempo reale. Morfologia geometrica è stata valutata, tra cui lo spessore della parete, degradabile PGA contenuti e confronto di spessore TEBV in momenti di cultura diversa, così come la presenza di stimolazione pulsatile. Un trend di decremento di spessore e drammaticamente cambiamenti del tessuto ingegnerizzato entro le prime due settimane di cultura è stato visto, suggerendo la degradazione graduale di PGA di segnale-ricco e la struttura del nuovo tessuto da sciolti in modo stretto. 21 giorni nella cultura, il sistema vascolare aveva formato una struttura liscia con matrice extracellulare in modo uniforme e componenti di alto segnale principalmente dissipate. Lo spessore della parete di TEBVs con segnale anche aumentato gradualmente dopo tre settimane di cultura. Questo rimodellamento fosse avvenuto prima e i cambiamenti morfologici si manifestano più ovviamente nel gruppo dinamico (Figura 3). Quindi OCT permette l'imaging della morfologia ingegnerizzato vascolare possano essere visualizzati in situ ed in tempo reale nel corso della cultura di lunga durata.

Figura 4 confrontato le immagini OCT con reperti istopatologici di TEBV dopo 4 settimane di cultura. Colorazione tricromica di Masson dimostra fibre di collagene, distribuite in una certa direzione insieme con resti di PGA in media strato dei vasi ingegnerizzati (Figura 4B). Macchiatura di Sirius rosso ha rivelato i resti di PGA e componente di collagene utilizzando un microscopio polarizzato (Figura 4). I micrografi elettronici scansione dei vasi ingegnerizzati con microstruttura compatta sono stati confrontati con la valutazione istologica (Figura 4). Presi insieme, immagini di ottobre ha mostrato che PGA era con diverse dimensioni e struttura di rete porosa. La struttura dell'impalcatura di PGA non ha nessun cambiamento evidente e gonfio dal contatto diretto con il terreno di coltura nella fase iniziale della cultura. Ma è stata ridotta l'intensità del segnale di PGA. Componenti di PGA era disintegrato e sostituito con le cellule e matrice extracellulare. Un minor numero di frammenti sono stati veduti su periodo di quattro settimane. Immagini di SEM dei vasi ingegnerizzati a sezione trasversale ha dimostrato la rottura della fibra per l'estensione del tempo di incubazione. Compositi a matrice extracellulare e materiale erano in struttura a nido d'ape con più compatta e meno trasparenza.

Figure 1
Figura 1 . Schematica del sistema vascolare della coltura, che consisteva di una camera di coltura in bioreattore e il sistema di perfusione per OCT imaging di ingegneria tissutale. La pompa pulsatile provvista di flusso di un fluido stabile che simula il microambiente biomeccanico. Catetere di imaging OCT è stato tirato indietro nel tubo in silicone nella camera di cultura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . La microstruttura del tessuto ingegnerizzato vasi sanguigni durante cultura. Nel corso del tempo cultura, segnale-ricco PGA gradualmente degradato e la struttura del nuovo tessuto era allentato-stretto. TEBVs aveva una matrice extracellulare liscia superficie e abbondante in modo uniforme dopo quattro settimane di cultura. Ha mostrato il processo di rimodellamento vascolare ingegnerizzati attraverso immagini a sezione trasversale in tempo reale. Questa figura è stata modificata da Chen, w. et al. 10 lo spessore del tubo in silicone usato qui è di 0,8 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Confronto del cambiamento di spessore di parete TEBV durante il rimodellamento vascolare in gruppi statici e dinamici ottenuti dalle misure di OCT. Barre di errore indicano l'errore standard. Questa figura è stata modificata da Chen, w. et al. 10 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Imaging dei vasi sanguigni tessutale a base di polimeri biodegradabili. (A) immagine OCT di TEBV dopo quattro settimane di cultura. M: terreno di coltura; S: tubo in silicone; lo spessore del tubo in silicone usato qui è di 0,8 mm. Freccia bianca indicato TEBV. Freccia rossa indicato frammento di PGA. (B) colorazione tricromica di Masson ha dimostrato le fibre di collagene ben organizzata insieme al contenuto residuo di PGA in media strato dei vasi ingegnerizzati. Barra della scala = 100 µm. (C) Sirius rosso colorazione ha rivelato PGA resti utilizzando un microscopio polarizzato. Freccia verde indica il frammento di PGA. Barra della scala: 100 µm. (D) scansione micrografi di derivati dal vaso con microstruttura compatta erano hanno mostrato da confrontare con la valutazione istologica. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per generare ingegnerizzato vasi con strutturali e proprietà meccaniche simili a quelle dei vasi sanguigni nativi può condurre per accorciare i tempi per l'uso clinico ed è l'obiettivo finale di ingegneria vascolare. Tecniche di imaging ottici consentono la visualizzazione di tessuti ingegnerizzati vascolare componenti specifici, che non è possibile monitorare diversi costrutti in tutto gli innesti di cultura e l'esposizione a un ambiente di cultura senza compromettere la sterilità7. In questo articolo, l'alloggiamento della coltura è separato dal sistema di perfusione. Il sistema di perfusione relativamente indipendente garantisce il rischio di diminuzione di inquinamento durante la cultura e il posizionamento del filo guida OCT. Nel frattempo questo intraluminal modalità di imaging adottato facile e monitoraggio della sicurezza di TEBVs in situs con alta risoluzione si avvicina che di istopatologia, che reso più pratico la valutazione dello stato di crescita TEBV ed era anche previsto che venga utilizzato prima o dopo il posizionamento dell'impianto.

L'attuale protocollo indica una strategia di formazione immagine prontamente disponibile, veloce in tempo reale e non distruttiva per valutare lo sviluppo biodegradabili a base di polimeri derivati dal vaso utilizzando basati su catetere OCT. Attraverso l'osservazione del processo dinamico, alcuni principali fattori che influenzano ingegneria vascolare, come la contaminazione o ineguagliata interazione cellula-materiale ha portato alla perdita del tessuto, può essere distinto con la diagnosi precoce. Fasi critiche per garantire l'efficacia del protocollo includono la fabbricazione di scaffold NaOH-modificato PGA, successo semina di HUASMCs nell'impalcatura, sistema di coltura sterile di separazione dal sistema di monitoraggio, veloce e processo di funzionamento del catetere qualificati .

Questa tecnica può essere utilizzata per valutare stati di degrado e la complessa struttura del PGA ponteggi mescolato con nuovo tessuto. Lo scaffold polimerico con struttura porosa rete degrada gradualmente e domina il processo di rimodellamento vascolare nelle prime tre settimane, che sono importanti per l'adesione delle cellule e la deposizione di matrice extracellulare con una struttura di tre-dimensionati per cambio dei nutrienti e come un segnale portante15,16. Per la quantificazione dei residui di PGA nei derivati dal navi chiaramente identificate da Sirius rosso-macchiato immagini, l'uso di microscopi polarizzati17 in ingegneria vascolare basati su impalcatura degradabile ha il potenziale per diventare la valutazione standard dopo coltivazione. Da qui la formazione immagine OCT combinata con microscopio polarizzato potrebbe servire come metodi qualitativi e quantitativi per la valutazione della degradazione di PGA in ingegneria vascolare.

Una limitazione di questa tecnica è il limite di risoluzione per valutare l'interazione cellula proliferazione, distribuzione, cellula-cellula e cellula-ECM durante derivati dal rimodellamento vascolare. Speriamo di trovare un metodo adatto per indagare TEBVs microstruttura a cellulari o subcellulari livello18 e quantificare la cinetica di crescita. Con analisi quantitativa della medio segnali ottici di imaging OCT, potremmo essere più consapevoli del meccanismo di degradazione materiale in ingegneria vascolare. Tali esperimenti vengono considerati per i nostri futuri studi.

Nel complesso, i nostri risultati mostrano che OCT è un prontamente disponibile, veloce in tempo reale e non distruttivo imaging strategia per monitorare la crescita e rimodellamento del TEBVs. È utilizzata per caratterizzare elementi architettonici strutturali e il processo di rimodellamento a lungo termine dei vasi ingegnerizzati. L'applicazione del microscopio polarizzato che ha fornito la prova supplementare per la quantificazione dei residui polimerici nei derivati dal navi potrebbe essere utile per la valutazione della degradazione di scaffold combinato con formazione immagine OCT. Presi insieme, l'attuale protocollo contiene valore promettente di ottobre per la sua applicazione nell'ingegneria del tessuto vascolare.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere la scienza e la tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (2016B070701007) per sostenere questo lavoro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PGA mesh Synthecon
silicone tube Cole Parmer
connector Cole Parmer
intravascular OCT system St. Jude Medical, Inc ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic Philips FEI Philips XL-30
polarized microscope Olympus Olympus BX51
sutures Johnson & Johnson
pulsatile pump Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software St. Jude Medical, Inc

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References

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Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).More

Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).

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