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Bioengineering

광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 분해 비 계 기반 조직 설계 혈관 개발의 비파괴 모니터링

doi: 10.3791/58040 Published: October 3, 2018

Summary

혈관 개장 및 생 분해성 고분자 비 계 기반 조직 설계 혈관의 자극 타악기와 실시간 문화에 비 계 저하의 과정을 감시 하는 비파괴 및 긴 기간에 대 한 단계 프로토콜 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다.

Abstract

비슷한 자연 혈관 구조 및 기계적 속성 조작된 혈관 이식 동맥 우회에 대 한 수요를 충족 하기 위해 예상 된다. 성장 역학의 특성화 및 분해성 고분자 비 계 기반 조직 설계 혈관 (TEBVs) 타악기 자극의 리 모델링 과정은 혈관 조직 공학에 대 한 중요 합니다. 광학 이미징 기술을 설계 조직 활성화 실시간 문화에 고해상도 이미징의 vascularization를 모니터링 하기 위한 강력한 도구로 밖으로 서. 이 문서는 비파괴 및 빠른 실시간 성장 모니터링 전략 이미징 및 리 모델링 TEBVs의 장기 문화에 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여 보여 줍니다. 기하학적 형태, 다른 문화 시간 포인트와 타악기 자극의 존재에 혈관 개장 과정, 벽 두께, 그리고 TEBV 두께의 비교를 포함 하 여 계산 됩니다. 마지막으로, 10 월 타악기 자극 아래 재구성 조직에 폴리머 저하의 실시간 관찰에 대 한 실용적인 제공 또는 사용 하 여 폴리머 저하의 평가와 여 비교 하지 및 각 선박 세그먼트에 전자 microscopic(SEM) 및 편광된 현미경 검사.

Introduction

혈관 조직 설계 (TEBVs)는 이상적인 혈관 이식1으로 가장 유망한 소재입니다. 이식 네이티브 혈관으로 유사한 구조 및 기능 속성으로 임상적으로 유용 하, 개발 하기 위하여 여러 기법 혈관 기능2,3를 유지 하기 위해 설계 되었습니다. 비록 주입 중 고 단계 III 임상 연구4에서 허용 patency 속도와 설계 배 왔다, 장기 문화 및 높은 비용 또한 표시 TEBVs의 개발 모니터링의 필요성. 생체 모방 화학 기계 환경 TEBVs에 extracellular matrix(ECM), 리 모델링, 성장과 적응 프로세스의 이해는 혈관 조직 공학의 발전에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다.

작은-직경 설계 배5 의 개발을 추적 하기 위해 이상적인 전략 비파괴, 살 균, 경도, 3 차원 고 양적 이어야 한다. 다른 문화 조건 하에서 TEBVs 혈관 이식 전후도 변화를 포함 하 여이 이미지 양식 적임에 의해 사정 될 수 있는. 전략 설계 생활 혈관의 기능을 설명 하기 위해 필요 합니다. 광학 이미징 기술을 시각화 및 조직 증 착 및 생체 재료의 정량화를 허용합니다. 다른 장점은 고해상도6,7깊은 조직 및 레이블 무료 이미징 수 있도록 가능성 있다. 그러나, 이미지 관련 분자 및 실시간 모니터링을 위한 적은 쉽게 접근할 수 있는 광학 장비는 중요 한 실용적인 장애 이다, 비선형 광학 현미경의 광범위 한 응용 프로그램 제한. 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)입니다 광학 혈관 내 이미징 적임을 도구로 널리 사용 임상 심장 중재 치료8가이드. 문학에서는 10 월의 방법 TEBVs9,10, 혈관 조직 공학 연구에 대 한 긍정적인 이미징 형식와 결합의 벽 두께 평가 하는 방법으로 보고 되었다. 반면의 역학 관 설계 성장과 개장 하지 관찰 되었다.

이 원고에서 우리 선발 4 주 문화에 대 한 생 분해성 고분자 비 계 기반 TEBVs의 준비. 인간의 탯 줄 동맥 혈관 평활 근 세포 (HUASMCs)는 확장 하 고에 생물 분해성 다공성 polyglycolic 산 (PGA) 건설 기계에 시드. 생 분해성 고분자 역할을 조직 공학에 대 한 임시 기판에 있고 특정 저하 속도11. 비 계 저하와 네오 조직 형성 사이 일치 하는 적절 한 수 있도록, ECM 및 PGA 건설 기계 효과적인 혈관 개장을 위한 중요 한 요소가 됩니다. 관류 시스템 시뮬레이션의 기본 선박 biomechanical microenvironment 고 압력 자극 아래 일관 된 변형을 유지 한다.

제시 프로토콜의 목적은 TEBVs 이미징 및 문화의 장기 모니터링에 대 한 비교적 간단 하 고 비파괴 전략을 설명 하는 것입니다. 이 프로토콜은 시각화 형태학 변화 및 다른 문화 조건 하에서 설계 된 혈관의 두께 측정에 대 한 이용하실 수 있습니다. 또한, 식별에 대 한 건설 기계 엔지니어링 조직에 폴리머 기반 자료 저하의 분석을 수행할 수 있습니다. 전자 검색의 방법을 결합 하 여 microscopic(SEM) 및 편광된 현미경이 프로토콜, 상관 관계 및 기질 유통 및 PGA 저하의 정량화에 사용 할 수 있다는 사정 비 계를 촉진할 수 있다 저하 10 월 이미지와 결합.

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Protocol

1. 분해성 PGA 비 계 기반 선박 문화 조직 설계

  1. PGA 비 계 제조
    1. 실리콘 튜브 (17 cm 길이, 5.0 m m 직경, 및 0.3 m m 두꺼운) 에틸렌 산화에 의해 소독 주위 PGA 메쉬 (19 m m 직경 및 두께 1 m m) 바느질 5-0 봉합 사를 사용 하 여.
    2. 소계 (ePTFE, 1 cm 길이) PGA 메시의 각 끝에 4-0 봉합 사로 꿰 매 고 2 m m에 의해 중첩.
    3. PGA 건설 기계 1 mol/L NaOH 1 분 메시의 공간 구조를 조정 하 여 2 분에 대 한 세 번 조직 문화 학년 물으로 흠뻑 젖어 있는 손으로 찍어. 부드럽게 팻 건조는 휴지와 비 계 각 시간. 그런 다음 1 시간을 위한 송풍기와 후드에 건설 기계를 건조.
  2. 생물 반응 기 및 10 월 영상에 대 한 Y 접속점
    1. 자체 개발한 유리 원통형 생물 (10 cm 직경 및 안쪽 4 개의 입술과 그림 1에서 보듯이 원자로 밖에 서 4 쪽 팔 높이 11.7 c m), PGA 건설 기계, 실리콘 튜브를 담가 (외부 직경 5 m m, 두께 0.3 m m), 생체 튜브, 커넥터, 저 어 바 및 어셈블리 2 h에 대 한 95% 에탄올 탱크에 대 한 장비.
    2. Y 접점 10 월 guidewire를 제공 하는 데 사용 된 또 다른 측면으로 커넥터를 가진 1 개의 측에 연결 하는 생물의 측면-팔을 통해 PGA 비 계를 당겨. 같은 방식으로 생물에서 다른 PGA 비 계를 조립. 그림 1을 참조 하십시오.
    3. 4-0 봉합을 강화 하 여 생물 입술 ePTFE를 맞습니다.
    4. 다시 1 시간에 대 한 에탄올 탱크에는 생물 반응 기를 넣고 송풍기와 후드에 하룻밤에 건조.
  3. HUASMCs 및 정적 생물 조절의 시드
    1. 표준 explant 기술로 인간의 탯 줄 동맥에서 HUASMCs를 격리 합니다.
    2. 확장 하 고 부드러운 근육 세포 성장 매체에 셀 DMEM 매체, 20% 태아 둔감 한 혈 청, 2.36 mg/mL HEPES, 100 U/mL 페니실린 G, 50 µ g/mL 프롤린, 20 µ g/mL 알라닌, 50 µ g/mL 글리신, 1.5 µ g/mL CuSO4, 50 µ g/mL 의약품의 구성 유지 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 및 10 ng/mL 혈소판 파생 된 성장 인자.
    3. 5 × 106 셀/mL PGA 건설 기계에 위의 문화 매체에서의 농도에서 종자 HUASMCs.
    4. 생물 (1.5 c m 길이) 바 볶음을 넣어. 실리콘 마 개 뚜껑을 통해 가스 교환을 위한 한 먹이 튜브 (5 m m 직경, 길이 15 cm) 및 3 개의 짧은 튜브 세그먼트 (5 m m 직경, 7 cm 길이)를 삽입 합니다.
    5. 각 공기 변경 튜브와 튜브 먹이를 한 헤 파 린 캡 PTFE 0.22 μ m 필터를 연결 합니다. 분당 13 라운드의 교 반 속도와 저 어 막대를 조정 합니다. 문화 시스템에 유리 생물, 실리콘 마 개 뚜껑과 PGA 비 계를 조립.
    6. 생물을 기대 하 여 45 분에 대 한 준수 HUASMCs 스탠드, 왼쪽과 오른쪽에 매 15 분을 허용 합니다. 원자로 포트와 관절 모든 파라핀 필름으로 밀봉 된다.
    7. 연결 하는 루 오-예 펌프, PBS 가방, 관류 시스템으로 생체 튜브 드라이버. PBS를 가진 튜브를 채우기 위해 드라이브를 엽니다.
    8. 장소 5% CO2 37 ° c.에 습도 인큐베이터에서 전반적인 생물 HUASMCs 문화 매체의 450 mL로 문화 챔버를 채우십시오.
    9. 중지 단추를 누르고 드라이브 장치의 전원을 끄십시오. 1 주일에 대 한 정적 문화 아래 시드 건설 기계를 성장.
    10. 3-4 일 마다 튜브 먹이 신선한 문화 매체의 상응 하는 금액으로 원자로 채우는 통해 오래 된 매체의 절반을 발음으로 문화 매체를 변경 합니다.
  4. 10 월 영상에 대 한 관류 시스템의 준비
    1. 생체 튜브를 통해 고 가방을 다시 순환 PBS 가방에 액체 펌프.
    2. 드라이버의 힘 연 분 및 출력 수축 기 혈압 120 mmHg의 60 분당의 주파수와 펌프 설정을 조절 합니다. 조직 공학 관 문화의 필요에 따라 기계 매개 변수를 조정 합니다.
    3. 관류 시스템을 작동 하 게 하려면 실행된 단추를 클릭 합니다. 반복적으로 정적 문화의 1 주 후 생체 튜브10,12 를 가압 하 여 위의 고정된 타악기 자극 혈관을 3 주 동안을 제공 합니다.

2. 10 월으로 광 이미징을 수행

  1. 10 20µm의 축 해상도 고 1-2 m m의 이미지 깊이는 주파수 영역 10 월 혈관 내 이미징 시스템9에 따라 TEBV의 구조를 식별 하는 광원을 사용 합니다.
  2. 전원 스위치를 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.
  3. 카 테 터 자동 퇴각 기능 및 광학 드라이브 모터 컨트롤러 (DOC)를 섬유 광학 이미징 카 테 터를 연결 합니다.
  4. 10 m m/s의 자동 철수 속도와 초당 10 프레임을 이미지 획득 율의 매개 변수를 설정 합니다.
  5. 18 G 바늘으로 헤 파 린 캡을 통해 Y 접점을 이미징 카 테 터 연결.
  6. 실리콘 튜브 카 테 터를 삽입 하 고 PGA는 생물에 비 계를 로드 하기 전에 PGA 망의 봉합 압박감을 식별 합니다.
  7. 카 테 터 팁 관심 영역에 배치. 철수 장치 및 이미지 품질8확인 조정 합니다.
  8. 이미지 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 일 각 개별 TEBV에 대 한 문화 및 순차적으로 저장 TEBV 미세의 실시간으로 관찰, 포함 한 표면 형태, 내부 구조 및 구성.
  9. 신뢰할 수 있는 측정 조작된 혈관의 각 시간을 3 번 측정을 반복 합니다. 일련을의 이미지 캡처 소프트웨어를 사용 하 여 테스트를 통해 이미지를 캡처하십시오.

3. 영상 분석

  1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 TEBV 벽 두께 측정. 분석 이미지를 선택 합니다. 추적 도구를 소프트웨어에 의해 TEBV의 안쪽을 자동으로 식별 하 고 수동으로 외부 측면 스케치를 클릭 합니다. 두께의 다이어그램 화면에 표시 됩니다.
  2. 5 번의 구문이 신뢰할 수 있는 측정을 위한 측정을 반복 합니다. 10 월 분석 획득된 정보를 눈 멀게 하는 두 개의 독립적인 조사자에 의해 수행 되었다.

4입니다. 수확의 TEBV 및 조직 처리

  1. 오픈 실리콘 마 개 뚜껑 문화 완료 되는 생물 위에 배치 하 고 문화 매체를 삭제. 풀고 생물 입술에서 ePTFE ePTFE의 외부 측면에서 실리콘 튜브가 위로 잘라 합니다. TEBVs는 생물 반응 기에서 수확 하 고 스캐닝 전자 현미경 검사에 대 한 섹션을 잘라.
  2. TEBVs의 나머지를 꺼내와 4 µ m 두꺼운 부분으로 잘라. 지 원하는 실리콘 튜브 밖으로 당기고 4 %paraformaldehyde 섹션을 수정. 일상적인 조직학 얼룩 Masson의의 trichrome 및 시리우스 빨간색 콜라겐과 PGA10,,1314의 형태를 검사를 수행 합니다.
  3. PGA 콘텐츠 및 콜라겐 구성 요소 평가, 편광된 현미경에 의해 시리우스 붉은 얼룩과 더 샘플을 관찰 합니다. PGA 잔재 복굴절을 통해 명확 하 게 구분 하 고 나머지 영역 단면적10에 따라 측정할 수 있습니다.

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Representative Results

문화 챔버는 생물에 닫힌된 유체 사이클10,13 (그림 1) 관류 시스템 3 차원 문화 체계에 의하여 이루어져 있다. OCT 영상 테 Y 접점의 원심 끝에 삽입 되었고 이미징 실리콘 튜브에서 철수. 10 월 영상 처음 생물 재배 중 생 분해성 고분자 비 계 기반 TEBVs의 구조적 특성을 나타내는 데 사용 되었습니다.

그림 2 이들을 통해 조작 혈관 개장의 과정을 보여주는 횡단면 실시간으로 조직 미세의 이미징. 기하학적 형태, 타악기 자극의 존재 뿐 아니라 다른 문화 시간 포인트 벽 두께, 분해성 PGA 콘텐츠 및 TEBV 두께의 비교를 포함 하 여 평가 되었다. 두께 감소의 추세와 극적으로 설계 조직 문화의 첫 2 주 내에서 변화 신호 풍부한 PGA 점진적인 저하와 새로운 조직 느슨하게 꽉의 구조 제안 모습 이었다. 문화에서 21 일에는 맥 관 구조 기질 고르게 분포와 높은 신호 구성 요소 주로 소산 부드러운 구조를 형성 했다. 도 신호 TEBVs의 벽 두께 문화의 3 주 후에 점차적으로 증가. 이전 발생이 리 모델링 하 고 형태학 상 변화는 동적 그룹 (그림 3)에서 더 분명 각 성. 그로 인하여 10 월 영상을 현장에서 시각화를 설계한 혈관 형태 및 장기 실행 문화 중 실시간으로에서 수 있습니다.

그림 4 는 10 월 문화의 4 주 후 TEBV의 histopathological 발견 이미지 비교. Masson의 trichrome 얼룩 콜라겐 섬유 설계 된 선박 (그림 4B)의 미디어 계층에서 PGA 나머지 함께 특정 방향에서 분산을 보여 줍니다. 시리우스 붉은 얼룩 PGA 잔재와 콜라겐 구성 요소 (그림 4C) 편광된 현미경을 사용 하 여 공개. 소형 미세 조작된 혈관의 스캐닝 전자 현미경 조직학 평가 (그림 4D)와 비교 되었다. 함께 찍은, OCT 이미지 나타났다 PGA 다른 크기와 다공성 네트워크 구조. PGA 발판의 구조는 분명 한 변화 문화의 초기 단계에서 문화 매체와 직접 접촉에 의해 부 어. 하지만 PGA의 신호 강도 감소 했다. PGA 구성 요소 분해 되었고 세포와 세포 외 기질 대체. 적은 조각 보였다 4 주 기간. 횡단면 설계 혈관의 SEM 이미지 보육 시간 연장에 섬유 파열을 시연 했다. 재료 및 세포 외 매트릭스 복합 재료 더 콤팩트 하 고 더 적은 투명도와 벌집 모양의 구조에서 했다.

Figure 1
그림 1 . 조직 문화 챔버는 생물 및 10 월 이미징 관류 시스템에서의 혈관 문화 시스템 엔지니어링의 도식. 타악기 펌프 biomechanical microenvironment 시뮬레이션 안정적인 유체 흐름 제공. 10 월 이미징 카 테 테 르는 문화 챔버에 실리콘 튜브에 다시 당겨 졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 미세 조직의 문화 중 혈관 설계. 문화 시간 동안 신호 풍부한 PGA 점차적으로 저하 하 고 새로운 조직 구조에서 이었다 느슨한 꽉. TEBVs는 부드러운 표면과 풍부한 기질 문화의 4 주 후에 고르게 분포 했다. 그것은 실시간으로 단면 이미지를 통해 설계 된 혈관 개장의 과정을 보여주었다. 이 그림에서 첸, 외 알W. 수정 되었습니다. 10 여기에 사용 되는 실리콘 튜브의 두께 0.8 m m 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 10 월 측정에서 얻은 TEBV 벽 두께 변화의 동적 및 정적 그룹 혈관 개장 동안 비교. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림에서 첸, 외 알W. 수정 되었습니다. 10 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 생 분해성 폴리머 기반 조직 설계 혈관의 이미징. (A) 10 월 문화의 4 주 후 TEBV의 이미지. M: 문화 매체; S: 실리콘 튜브; 여기에 사용 되는 실리콘 튜브의 두께 0.8 m m 이다. 흰색 화살표 표시 TEBV. 빨간색 화살표 표시 PGA 조각. (B) Masson의 trichrome 얼룩 미디어 계층의 설계 선박에 PGA의 잔여 콘텐츠와 함께 잘 조직 된 콜라겐 섬유 시연. 눈금 막대는 편광된 현미경을 사용 하 여 100 µ m. (C) 시리우스 붉은 얼룩 밝혀 PGA 잔재를 =. 녹색 화살표는 PGA 단편을 나타냅니다. 눈금 막대: 100 µ m. (D) 스캐닝 전자 현미경 조밀한 미세 조작의 조직학 평가와 비교를 보여주 했다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

선박 구조와 설계를 생성 하 고 네이티브 혈관의 그들과 유사한 기계적 특성 임상 사용에 대 한 시간 단축으로 이어질 수 있는 혈관 공학의 궁극적인 목표 이다. 광학 이미징 기술을 불 임의7을 타협 하지 않고 문화 환경에 문화 및 노출 이식 통해 개별 구조를 모니터 수 없습니다 설계 조직 혈관 특정 부품의 시각화를 허용 합니다. 이 문서에서는 문화 챔버 관류 시스템에서 분리 된다. 비교적 독립적인 관류 시스템 문화 중 오염 감소 위험 10 월 guidewire의 배치를 보장합니다. 이 intraluminal 양식 적임 이미징 쉽게 채택 하는 한편 고 전에 사용 될 것으로 예상 고해상도 접근 그 histopathology의 TEBV 성장 상태 평가 더 실용적 만들었고 심지어 사이트에 TEBVs의 안전 모니터링 또는 후에 임 플 란 트 배치.

현재 프로토콜 분해성 폴리머 기반 엔지니어링된 선박 개발 카 테 터 기반 OCT를 사용 하 여 평가를 쉽게 사용할 수, 빠른 실시간 및 비파괴 이미징 전략을 나타냅니다. 동적 과정의 관측을 통해 몇 가지 주요 요인에 영향을 미치는 혈관 공학, 오염 또는 일치 하지 않는 셀 소재 상호 작용 조직 손실에 구분할 수 조기 발견으로. 프로토콜의 효능을 보장 하기 위해 중요 한 단계 포함 PGA NaOH 수정 비 계, 비 계, 모니터링 시스템, 빠른 분리 메 마른 문화 시스템에 숙련 된 카 테 터 작업 프로세스 HUASMCs의 시드 성공의 제조 .

이 기술은 저하 상태 및 새로운 조직으로 혼합 PGA 장비의 복잡 한 구조를 평가 하기 위해 활용할 수 있습니다. 다공성 네트워크 구조를 가진 고분자 발판 점차적으로 저하 하 고 처음 3 주 동안, 3 치수 구조를 가진 세포 접착 및 세포 외 매트릭스 증 착에 대 한 중요 한 혈관 개장의 과정 영양소 교환 및 신호 캐리어15,16. 시리우스로 명확 하 게 식별 하는 엔지니어링된 선박에 PGA 잔재의 정량화에 대 한 레드 스테인드 이미지, 편광된 현미경17 비 계 기반 분해 혈관 공학에서의 사용 후 표준 평가 될 수가 있다 재배입니다. 따라서 10 월 영상 편광된 현미경과 함께 혈관 공학에서 PGA 저하를 평가 하기 위한 질적, 양적 방법 역할을 수 있습니다.

이 기법은 제한 설계 혈관 개장 동안 셀 확산, 유통, 세포-세포 및 세포-ECM 상호 작용을 평가 하기 위해 해상도 제한입니다. TEBVs 미세 세포 또는 subcellular 레벨18 을 조사 하 고 성장 속도 론을 계량 하는 적당 한 방법의 찾을 하겠습니다. 10 월 영상의 평균 광 신호의 정량 분석, 우리 혈관 공학에서 소재 저하의 메커니즘에 더 자각 수 있습니다. 이러한 실험 우리의 미래 연구에 대 한 고려 되 고 있다.

전반적으로, 우리의 결과 10 월을 쉽게 사용할 수, 빠른 실시간 및 비파괴 이미징 성장 모니터링 전략 및 TEBVs의 개장은 보여 줍니다. 그것은 성격 구조 건축 특징 및 설계 혈관의 장기 개장 과정 활용. 설계 된 선박에 고분자 잔재의 정량화에 대 한 추가 증거를 제공 하는 편광된 현미경의 응용 프로그램은 10 월 이미지와 결합 하는 비 계 저하를 평가 하기 위한 유용할 수 있습니다. 함께 찍은, 현재 프로토콜 혈관 조직 공학에서의 응용 프로그램에 대 한 10 월의 유망 값을 보유 합니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

우리는 과학 기술 계획 프로젝트 중국의 광 동 지방 (2016B070701007)의이 작품을 지 원하는 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PGA mesh Synthecon
silicone tube Cole Parmer
connector Cole Parmer
intravascular OCT system St. Jude Medical, Inc ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic Philips FEI Philips XL-30
polarized microscope Olympus Olympus BX51
sutures Johnson & Johnson
pulsatile pump Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software St. Jude Medical, Inc

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References

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Chen, W., Liu, S., Yang, J., Wu, Y., Ma, W., Lin, Z. Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58040, doi:10.3791/58040 (2018).More

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