Summary
Um protocolo passo a passo para ensaios não destrutivos e longo período de acompanhamento do processo de remodelação vascular e degradação de andaime na cultura em tempo real de biodegradáveis poliméricos baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos com estimulação pulsátil usando a tomografia de coerência óptica é descrito aqui.
Abstract
Enxertos vasculares projetados com propriedades estruturais e mecânicas similares ao natural dos vasos sanguíneos são esperados para atender à crescente demanda para bypass arterial. Caracterização da dinâmica de crescimento e processo de remodelação de polímeros degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos (TEBVs) com estimulação pulsátil são cruciais para a engenharia de tecido vascular. Técnicas de imagem ópticas destacam-se como poderosas ferramentas para monitorar a vascularização do tecido projetado, permitindo imagens de alta resolução em cultura em tempo real. Este artigo demonstra um rápido em tempo real e não destrutiva imaging estratégia para monitorar o crescimento e remodelação do TEBVs na cultura a longo prazo usando tomografia de coerência óptica (OCT). Morfologia geométrica é avaliada, incluindo o processo de remodelação vascular, espessura de parede e comparação da espessura TEBV em pontos de cultura diferente tempo e presença de estimulação pulsátil. Finalmente, a OCT fornece possibilidades práticas para observação em tempo real de degradação do polímero nos tecidos reconstrução sob estimulação pulsátil ou não e em cada segmento de navio, por em comparação com a avaliação do uso de degradação do polímero varredura de elétrons microscopic(SEM) e microscópio polarizado.
Introduction
Engenharia de tecidos vasos sanguíneos (TEBVs) é o material mais promissor como um enxerto vascular ideal1. A fim desenvolver enxertos para ser clinicamente útil com propriedades estruturais e funcionais semelhantes como vasos nativos, várias técnicas foram projetadas para manter a função vascular2,3. Embora tenha havido navios projetados com perviedade aceitável durante a implantação e em estudo clínico de fase III4, cultura a longo prazo e alto custo também mostram a necessidade de acompanhamento do desenvolvimento de TEBVs. Compreensão dos processos de crescimento, remodelação e adaptação de matrix(ECM) extracelular em TEBVs no ambiente biomimético mecânica pode fornecer informações cruciais para o desenvolvimento da engenharia de tecido vascular.
A estratégia ideal para acompanhar o desenvolvimento da engenharia vasos de pequeno diâmetro5 deve ser não-destrutiva, estéril, longitudinal, tridimensional e quantitativa. TEBVs em condições de cultura diferentes puderam ser avaliadas por esta modalidade de imagem, mesmo incluindo alterações antes e após transplante vascular. São necessárias estratégias para descrever as características dos navios de vida projetada. Técnicas de imagem ópticas permitem a visualização e quantificação de deposição de tecidos e biomateriais. Outras vantagens são a possibilidade de habilitar tecidos profundos e sem etiqueta de imagem com alta resolução6,7. No entanto, as moléculas de imagem específicos e menos facilmente acessível equipamento óptico para monitoramento em tempo real é um obstáculo prático, que limitou a aplicação extensiva da microscopia óptica não-linear. Tomografia de coerência óptica (OCT) é uma abordagem óptica com intravascular modalidade de imagem como uma ferramenta clínica utilizado para orientar a terapia intervencionista cardíaca8. Na literatura, o método de outubro foi relatado como uma forma de avaliar a espessura da parede do TEBVs9,10, juntamente com a afirmativas modalidades de imagem para pesquisa de engenharia de tecido vascular. Considerando que, a dinâmica da engenharia vascular crescimento e remodelação não foi observada.
Neste manuscrito, detalhamos a preparação de biodegradáveis poliméricos baseados no cadafalso TEBVs para cultura de quatro semanas. Células de músculo liso vascular humano artérias umbilicais (HUASMCs) são expandidas e semeadas em andaimes de ácido (PGA) um poroso polyglycolic degradável em bioreator. Polímeros biodegradáveis desempenham o papel em um substrato temporário para a engenharia de tecidos e tem uma certa degradação taxa11. Para garantir uma correspondência adequada entre neo-tecido formação e degradação de andaime, andaimes de ECM e PGA são fatores cruciais para a remodelação vascular eficaz. O sistema de perfusão simula o microambiente biomecânico dos vasos nativos e mantém uma consistente deformação sob estimulação de pressão.
O objectivo do protocolo apresentado é para descrever uma estratégia relativamente simples e não-destrutiva para TEBVs de imagens e acompanhamento a longo prazo da cultura. Este protocolo pode ser utilizado para a visualização de alterações morfológicas e medições de espessura de navios projetados sob condições de cultura diferentes. Além disso, as análises de degradação de materiais baseados em polímero no tecido andaimes de engenharia podem ser realizadas para a identificação. Combinando métodos de varredura de elétrons microscopic(SEM) e polarizado microscópio usado neste protocolo, correlação e quantificação de distribuição da matriz extracelular e PGA degradação podem ser feitas, que pode facilitar a avaliação do andaime degradação combinado com imagens de OCT.
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Protocol
1. degradáveis PGA andaime com base em engenharia de tecidos vasos cultura
- Fabricação de andaime de PGA
- Costurar malha PGA (19 mm de diâmetro e 1 mm de espessura) em torno da tubulação do silicone esterilizada por óxido de etileno (17 cm de comprimento, diâmetro de 5,0 mm e 0,3 mm de espessura) usando sutura de 5-0.
- Costurar o politetrafluoroetileno (ePTFE, 1cm de comprimento) com 4-0 sutura em cada extremidade da malha de PGA e sobreposto por 2 mm.
- Mergulhe andaimes PGA com a mão no 1 mol/L do NaOH para 1 min para ajustar a estrutura espacial da malha e molhe com água de grau de cultura de tecidos três vezes por 2 min cada. Cada tempo... suavemente pat seco o andaime com um papel absorvente. Em seguida seca andaimes em uma capa com um ventilador por 1h.
- Montagem do biorreator e a junção-Y para a imagem latente OCT
- Mergulhe o auto-desenvolvimento vidro cilíndrico biorreator (10 cm de diâmetro e 11,7 cm de altura com quatro lábios dentro e quatro lado-braços para fora do reator, como mostrado na Figura 1), PGA andaimes, tubo de silicone (diâmetro externo de 5 mm, espessura 0,3 mm), biocompatíveis tubos, conectores, barra de agitação e equipamentos para montagem em um tanque de etanol 95% por 2 h.
- Andaime de PGA puxar pelo lado-braços de bioreator conectado a um lado com um conector, bem como um outro lado com a junção-Y costumava entregar OCT fio-guia. Monte outro andaime PGA em bioreator da mesma forma. Por favor, consulte a Figura 1.
- Caber aos lábios de biorreator de ePTFE apertando com suturas de 4-0.
- Colocar o biorreator no tanque de etanol novamente por 1h e secar durante a noite de capuz com ventilador.
- Semeadura de HUASMCs e condicionamento de biorreator estático
- Isole o HUASMCs das artérias umbilicais humanas por técnicas padrão explante.
- Expandir e manter as células em meio de crescimento de células de músculo liso é composto por meio DMEM, 20% de soro fetal bovino, 2,36 mg/mL HEPES, penicilina de U/mL 100 G, 50 µ g/mL prolina, 20 alanina µ g/mL, 50 glicina µ g/mL, 1,5 µ g/mL CuSO4, ácido ascórbico de 50 µ g/mL , 10 ng/mL fator de crescimento fibroblástico básico e ng/mL 10 fator de crescimento derivado de plaquetas.
- Sementes HUASMCs na concentração de 5 × 106 células/mL em meio de cultura acima para os andaimes de PGA.
- Colocar uma celeuma bar (1,5 cm de comprimento) em bioreator. Inserir um tubo de alimentação (5 mm de diâmetro, 15 cm de comprimento) e três segmentos de tubo curto (5 mm de diâmetro, comprimento de 7 cm) para a troca gasosa através da tampa de rolha de silicone.
- Anexe filtros de 0,22 µm PTFE para cada tubo de mudança de ar e tampa de um heparina para o tubo de alimentação. Ajuste a barra de agitação com uma velocidade de agita de 13 tiros por minuto. Monte o biorreator de vidro, tampa de rolha de silicone e andaime PGA para o sistema de cultura.
- Permitir que HUASMCs aderir para 45 min, apoiando o biorreator cada 15 min com suporte, para a esquerda e direita. As portas de reator e articulações são seladas com película de parafina.
- Conectar o Luo-Ye bomba, saco do PBS, o driver com tubos biocompatíveis, como o sistema de perfusão. Abra a unidade para encher os tubos com PBS.
- Coloque o biorreator global numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C. Encha a câmara de cultura com 450 mL de meio de cultura de HUASMCs.
- Pressione o botão parar e desligar a energia do dispositivo rígido. Crescem os andaimes semeados sob cultura estática por uma semana.
- Altere o meio de cultura cada 3-4 dias, metade do meio velho através do tubo de alimentação e voltar a encher o reator com uma quantidade equivalente de meio de cultura fresco por aspiração.
- Preparação do sistema de perfusão para a imagem latente OCT
- Bomba de líquidos na bolsa PBS a circular por tubos biocompatíveis e voltar para o saco.
- Abra o poder do driver e regular o ajuste da bomba com uma frequência de 60 batimentos por minuto e saída de pressão sistólica de 120 mmHg. Ajuste os parâmetros mecânicos de acordo com as necessidades da cultura vascular engenharia de tecidos.
- Clique no botão Executar para funcionar o sistema de perfusão. Fornece a estimulação pulsátil fixa acima para os vasos por 3 semanas, iterativamente, pressurizando tubos biocompatíveis10,12 após 1 semana de cultura estática.
2. realização de imagem óptica com OCT
- Use uma fonte de luz para garantir a resolução axial de 10-20µm e a profundidade da imagem de 1-2 mm para identificar a estrutura de TEBV com base no domínio da frequência OCT intravascular de imagem sistema9.
- Ligue o interruptor de energia e abrir o software de captura de imagem.
- Conecte o cateter de imagem óptica de fibra para o controlador de motor de acionamento e óptico (DOC) com função de retirada automática do cateter.
- Definir parâmetros de taxa de aquisição de imagem para 10 quadros por segundo com uma velocidade de recuo automático de 10 mm/s.
- Fixe cateter de imagem Y-junção através do tampão de heparina com uma agulha de 18G.
- Coloque o cateter para dentro do tubo do silicone e identificar a tensão da sutura de malha PGA antes de carregar o andaime PGA para o biorreator.
- Coloque a ponta do cateter sobre a região de interesse. Ajuste o dispositivo de retração e verificar a qualidade de imagem8.
- Adquirir imagens em 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 dias em cultura para cada TEBV individual e salvar sequencialmente com tempo real observação da microestrutura TEBV, incluindo morfologia superficial, estrutura interna e composição.
- Repita a medição por 3 vezes para obter a mensuração fiável dos navios projetados cada vez. Capture uma série de imagens durante todo o teste usando o software de captura de imagem.
3. análise de imagem
- Use o software de análise de imagem para medir a espessura de parede TEBV. Selecione a imagem a ser analisada. Clique na ferramenta de rastreamento para identificar o lado interno do TEBV pelo software automaticamente e esboçar manualmente o lado exterior. Um diagrama de espessura irá aparecer na tela.
- Repita a medição por 5 vezes obter uma medida confiável das construções. A análise de OCT foi realizada por dois investigadores independentes cegados para a informação obtida.
4. colheita de TEBV e processamento de tecido
- Abrir a tampa de rolha de silicone colocado sobre o biorreator quando a cultura for concluída e descartar o meio de cultura. Afrouxar dos lábios de biorreator de ePTFE e cortar os tubos de silicone do lado exterior da ePTFE com uma tesoura. TEBVs de bioreator de colheita e cortadas em seções para exame de microscopia eletrônica de varredura.
- Tirar o resto de TEBVs e corte em 4 µm seções espessas. Retire o suporte do tubo do silicone e corrigir as seções com paraformaldeído 4%. Execute rotina histológica coloração de Masson tricromo e Sirius vermelho para examinar a morfologia do colágeno e PGA10,13,14.
- Para avaliar o conteúdo do PGA e componente do colágeno, observe amostras histológicas com coloração de Sirius vermelho por um microscópio de polarização. Remanescentes de PGA são claramente demarcadas através de birrefringência e área remanescente pode ser quantificada com base na área de seção transversal10.
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Representative Results
O sistema de cultura tridimensional consistiu de uma câmara de cultura em bioreator e o sistema de perfusão com um fluido de ciclo fechado10,13 (Figura 1). O cateter de imagem OCT foi inserido na extremidade distal da junção-Y e puxado para trás no tubo do silicone para a imagem latente. Imagem de OCT foi usada primeiramente para delinear a caracterização estrutural de biodegradáveis poliméricos TEBVs baseados em andaime durante o cultivo do biorreator.
Figura 2 mostrou o processo de remodelação vascular engenharia através destes transversal da imagem latente da microestrutura de tecido em tempo real. Morfologia geométrica foi avaliada, incluindo espessura de parede, conteúdo de PGA degradável e comparação da espessura TEBV em pontos de tempo de cultura diferente, bem como a presença de estimulação pulsátil. Foi vistas uma tendência de diminuição da espessura e dramaticamente as alterações do tecido projetado dentro das primeiras duas semanas de cultura, sugerindo degradação gradual do sinal-rico PGA e a estrutura do novo tecido de solto para apertado. Em 21 dias na cultura, a vasculatura tinha formado uma estrutura lisa com matriz extracelular uniformemente distribuídos e componentes de sinal elevado principalmente se dissipou. A espessura da parede do TEBVs com o mesmo sinal aumentado gradualmente após três semanas de cultura. Esta remodelação ocorreu mais cedo e as alterações morfológicas mais obviamente manifestaram no grupo dinâmico (Figura 3). Assim, OCT permite que imagens da morfologia vascular projetada para ser visualizado no local e em tempo real no curso de cultura de longa duração.
Figura 4 compararam as imagens de OCT com achados histopatológicos de TEBV após 4 semanas da cultura. A coloração tricromo de Masson demonstra fibras de colágeno, distribuídas em uma determinada direção, juntamente com os restos do PGA em camada de mídia dos navios projetados (Figura 4B). Coloração vermelho Sirius revelou PGA remanescentes e componente colágeno usando um microscópio de polarização (Figura 4). Micrografias de elétron digitalização dos navios projetados com microestrutura compacta foram comparadas com avaliação histológica (Figura 4). Tomados em conjunto, imagens OCT mostraram PGA com tamanhos diferentes e a estrutura de rede porosa. A estrutura do andaime PGA não tem nenhuma mudança óbvia e inchados pelo contato direto com meio de cultura na fase inicial da cultura. Mas foi reduzida a intensidade do sinal da PGA. Componentes do PGA foi desintegrado e substituídas por células e matriz extracelular. Poucos fragmentos foram vistos ao longo período de quatro semanas. SEM imagens dos navios projetados transversais demonstraram ruptura da fibra para a extensão do tempo de incubação. Compósitos de matriz extracelular e material foram em estrutura de favo de mel com mais compacta e menos transparência.
Figura 1 . Esquemático do tecido engenharia sistema vascular de cultura, que consistia em uma câmara de cultura em bioreator e o sistema de perfusão para a imagem latente de OCT. A bomba pulsátil desde um fluxo de fluido estável, simulando o microambiente biomecânico. Cateter de imagem OCT foi puxado para trás no tubo do silicone na câmara de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . A microestrutura do tecido projetado vasos sanguíneos durante a cultura. Ao longo do tempo de cultura, sinal-rico PGA gradualmente degradada e a estrutura do novo tecido foi solto-apertado. TEBVs tinha uma suave superfície e abundante da matriz extracelular uniformemente distribuída após quatro semanas de cultura. Ele mostrou o processo de remodelação vascular engenharia através de imagens transversais em tempo real. Esta figura foi modificada de Chen, w. et al. 10 a espessura do tubo de silicone usado aqui é 0,8 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Comparação da mudança de espessura de parede TEBV durante a remodelação vascular grupos dinâmicos e estáticos obtidos de medições de OCT. Barras de erro indicam o erro padrão. Esta figura foi modificada de Chen, w. et al. 10 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Imagem de biodegradáveis baseado em polímero de engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos. (A) imagem do OCT de TEBV após quatro semanas de cultura. M: meio de cultura; S: tubo de silicone; a espessura do tubo de silicone usado aqui é 0,8 mm. Seta branca indicado TEBV. Seta vermelha indicado fragmento de PGA. (B) a coloração tricromo de Masson demonstrou fibras de colágeno bem organizada juntamente com o conteúdo residual do PGA em camada de mídia dos navios projetados. Barra de escala = 100 µm. (C) Sirius vermelho coloração revelada PGA remanescentes usando um microscópio de polarização. Seta verde indica o fragmento de PGA. Barra de escala: 100 µm. (D) Scanning electron micrografias de embarcação projetada com microestrutura compacta foram mostrou para comparar com avaliação histológica. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para gerar engenharia vasos com estruturais e propriedades mecânicas semelhantes dos nativos de vasos sanguíneos podem levar a encurtar o tempo para uso clínico e é o objetivo final de engenharia vascular. Técnicas de imagem ópticas permitem a visualização da engenharia de tecidos vasculares componentes específicos, que não pode monitorar as construções individuais ao longo de enxertos de cultura e exposição a um ambiente de cultura sem comprometer a esterilidade7. Neste artigo, a câmara de cultura é separadoda do sistema de perfusão. O sistema de perfusão relativamente independente garante o risco de diminuição da poluição durante a cultura e a colocação do fio-guia OCT. Entretanto esta intraluminal de imagem modalidade adoptada fácil e monitorização da segurança de TEBVs em situs com alta resolução se aproximando da histopatologia, que fez a avaliação do estado de crescimento TEBV mais prático e era mesmo esperado para ser usado antes ou após a colocação do implante.
O protocolo atual indica uma estratégia de imagem prontamente disponível, rápido em tempo real e não destrutiva para avaliar o desenvolvimento de degradáveis baseados no polímero projetado embarcação usando a OCT baseado no cateter. Através da observação do processo dinâmico, alguns fatores principais que afetam a engenharia vascular, tais como contaminação ou incomparável interação célula-material levou à perda de tecido, podem ser distinguidas com deteção adiantada. Passos críticos para garantir a eficácia do protocolo incluem a fabricação de andaime de NaOH-modificado PGA, sucesso de semeadura de HUASMCs no processo de operação de cateter qualificados de andaime, sistema de cultura estéril de separação do sistema de monitoramento, rápido e .
Esta técnica pode ser utilizada para avaliar Estados de degradação e complexa estrutura de andaimes PGA misturado com tecido novo. O andaime polimérico com estrutura de rede porosa degrada gradualmente e domina o processo de remodelação vascular nas três primeiras semanas, que são importantes para a aderência de célula e deposição de matriz extracelular, com uma estrutura de três-dimensionado para troca de nutrientes e como um sinal portador15,16. Para a quantificação dos remanescentes do PGA em vasos projetados claramente identificados por Sirius imagens manchados de vermelho, o uso de microscópios polarizada17 em degradável baseados em andaime vascular engenharia tem o potencial para se tornar a padrão avaliação após cultivo. Portanto, imagem OCT combinada com microscópio de polarização poderá servir como métodos quantitativos e qualitativos para avaliar a degradação de PGA em engenharia vascular.
Uma limitação dessa técnica é o limite de resolução para avaliar a interação de proliferação, a distribuição, a célula-célula e célula-ECM celular durante a remodelação vascular engenharia. Esperamos encontrar um método adequado para investigar TEBVs microestrutura no nível celular ou subcelular18 e quantificar a cinética de crescimento. Com análise quantitativa de sinais ópticos médios da imagem latente da OCT, talvez sejamos mais conscientes do mecanismo da degradação material em engenharia vascular. Tais experiências estão sendo consideradas para nossos futuros estudos.
Em geral, nossos resultados mostram que o TOC é um prontamente disponível, rápido em tempo real e não-destrutiva de imagens estratégia para monitorar o crescimento e remodelação de TEBVs. Ele é utilizado para caracterizar estruturais características arquitectónicas e o processo de remodelação a longo prazo dos navios projetados. A aplicação do microscópio polarizado que forneceu provas suplementares para a quantificação dos remanescentes poliméricos em vasos de engenharia pode ser útil para avaliar a degradação de andaime, combinada com imagens de OCT. Tomados em conjunto, o protocolo atual tem um valor promissor da OCT para sua aplicação na engenharia de tecido vascular.
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Disclosures
Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Nós gostaríamos de reconhecer a ciência e a tecnologia de projeto de planejamento da província de Guangdong de China (2016B070701007) para apoiar este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PGA mesh | Synthecon | ||
| silicone tube | Cole Parmer | ||
| connector | Cole Parmer | ||
| intravascular OCT system | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| scanning electron microscopic | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| polarized microscope | Olympus | Olympus BX51 | |
| sutures | Johnson & Johnson | ||
| pulsatile pump | Guangdong Cardiovascular Institute | ||
| LightLab Imaging software | St. Jude Medical, Inc |
References
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