Summary
Шаг за шагом протокол для неразрушающего контроля и длительного периода наблюдения за процессом сосудистого ремоделирования и эшафот деградации в реальном времени культуры биоразлагаемые полимерные основанных на эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов с пульсирующего стимуляции Здесь описывается использование оптическая когерентная томография.
Abstract
Инженерии сосудистых имплантатов с структурно-механические свойства, аналогичные природные кровеносных сосудов, как ожидается, удовлетворять растущий спрос на артериальной объездной. Характеристика динамики роста и модернизации процесса разложению полимер на основе эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов (TEBVs) с пульсирующего стимуляции имеет решающее значение для сосудистой тканевой инженерии. Оптические методы визуализации выделяются как мощные инструменты для мониторинга васкуляризации инженерии тканей позволяет с высоким разрешением изображений в реальном времени культуры. Этот документ демонстрирует неразрушающего и быстро в реальном времени визуализации стратегии для мониторинга роста и реконструкции TEBVs в долгосрочные культуры с помощью оптическая когерентная томография (Окт). Оценивается геометрические морфологии, включая сосудистого ремоделирования процесс, толщина стенок и Сравнение толщины TEBV в моменты времени различные культуры и наличие пульсирующего стимуляции. Наконец OCT предоставляет практические возможности для реального времени наблюдения деградации полимера в реконструкции тканях под пульсирующего стимуляции или не и в каждом сегменте судна, по сравнению с оценкой использования деградации полимера Сканирование, microscopic(SEM) электронов и поляризационный микроскоп.
Introduction
Ткани инженерии кровеносных сосудов (TEBVs) является наиболее перспективных материалов как идеальный сосудистого трансплантата1. Для того, чтобы развивать графтов клинически полезным с аналогичными структурных и функциональных свойств как родной судов, были разработаны несколько методов для поддержания функции сосудистого2,3. Хотя там были инженерии судов с приемлемым проходимость ставок во время имплантации и клиническое исследование III фазы4, долгосрочные культуры и высокой стоимости также показывают необходимость наблюдения за развитием TEBVs. Понимание процессов роста, модернизация и адаптация внеклеточные matrix(ECM) в TEBVs в среде химико механические biomimetic может предоставить важную информацию для развития сосудистой тканевой инженерии.
Идеальной стратегии для отслеживания развития инженерии судов малого диаметра5 должно быть неразрушающего контроля, стерильные, продольная, трехмерные и количественные. TEBVs условиях различные культуры могут оцениваться этой модальности изображений, включая даже изменения до и после трансплантации сосудов. Необходимо разработать стратегии для описания особенностей жизни инженерии судов. Оптические методы визуализации позволяют визуализации и количественной оценки осаждения ткани и биоматериалов. Другими преимуществами являются возможность включить глубокие ткани и этикетка бесплатные изображения с высоким разрешением6,7. Однако изображение конкретных молекул и менее легко доступны оптического оборудования для мониторинга в реальном времени является значительное практическое препятствие, которое имеет ограниченную широкое применение нелинейной оптической микроскопии. Оптическая когерентная томография (Окт) — это оптический подход с внутрисосудистого изображений модальности как широко используется клинический инструмент направлять сердечной интервенционной терапии8. В литературе метод октября было сообщено о том, как способ оценки толщины стенок TEBVs9,10, в сочетании с позитивных изображений условия для сосудистых тканей инженерных исследований. В то время как динамика инженерии сосудистой роста и реконструкции не наблюдалось.
В этой рукописи мы подробно подготовку биоразлагаемые полимерные основанных на эшафот TEBVs для четырех недель культуры. Человека пупочных артерий сосудистой гладкомышечные клетки (HUASMCs) расширил и посеяны в пористых разложению Полигликолидная кислота (PGA) леса в биореактор. Биоразлагаемые полимеры играть роль в временной субстрат для тканевой инженерии и имеют определенные11деградации ставка. С тем чтобы обеспечить соответствующий матч между деградацией лесов и нео-ткани, ECM и PGA подмостей являются важнейшими факторами для эффективного сосудистого ремоделирования. Система перфузии имитирует биомеханических микроокружения родной судов и поддерживает последовательную деформации под давлением стимуляции.
Цель представленных протокола-изложить стратегию относительно простой и неразрушающего контроля для TEBVs изображений и долгосрочный мониторинг культуры. Этот протокол может использоваться для визуализации морфологических изменений и измерения толщины инженерии судов в условиях иной культуры. Кроме того можно выполнить анализ деградации материалов на основе полимеров в ткани, инженерные строительные леса для идентификации. Комбинируя методы сканирования электрон microscopic(SEM) и поляризационный микроскоп, используемые в этот протокол, корреляции и количественной оценки распределения внеклеточного матрикса и PGA деградации может быть сделано, которая может содействовать оценке эшафот деградация в сочетании с октября изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. разложению PGA леску на основе культуры ткани инженерии судов
- Изготовление PGA эшафот
- Шить PGA сетки (диаметром 19 мм и толщиной 1 мм) вокруг Силиконовая трубка, стерилизована окисью этилена (длина 17 см, диаметр 5.0 мм и толщиной 0,3 мм) с помощью швов 5-0.
- Шить политетрафторэтилена (ePTFE, 1 см длиной) с 4-0 швом на каждом конце PGA сетки и перекрывается 2 мм.
- Окуните PGA подмости с рукой в 1 моль/Л NaOH за 1 мин, чтобы скорректировать структуру пространственной сетки и смочите водой культуры ткани класса три раза за 2 мин. Нежно погладить сухой леску с папиросной бумаги каждый раз. Затем высушите до леса в капюшон с вентилятором на 1 ч.
- Ассамблея биореактора и Y-соединения для октября изображений
- Замочить самостоятельно разработанные стекла цилиндрических биореактора (диаметр 10 см и 11,7 см в высоту с четырьмя губы внутри и четыре стороны оружия вне реактора, как показано на рис. 1), PGA подмостей, силиконовые трубки (внешний диаметр 5 мм, толщина 0,3 мм), биосовместимых трубы, разъемы, перемешать бар и оборудование для сборки в баке этанола 95% за 2 ч.
- Вытяните PGA леску через сторону герб биореактора, подключенных к одной стороне с разъемом, а также другая сторона с Y-Джанкшн, используются для доставки OCT проволочного проводника. Соберите другую леску PGA в биореакторе таким же образом. Пожалуйста, обратитесь к рис.
- Установите ePTFE биореактор губы, затянув с 4-0 швами.
- Поместить реактор в этанол бак снова за 1 ч и высохнуть на ночь в капот с вентилятором на.
- Заполнение HUASMCs и статические биореактор кондиционирования
- Изолируйте HUASMCs от человеческой пуповинной артерии методами стандартных экспланта.
- Расширять и поддерживать клетки в гладкомышечные клетки рост среднего, состоящий из среде DMEM, 20% плода бычьим сывороточным, 2,36 мг/мл HEPES, 100 ед/мл пенициллин G, 50 мкг/мл пролина, 20 мкг/мл аланина, 50 мкг/мл глицин, 1,5 мкг/мл CuSO4, аскорбиновая кислота 50 мкг/мл , 10 нг/мл основные фибробластический фактор роста и 10 нг/мл тромбоцитарный фактор роста.
- Семена HUASMCs в концентрации 5 × 106 клеток/мл в выше питательной среды на PGA подмостей.
- Положите сенсацию бар (1,5 см длины) в биореактор. Вставка одного кормления труб (диаметром 5 мм, длина 15 см) и трех сегментов коротких труб (диаметром 5 мм, длиной 7 см) для газового обмена через крышку пробкой силикона.
- Прикрепите фильтры 0,22 мкм PTFE для каждого изменения трубку и один гепарина колпачок для питания трубки. Настройка панели перемешать с перемешивания скорость 13 выстрелов в минуту. Соберите стекла биореактора, силиконовая пробка крышки и PGA леску в системе культуры.
- Разрешить HUASMCs следовать за 45 мин, опираясь биореактор каждые 15 мин с подставкой, влево и вправо. Реактор портов и стыки загерметизированы с парафин фильм.
- Подключите Луо-Ye насос, PBS мешок, водитель с биосовместимыми трубы как система перфузии. Откроете диск для заполнения трубы с PBS.
- Поместите общий биореактор в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C. Заполните палаты культуры с 450 мл HUASMCs питательной среды.
- Нажмите кнопку «Стоп» и выключите устройство. Посеян подмостки под статической культуры растут на одну неделю.
- Измените культуру среднего каждые 3-4 дня, аспирационных половина из старой среды путем кормления трубки и заправки реактора с эквивалентное количество свежей питательной среды.
- Подготовка системы перфузии для октября изображений
- Перекачивать жидкости в мешке PBS распространить через биосовместимых трубы и обратно в мешок.
- Откройте силу водителя и регулировать параметр насос с частотой 60 ударов в минуту и вывода систолическое давление 120 мм рт.ст.. Механические параметры согласно потребностям инженерных сосудистой культуры ткани.
- Нажмите кнопку "запустить", чтобы сделать работу системы перфузии. Предоставить выше фиксированных пульсирующего стимуляции для судов на 3 недели, многократно герметизирующего биосовместимых трубы10,12 после 1 недели статической культуры.
2. выполнение оптических изображений с октября
- Используйте источник света для обеспечения осевой резолюции 10-20µm и глубина изображения 1-2 мм для определения структуры на основе частотной области октября внутрисосудистого изображений системы9TEBV.
- Включите выключатель питания и откройте программное обеспечение захвата изображения.
- Подключите волоконно оптических изображений катетер к мотор и оптических контроллер (DOC) с функцией автоматического отступление катетера.
- Установка параметров изображения приобретение ставки до 10 кадров в секунду с автоматической обратной протяжке скорость 10 мм/сек.
- Придаем изображений катетер Y-Джанкшн через гепарина колпачок с иглой 18G.
- Уложите силиконовые трубки катетера и определить герметичность шва PGA сетки перед загрузкой PGA леску на реактор.
- Поместите кончик катетера области интереса. Настройте устройство обратной протяжке и проверить качество изображения8.
- Получение изображений в 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 дней в культуре для каждого индивидуального TEBV и сохранить последовательно с наблюдения в реальном времени TEBV микроструктуры, включая поверхности морфологии, внутренней структуры и состава.
- Повторите измерение для 3 раз, чтобы получить надежное измерение инженерии судов каждый раз. Захват серии изображений на протяжении тестирования с использованием программного обеспечения захвата изображения.
3. томография анализ
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений для измерения толщины стенок TEBV. Выберите изображение для анализа. Щелкните инструмент отслеживания для определения внутренней стороне TEBV программное обеспечение автоматически и вручную эскиз внешней стороне. На экране появится диаграмма толщины.
- Повторите измерение в 5 раз получить надежное измерение конструкции. Был проведен анализ октября два независимых следователей, ослепленный к полученной информации.
4. урожай TEBV и обработки тканей
- Открыть крышку пробкой силикона помещен над биореактора по завершении культуры и отбросить питательной среды. Ослабьте ePTFE от биореактор губы и вырезать трубы силиконовые с внешней стороны ПТФЭ с ножницами. Урожай TEBVs от биореактор и нарезать разделы для сканирования электронной микроскопии экспертизы.
- Взять из остальной части TEBVs и нарезать 4 µm толщиной секции. Вытяните поддержки силиконовые трубки и исправить разделы с параформальдегида 4%. Выполняйте обычные гистологические окрашивание Массон в trichrome и Сириус красный для изучения морфологии коллагена и PGA10,,1314.
- Чтобы оценить PGA контента и компонент коллагена, наблюдать гистологических образцы с Sirius красное окрашивание, поляризационный микроскоп. PGA Остатки четко разграниченные через двойное лучепреломление и остаток области могут быть количественно основанные на площадь поперечного сечения10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Система трехмерного культуры состояла из палаты культуры в биореактор и перфузии системы с замкнутым циклом жидкости10,13 (рис. 1). Окт изображений катетер был вставлен в дистальный конец Y-Джанкшн и вытащил обратно в силиконовой трубки для изображений. Окт изображений впервые был использован для описания структурных характеристика биоразлагаемые полимерные основанные на эшафот TEBVs возделывание биореактора.
На рисунке 2 показан процесс инженерии сосудистого ремоделирования через эти поперечного сечения изображений микроструктуры ткани в режиме реального времени. Была проведена оценка геометрические морфологии, включая толщины стенок, разложению PGA содержание и Сравнение толщины TEBV в моменты времени различные культуры, а также наличие пульсирующего стимуляции. Тенденция снижения толщины и резко изменений инженерных ткани в течение первых двух недель культуры был замечен, предлагая сигнал-богатые люди PGA постепенной деградации и структура новой ткани от свободной до жесткой. На 21 день в культуре сосудистую сформировали гладкой структуры с внеклеточного матрикса равномерно распределены и высокий сигнал компонентов основном рассеялись. Толщина стенок TEBVs с даже сигнала увеличена постепенно после трех недель культуры. Эта реконструкция произошла раньше и морфологические изменения проявляется более очевидно в группе динамических (рис. 3). Тем самым OCT позволяет визуализации инженерных сосудистой морфологии для отображения на месте и в режиме реального времени в ходе длительных культуры.
Рисунок 4 сравнение OCT изображения с гистопатологические находки TEBV после 4 недель культуры. Массон trichrome окрашивание демонстрирует коллагеновые волокна, распределенных в определенном направлении, а также PGA остатки в слое СМИ инженерии судов (рис. 4В). Сириус красное окрашивание показали PGA остатки и коллаген компонент с помощью поляризационный микроскоп (рис. 4 c). Сканирования электрона микроскопии инженерии судов с компактным микроструктурой были сопоставлены с гистологической оценки (Рисунок 4 d). Взятые вместе, Окт изображений показал, что PGA был с разных размеров и структуры пористых сети. Структура леса PGA имеет никаких очевидных изменений и опухшие путем прямого контакта с питательной среды в ранней стадии культуры. Однако интенсивность сигнала PGA было сокращено. PGA компоненты распался и заменены клетки и внеклеточного матрикса. Меньшее количество фрагментов были замечены four-week период. SEM изображений поперечного сечения инженерии судов продемонстрировал разрыва волокна на продление время инкубации. В Сота подобную структуру с более компактной и менее прозрачности материала и внеклеточной матрицы композитов.
Рисунок 1 . Схема из ткани сосудистой культуры системы, которая состояла из палаты культуры в биореактор и перфузии системы визуализации OCT. Пульсирующего насос условии стабильного потока жидкости, имитируя биомеханических микроокружения. Окт изображений катетер был вытащил обратно в силиконовой трубки в зале культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Микроструктуры ткани инженерии кровеносные сосуды во время культуры. Со временем культуры PGA сигнал-богатые люди постепенно деградировали и жесткой структуры новой ткани было от свободно. TEBVs была гладкой поверхности и обильный внеклеточный матрикс равномерно распределены после четырех недель культуры. Он показал процесс инженерии сосудистого ремоделирования через поперечные изображения в режиме реального времени. Этот рисунок был изменен с Чэнь, W. et al. 10 толщина силиконовые трубки используется здесь составляет 0,8 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Сравнение изменения толщины стены TEBV во время сосудистого ремоделирования в динамических и статических групп, полученных в результате измерений Окт. Планки погрешностей указывают стандартную ошибку. Этот рисунок был изменен с Чэнь, W. et al. 10 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Imaging биоразлагаемых полимерных инженерии тканей кровеносных сосудов. (A) октября изображение TEBV после четырех недель культуры. M: питательной среды; S: силиконовые трубки; Толщина силиконовые трубки используется здесь составляет 0,8 мм. Белая стрелка указал TEBV. Красная стрелка указала PGA фрагмент. (B) Массон trichrome окрашивание продемонстрировал хорошо организованные коллагеновых волокон вместе с остаточное содержание PGA в слое СМИ инженерии судов. Шкалы бар = 100 мкм. (C) Сириус красное окрашивание показали PGA остатки с помощью поляризационный микроскоп. Зеленая стрелка указывает фрагмент PGA. Линейки: 100 µm. (D) проверка электрона микроскопии инженерии судна с компактным микроструктуры проявились для сравнения с гистологическим оценки. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для создания инженерии судов с структурных и механические свойства аналогичны родной кровеносных сосудов может привести к сократить время для клинического использования и является конечной целью сосудистой техники. Оптические методы визуализации позволяют визуализации сосудистой конкретных компонентов инженерии тканей, которые не могут контролировать отдельные конструкции всей культуры и воздействия графтов в среде культуры без ущерба для бесплодия7. В этой статье культуры Камера отделена от перфузии системы. Относительно независимых перфузии система гарантирует снижение риска загрязнения во время культуры и размещение OCT проволочного проводника. Тем временем этот внутрипросветная визуализации механизм принял легко и мониторинг безопасности TEBVs в situs с высоким разрешением приближается что гистопатология, который произвел оценку TEBV роста статуса более практичным и даже, как ожидается, использоваться до или После имплантата.
Текущий протокол указывает доступной, быстрый режиме реального времени и неразрушающего визуализации стратегии для оценки развития разложению на основе полимерной инженерии судна с помощью катетера основе OCT. Путем наблюдения за динамичного процесса некоторые основные факторы, влияющие на сосудистой инженерии, например загрязнение или непревзойденной взаимодействия клеток материал, привели к потере ткани, можно отличить с раннего обнаружения. Важнейшие шаги для обеспечения эффективности Протокола включают изготовление NaOH модифицированные PGA эшафот, успешного посева семян HUASMCs в эшафот, стерильные культуры системы разделения от системы мониторинга, быстрый и процесс работы квалифицированных катетер .
Этот метод может использоваться для оценки деградации государствам и сложную структуру PGA подмостей, смешивается с новой ткани. Полимерные леску с пористой сетевой структурой постепенно деградирует и доминирует процесс сосудистого ремоделирования в первые три недели, которые важны для клеточной адгезии и внеклеточной матрицы осаждения с трех концевые структурой для обмен питательных веществ и как сигнал несущей15,16. Для количественной оценки PGA остатки в инженерии судов четко определены Сириус красно окрашенных изображений, использование Поляризационные микроскопы17 разложению на основе эшафот сосудистой инженерии имеет потенциал, чтобы стать стандартной оценки после культивирование. Поэтому OCT изображений в сочетании с поляризационный микроскоп может служить качественные и количественные методы для оценки деградации PGA в сосудистой инженерии.
Ограничением этой методики является предел разрешения для оценки распространения, распределение, -клеток и клеток ECM взаимодействия клеток во время инженерии сосудистого ремоделирования. Мы надеемся найти подходящий метод для расследования TEBVs микроструктуры на клеточном и субклеточном уровне18 и количественно Кинетика роста. Количественный анализ среднего оптических сигналов OCT изображений мы могли бы быть более осведомлены о механизм деградации материала в сосудистой инженерии. Такие эксперименты в настоящее время рассматриваются для наших будущих исследований.
В целом наши результаты показывают, что октября является легкодоступной, быстрый режиме реального времени и неразрушающего визуализации стратегии для мониторинга роста и реконструкции TEBVs. Он используется для охарактеризовать структурные архитектурные особенности и долгосрочный процесс реконструкции инженерных судов. Приложение поляризационный микроскоп, который представил дополнительные доказательства для количественной оценки полимерных остатки в инженерии судов может быть полезным для оценки деградации лесов в сочетании с октября изображений. Взятые вместе, текущий протокол содержит перспективные значение OCT для его применения в сосудистой тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить науки и технологии планирования проекта в провинции Гуандун Китая (2016B070701007) для поддержки этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PGA mesh | Synthecon | ||
| silicone tube | Cole Parmer | ||
| connector | Cole Parmer | ||
| intravascular OCT system | St. Jude Medical, Inc | ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM | |
| scanning electron microscopic | Philips | FEI Philips XL-30 | |
| polarized microscope | Olympus | Olympus BX51 | |
| sutures | Johnson & Johnson | ||
| pulsatile pump | Guangdong Cardiovascular Institute | ||
| LightLab Imaging software | St. Jude Medical, Inc |
References
- Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
- Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
- Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
- Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
- Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
- Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
- Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
- Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
- Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
- Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
- Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
- Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
- Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
- Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
- Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
- Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).
