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Neuroscience

Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/58043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

Summary

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

Abstract

À terminaisons nerveuses présynaptiques actives, les vésicules synaptiques subissent des cycles d’exo - et l’endocytose. Lors du recyclage, les domaines luminales de protéines transmembranaires SV deviennent exposés à la surface cellulaire. Une de ces protéines est synaptotagmine-1 (Syt1). Un anticorps dirigé contre le domaine luminal de Syt1, une fois ajoutée au milieu de culture, est repris pendant le cycle exo-endocytose. Cette absorption est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV et peut être quantifiée par immunofluorescence. Ici, nous combinons l’absorption anticorps Syt1 avec double transfection des neurones hippocampal cultivés. Cela permet de nous (1) localiser les sites présynaptiques basées sur l’expression du marqueur présynaptique recombinant synaptophysine, (2) déterminer leurs fonctionnalités à l’aide de l’absorption Syt1 et (3) caractérisent le ciblage et les effets d’une protéine d’intérêt, GFP-Rogdi.

Introduction

Étudier le recyclage de la vésicule synaptique est importante pour déterminer comment les propriétés présynaptiques changent, soit au cours de la plasticité synaptique, ou en réponse à la perturbation de la fonction synaptique. Étudier la synaptotagmine-1 (Syt1) absorption anticorps fournit une méthode de mesure de la quantité de recyclage de la SV. SYT1 est une protéine associée aux SV qui agit comme un capteur de Ca2 + et est nécessaire pour la libération du neurotransmetteur1,2exocytotique. C’est une protéine transmembranaire avec un domaine cytoplasmique C-terminal en dehors de la SV et un domaine luminal N-terminal à l’intérieur de la SV3. Au cours de l’exocytose, le domaine luminal de Syt1 devient exposé au milieu externe. Dans ce milieu externe, nous ajoutons des anticorps dirigés contre le domaine cytoplasmique, qui devient intériorisé au cours de l’endocytose. Ces anticorps peuvent être que soit des conjugués avec fluorophores ou immunomarquage avec anticorps secondaires4,5,6,7. L’intensité de la fluorescence de l’immunosignal qui en résulte est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV. Cette approche peut servir à déterminer la SV constitutive et induite par une dépolarisation recyclage6,8.

Essais de captation SYT1 peuvent être effectuées après le transfert de gène induite par le virus à presque toutes les cellules dans le plat ou après transfection clairsemée d’un petit nombre de cellules. Notre méthode allie l’analyse clairsemée double transfection des neurones de l’hippocampe primaires à l’aide de phosphate de calcium9. Nous utilisons une protéine recombinante marqueur connue pour s’accumuler à presynapses, synaptophysine fluorescent étiqueté, pour localiser les terminaisons présynaptiques et surexpriment notre protéine d’intérêt, Rogdi. Cela nous permet de tester si oui ou non Rogdi objectifs fonctionnels synapses et affecte SV recyclage. Le gène codant pour la Rogdi a été initialement identifié dans un écran pour des mutants de Drosophila caractérisées par des troubles de la mémoire10. Chez l’homme, des mutations du gène Rogdi causent une maladie rare et dévastatrice appelée syndrome de Kohlschütter-Tönz. Les patients souffrent de malformations de l’émail dentaire, l’épilepsie pharmacorésistantes et des retards psychomoteurs ; Cependant, la localisation subcellulaire du produit du gène est resté insaisissable11. Ainsi, l’essai d’absorption Syt1 fourni des éléments de preuve fondamentaux pour la localisation de GFP-étiquetée Rogdi à synapses fonctionnelles9.

Cette technique d’absorption a plusieurs avantages. Tout d’abord, SV recyclage peut être observée aussi bien en temps réel en effectuant le live d’imagerie7,12et après fixation6,9 en mesurant l’intensité de la fluorescence de l’étiquette de fluorescence Syt1. En outre, plusieurs variantes d’anticorps Syt1 ont été développés. Il y a des variantes sans étiquette qui peuvent être marqués avec un anticorps secondaire suite à un protocole standard immunostaining après fixation et variantes des conjugués avec une étiquette de fluorescence déjà fixée. Enfin, la fluorescence à base d’anticorps est avantageuse en raison de la grande sélection de disponible dans le commerce secondaires ou conjugués des colorants qui peuvent être utilisés.

Lorsque fixation et immunostaining les neurones, il est également possible souiller des protéines supplémentaires et effectuer des analyses de colocalisation. Cela peut aider à déterminer où ils se trouvent en ce qui concerne le recyclage SVs. L’intensité de l’étiquette de fluorescence est la mesure directe de la quantité de SV recyclage. En outre, les anticorps étiquette sélectivement les structures contenant Syt1, ayant pour résultat une spécificité élevée et peu de fluorescence de fond4. Protocoles de stimulation différents permet également, tels que les tampons de dépolarisation ou protocoles de stimulation électrique9,12,13,14. Toutefois, les basales SV recyclage peut être mesurée sans stimuler les cultures de neurones15.

Notre méthode s’adresse spécifiquement Syt1 absorption d’anticorps dans les neurones double transfectées avec l’anticorps secondaire immunomarquage après fixation. Cependant, nous nous référons à toutes les variantes utilisées systématiquement du dosage dans notre discussion pour donner aux téléspectateurs l’occasion d’adapter le protocole à des besoins spécifiques.

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Protocol

Aucune étude avec des animaux vivants ont été menées. Expériences impliquant des animaux euthanasiés pour obtenir cell cultures ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T10/30. Les expériences ont été menées avec les protocoles approuvés.

1. Culture de cellules hippocampiques primaire

  1. Préparer la culture de cellules dissociées de l’hippocampe du rat le jour embryonnaire 1916,17. Plaque de cellules de lamelles de 12 mm recouvert de POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI) dans les plats de 24 puits à une densité de 50 000-60 000 cellules par puits. Vérifier la densité à l’aide d’une cellule de comptage optique de contraste de phase et de la chambre.
  2. Les neurones de la culture pendant 3 jours (jour in vitro (DIV) 3) dans une plaque 24 puits dans l’incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  3. Évaluer les lamelles couvre-objet pour les indicateurs de la santé de cellules au microscope photonique transmissible (p. ex., phase contraste optique à un grossissement de X 10-20). Vérifier les indicateurs suivants d’une bonne santé : un halo de contraste de phase claire, neurites sans structures perlés et aucun soma clustering ou le groupage des neurites.

2. la transfection

Remarque : Le protocole suivant fait référence à une double-transfection pour 3 puits. Toutefois, le protocole fonctionne mieux lorsque les quantités suffisantes pour 4 puits sont préparées.

  1. Préparer 500 mL de tampon de transfection (274 mM NaCl, KCl, 1,4 mM Na2HPO4, glucose de 15 mM, 42 mM HEPES 10 mM) dans un erlenmeyer.
    1. Dissoudre 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glucose et 5,0 g de HEPES dans 400 mL d’eau distillée dans une fiole d’Erlenmeyer.
    2. Ajuster le pH à 6,95 avec 1 NaOH M, à l’aide d’un pH-mètre.
    3. Réglez le volume d’eau distillée à 500 mL et vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre.
    4. Faire 20-30 ml de tampon de transfection avec les valeurs suivantes de pH par pipetage 1 M NaOH dans le tampon de transfection : 6,96 6,97, 6,98, 6,99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
      Nota : Le pH de la mémoire tampon de transfection est crucial pour l’efficacité de transfection.
    5. Pour tester ce qui conduit de tampon de transfection pour le plus grand nombre de cellules transfectées, tester chaque valeur de pH de 6.96 à 7.11. Utilisez la méthode de transfection décrite dans 2.2-2.11 et un plasmide validé exprimant la GFP. Déterminer le nombre de cellules transfectées par lamelle couvre-objet pour chaque valeur de pH tampon de transfection évaluer quel tampon fonctionne le mieux.
    6. Aliquoter le tampon avec la plus grande efficacité de transfection dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL congeler et stocker les tubes à-20 ° C.
  2. Réchauffez le sérum réduit milieu, milieu de culture cellulaire et l’eau distillée à 37 ° C dans un bain-marie.
  3. Préparer le mélange de transfection dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Travailler sous la hotte à flux laminaire pour assurer des conditions de travail stérile.
    1. Mix 7,5 µL de chlorure de calcium 2 M avec 4 µg de chaque ADN exempte d’endotoxine (synaptophysine-mOrange et mGFP/GFP-Rogdi). Ajouter de l’eau pour atteindre un volume total de 60 mL dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    2. Ajouter 60 mL de tampon de transfection au mélange. Pour obtenir les meilleurs résultats, ajouter le tampon de transfection goutte à goutte et en agitant le mélange en ADN doucement sur le vortex.
    3. Incuber à température ambiante (RT) pendant 20 minutes. Éviter de secouer le tube d’incubation durant le temps d’incubation en plaçant le tube à côté de la hotte à flux laminaire.
  4. Sous la hotte à flux laminaire, retirer le milieu de culture cellulaire (« milieu conditionné ») provenant des puits à l’aide d’une pipette de 1000 mL et les entreposer dans un récipient séparé dans l’incubateur.
  5. Ajouter 500 mL de milieu de sérum réduit dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu'à ce que la période d’incubation de 20 minutes (étape 2.3.3).
  6. Ajouter 30 mL de mélange de transfection dans chaque puits en pipettant également, quelques gouttes. Jeter les résidus au fond du tube.
  7. Après que tous les puits ont été fournis avec mélange de transfection, secouez légèrement la plaque 24 puits afin d’assurer la distribution de la combinaison de transfection dans le milieu.
  8. Incuber les puits pendant 60 minutes à 37 ° C et 5 % de CO2.
  9. Retirer et jeter le mélange de transfection et laver trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et incuber eux pendant 30 secondes à RT. supprimer 750 mL de milieu et ajouter la même quantité de milieu frais. Répétez ceci trois fois.
    Remarque : L’étape de lavage est essentielle. Garder le temps que chaque puits n’a aucun moyen au minimum (i.e., enlever et remplacer les puits par puits) et ajouter le support de laver doucement.
  10. Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire et ajouter 450 mL de la conditionnée moyen puits par puits.
  11. Laissez les neurones matures dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 à DIV 10.

3. la stimulation et l’absorption Syt1

Remarque : Le protocole suivant concerne la captation 3 puits. Pour la dépolarisation de n’importe quel autre nombre de puits, ajuster les quantités en conséquence.

  1. Préparer 50 mL de tampon de dépolarisation 10 x (640 mM NaCl, KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, glucose de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4 700 mM) dans un erlenmeyer.
    Remarque : Le tampon de dépolarisation peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Si une solution non dépolarisants sert aussi, préparer un 10 solution de x Tyrode composée de 1290 mM NaCl, KCl, 10 mM MgCl2, 50 mM 20 mM CaCl2, 300 mM de Glucose, 200 millimètres HEPES pH 7,4 afin de comparer induite par stimulation recyclage avec spontanée le recyclage. Après dilution à 1 x, ajoutez 1 µM de tétrodotoxine avant de l’utiliser pour bloquer la génération de potentiels d’action.
    1. Dissoudre 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl2-6 H20, 0,15 g de CaCl2-2 H2O et 3,0 g de glucose-1 H2O et 2,38 g de HEPES dans 50 mL d’eau distillée dans une fiole d’Erlenmeyer. Ajuster le pH avec NaOH et stérile-filtrer la solution. Diluer le tampon 01:10 dans l’eau distillée pour obtenir une concentration de 1 x.
  2. Préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x (pH 7,4) pour la fixation après stimulation.
    1. Pour 500 mL de 4 % PFA dans du PBS 1 x, dissoudre 20 g de paraformaldéhyde à 450 mL de distillée H2O.
      Remarque : La solution de chauffage peut accélérer la dissolution, mais ne pas chauffer la solution au-dessus de 70 ° C, comme l’IFP peut se désintégrer.
      ATTENTION : PFA est toxique, potentiellement cancérigène et tératogène. Portez des gants lorsque vous manipulez la PFA, travailler sous la hotte et éviter l’ingestion.
    2. Laisser refroidir les solution a RT et ajouter 50 mL de solution mère de PBS x 10. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH/HCl à l’aide d’un pH-mètre.
  3. Réchauffez 600 mL de 1 x tampon de dépolarisation et 10 mL de milieu de culture cellulaire à 37 ° C dans un bain-marie.
  4. Ajouter 1 mL d’anticorps de souris anti-Syt1 (clone 604.2) 1 x tampon de dépolarisation et vortex pendant 10 secondes.
  5. Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire des cellules. Ajouter 200 mL du mélange dépolarisation-anticorps à chaque puits et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C et 5 % de CO2 dans l’incubateur.
  6. Retirer et jeter le mélange de dépolarisation-anticorps et laver trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 30 secondes à RT. supprimer 750 mL de milieu et ajouter la même quantité de milieu frais. Répéter trois fois.
  7. Retirez et jetez le milieu de culture cellulaire et ajouter 300 mL de 4 % PFA dans du PBS 1 x. Incuber pendant 20 minutes à 4 ° C.
  8. Laver trois fois pendant 5 minutes chacun avec du PBS 1 x.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

4. immunocytochimie

  1. Préparer 50 mL de tampon de blocage.
    Remarque : Tampon de blocage peut être conservé à-20 ° C pendant plusieurs mois.
    1. Dissoudre 2,5 g de saccharose et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 5 mL de solution mère de PBS x 10. Ajouter 1,5 mL de solution détergente 10 %. Agiter la solution jusqu'à ce que tous les composants ont bien dissous et ajouter distillée H2O jusqu'à atteindre un volume de 50 mL. Partie aliquote de la solution et geler les aliquotes pour le stockage.
  2. Diluer l’anticorps secondaire, couplé à un fluorophore (dirigés contre les principales espèces Syt1-anticorps) dans 200 mL de tampon de blocage dans chaque puits à une dilution de 1/1000.
  3. Retirer et jeter le PBS 1 x de chaque cupule contenant un lamelle couvre-objet.
  4. Ajouter 200 mL de blocage mélange tampon-anticorps dans chaque puits et incuber pendant 60 minutes à température ambiante.
    ATTENTION : Parce que les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière, aller de l’avant toutes les mesures doivent être effectuées dans l’obscurité.
  5. Après incubation, laver les cellules trois fois pendant 5 minutes avec 1 mL de PBS 1 x.
  6. Incorporer les lamelles sur lames de microscope avec le milieu d’enrobage.
    1. Ajouter une goutte de 7 mL d’enrobage moyen sur la lame de microscope. Retirer la lamelle de la plaque 24 puits en soulevant avec une seringue et il saisir avec une pince.
      ATTENTION : Cellules à la surface de la lamelle sont facilement endommagés, donc forceps doivent être manipulés avec soin.
    2. Tremper le couvre-objet dans l’eau distillée pour enlever les PBS et séchez-le soigneusement en appuyant sur un bord de des tissus mous.
    3. Mettez le couvre-objet sur l’encastrement gouttelettes moyennes, afin que la surface portant les cellules fait face à la lame de microscope, intégrant ainsi les cellules dans le milieu d’enrobage.
  7. Laissez les diapositives à sécher sous la hotte pendant 1-2 h (couvrir afin d’éviter l’exposition à la lumière) et stockez-les dans une boîte de glissière de microscope à 4 ° C.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

5. analyse microscopique

  1. Après que les lamelles sèchent, les placer sous le microscope avec l’objectif et la caméra.
  2. Ajuster la durée d’exposition pour chaque canal afin que quelques pixels sont surexposés afin d’assurer une répartition maximale des valeurs de gris.
    Remarque : La durée d’exposition peut varier entre les canaux, il doit être constante pour une voie assurer la comparabilité entre les lamelles.
  3. Acquisition d’images de multi-canal pour les 10 régions d’intérêt (ROIs) par lamelle couvre-objet. Vérifiez que le ROI contienne des processus axones d’un neurone transfectée en cochant GFP-fluorescence, qui devrait être ponctuée.

6. analyse statistique

  1. Exporter les images sous forme de fichiers .tif. Charger les images dans OpenView18 en cliquant sur fichier | Charger le fichier image.
  2. Choisissez l’image synaptophysine-mOrange Channel 1, l’image Rogdi-GFP/mGFP tant que canal 2 et l’image de fluorescence Alexa647 Channel 3.
  3. Seuil des ROIs.
    1. Cliquez sur analyse | Zone de la Place au cours de l’examen. Choisissez les valeurs seuil et l’intensité de la Delta afin que lors de l’inspection visuelle, fluorescence diffuse est exclu, laissant seulement ponctuées signaux dans l’image du canal 1 (représentant synaptophysine-mOrange fluorescence). Garder le même seuil pour toutes les images.
  4. Transférer ces ROIs sur le canal correspondant 2 (fluorescence GFP-Rogdi/mGFP) et 3 (Syt1-fluorescence) de chaque zone de la lamelle couvre-objet en cliquant sur Exécuter maintenant.
    Remarque : La ROIs ne doit être envisagée que si la cellule est double transfectées. Dans cette méthode, mOrange - et GFP-fluorescence doivent être clairement visible.
  5. Enregistrer les données dans l’éditeur de journal d’analyse en cliquant sur les données du journal.
  6. Ouvrez l’éditeur de journal d’analyse sous l’onglet Windows et copier les valeurs pour chaque canal. Collez les valeurs pour les canaux distincts dans une feuille de calcul.
  7. Déterminer l’intensité de fluorescence moyenne du Syt1-chenal au ROIs dans les deux conditions de transfection (GFP-Rogdi et mGFP).
  8. Appliquer les tests statistiques appropriés tels que de Student test t pour déterminer des différences significatives.

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Representative Results

Un résultat attendu de cette approche est localiser approximativement 50 double transfectées neurones par lamelle à une densité de 50 000 neurones par puits. L’axone de chaque neurone est censé montrer plusieurs points d’accès de fluorescent-étiquetées synaptophysine accumulation, indiquant les clusters nhsp. À des sites fonctionnels présynaptiques, le signal de synaptophysine recombinant putative ponctuée Syt1 fluorescence. À l’aide de transfection double, soit GFP-Rogdi comme la protéine d’intérêt (Figure 1) ou mGFP que le contrôle est exprimée conjointement avec recombinant synaptophysine.

Dans cette expérience, nous analysons SV recyclage sur les sites présynaptiques dans les neurones exprimant soit GFP-Rogdi ou mGFP. Si la protéine contrôle, mGFP, est distribuée de façon homogène dans l’ensemble de la cellule entière, mais son influence sur les sites synaptiques doit encore être étudié, puis il faut co transfecter une seconde protéine qui est enrichie de manière présynaptique, fluorescent tag Synaptophysine.

Comme décrit précédemment, les cellules subissent la libération du transmetteur induite par une dépolarisation. Ainsi, les synapses fonctionnelles reprennent Syt1 anticorps ajoutés au milieu. Après immunomarquage le Syt1 anticorps avec un anticorps secondaire fluorescent étiqueté, l’ampleur de l’absorption Syt1 est enfin quantifié à l’aide de l’immunosignal (Figure 2).

Figure 1
Figure 1. Les cellules transfectées double. Le champ de vision montre une cellule double transfectées exprimant GFP-Rogdi (A) et synaptophysine-mCherry (B). Synaptophysine est une protéine abondante Vésicule synaptique. Sa variante recombinante peut être utilisée pour l’étiquetage des boutons synaptiques. Le modèle de localisation du GFP-Rogdi ressemble à celle de Synaptophysin-mCherry (C). Barreaux de l’échelle = 10 μm. Boîtes affichent un grossissement de 2,5 fois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. GFP-Rogdi aux synapses fonctionnelles. Webcam live Syt1 captation a été réalisée dans les cellules transfectées double exprimant soit mGFP (vert) et la synaptophysine-mOrange (rouge ; A-D) ou GFP-Rogdi (vert) et synaptophysine-mOrange (rouge ; E-H). Absorption d’anticorps SYT1 a été réalisée à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris dirigé contre le domaine luminal de Syt1. Après fixation de l’IFP, les cellules ont été colorées avec des anticorps de lapin anti-GFP. Anticorps secondaires (anti-lapin Alexa 488 et anti-souris Alexa 647) ont été ajoutés pour détecter des GFP ou GFP-Rogdi et Syt1, respectivement. Autofluorescence des synaptophysine-mOrange a été utilisé pour détecter les terminaisons présynaptiques (B et F). Ponctuée Syt1 immunofluorescence indique les sites de vésicule recyclage (bleu ; C et G). Notez que la majorité des synapses Syt1 marqués est localisée aux neurones non transfectées. GFP-Rogdi était destiné aux synapses actives et ne modifiait pas la vésicule synaptique recyclage (I). 3 expériences de culture indépendante ont été effectuées (N = 3). Au moins 3 lamelles de chaque culture (10 au total) ont été utilisées pour l’analyse. Enfin, on a analysé les 3 zones par lamelle couvre-objet (n = 30). Student´s t-test a montré aucune différence significative. Barreaux de l’échelle = 10 μm. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (S.E.M.). « NS » n’indique aucune signification. Ce chiffre a été modifié par Riemann et al. 9 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Il y a trois tests couramment utilisées pour étudier les vésicules synaptiques (SV) recyclage. Les deux premiers comprennent l’utilisation d’un) styryl fluorescente colorants comme FM1-43 (qui incorporent dans les membranes et sont repris dans les organites au cours de l’endocytose sont libérés après exocytose) ; et b) fluorescent tag protéines recombinantes de SV (qui, à la surexpression, incorporent dans la machinerie protéique de recyclage). Si les fluorophores attachés changer leur fluorescence selon le pH, il peuvent servir à surveiller les changements entre l’intérieur acide d’un SV et le pH du milieu extracellulaire. Les protéines recombinantes taggés une variante sensibles au pH de GFP sont appelés Phluorins. Les deux essais discutés ont tous deux été présentés précédemment19,20, et les avantages et les inconvénients de chacun ont également été examinés21.

Nous décrivons ici une troisième méthode bien établie4,5,6,7,9,14. Pour tester le recyclage de la SV, nous profitons du fait que le domaine luminal de la protéine associée à la vésicule synaptotagmine-1 (Syt1) devient exposé à la surface de la cellule à l’exocytose. Tout d’abord, nous ajoutons un anticorps dirigé contre le domaine luminal vers le milieu de culture, qui est ensuite repris par la vésicule lors du recyclage de la SV. Cette absorption d’anticorps est visualisée et quantifiée par immunofluorescence. Par ailleurs, un anticorps Syt1 marqué directement utilisable. Le label peut être indépendant de pH, rapports de localisation de le Syt1-anticorps à l’intérieur et sur la surface extérieure du SVs ou dépendante du pH, rapports de localisation basés sur les changements de fluorescence. Nous décrivons également la combinaison de ce test de recyclage de SV avec double transfection des neurones en culture pour tester si une protéine de cibles d’intérêt, GFP-Rogdi, fonctionnelles synapses et affecte SV recyclage. GFP-Rogdi est spécifique à cette approche ; Toutefois, les mêmes questions peuvent être adressées à une protéine d’intérêt.

Ce test a été introduit en 1992 pour surveiller le recyclage spontanée des SVs4 et a été développé par le même groupe de surveiller évoqué SV recyclage12. Leurs expériences établi que l’absorption Syt1 est sensible aux neurotoxines clostridiales, qui bloquent la SV exocytose12. Ils ont également montré que la stimulation des cultures de dépolarisation à 37 ° C améliore l’internalisation des anticorps Syt1 comparé à 1) les cultures qui sont conservés sur la glace, ce qui empêche la plupart endocytose et à 2) cultures incubées à 37 ° C, sans stimulation, qui permet un recyclage spontanée mais n’évoque pas le recyclage12,22. Le test peut facilement comparer SV recyclage entre deux conditions, tels que, avec ou sans une molécule d’intérêt. En particulier, le présent protocole cherche à comparer l’absorption d’anticorps Syt1 dans la présence ou l’absence d’une certaine protéine surexprimée. Le protocole peut être étendu si les contributions relatives de la liaison de surface, spontanée recyclage et recyclage évoqués doivent être évaluées. Par exemple, en incubant les neurones sur la glace sans stimulation empêche l’endocytose, révélant toute surface liaison de l’anticorps Syt1. Incubant les neurones à 37 ° C dans une solution basale à la tétrodotoxine empêche la propagation des potentiels d’action, révélant tout recyclage spontanée. Ainsi, les neurones en incubation à 37 ° C, moins stimulant des conditions peuvent révèlent l’étendue du recyclage de SV évoqués.

Des cellules vivantes sont sensibles aux conditions physiologiques idéales ; donc, entretien, transfection et des tampons de dépolarisation doivent toujours être testés pour des paramètres physiologiques, y compris le pH et la température. Alors que les tampons de dépolarisation peuvent être passés à travers les filtres stériles après que le pH a été ajusté, transfection tampons sont sensibles à la filtration stérile. Donc, nous ajuster son pH, garder congelé jusqu'à l’utilisation et le tourner dans une centrifugeuse de table-top pour granuler des bactéries. Pour la transfection, il est essentiel de mélanger le tampon adéquatement afin d’assurer la liaison du plasmide avec les cristaux de phosphate de calcium. Transfection de phosphate de calcium fonctionne mieux sur jour in vitro (DIV) 2-4. Nous utilisons tagged synaptophysine, une protéine transmembranaire de SV, comme un marqueur pour identifier les terminaisons présynaptiques dans les neurones transfectées. Taggé versions d’autres protéines SV comme SV2, Synapsin et VAMP/synaptobrévine ou molécules zone active comme basson, RIM, Munc13-1 et CAST est également utilisable.

Les deux mCherry et mOrange émettent une fluorescence rouge. Bien que mCherry est plus brillante que mOrange, il a plus d’émission à grandes longueurs d’onde que mOrange. Par conséquent, pour l’imagerie de fluorescence triple avec GFP, un colorant rouge et un colorant émettant dans la région 700 nm, mOrange est une meilleure option que mCherry. Pour double fluorescence avec GFP et un colorant rouge, mCherry peut être favorable, puisque c’est la teinture plus lumineuse. Afin de garantir la transfection clairsemée, le mélange de transfection ne doit pas être incubé pendant plus de 60 minutes. Il est également important que l’incubation dans un tampon de dépolarisation est la bonne longueur de temps pour s’assurer de l’exocytose des vésicules tous. Cependant, une exposition prolongée à la dépolarisation tampon doit être évitée. Au cours de l’acquisition d’images, il est également essentiel d’appliquer les mêmes durées d’exposition et les intensités lumineuses pour assurer une comparaison quantifiable entre différentes séries d’expériences.

Enfin, au cours de l’analyse d’image, notre protocole inclut plusieurs considérations. Pour un domaine d’intérêt montrant recombinant synaptophysine examen, le seuil de faible intensité est défini afin que la fluorescence diffuse est exclue. Ensuite, ce seuil a été testé sur d’autres domaines et les lamelles d’observer similaire inclusion des signaux ponctuées et exclusion de fluorescence diffuse. Une fois qu’un seuil approprié est identifié, il est appliqué à toutes les images, produisant des régions ponctuées d’intérêt (ROIs) dans le canal de la synaptophysine (Taggé mCherry ou mOrange) recombinant. Enfin, Syt1 intensité est déterminée pour les ROIs9.

Notre approche est optimisé pour la transfection clairsemée. Nous analysons présynaptique fonction dans un environnement complexe où il y a SV recyclage dans les axones des neurones transfectées entourés de neurones celllulaire. Dans cette configuration, double-transfection nous permet de manipuler la fonction neuronale et localiser les terminaisons présynaptiques des neurones transfectées. Transfectées pré-synaptiques entrer en contact avec les neurones post-synaptiques celllulaire est un facteur important pour évaluer les effets d’un neurone présynaptique sur le recyclage de la SV. Le réglage peut également être facilement adapté pour tester si une manipulation postsynaptique entraîne des modifications présynaptiques. Dans ce cas, transfection clairsemée des neurones avec une protéine qui est destiné aux sites postsynaptiques localiserez les sites postsynaptiques des neurones transfectées et Syt1 absorption peut être déterminée à boutons synaptiques des neurones celllulaire.

Lors de la transfection clairsemée n’est pas nécessaire, protocoles de transfection différentes peuvent être appliquées. Par exemple, transfection avec Lipofectamine sur DIV 7 - 8 résultats à des taux plus élevés de transfection, mais il implique également la plus forte expression dans chaque cellules transfectées9. En outre, transduction virale peut entraîner expression dans presque 100 % des neurones cultivés14,23,24. Au cours d’expériences visant à contrôler le recyclage de la SV, transfection peut être effectuée pour une seule protéine ou complètement laissée de côté. Par exemple, lorsque recyclage globalement synaptique est comparée entre les neurones de type sauvage et génétiquement modifié souris, étiquetage des neurones individuels par transfection ne sont pas nécessaires. En outre, cette mesure immunomarquage des protéines endogènes. Si la transfection échoue, il est important de tester la mémoire tampon de transfection avec un plasmide validé ou utiliser une mémoire tampon dont le pH est différent (voir préparation du tampon de transfection). À l’aide de préparations d’ADN libres endotoxine apparaît également très importante. Immunomarquage intériorisé Syt1 œuvres d’anticorps dans les échantillons de PFA-correction tant méthanol-correction. Il est à noter également que l’autofluorescence GFP et DP est perdu après fixation de méthanol. Si GFP ou DP doivent être localisée dans les cellules méthanol-fixes, ces protéines doivent être immunomarquées. Si l’absorption Syt1 échoue, temps de dépolarisation et de la concentration de K+ dans le tampon de dépolarisation doivent être changés en conséquence. Nombreuses variantes de protocole ont été publiés, avec dépolarisation fois allant de 90 s25 à 60 min12et avec des concentrations de 45 mM, 50 mM, 70 mM et 110 mM6,25,26 K+ ,,27. Lorsque l’activité récurrente doit être évitée, bloqueurs des récepteurs de glutamate peuvent également être ajoutés pendant la dépolarisation. Enfin, bien que forte dépolarisation K+ est considérée comme le plus puissant stimulus, potentiels d’action peuvent induire SV recyclage par le biais de plusieurs stimuli physiologiques22,28. Différence d’efficacité de l’absorption anticorps Syt1 peut se produire dans des cultures de rat et de souris. Dans notre méthode, l’anticorps monoclonal de souris anti-Syt1 clone 604.2 (RRID:AB_993036) produit une coloration plus forte dans les cultures de rat que dans les cultures de souris, tandis que l’anticorps d’anti-Syt1 anticorps polyclonal de lapin (RRID:AB_11042457) produit une coloration plus forte dans les cultures de souris, mais plusieurs notes d’avertissement sont examinés ci-dessous.

On envisagera plusieurs mises en garde concernant l’utilisation d’anticorps anti-synaptotagmine à absorption en SVs. Tout d’abord, la N-glycosylation de l’asparagine 24 de Syt1 favorise l’endocytose absorption des protéines29,30. L’asparagine 24 fait partie du domaine luminal de Syt1. Les anticorps de souris et le lapin que nous utilisons sont dirigés contre les acides aminés 1 à 12 et 1-8, respectivement, de Syt1. Alors que leurs épitopes ne se chevauchent pas avec le site de N-glycosylation, empêchement stérique ou, au contraire, une induction de l’absorption de la liaison de l’anticorps ne peut être exclue. Mutation du site N-glycosylation dans Syt1 ne modifie pas la cinétique de l’endocytose et le ciblage des Syt1 à SVs. Il augmente la fraction de Syt1 reste sur la surface de la membrane plasmique externe lors de l’endocytose est induite par des stimuli faibles. Lorsque des stimuli forts, tels que la forte dépolarisation K+ , sont appliquées, aucune réduction Syt1-captation est observée30. Dans l’ensemble, si les anticorps interféré avec le site de N-glycosylation en quelque sorte, ils pourraient provoquer un changement dans l’endocytose SV par rapport aux conditions sans anticorps, mais ce changement devrait être similaire pour l’expérience (dans notre cas la surexpression de GFP-Rogdi) et le contrôle (dans notre cas, l’expression de la GFP). En outre, les anticorps polyclonaux peuvent être plus susceptibles d’occasionner des problèmes stériques et réticulation que des anticorps monoclonaux, parce qu’un plus grand nombre de copies d’anticorps se lie à l’épitope. Nous ne sommes pas au courant des études systématiques comparant les anticorps disponibles entre eux ; Toutefois, certaines études ont examiné la validité de certains anticorps. Par exemple, lorsque cinétique recyclage SV ont été sondé à l’aide du clone d’anticorps monoclonal de souris anti-Syt1 604.2 et changements Synaptophluorin-fluorescence dans une comparaison directe, des résultats similaires ont été obtenus, validant l’utilisation de cet anticorps28. SVs de chargement avec Syt1 anticorps polyclonaux de lapin et de la transmission synaptique d’enregistrement électrophysiologique a révélé que les synapses chargés avaient réduit la transmission synaptique d’une manière qui rappelle des mutants de la perte de fonction des Syt1. Par conséquent, ces anticorps polyclonaux affectent la transmission synaptique. L’absorption réelle a révélé spontanés et évoqués recyclage, ce qui suggère qu’un anticorps polyclonal est apte à suivre un cycle de recyclage de la SV, mais attention devrait être prise lors de l’interprétation des résultats après l’absorption de ces anticorps31.

Trois tests sont couramment utilisé pour étudier le recyclage de la SV, qui comprennent la membrane étiquetage avec styryl colorants, la surexpression de la Phluorins, et l’absorption d’anticorps-Syt1 pratiquée ici. Tous les trois épreuves peuvent servir à déterminer les jambes endocytose et exocytotique de recyclage de la SV. Alors que tous les trois épreuves ont les avantages puissants, chacun a aussi une opposition de principe. Les colorants FM étiqueter la surface de la cellule entière et sont repris dans la cellule avec toutes les membranes de recyclage. Phluorins doit être introduite par la surexpression. SYT1-anticorps étiquette la protéine endogène, mais certains anticorps susceptibles d’affecter sa fonction sous certaines conditions. Chaque mise en garde possible, toutefois, être convenablement traitées21.

Dans l’ensemble, l’essai d’absorption anticorps Syt1 a servi à des fins diverses. Tout d’abord, il a été utilisé pour étiqueter sélectivement SVs subissant spontanées ou induites recyclage, respectivement28,31,32,33. Deuxièmement, il a été utilisé pour déterminer l’effet d’une drogue ou de la protéine sur l’étendue de la SV de recyclage ; par exemple, pour montrer que le BDNF renforce SV spontané et évoqué recyclage6. En troisième lieu, il a été utilisé pour déterminer le nombre de synapses avec recyclage SVs en pourcentage relatif au nombre total de synapses morphologiquement défini34,35. Il en est ressorti que surexprimant la molécule d’adhérence cellule postsynaptique neuroligines-1 augmente le pourcentage des synapses avec recyclage SVs25 et que réduire l’exprimant des récepteurs du glutamate de type AMPA diminue le pourcentage de synapses avec recyclage SVs, augmentation du pourcentage de manière présynaptique silencieux synapses36. En outre, le test a été utilisé pour analyser la mobilité des étiquetés SVs27 et de déterminer la localisation de Syt1 utilisant nanoscopy13,22,33. Enfin, cette méthode est encore utilisée pour tester si oui ou non certaines protéines localiser aux synapses fonctionnelles9. L’anticorps Syt1 également utilisable pour les études à long terme, où l’anticorps reste dans les neurones pour les jours qui suivent l’absorption37. C’est cumulable avec un deuxième tour d’absorption à l’aide d’un anticorps Syt1 séparément ou un anticorps dirigé contre le domaine luminal d’une protéine différente de la SV. Cela permet de tester qui SVs recyclé au départ et qui recycle de l’issue d’une expérience. Il serait intéressant d’adapter ce dosage pour plus intacte de modéliser des systèmes, tels que les tranches aiguës et organotypiques. En principe, l’essai d’absorption permet de comparer des tissus de type sauvage et génétiquement modifiés animaux ou peut être combiné avec livraison viral ou biolistique, i.e., un « pistolet de gène », pour manipuler l’expression de la protéine dans ces systèmes modèles. Dans ces systèmes, l’influence de certaines perturbations sur machines présynaptique, suivies par le dosage de l’absorption et dynamique des réseaux peut être étudié simultanément.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Irmgard Weiss d’assistance technique d’experts. Ce travail a été soutenu par la DFG via le pôle d’excellence pour la microscopie à la gamme nanomètre et physiologie moléculaire du cerveau (CNMPB, B1-7, à T.D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B27 Gibco 17504-044
BSA Sigma A7030-50g
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306-100g
CoolSNAP HQ2 Photometrics
dH2O Invitrogen 15230
DABCO Merck 8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647 Jackson-Immunoresearch 715605151 antibody
DMEM Invitrogen 41966
DPBS Gibco 14190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120094
multiwell 24 well Fisher Scientific 087721H
tube (50 mL) Greiner Bio-One 227261
FBS superior BiochromAG S0615
Glucose Merck 1,083,421,000
HBSS Invitrogen 14170
HEPES Sigma H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator) ThermoElectron Corporation
KCL Sigma-Aldrich P9541-500g
L-Glutamin Gibco 25030
MgCl2 Honeywell M0250-500g
microscope slides Fisher Scientific 10144633CF
Microsoft Excel Microsoft
Mowiol4-88 Calbiochem 475904
NaCl BioFroxx 1394KG001
Na2HPO4 BioFroxx 5155KG001
Neurobasal Invitrogen 21103049
OpenView Experiment Analysis Application Free software, see comments written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x) Roche 11666789001
Optimem Invitrogen 31985
Penstrep Gibco 15140-122
PFA Sigma P6148-1kg
safety hood ThermoElectron Serial No. 40649111
Sucrose neoFroxx 1104kg001
Synaptotagmin1 Synaptic Systems 105311 mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100 Merck 1,086,031,000
Vortex Genius 3  IKA 3340001
Water bath GFL 1004
Zeiss Observer. Z1  Zeiss

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References

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Numéro 136 vésicules synaptiques recyclage de synapses Neuroscience neurones synaptotagmine-1 hippocampe rat culture cellulaire
Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques
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Riemann, D., Petkova, A., Dresbach,… More

Riemann, D., Petkova, A., Dresbach, T., Wallrafen, R. An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins. J. Vis. Exp. (136), e58043, doi:10.3791/58043 (2018).

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