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Neuroscience

कल्चरल न्यूरॉन्स में Synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए एक ऑप्टिकल परख Presynaptic प्रोटीन को व्यक्त

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/58043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

Summary

हम synaptic पुटिका (एसवी) के लिए एक ऑप्टिकल परख कल्चरल न्यूरॉन्स में रीसाइक्लिंग का वर्णन । डबल अभिकर्मक के साथ इस प्रोटोकॉल का मेल एक presynaptic मार्कर और ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने के लिए हमें presynaptic साइटों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, उनके synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग क्षमता, और ब्याज की प्रोटीन की भूमिका निर्धारित करते हैं ।

Abstract

सक्रिय presynaptic तंत्रिका टर्मिनलों पर, synaptic बुलबुले exo के चक्र से गुजरना-और endocytosis । रीसाइक्लिंग के दौरान, एसवी transmembrane प्रोटीन के चमकीले डोमेन कोशिका की सतह पर खुल जाते हैं । इनमें से एक प्रोटीन Synaptotagmin-1 (Syt1) है । एक एंटीबॉडी Syt1 के चमकदार डोमेन के खिलाफ निर्देशित, एक बार संस्कृति माध्यम में जोड़ा, exo-endocytotic चक्र के दौरान लिया जाता है । इस quantified एसवी रीसाइक्लिंग की राशि के लिए आनुपातिक है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से किया जा सकता है । यहां, हम Syt1 एंटीबॉडी के साथ गठबंधन हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस के डबल अभिकर्मक के साथ । यह हमें की अनुमति देता है (1) information presynaptic रिकॉमबिनेंट presynaptic मार्कर Synaptophysin की अभिव्यक्ति के आधार पर साइटों, (2) Syt1 का उपयोग करते हुए उनकी कार्यक्षमता का निर्धारण, और (3) लक्ष्यीकरण और ब्याज की एक प्रोटीन के प्रभाव की विशेषता, GFP-Rogdi.

Introduction

synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग का अध्ययन कैसे presynaptic गुण बदलने के निर्धारण में महत्वपूर्ण है, या तो synaptic प्लास्टिक के दौरान या गड़बड़ी समारोह के synaptic के जवाब में । Synaptotagmin-1 (Syt1) एंटीबॉडी का अध्ययन करना एसवी रीसाइक्लिंग की मात्रा को मापने का एक तरीका प्रदान करता है । Syt1 एक एसवी-एसोसिएटेड प्रोटीन है जो एक Ca2 + सेंसर के रूप में कार्य करता है और न्यूरोट्रांसमीटर1,2के exocytotic रिलीज के लिए आवश्यक है । यह एसवी के बाहर एक सी-टर्मिनल cytoplasmic डोमेन और एसवी3के अंदर एक एन-टर्मिनल चमकीले डोमेन के साथ एक transmembrane प्रोटीन है । exocytosis के दौरान Syt1 का चमकीला डोमेन बाहरी माध्यम के संपर्क में आ जाता है । इस बाहरी माध्यम के लिए, हम cytoplasmic डोमेन है, जो endocytosis के दौरान आंतरिक हो जाता है के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी जोड़ें । ये एंटीबॉडी या तो पूर्व माध्यमिक एंटीबॉडी4,5,6,7के साथ fluorophores या immunostained के साथ संयुग्मित हो सकता है । परिणामस्वरूप immunosignal की प्रतिदीप्ति तीव्रता एसवी रीसाइक्लिंग की राशि के लिए आनुपातिक है । यह दृष्टिकोण दोनों के लिए गठित और ध्रुवीकरण-प्रेरित एसवी6,8रिसाइकिलिंग निर्धारित किया जा सकता है ।

Syt1 को ऊपर उठाने की परख की जा सकती है वायरस मध्यस्थता जीन हस्तांतरण के बाद वस्तुतः पकवान में सभी कोशिकाओं या कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के विरल अभिकर्मक के बाद । हमारे विधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के स्पार्स डबल अभिकर्मक कैल्शियम फॉस्फेट9का उपयोग कर के साथ परख को जोड़ती है. हम एक रिकॉमबिनेंट मार्कर के लिए presynapses पर जमा ज्ञात प्रोटीन का उपयोग करें, फ्लोरोसेंट टैग Synaptophysin, presynaptic टर्मिनलों का पता लगाने और ब्याज की हमारे प्रोटीन, Rogdi । यह हमें परीक्षण करने के लिए या नहीं Rogdi लक्ष्य कार्यात्मक synapses और एसवी रिसाइकिलिंग को प्रभावित करता है की अनुमति देता है । जीन एंकोडिंग Rogdi मूल रूप से Drosophila म्यूटेंट के लिए एक स्क्रीन में पहचान की थी बिगड़ा स्मृति10द्वारा विशेषता । मनुष्यों में, Rogdi जीन में उत्परिवर्तनों Kohlschütter-Tönz सिंड्रोम नामक एक दुर्लभ और विनाशकारी रोग का कारण । रोगियों दंत तामचीनी विकृतियों, pharmacoresistant मिर्गी, और मनोप्रेरणा देरी से पीड़ित; हालांकि, जीन उत्पाद का उपसेलुलर स्थानीयकरण11मायावी बना रहा । इस प्रकार, Syt1 कार्रवाई परख GFP के स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण सबूत-टैग Rogdi कार्यात्मक synapses9में प्रदान की है ।

इस तीनो तकनीक के कई फायदे हैं । सबसे पहले, एसवी पुनर्चक्रण दोनों वास्तविक समय में प्रदर्शन करके लाइव इमेजिंग7,12, और Syt1 प्रतिदीप्ति लेबल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा6,9 निर्धारण के बाद मनाया जा सकता है । साथ ही, कई Syt1 एंटीबॉडी वेरिएंट डेवलप किए गए हैं । वहां untagged वेरिएंट है कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक मानक immunostaining प्रोटोकॉल के बाद निर्धारण, और पहले से ही संलग्न एक प्रतिदीप्ति लेबल के साथ पूर्व संयुग्मित वेरिएंट के साथ लेबल किया जा सकता है । अंत में, एंटीबॉडी आधारित प्रतिदीप्ति व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यमिक या संयुग्मित रंजक है कि इस्तेमाल किया जा सकता है की बड़ी चयन के कारण लाभप्रद है ।

जब फिक्सिंग और ंयूरॉंस immunostaining, यह भी संभव अतिरिक्त प्रोटीन के लिए दाग और colocalization विश्लेषण प्रदर्शन । यह निर्धारित करने में मदद कर सकते है जहां वे SVs रीसाइक्लिंग के संबंध में स्थित हैं । प्रतिदीप्ति लेबल की तीव्रता एसवी पुनर्चक्रण की मात्रा का सीधा उपाय है । इसके अलावा, एंटीबॉडी चुनिंदा लेबल Syt1 युक्त संरचनाओं, उच्च विशिष्टता और थोड़ा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति4में जिसके परिणामस्वरूप । विभिंन उत्तेजना प्रोटोकॉल भी इस्तेमाल किया जा सकता है, ऐसे ध्रुवीकरण बफ़र या बिजली उत्तेजना प्रोटोकॉल9,12,13,14के रूप में । हालांकि, बेसल एसवी रीसाइक्लिंग के बिना मापा जा सकता है ंयूरॉन संस्कृतियों15उत्तेजक ।

हमारी विधि विशेष रूप से निर्धारण के बाद माध्यमिक एंटीबॉडी immunolabeling के साथ डबल-transfected न्यूरॉन्स में Syt1 एंटीबॉडी के बारे में पता । हालांकि, हम हमारी चर्चा में सभी नियमित रूप से परख के वेरिएंट का इस्तेमाल दर्शकों को एक के लिए विशिष्ट जरूरतों को प्रोटोकॉल अनुकूलन का अवसर दे ।

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Protocol

जीवित पशुओं के साथ कोई पढ़ाई नहीं आयोजित की गई । सेल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए euthanized जानवरों को शामिल प्रयोगों अनुमोदन संख्या T10 के तहत स्थानीय पशु संरक्षण अधिकारियों (Tierschutzkommission डेर Universitätsmedizin गौटिंगेन) द्वारा अनुमोदित किया गया/ प्रयोगों को अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ आयोजित किया गया ।

1. प्राथमिक हिप्पोकैम्पस सेल कल्चर

  1. भ्रूण दिवस 1916,17पर चूहे हिप्पोकैम्पस का असंबद्ध सेल कल्चर तैयार करें । प्लेट 12 मिमी coverslips पर polyethyleneimine (पी) के साथ लेपित 24-अच्छी तरह से व्यंजन में ५०,००० के घनत्व-६०,००० कोशिकाओं/ एक कक्ष और चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी गिनती सेल का उपयोग कर घनत्व की जांच करें ।
  2. संस्कृति न्यूरॉन्स के लिए 3 दिन (इन विट्रो में दिन (DIV) 3) मशीन में एक 24 में अच्छी तरह से प्लेट में ३७ ° c 5% CO2के साथ.
  3. सेल के संकेतकों के लिए coverslips का आकलन प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर (उदाहरण के लिए, चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी 10-20X के एक आवर्धन पर) । अच्छे स्वास्थ्य के निम्नलिखित संकेतकों के लिए जाँच करें: एक स्पष्ट चरण कन्ट्रास्ट हेलो, मनके संरचनाओं के बिना neurites, और कोई सोमा clustering या neurite bundling.

2. अभिकर्मक

नोट: निम्न प्रोटोकॉल 3 कुओं के लिए एक डबल-अभिकर्मक करने के लिए संदर्भित करता है. 4 कुओं के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार कर रहे हैं, जब हालांकि, प्रोटोकॉल सबसे अच्छा काम करता है ।

  1. अभिकर्मक बफर के ५०० मिलीलीटर (२७४ मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, १.४ मिमी ना2HPO4, 15 मिमी ग्लूकोज, ४२ मिमी HEPES) एक Erlenmeyer कुप्पी में तैयार करें ।
    1. NaCl के ८.० जी भंग, KCl के ०.३७ ग्राम, एनए के2HPO4, ग्लूकोज के १.३५ ग्राम, और एक Erlenmeyer कुप्पी में आसुत जल के ५.० मिलीलीटर में HEPES के ४०० जी.
    2. एक पीएच मीटर का उपयोग कर NaOH 1 मीटर के साथ ६.९५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    3. आसुत जल के साथ मात्रा ५०० मिलीलीटर को समायोजित करने और पीएच एक पीएच मीटर का उपयोग कर की जांच करें ।
    4. pipetting 1 M NaOH अभिकर्मक बफ़र के द्वारा निम्न pH मान के साथ अभिकर्मक बफ़र की 20-30 मिलीलीटर aliquots करें: ६.९६, ६.९७, ६.९८, ६.९९, ७.००, ७.०१, ७.०२, ७.०३, ७.०४, ७.०५, ७.०६, ७.०७, ७.०८, ७.०९, ७.११ ।
      नोट: अभिकर्मक बफर के पीएच अभिकर्मक प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण है ।
    5. transfected कक्षों की सबसे अधिक संख्या के लिए जो अभिकर्मक बफ़र लीड का परीक्षण करने के लिए, प्रत्येक pH मान ६.९६ से ७.११ तक परीक्षण करें । २.२-२.११ में वर्णित अभिकर्मक विधि का उपयोग करें और एक मान्य प्लाज्मिड व्यक्त GFP. जो बफ़र सबसे अच्छा काम करता है का आकलन करने के लिए प्रत्येक अभिकर्मक बफ़र pH मान के लिए प्रति coverslip transfected कक्षों की संख्या निर्धारित करें ।
    6. Aliquot में उच्चतम अभिकर्मक दक्षता के साथ बफर 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों फ्रीज और स्टोर ट्यूबों में-20 ° c.
  2. पूर्व गर्म कम सीरम मध्यम, कोशिका संस्कृति मध्यम, और पानी स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए आसुत जल ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें । बाँझ काम की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए लामिना फ्लो हुड के तहत काम करते हैं ।
    1. प्रत्येक endotoxin के 4 µ g के साथ 2 एम कैल्शियम क्लोराइड के ७.५ µ l को मिलाएं-फ्री डीएनए (Synaptophysin-mOrange and mGFP/GFP-Rogdi) । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ६० मिलीलीटर की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए पानी जोड़ें ।
    2. मिश्रण करने के लिए अभिकर्मक बफर के ६० मिलीलीटर जोड़ें । सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, जबकि डीएनए-मिश्रण धीरे भंवर पर मिलाते हुए अभिकर्मक बफर dropwise जोड़ें ।
    3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर मशीन । लामिना फ्लो हूड के बगल में ट्यूब रखकर मशीन समय के दौरान मशीन ट्यूब मिलाते से बचें ।
  4. लामिना फ्लो हूड के तहत, सेल संस्कृति माध्यम ("वातानुकूलित मध्यम") एक १००० मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर कुओं से निकालें और यह मशीन में एक अलग कंटेनर में स्टोर ।
  5. एक अच्छी तरह से कम सीरम मध्यम के ५०० मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c और 5% सह2 पर कोशिकाओं को 20 मिनट की मशीन अवधि (कदम 2.3.3) खत्म हो गया है जब तक मशीन ।
  6. कई बूंदें pipetting द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण के 30 मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब के नीचे अवशेषों को त्यागें ।
  7. सभी कुओं अभिकर्मक मिश्रण के साथ आपूर्ति की गई है के बाद, धीरे से मध्यम में अभिकर्मक मिश्रण का वितरण सुनिश्चित करने के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेट हिला ।
  8. ३७ ° c और 5% सह2पर ६० मिनट के लिए कुएं की मशीन ।
  9. अभिकर्मक मिश्रण को निकालें और छोड़ें और इसे तीन बार सेल कल्चर मीडियम से धो लें । एक अच्छी तरह से सेल संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और आर टी पर 30 सेकंड के लिए उंहें दूर करना । मध्यम के ७५० मिलीलीटर निकालें और ताजा माध्यम की एक ही राशि जोड़ें । इस तीन बार दोहराएं ।
    नोट: धुलाई कदम महत्वपूर्ण है । समय है कि एक अच्छी तरह से एक ंयूनतम पर कोई माध्यम नहीं है रखो (यानी, हटाने और अच्छी तरह से जगह अच्छी तरह से) और धोने मध्यम धीरे जोड़ें ।
  10. कक्ष संस्कृति माध्यम को निकालें और छोड़ें और वातानुकूलित मध्यम अच्छी तरह से ४५० मिलीलीटर जोड़ें ।
  11. दो ंयूरॉंस में ३७ ° c और 5% सह2 DIV 10 को मशीन में परिपक्व ।

३. उत्तेजना आणि Syt1

नोट: निम्न प्रोटोकॉल 3 कुओं के लिए आगे लागू होता है. किसी भी अन्य संख्या के कुओं के ध्रुवीकरण के लिए, तदनुसार मात्रा समायोजित करें ।

  1. एक HEPES कुप्पी में 10x ध्रुवीकरण बफर (६४० मिमी NaCl, ७०० मिमी KCl, 10 मिमी MgCl2, 20 मिमी CaCl2, ३०० मिमी ग्लूकोज, २०० मिमी Erlenmeyer, पीएच ७.४) के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: ध्रुवीकरण बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों के लिए रखा जा सकता है । यदि एक गैर-ध्रुवीकरण समाधान भी प्रयोग किया जाता है,, एक 10x Tyrode के १२९० mm NaCl, ५० mm KCl, 10 मिमी MgCl2, 20 मिमी CaCl2, ३०० mm ग्लूकोज, २०० mm HEPES पीएच ७.४ से मिलकर समाधान तैयार करने के क्रम में उत्तेजना से प्रेरित रिसाइकिलिंग तुलना सहज रीसाइक्लिंग. 1x को कमजोर पड़ने के बाद, Tetrodotoxin के 1 µ m जोड़ने के लिए कार्रवाई संभावित पीढ़ी ब्लॉक का उपयोग करें ।
    1. NaCl के १.८७ g को भंग करना, २.६१ ग्राम का KCl, ०.१ ग्राम का MgCl2-6H20, ०.१५ ग्राम का CaCl2-2H2ओ और ३.० जी का ग्लूकोज-1 एच2ओ और २.३८ जी का ५० ग्राम एक HEPES कुप्पी में आसुत जल का Erlenmeyer । NaOH और बाँझ फिल्टर समाधान के साथ पीएच समायोजित करें । आसुत जल में 1:10 बफर पतला एक 1x एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए ।
  2. उत्तेजन के बाद निर्धारण के लिए 1x पंजाबस (pH ७.४) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें ।
    1. 1x पंजाब में 4% पीएफए के ५०० मिलीलीटर के लिए, आसुत एच2ओ के ४५० मिलीलीटर में paraformaldehyde के 20 ग्राम भंग ।
      नोट: हीटिंग समाधान को गति भंग हो सकता है, लेकिन ७० डिग्री सेल्सियस से अधिक समाधान गर्मी नहीं है, के रूप में पीएफए बिखर सकता है ।
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त, संभावित यलो, और टेराटोजेनिक है । दस्ताने पहनें जब पीएफए के साथ काम करने, धुएं डाकू के तहत काम करते हैं, और घूस से बचें ।
    2. चलो समाधान आरटी को शांत और 10x पंजाब शेयर समाधान के ५० मिलीलीटर जोड़ें । एक पीएच मीटर का उपयोग NaOH/एचसीएल के साथ ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
  3. 1x ध्रुवीकरण बफर के पूर्व गर्म ६०० मिलीलीटर और सेल संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर पानी स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए ।
  4. 10 सेकंड के लिए 1x ध्रुवीकरण बफर और भंवर के लिए माउस विरोधी Syt1 एंटीबॉडी (क्लोन ६०४.२) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. कक्षों से कक्ष culture माध्यम निकालें और छोड़ें । ध्रुवीकरण के २०० मिलीलीटर जोड़ें-एंटीबॉडी मिश्रण को एक अच्छी तरह से और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और मशीन में 5% सह2 के लिए गर्मी ।
  6. ध्रुवीकरण को हटाना और त्यागना-एंटीबॉडी मिश्रण और सेल कल्चर मीडियम के साथ इसे तीन बार धोना. एक अच्छी तरह से और आर टी पर 30 सेकंड के लिए मशीन के लिए सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । मध्यम से ७५० मिलीलीटर निकालें और ताजा माध्यम की एक ही राशि जोड़ें । तीन बार दोहराएं ।
  7. सेल कल्चर मीडियम को निकालें और छोड़ें और 1x पंजाबन में 4% पीएफए की ३०० mL जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
  8. 1x पंजाबियों के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

4. Immunocytochemistry

  1. बफ़र अवरुद्ध की ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: ब्लॉकिंग बफर कई महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
    1. सुक्रोज के २.५ g भंग और 10x पंजाब शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के 1 जी । जोड़ें १.५ 10% डिटर्जेंट स्टॉक समाधान की मिलीलीटर । समाधान हलचल जब तक सभी घटकों को ठीक से भंग कर दिया है और आसुत एच2हे जोड़ने जब तक ५० मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुंचने । समाधान Aliquot और aliquots के लिए फ़्रीज़ करें ।
  2. पतला माध्यमिक, fluorophore-युग्मित एंटीबॉडी (प्राथमिक Syt1 के खिलाफ निर्देशित-एंटीबॉडी प्रजातियों) में एक अच्छी तरह से 1:1000 के कमजोर पड़ने पर बफर अवरुद्ध के २०० मिलीलीटर में ।
  3. निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से एक coverslip युक्त से 1x पंजाबियों त्यागें ।
  4. एक अच्छी तरह से और आरटी पर ६० मिनट के लिए गर्मी को अवरुद्ध बफर-एंटीबॉडी मिश्रण के २०० मिलीलीटर जोड़ें ।
    चेतावनी: क्योंकि माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, सभी कदम आगे बढ़ अंधेरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  5. मशीन के बाद, 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए तीन बार धो लें ।
  6. एंबेडिंग माध्यम के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslips एम्बेड करें ।
    1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मध्यम embedding की एक 7 मिलीलीटर ड्रॉप जोड़ें । एक सिरिंज के साथ इसे उठाने और संदंश के साथ इसे हथियाने द्वारा 24 अच्छी तरह से थाली से coverslip निकालें ।
      चेतावनी: coverslip की सतह पर कोशिकाओं को आसानी से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं, तो संदंश देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    2. पंजाबियों को दूर करने के लिए आसुत जल में coverslip डुबकी और एक नरम ऊतक के लिए एक किनारे को छूने से इसे ध्यान से सूखी ।
    3. coverslip को एंबेडिंग मध्यम छोटी बूंद पर फ़्लिप करें, ताकि कक्षों को ले जाने वाली सतह को माइक्रोस्कोप स्लाइड का सामना न करना पड़े, जिससे एंबेडिंग माध्यम में कक्षों की एंबेडिंग हो सके ।
  7. स्लाइड छोड़ 1-2 के लिए हुड के नीचे के लिए एच (प्रकाश जोखिम से बचने के लिए उंहें कवर) और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर एक खुर्दबीन स्लाइड बॉक्स में स्टोर ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

5. सूक्ष्म विश्लेषण

  1. coverslips के बाद सूखी, उंहें उद्देश्य और कैमरे के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे जगह है ।
  2. हर चैनल के लिए एक्सपोज़र समय समायोजित करें ताकि धूसर मानों के अधिकतम वितरण को सुनिश्चित करने के लिए कुछ पिक्सेल को उजागर किया जा सके.
    नोट: जबकि जोखिम समय चैनलों के बीच भिन्न हो सकते हैं, यह एक चैनल के लिए लगातार होना चाहिए coverslips के बीच तुलना सुनिश्चित करने के लिए.
  3. प्रति coverslip ब्याज के 10 क्षेत्रों (ROIs) के लिए मल्टी चैनल छवियों का अधिग्रहण । जांच करें कि रॉय एक transfected ंयूरॉन से axonal प्रक्रियाओं GFP-प्रतिदीप्ति, जो कबरा किया जाना चाहिए की जांच से होता है ।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. tif फ़ाइलों के रूप में छवियों को निर्यात करें । फ़ाइल क्लिक करके OpenView18 में छवियां लोड करें । छवि फ़ाइल लोड।
  2. चैनल के रूप में Synaptophysin-mOrange छवि चुनें 1, Rogdi-GFP/mGFP छवि चैनल 2 के रूप में, और चैनल 3 के रूप में Alexa647 प्रतिदीप्ति छवि ।
  3. दहलीज ROIs ।
    1. विश्लेषण पर क्लिक करें | puncta पर जगह क्षेत्र। थ्रेशोल्ड और डेल्टा तीव्रता मान चुनें ताकि दृश्य निरीक्षण पर, फैलाना प्रतिदीप्ति बाहर रखा गया है, चैनल 1 की छवि में केवल कबरा संकेतों छोड़ने (Synaptophysin-mOrange प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व). सभी छवियों के लिए एक ही दहलीज रखो ।
  4. इन ROIs को इसी चैनल 2 (GFP-Rogdi/mGFP प्रतिदीप्ति) और प्रत्येक Syt1 क्षेत्र के 3 (प्रतिदीप्ति-coverslip) को अब निष्पादितकरें पर क्लिक कर के स्थानांतरण ।
    नोट: यदि कक्ष डबल-transfected है तो ROIs केवल विचार किया जाना चाहिए । इस विधि में mOrange-और GFP-प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से दृष्टिगोचर होना चाहिए ।
  5. डेटा लॉग डेटापर क्लिक करके विश्लेषण लॉग संपादक में सहेजें ।
  6. विश्लेषण लॉग संपादक के अंतर्गत Windows टैब खोलें और प्रत्येक चैनल के लिए मानों की प्रतिलिपि बनाएँ । किसी स्प्रेडशीट में अलग चैनल के लिए मान चिपकाएँ.
  7. दोनों अभिकर्मक स्थितियों (GFP-Rogdi और mGFP) में ROIs पर Syt1-चैनल की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करें.
  8. इस तरह के छात्र टी परीक्षण के रूप में उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षणों को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण मतभेदों का निर्धारण ।

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Representative Results

इस दृष्टिकोण के एक परिणाम की उंमीद लगभग ५० दोहरे transfected न्यूरॉन्स प्रति coverslip ५०,००० ंयूरॉंस के घनत्व पर अच्छी तरह से पता लगाने है । प्रत्येक न्यूरॉन के axon को फ्लोरोसेंट-टैग किए गए Synaptophysin संचय के कई हॉटस्पॉट दिखाने की उम्मीद है, जो क्लस्टर ofSVs का संकेत है । पर कार्यात्मक presynaptic साइटों, रिकॉमबिनेंट Synaptophysin संकेत colocalizes के साथ कबरा Syt1 प्रतिदीप्ति । डबल अभिकर्मक का प्रयोग, या तो GFP-Rogdi ब्याज के प्रोटीन के रूप में (चित्रा 1) या mGFP के रूप में नियंत्रण सह है रिकॉमबिनेंट Synaptophysin के साथ व्यक्त की ।

इस प्रयोग में, हम या तो GFP-Rogdi या mGFP व्यक्त न्यूरॉन्स में presynaptic साइटों पर एसवी रीसाइक्लिंग का विश्लेषण । यदि नियंत्रण प्रोटीन, mGFP, पूरे सेल भर में वितरित homogeneously है, लेकिन synaptic साइटों पर अपने प्रभाव अभी भी अध्ययन करने की जरूरत है, तो यह आवश्यक है सह एक दूसरा प्रोटीन है कि presynaptically समृद्ध है transfect, फ्लोरोसेंट टैग Synaptophysin ।

जैसा कि पहले वर्णित है, कोशिकाओं के ध्रुवीकरण प्रेरित ट्रांसमीटर रिलीज से गुजरना । नतीजतन, कार्यात्मक synapses ले Syt1 एंटीबॉडी माध्यम में जोड़ा । एक फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ Syt1 एंटीबॉडी immunolabeling के बाद, Syt1 के ऊपर की हद अंततः quantified (चित्रा 2) का उपयोग कर immunosignal है ।

Figure 1
चित्र 1. डबल-transfected कक्ष । दृश्य का फ़ील्ड डबल-transfected सेल एक्सप्रेस GFP-Rogdi (a) और Synaptophysin-mCherry (B) दिखाता है । Synaptophysin प्रचुर synaptic पुटिका प्रोटीन आहे. इसका रिकॉमबिनेंट वैरिएंट को लेबलिंग synaptic बूटोंस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । GFP-Rogdi के स्थानीयकरण पैटर्न Synaptophysin-mCherry (सी) की है कि जैसा दिखता है । स्केल बार्स = 10 माइक्रोन । बक्से 2.5 x आवर्धन दिखाएं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. GFP-Rogdi पर कार्यात्मक synapses. लाइव Syt1 डबल transfected कोशिकाओं में प्रदर्शन किया था या तो mGFP व्यक्त (हरी) और Synaptophysin-mOrange (लाल; क-घ) या GFP-Rogdi (हरा) और Synaptophysin-mOrange (लाल; ई एच) । Syt1 एंटीबॉडी एक माउस का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Syt1 के चमकदार डोमेन के खिलाफ निर्देश दिया । पीएफए निर्धारण के बाद, कोशिकाओं खरगोश विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ दाग थे । माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी खरगोश alexa ४८८ और विरोधी माउस alexa ६४७) GFP या GFP-Rogdi और Syt1, क्रमशः का पता लगाने के लिए जोड़ा गया । Synaptophysin-mOrange के Autofluorescence का उपयोग presynaptic टर्मिनलों (बी एण्ड एफ) का पता लगाने के लिए किया जाता था. कबरा Syt1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस पुटिका रीसाइक्लिंग की साइटों को इंगित करता है (नीला; सी और जी). ध्यान दें कि Syt1-लेबल synapses के बहुमत गैर transfected ंयूरॉंस के लिए स्थानीयकृत रहे हैं । GFP-Rogdi सक्रिय synapses को निशाना बनाया गया और synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग (I) को नहीं बदला गया । 3 स्वतंत्र संस्कृति प्रयोगों (N = 3) प्रदर्शन किया गया । प्रत्येक संस्कृति (कुल 10 में से) से कम 3 coverslips का उपयोग विश्लेषण के लिए किया गया । अंत में, coverslip प्रति 3 क्षेत्रों (n = 30) का विश्लेषण किया गया । छात्र ´ एस टी-टेस्ट में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं दिखा. स्केल बार्स = 10 माइक्रोन । त्रुटि पट्टियां माध्य (S.E.M.) की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । "एन एस" कोई महत्व इंगित करता है । यह आंकड़ा Riemann एट अल से संशोधित किया गया है । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वहां तीन नियमित रूप से परख synaptic पुटिका (एसवी) रिसाइकिलिंग अध्ययन किया करते थे । पहले दो एक) ऐसे FM1-43 के रूप में फ्लोरोसेंट styryl रंजक का उपयोग शामिल है (जो झिल्ली में शामिल, organelles में endocytosis के दौरान लिया जाता है, और exocytosis के बाद जारी कर रहे हैं); और ख) फ्लोरोसेंट रिकॉमबिनेंट एसवी प्रोटीन टैग (जो, पर व्यक्त, proteinaceous रीसाइक्लिंग मशीनरी में शामिल) । यदि संलग्न fluorophores पीएच पर निर्भर करता है उनके प्रतिदीप्ति बदलने के लिए, वे एक एसवी और extracellular माध्यम के पीएच के अंलीय इंटीरियर के बीच परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । रिकॉमबिनेंट GFP के एक पीएच के प्रति संवेदनशील संस्करण के साथ टैग प्रोटीन Phluorins कहा जाता है । दो परख चर्चा की है दोनों पहले से चित्रित किया गया है19,20, और पेशेवरों और प्रत्येक के विपक्ष भी21की समीक्षा की गई है ।

यहां, हम एक तिहाई, अच्छी तरह से स्थापित विधि का वर्णन4,5,6,7,9,14। एसवी रीसाइक्लिंग का परीक्षण करने के लिए, हम इस तथ्य का लाभ उठाते हैं कि पुटिका-जुड़े प्रोटीन Synaptotagmin-1 (Syt1) के चमकीले डोमेन exocytosis पर कोशिका की सतह के संपर्क में आ जाते हैं । सबसे पहले, हम एक एंटीबॉडी संस्कृति माध्यम है, जो तब एसवी रिसाइकिलिंग के दौरान पुटिका द्वारा लिया जाता है के लिए चमकदार डोमेन के खिलाफ निर्देश दिया जोड़ें । यह एंटीबॉडी है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा quantified visualized है । वैकल्पिक रूप से, एक सीधे लेबल Syt1-एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा सकता है । लेबल पीएच-स्वतंत्र हो सकता है, Syt1-एंटीबॉडी के स्थानीयकरण की रिपोर्टिंग दोनों के अंदर और SVs की बाहरी सतह पर, या पीएच-निर्भर, स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति परिवर्तन के आधार पर रिपोर्टिंग । हम भी के संयोजन का वर्णन इस एसवी रीसाइक्लिंग परख के डबल अभिकर्मक के साथ प्रसंस्कृत ंयूरॉंस परीक्षण करने के लिए या नहीं एक प्रोटीन के ब्याज, GFP-Rogdi, लक्ष्य कार्यात्मक synapses और प्रभावित करता है एसवी पुनर्चक्रण । GFP-Rogdi इस दृष्टिकोण के लिए विशिष्ट है; हालांकि, एक ही सवाल हित के किसी भी प्रोटीन के लिए संबोधित किया जा सकता है ।

इस परख पहले १९९२ में शुरू की SVs4 के सहज रिसाइकिलिंग निगरानी और आगे एक ही समूह द्वारा विकसित किया गया था पर नजर रखने एसवी12रिसाइकिलिंग । उनके प्रयोगों ने स्थापित किया है कि Syt1 clostridial neurotoxins के प्रति संवेदनशील है, जो ब्लॉक एसवी exocytosis12। उंहोंने यह भी दिखाया कि ३७ डिग्री सेल्सियस पर ध्रुवीकरण के द्वारा संस्कृतियों की उत्तेजना 1 की तुलना में Syt1 एंटीबॉडी के internalization को बढ़ाता है) संस्कृतियों है कि बर्फ पर रखा जाता है, जो सबसे endocytosis रोकता है, और 2) संस्कृतियों उत्तेजना के बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन, जो सहज रिसाइकिलिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन12,22रिसाइकिलिंग पैदा नहीं करता है । परख आसानी से दो शर्तों, जैसे के साथ और ब्याज की एक अणु के बिना के बीच एसवी पुनर्चक्रण की तुलना कर सकते हैं । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल Syt1 एंटीबॉडी उपस्थिति में एक निश्चित व्यक्त प्रोटीन की अनुपस्थिति बनाम की तुलना पर केंद्रित है । प्रोटोकॉल का विस्तार किया जा सकता है अगर सतह के सापेक्ष योगदान बाध्यकारी, सहज रिसाइकिलिंग और पैदा रीसाइक्लिंग का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, उत्तेजना के बिना बर्फ पर गर्मी ंयूरॉंस endocytosis रोकता है, किसी भी Syt1 एंटीबॉडी की सतह बंधन खुलासा । Tetrodotoxin के साथ बेसल समाधान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ंयूरॉंस की मशीनिंग संभावित प्रसार कार्रवाई रोकता है, किसी भी सहज रिसाइकिलिंग खुलासा । इस प्रकार, उत्तेजक स्थितियों के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीनिंग न्यूरॉन्स पैदा एसवी रिसाइकिलिंग की हद तक प्रकट कर सकते हैं ।

जीवित कोशिकाओं आदर्श शारीरिक स्थितियों के प्रति संवेदनशील हैं; इसलिए, रखरखाव, अभिकर्मक, और ध्रुवीकरण बफ़र हमेशा पीएच और तापमान सहित शारीरिक मापदंडों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । जबकि ध्रुवीकरण बफर बाँझ फिल्टर के माध्यम से पारित किया जा सकता है के बाद पीएच समायोजित किया गया है, अभिकर्मक बफ़र्स बाँझ छानने के लिए संवेदनशील हैं. इसलिए, हम अपने पीएच समायोजित, यह प्रयोग जब तक जमे रहते हैं, और यह एक तालिका में स्पिन किसी भी जीवाणु गोली शीर्ष केंद्रापसारक । अभिकर्मक के लिए, यह बफर कैल्शियम फॉस्फेट क्रिस्टल के साथ प्लाज्मिड के सहयोग को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है । कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक इन विट्रो (DIV) 2-4 में दिन पर सबसे अच्छा काम करता है । हम transfected ंयूरॉंस में presynaptic टर्मिनलों की पहचान करने के लिए एक मार्कर के रूप में टैग Synaptophysin, एक एसवी transmembrane प्रोटीन, का उपयोग करें । जैसे SV2, Synapsin, और खलनायिका/Synaptobrevin या सक्रिय क्षेत्र अणु जैसे बसून, रिम, Munc13-1 के रूप में अंय एसवी प्रोटीन के संस्करणों टैग, और कलाकारों को भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।

mCherry और mOrange दोनों ही लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं । हालांकि mCherry mOrange की तुलना में उज्जवल है, यह mOrange से लंबी तरंग दैर्ध्य में अधिक से अधिक उत्सर्जन है । इसलिए, GFP के साथ ट्रिपल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, एक लाल रंग, और ७०० एनएम रेंज में उत्सर्जक एक डाई, mOrange mCherry से बेहतर विकल्प है । GFP और एक लाल रंग के साथ डबल प्रतिदीप्ति के लिए, mCherry अनुकूल हो सकता है क्योंकि यह चमकदार डाई है । विरल अभिकर्मक की गारंटी के लिए, अभिकर्मक मिश्रण ६० मिनट से अधिक समय के लिए नहीं किया जाना चाहिए । यह भी महत्वपूर्ण है कि एक ध्रुवीकरण बफर में गर्मी सभी बुलबुले के exocytosis सुनिश्चित करने के लिए समय की सही लंबाई है । हालांकि, ध्रुवीकरण बफर करने के लिए विस्तारित जोखिम से बचा जाना चाहिए । छवि अधिग्रहण के दौरान, यह भी प्रयोगों के विभिन्न सेट के बीच quantifiable तुलना सुनिश्चित करने के लिए एक ही जोखिम बार और प्रकाश तीव्रता लागू करने के लिए आवश्यक है.

अंत में, छवि विश्लेषण के दौरान, हमारे प्रोटोकॉल कई विचार शामिल हैं । रिकॉमबिनेंट Synaptophysin puncta दिखा ब्याज के एक क्षेत्र के लिए, कम तीव्रता दहलीज ताकि फैलाना प्रतिदीप्ति बाहर रखा गया है सेट है । अगले, इस दहलीज अंय क्षेत्रों और कबरा संकेतों और फैलाना प्रतिदीप्ति के अपवर्जन के समान समावेश का पालन करने के लिए coverslips पर परीक्षण किया है । एक बार एक उचित सीमा की पहचान की है, यह सभी छवियों के लिए लागू किया जाता है, ब्याज के कबरा क्षेत्रों का निर्माण (ROIs) रिकॉमबिनेंट Synaptophysin में (mCherry या mOrange के साथ टैग) चैनल । अंत में, Syt1 तीव्रता ROIs9के लिए निर्धारित किया जाता है ।

हमारे दृष्टिकोण विरल अभिकर्मक के लिए अनुकूलित है । हम एक जटिल सेटिंग में presynaptic समारोह का विश्लेषण जहां untransfected न्यूरॉन्स से घिरा transfected न्यूरॉन्स के axons में एसवी रीसाइक्लिंग है । इस सेट अप में, डबल अभिकर्मक हमें ंयूरॉन समारोह में हेरफेर और transfected ंयूरॉंस के presynaptic टर्मिनलों का पता लगाने की अनुमति देता है । Transfected presynaptic न्यूरॉन्स कि संपर्क untransfected postsynaptic न्यूरॉन्स एसवी रीसाइक्लिंग पर एक presynaptic ंयूरॉन के प्रभाव का आकलन करने में एक महत्वपूर्ण कारक है । सेटिंग भी आसानी से परीक्षण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या नहीं एक postsynaptic हेरफेर presynaptic परिवर्तन का कारण बनता है । इस मामले में, एक प्रोटीन है कि postsynaptic साइटों के लिए लक्षित है के साथ न्यूरॉन्स के विरल अभिकर्मक transfected न्यूरॉन्स की postsynaptic साइटों को स्थानीयकृत करेगा, और Syt1 synaptic बूटोंस न्यूरॉन्स के untransfected पर निर्धारित किया जा सकता है.

जब स्पार्स अभिकर्मक आवश्यक नहीं है, अलग अभिकर्मक प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, उच्च अभिकर्मक दरों में DIV 7-8 परिणामों पर Lipofectamine के साथ अभिकर्मक, लेकिन यह भी प्रत्येक transfected सेल9में मजबूत अभिव्यक्ति जरूरत पर जोर देता । इसके अलावा, वायरल transduction अभिव्यक्ति में संस्कृतिपूर्ण ंयूरॉंस के लगभग १००% में परिणाम कर सकते है14,23,24। एसवी रीसाइक्लिंग की निगरानी के उद्देश्य से प्रयोगों में, अभिकर्मक एक प्रोटीन के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है या पूरी तरह से बाहर छोड़ दिया । उदाहरण के लिए, जब समग्र synaptic रीसाइक्लिंग wildtype और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से न्यूरॉन्स के बीच की तुलना में है, अभिकर्मक द्वारा व्यक्तिगत न्यूरॉन्स लेबलिंग आवश्यक नहीं है. साथ ही, यह अंतर्जात प्रोटीन के immunolabeling सक्षम बनाता है । अभिकर्मक विफल रहता है, तो यह अभिकर्मक बफ़र के साथ एक मान्य प्लाज्मिड का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है या किसी अन्य pH के साथ एक बफ़र का उपयोग करें (देखें अभिकर्मक बफ़र की तैयारी) । endotoxin मुफ्त डीएनए की तैयारी का उपयोग भी महत्वपूर्ण प्रतीत होता है । Immunostaining आंतरिक Syt1 एंटीबॉडी दोनों पीएफए-फिक्स्ड और मेथनॉल-फिक्स्ड नमूनों में काम करता है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि मेथनॉल निर्धारण के बाद GFP और आरएफपी autofluorescence खो जाता है । यदि GFP या आरएफपी को मेथनॉल-फिक्स्ड कोशिकाओं में स्थानीयकृत करने की आवश्यकता हो तो ये प्रोटीन immunolabeled होना चाहिए. यदि Syt1, ध्रुवीकरण बफर में समय और कश्मीर एकाग्रता विफल रहता है, तदनुसार बदल दिया जाना चाहिए । कई प्रोटोकॉल रूपांतरों ९० एस25 से ६० मिनट12से लेकर ध्रुवीकरण बार के साथ प्रकाशित किया गया है, और के साथ K+ की सांद्रता ४५ mm, 50mM, ७० mm, और ११० mm6,25,26 ,27. जब आवर्तक गतिविधि को रोका जाना चाहिए, तो ध्रुवीकरण के दौरान ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर भी जोड़ा जा सकता है । अंत में, जबकि उच्च कश्मीर+ ध्रुवीकरण के लिए सबसे मजबूत उत्तेजना होने लगा है, कार्रवाई की क्षमता अधिक शारीरिक उत्तेजनाओं के माध्यम से एसवी रिसाइकिलिंग प्रेरित कर सकते है22,28। Syt1 एंटीबॉडी में अंतर को फिर से उठाना प्रभावकारिता चूहे और माउस संस्कृतियों में हो सकता है । हमारे विधि में, मोनोक्लोनल माउस विरोधी Syt1 क्लोन ६०४.२ (RRID: AB_993036) माउस संस्कृतियों की तुलना में चूहे संस्कृतियों में मजबूत धुंधला पैदा करता है, जबकि polyclonal खरगोश विरोधी Syt1 एंटीबॉडी (RRID: AB_11042457) मजबूत माउस संस्कृतियों में धुंधला पैदा करता है, लेकिन सावधानी के कई नोटों के नीचे चर्चा कर रहे हैं ।

कई SVs में Synaptotagmin एंटीबॉडी के लिए विरोधी के उपयोग के बारे में निरंतर विचार किया जाना चाहिए । सबसे पहले, N-Syt1 के 24 asparagine के glycosylation प्रोटीन29,30के endocytotic को बढ़ावा देता है । Asparagine 24 Syt1 के चमकदार डोमेन का हिस्सा है । माउस और खरगोश एंटीबॉडी कि हम उपयोग अमीनो एसिड 1-12 और 1-8, क्रमशः Syt1 के खिलाफ निर्देशित कर रहे हैं । जबकि उनके epitopes N-glycosylation साइट के साथ ओवरलैप नहीं करते हैं, steric बाधा या, इसके विपरीत, एंटीबॉडी बंधन द्वारा ऊपर उठाने की एक प्रेरण शामिल नहीं किया जा सकता है । Syt1 में एन-glycosylation साइट के उत्परिवर्तन endocytosis के कैनेटीक्स और Syt1 को SVs के लक्ष्यीकरण में परिवर्तन नहीं करता है । यह बाहरी प्लाज्मा झिल्ली की सतह पर शेष Syt1 के अंश बढ़ जाती है जब endocytosis कमजोर उत्तेजनाओं से प्रेरित है । जब उच्च कश्मीर+ ध्रुवीकरण के रूप में मजबूत उत्तेजनाओं, लागू कर रहे हैं, Syt1 में कोई कमी-तेज30मनाया जाता है । कुल मिलाकर, अगर एंटीबॉडी एन-glycosylation साइट के साथ किसी तरह वे एसवी endocytosis में एक परिवर्तन एंटीबॉडी की तुलना में मुक्त शर्तों के कारण हो सकता है हस्तक्षेप, लेकिन इस परिवर्तन प्रयोग के लिए समान होना चाहिए (हमारे मामले में GFP के व्यक्त-Rogdi) और नियंत्रण (हमारे मामले में GFP की अभिव्यक्ति) । इसके अतिरिक्त, polyclonal एंटीबॉडी अधिक steric समस्याओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से crosslinking प्रेरित होने की संभावना हो सकती है, क्योंकि एंटीबॉडी की एक बड़ी प्रतिलिपि संख्या epitope को बांध. हम एक दूसरे के साथ उपलब्ध एंटीबॉडी की तुलना व्यवस्थित अध्ययन के बारे में पता नहीं कर रहे हैं; हालांकि, कुछ अध्ययनों से कुछ एंटीबॉडी की वैधता को संबोधित किया है । उदाहरण के लिए, जब एसवी पुनर्चक्रण कैनेटीक्स मोनोक्लोनल माउस एंटी-Syt1 एंटीबॉडी क्लोन ६०४.२ और Synaptophluorin-प्रतिदीप्ति परिवर्तन एक सीधी तुलना में, इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए थे, का उपयोग कर जांच की गई28इस एंटीबॉडी का उपयोग मांय । polyclonal खरगोश Syt1 एंटीबॉडी और रिकॉर्डिंग synaptic संचरण electrophysiologically के साथ SVs लोड हो रहा है पता चला है कि भरी हुई synapses synaptic के नुकसान-समारोह म्यूटेंट की याद ताजा एक तरह से Syt1 संचरण कम था । इसलिए, इन polyclonal एंटीबॉडी synaptic संचरण को प्रभावित करते हैं । वास्तविक कदम दोनों सहज और पैदा रिसाइकिलिंग पता चला है, सुझाव है कि एक polyclonal एंटीबॉडी एसवी रिसाइकिलिंग के एक दौर की निगरानी के लिए उपयुक्त है, लेकिन सावधानी जब इन एंटीबॉडी31के बाद परिणाम की व्याख्या लिया जाना चाहिए ।

तीन परख नियमित रूप से एसवी पुनर्चक्रण, जो styryl रंजक के साथ झिल्ली लेबलिंग शामिल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, Phluorins के एक्सप्रेस, और Syt1-एंटीबॉडी यहां प्रदर्शन किया । सभी तीन परख के लिए endocytotic और एसवी रिसाइकिलिंग के exocytotic पैर निर्धारित किया जा सकता है । जबकि सभी तीन परख शक्तिशाली लाभ है, एक भी एक सिद्धांत चेतावनी है । एफएम रंजक पूरे सेल सतह लेबल और सभी रीसाइक्लिंग झिल्ली के साथ सेल में ले रहे हैं । Phluorins के द्वारा व्यक्त किया जाना चाहिए । Syt1-एंटीबॉडी अंतर्जात प्रोटीन लेबल, लेकिन कुछ एंटीबॉडी कुछ शर्तों के तहत अपने कार्य को प्रभावित कर सकते हैं । प्रत्येक चेतावनी, तथापि, उचित21को संबोधित किया जा सकता है ।

कुल मिलाकर, Syt1 एंटीबॉडी को ले लो परख विभिंन प्रयोजनों के कार्य किया है । सबसे पहले, यह चुनिंदा लेबल SVs सहज या रिसाइकिलिंग पैदा के दौर में इस्तेमाल किया गया था, क्रमशः28,31,३२,३३। दूसरा, यह एक दवा या एसवी रीसाइक्लिंग की सीमा पर प्रोटीन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; उदाहरण के लिए, दिखाने के लिए कि बीडीएनएफ दोनों सहज और पैदा एसवी6पुनर्चक्रण को बढ़ाता है । तीसरा, यह आकृति विज्ञान synapses३४,३५परिभाषित की कुल संख्या के एक प्रतिशत के रूप में SVs रीसाइक्लिंग के साथ synapses की संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह पता चला कि postsynaptic सेल-आसंजन अणु Neuroligin-1 SVs25 रिसाइकिलिंग के साथ synapses का प्रतिशत बढ़ जाता है और है कि AMPA प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के व्यक्त करने को कम करने का प्रतिशत घट जाती है रीसाइक्लिंग SVs के साथ synapses, presynaptically मूक synapses३६के प्रतिशत में वृद्धि । इसके अतिरिक्त, परख SVs27 की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए और nanoscopy13,22,३३का उपयोग कर Syt1 के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । अंत में, इस विधि अभी भी परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है या नहीं कुछ प्रोटीन्स के लिए कार्यात्मक synapses9स्थानीयकृत । Syt1 एंटीबॉडी भी लंबी अवधि के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां एंटीबॉडी दिन के लिए न्यूरॉन्स में रहता है के बाद३७। यह एक अलग Syt1 एंटीबॉडी लेबल का उपयोग कर के एक दूसरे दौर के साथ संयुक्त किया जा सकता है या एक एंटीबॉडी एक भिंन एसवी प्रोटीन के चमकदार डोमेन के खिलाफ निर्देशित । इस परीक्षण की अनुमति देता है जो शुरू में पुनर्नवीनीकरण SVs और जो एक प्रयोग के अंत तक रीसायकल । यह इस तरह के तीव्र स्लाइसें और organotypic स्लाइस संस्कृतियों के रूप में और अधिक बरकरार मॉडल सिस्टम, के लिए इस परख अनुकूलन दिलचस्प होगा । सिद्धांत रूप में, अधिक परख wildtype और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं से ऊतक की तुलना की अनुमति देता है या वायरल डिलीवरी या biolistics, यानी, एक "जीन बंदूक," इन मॉडल सिस्टम में प्रोटीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के साथ जोड़ा जा सकता है । ऐसी प्रणालियों में, presynaptic मशीनरी पर कुछ perturbations के प्रभाव, ऊपर की परख द्वारा निगरानी, और नेटवर्क गतिशीलता एक साथ अध्ययन किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Irmgard Weiss को धन्यवाद देते हैं । यह काम नैनोमीटर रेंज और मस्तिष्क के आण्विक फिजियोलॉजी (CNMPB, B1-7, T.D. करने के लिए) में माइक्रोस्कोपी के लिए उत्कृष्टता के क्लस्टर के माध्यम से DFG द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B27 Gibco 17504-044
BSA Sigma A7030-50g
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306-100g
CoolSNAP HQ2 Photometrics
dH2O Invitrogen 15230
DABCO Merck 8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647 Jackson-Immunoresearch 715605151 antibody
DMEM Invitrogen 41966
DPBS Gibco 14190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120094
multiwell 24 well Fisher Scientific 087721H
tube (50 mL) Greiner Bio-One 227261
FBS superior BiochromAG S0615
Glucose Merck 1,083,421,000
HBSS Invitrogen 14170
HEPES Sigma H4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator) ThermoElectron Corporation
KCL Sigma-Aldrich P9541-500g
L-Glutamin Gibco 25030
MgCl2 Honeywell M0250-500g
microscope slides Fisher Scientific 10144633CF
Microsoft Excel Microsoft
Mowiol4-88 Calbiochem 475904
NaCl BioFroxx 1394KG001
Na2HPO4 BioFroxx 5155KG001
Neurobasal Invitrogen 21103049
OpenView Experiment Analysis Application Free software, see comments written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel
PBS (10x) Roche 11666789001
Optimem Invitrogen 31985
Penstrep Gibco 15140-122
PFA Sigma P6148-1kg
safety hood ThermoElectron Serial No. 40649111
Sucrose neoFroxx 1104kg001
Synaptotagmin1 Synaptic Systems 105311 mouse monoclonal; clone 604.2
Triton X-100 Merck 1,086,031,000
Vortex Genius 3  IKA 3340001
Water bath GFL 1004
Zeiss Observer. Z1  Zeiss

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तंत्रिका विज्ञान १३६ अंक Synaptic बुलबुले रीसाइक्लिंग synapses ंयूरॉंस Synaptotagmin-1 हिप्पोकैम्पस चूहा सेल संस्कृति
कल्चरल न्यूरॉन्स में Synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए एक ऑप्टिकल परख Presynaptic प्रोटीन को व्यक्त
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Riemann, D., Petkova, A., Dresbach,… More

Riemann, D., Petkova, A., Dresbach, T., Wallrafen, R. An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins. J. Vis. Exp. (136), e58043, doi:10.3791/58043 (2018).

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