Summary
Vi beskriver en optisk analys för synaptiskt vesikelprotein (SV) återvinning i odlade nervceller. Att kombinera detta protokoll med dubbel transfection uttrycka en presynaptiska markör och protein sevärdheter tillåter oss att hitta presynaptiska webbplatser, deras synaptiska vesikelproteinet återvinning kapacitet, och fastställa rollen av proteinet av intresse.
Abstract
På aktiva presynaptiska nerven terminaler genomgår synaptiska vesikler cykler av exo- och endocytos. Under återvinning exponeras luminala domäner av SV transmembrana proteiner på cellytan. Ett av dessa proteiner är Synaptotagmin-1 (Syt1). En antikropp riktad mot Syt1, när lagt till odlingsmediet, luminala domän tas upp under exo-endocytotic cykel. Detta upptag är proportionell mot mängden SV återvinning och kan kvantifieras genom immunofluorescens. Här kombinerar vi Syt1 antikropp upptag med dubbel transfection av odlade nervceller i hippocampus. Detta tillåter oss att (1) lokalisera presynaptiska webbplatser baserat på uttrycket av rekombinant presynaptiska markör Synaptophysin, (2) fastställa deras funktionalitet använder Syt1 upptag och (3) präglar inriktningen och effekterna av ett protein av intresse, GFP-Rogdi.
Introduction
Det är viktigt att fastställa att studera synaptiskt vesikelprotein återvinning hur presynaptiska egenskaper förändras, antingen under synaptisk plasticitet eller svar på störning av synaptic funktion. Antikropp upptag studera Synaptotagmin-1 (Syt1) och ger en metod för att mäta mängden SV återvinning. Syt1 är en SV-associerade protein som fungerar som en Ca2 + sensor och är nödvändigt för exocytotic release av signalsubstansen1,2. Det är ett transmembrane protein med en C-terminal cytoplasmiska domänen utanför SV och en N-terminal luminala domän inuti den SV3. Under exocytos, blir Syt1 luminala domän utsatta för externa mediet. Till detta externa medium, lägger vi till antikroppar riktade mot den cytoplasmiska domänen, som blir internaliserat under endocytos. Dessa antikroppar kan vara antingen före konjugerat med fluorophores eller immunostained med sekundära antikroppar4,5,6,7. Fluorescensintensiteten hos den resulterande immunosignal är proportionell mot mängden SV återvinning. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma både konstituerande och depolarisation-inducerad SV återvinning6,8.
Syt1 upptag analyser kan utföras efter virus-medierad genöverföring till praktiskt taget alla celler i skålen eller glesa transfection av ett litet antal celler. Vår metod kombinerar analysen med glesa dubbel transfection av primära Hippocampus nervceller använder kalciumfosfat9. Vi använder ett rekombinant markör protein känd samlas kring presynapses, fluorescently märkta Synaptophysin, att lokalisera presynaptiska terminaler och överuttrycka våra protein av intresse, Rogdi. Detta tillåter oss att testa huruvida Rogdi mål funktionella synapser och påverkar SV återvinning. Den gen som kodar Rogdi identifierades ursprungligen i en skärm för Drosophila mutanter kännetecknas av försämrat minne10. Hos människa orsakar mutationer i genen Rogdi en sällsynt och förödande sjukdom som kallas Kohlschütter-Tönz syndrom. Patienter lider av tandemaljen missbildningar, pharmacoresistant epilepsi och psykomotorisk förseningar. subcellulär lokalisering av genen produkten förblev dock svårfångade11. Således gav Syt1 upptag analysen viktiga bevis för lokalisering av GFP-märkta Rogdi på funktionella synapser9.
Detta upptag-tekniken har flera fördelar. Första kan SV återvinning observeras både i realtid genom att utföra live imaging7,12, och efter fixering6,9 genom att mäta fluorescensintensiteten hos skivbolaget Syt1 fluorescens. Dessutom har flera Syt1 antikropp varianter utvecklats. Det finns otaggade varianter som kan märkas med en sekundär antikropp efter en standard immunfärgning protokollet efter fixering och pre konjugerade varianter med en fluorescens etikett redan. Slutligen, antikroppsbaserade fluorescens är fördelaktigt på grund av det stora urvalet av kommersiellt tillgängliga sekundära eller konjugerade färgämnen som kan användas.
När fastställande och immunfärgning nervceller, det är också möjligt att fläcken för ytterligare proteiner och utföra colocalization analys. Detta kan avgöra var de är belägna i förhållande till återvinning SVs. Intensiteten av fluorescens etiketten är ett direkt mått på mängden SV återvinning. Dessutom etikett antikroppar selektivt Syt1-innehållande strukturer, vilket resulterar i hög specificitet och lite bakgrund fluorescens4. Olika stimulering protokoll kan också användas, såsom depolarisation buffertar eller elektrisk stimulering protokoll9,12,13,14. Basala SV återvinning kan dock mätas utan stimulerande i neuronala kulturer15.
Vår metod gäller specifikt Syt1 antikropp upptag i dubbel-transfekterade nervceller med sekundär antikropp immunolabeling efter fixering. Men hänvisar vi till alla rutinmässigt används varianter av analysen i vår diskussion att ge tittarna en möjlighet att anpassa protokollet till specifika behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Inga studier med levande djur har utförts. Experiment med euthanized djur för att få cell kulturer godkändes av de lokala djurskydd myndigheterna (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under godkännande nummer T10/30. Experimenten utfördes med de godkända protokoll.
1. primära Hippocampus cellkultur
- Förbereda den dissocierade cellkulturen för råtta hippocampus på embryonala dag 1916,17. Platta celler med 12 mm coverslips belagd med polyethyleneimine (PEI) i 24-väl rätter på en densitet på 50 000-60 000 celler per brunn. Kontrollera tätheten använder en cell räknar kammare och fas kontrast optik.
- Kultur nervceller i 3 dagar (dag i vitro (DIV) 3) i en 24-väl plåt i inkubatorn vid 37 ° C med 5% CO2.
- Bedöma coverslips indikatorer på cell hälsa använder överförda ljusmikroskopi (t.ex. fas kontrast optik vid 10-20 X förstoring). Kontrollera om följande indikatorer för god hälsa: en tydlig fas kontrast halo, neuriter utan pärlstav strukturer, och ingen soma klustring eller neurite kombinationserbjudanden.
2. transfection
Anmärkning: Följande protokoll refererar till en dubbel-transfection för 3 brunnar. Dock fungerar protokollet bäst när belopp som är tillräckligt för 4 brunnar är beredda.
- Förbereda 500 mL transfection buffert (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 15 mM glukos, 42 mM HEPES) i en Erlenmeyerkolv.
- Upplösa 8,0 g NaCl, 0,37 g KCl, 0,095 g av Na2HPO4, 1,35 g glukos och 5,0 g av HEPES i 400 mL destillerat vatten i en Erlenmeyerkolv.
- Justera pH till 6,95 med 1 M NaOH med hjälp av en pH-mätare.
- Justera volymen med destillerat vatten till 500 mL och kontrollera pH-värdet med hjälp av en pH-mätare.
- Gör 20-30 mL alikvoter av transfection buffert med följande pH värden genom pipettering 1 M NaOH till transfection bufferten: 6.96 6,97, 6.98, 6,99, 7.00, 7.01, 7.02, 7,03, 7.04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7.11.
Obs: pH transfection bufferten är avgörande för transfection effekten. - För att testa vilka transfection buffert leder till högsta antalet transfekterade celler, testa varje pH värde från 6,96 till 7.11. Använd metoden transfection beskrivs i 2.2-2.11 och en validerad plasmid uttrycker GFP. Bestämma antalet transfekterade celler per täckglas för varje transfection buffert pH värde att bedöma som buffert fungerar bäst.
- Alikvotens bufferten med högsta transfection effektivitet i 2 mL mikrocentrifugrör frysa och lagra rören vid-20 ° C.
- Pre värma den minskade serum medium, cellodlingsmedium och destillerat vatten till 37 ° C i vattenbadet.
- Förbereda transfection mixen i en 1,5 mL mikrocentrifug rör. Arbeta under den LAF att säkerställa sterila arbetsvillkor.
- Blanda 7,5 µL av 2 M kalciumklorid med 4 µg varje endotoxinfria DNA (Synaptophysin-mOrange och mGFP/GFP-Rogdi). Tillsätt vatten för att nå en total volym på 60 mL i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 60 mL transfection buffert till mixen. För att få bästa resultat, lägga till transfection bufferten droppvis under omskakning DNA-blandningen försiktigt på virveln.
- Odla i rumstemperatur (RT) i 20 minuter. Undvika skakar inkubation röret under inkubationstiden genom att placera röret bredvid LAF.
- Under laminärt flöde huven, ta bort cellodlingsmedium (”betingad medium”) från brunnarna med en 1000 mL Pipettera och förvara den i en separat behållare i inkubatorn.
- Tillsätt 500 mL minskade serum medium till varje brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 tills 20 minuters inkubationstiden (steg 2.3.3) är över.
- Tillsätt 30 mL transfection mix till varje brunn av pipettering flera droppar. Kassera återstoden på botten av röret.
- Efter alla brunnarna har levererats med transfection mix, skaka försiktigt 24-väl plattan för att säkerställa fördelningen av transfection mixen på medellång.
- Inkubera brunnarna i 60 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ta bort och kassera transfection mixen och tvätta tre gånger med cellodlingsmedium. Tillsätt 1 mL cellodlingsmedium till varje brunn och inkubera dem i 30 sekunder vid RT. bort 750 mL medium och tillsätt samma mängd färska medium. Upprepa detta tre gånger.
Obs: Steget tvätt är kritisk. Hålla varje brunn har ingen medium minst (dvs., ta bort och ersätta väl-av-väl) och tillsätt tvätt medlet försiktigt. - Ta bort och kassera cellodlingsmedium och tillsätt 450 mL luftkonditionerade medium well-av-brunnen.
- Låt mogna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 till DIV 10 nervceller.
3. stimulering och Syt1 upptag
Obs: Följande protokoll gäller upptaget 3 brunnar. Justera beloppen för depolarisation av valfritt andra antal brunnar.
- Förbereda 50 mL 10 x depolarisation buffert (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukos, 200 mM HEPES, pH 7,4) i en Erlenmeyerkolv.
Obs: Depolarisation buffert kan förvaras vid 4 ° C i flera veckor. Om en icke-depolariserande lösning används också, förbereda en 10 x Tyrode's lösning bestående av 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukos, 200 mM HEPES pH 7,4 för att jämföra stimulering-inducerad återvinning med spontan återvinning. Efter utspädning till 1 x, lägger du till 1 µM tetrodotoxin innan användning för att blockera aktionspotential generation.- Lös 1,87 g NaCl, 2,61 g kaliumklorid, 0,1 g MgCl2-6 H20, 0,15 g CaCl2-2 H2O och 3,0 g glukos-1 H2O och 2,38 g HEPES i 50 mL destillerat vatten i en Erlenmeyerkolv. Justera pH-värdet med NaOH och sterila-filter lösningen. Späd den buffert 1:10 i destillerat vatten för att uppnå en 1 x koncentration.
- Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4) för fixering efter stimulering.
- För 500 mL 4% PFA i 1 x PBS, Lös 20 g PARAFORMALDEHYD i 450 mL destillerat H2O.
Obs: Värme lösningen kan påskynda upplösning, men Värm inte lösningen över 70 ° C, som PFA kan upplösas.
Varning: PFA är giftiga, potentiellt cancerframkallande och teratogent. Använd skyddshandskar när du arbetar med PFA, arbeta under spiskåpa och undvika förtäring. - Låt lösningen svalna till RT och tillsätt 50 mL 10 x PBS stamlösning. Justera pH till 7,4 med NaOH/HCl med hjälp av en pH-mätare.
- För 500 mL 4% PFA i 1 x PBS, Lös 20 g PARAFORMALDEHYD i 450 mL destillerat H2O.
- Pre varma 600 mL 1 x depolarisation buffert och 10 mL av cellodlingsmedium till 37 ° C i vattenbadet.
- Tillsätt 1 mL av musen anti-Syt1 antikroppar (klon 604,2) till 1 x depolarisation buffert och vortex i 10 sekunder.
- Avlägsna och kassera cellodlingsmedium från cellerna. Tillsätt 200 mL depolarisation-antikropp mixen att varje väl och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C och 5% CO2 i inkubatorn.
- Ta bort och kassera depolarisation-antikroppen blanda och tvätta tre gånger med cellodlingsmedium. Tillsätt 1 mL cellodlingsmedium till varje brunn och inkubera i 30 sekunder vid RT. bort 750 mL medium och tillsätt samma mängd färska medium. Upprepa tre gånger.
- Ta bort och kassera cellodlingsmedium och tillsätt 300 mL 4% PFA i 1 x PBS. Inkubera i 20 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger för 5 minuter vardera med 1 x PBS.
Obs: Protokollet kan pausas här.
4. immuncytokemi
- Förbereda 50 mL blockerande buffert.
Obs: Blockerande buffert kan förvaras vid-20 ° C under flera månader.- Lös upp 2,5 g sackaros och 1 g av bovint serumalbumin (BSA) i 5 mL 10 x PBS stamlösning. Tillsätt 1,5 mL 10% lager rengöringslösning. Rör om lösningen tills alla komponenter har ordentligt upplöst och Tillsätt destillerat H2O tills de når en slutlig volym 50 ml. Alikvot lösningen och frysa alikvoter för lagring.
- Späd den sekundära fluorophore-kopplade antikropp (riktad mot de primära Syt1-antikropp-arterna) i 200 mL blockerande buffert i varje brunn vid en spädningsgrad av 1: 1000.
- Avlägsna och kassera 1 x PBS från varje brunn innehållande ett täckglas.
- Tillsätt 200 mL blockerande buffert-antikropp mix till varje brunn och inkubera i 60 minuter i RT.
Varning: Eftersom de sekundära antikropparna är ljuskänsliga, alla steg framåt måste utföras i mörkret. - Efter inkubation, tvätta cellerna tre gånger i 5 minuter med 1 mL 1 x PBS.
- Bädda in coverslips på objektglas med inbäddning medium.
- Lägga till en 7 mL droppe inbäddning medium på objektglas. Ta bort täckglaset från 24-väl plattan genom att lyfta det med en spruta och greppa den med pincett.
Försiktighet: Celler på ytan av täckglaset skadas lätt, så tången måste hanteras med försiktighet. - Doppa täckglaset i destillerat vatten för att ta bort PBS och torka den noga genom att röra vid ena kanten en mjuk vävnad.
- Vänd täckglaset på inbäddning medium droplet-programmet, så att ytan bära cellerna vänd på objektglas, därmed inbäddning cellerna till inbäddning medium.
- Lägga till en 7 mL droppe inbäddning medium på objektglas. Ta bort täckglaset från 24-väl plattan genom att lyfta det med en spruta och greppa den med pincett.
- Lämna bilderna ska torka under huven för 1-2 h (täcka dem för att undvika ljus exponering) och lagra dem i ett Mikroskop bild rutan vid 4 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här.
5. Mikroskopisk analys
- Efter coverslips torr, placera dem under mikroskopet med mål och kamera.
- Justera exponeringstiden för varje kanal så att några pixlar är överexponerade för att säkerställa maximal utdelning av grå värden.
Obs: Även exponeringstiden kan variera mellan kanalerna, det bör vara konstant för en kanal att säkerställa jämförbarheten mellan coverslips. - Förvärva Multi-Channel bilder för 10 regioner av intresse (ROIs) per täckglas. Kontrollera att ROI innehåller axonal processer från en transfekterade neuron genom att kontrollera GFP-fluorescens, vilket bör punktuell.
6. statistisk analys
- Exportera bilderna som TIF-filer. Läsa in bilder i OpenView18 genom att klicka på filen | Load bildfil.
- Välj Synaptophysin-mOrange bilden som kanal 1, Rogdi-GFP/mGFP bilden som kanal 2 och Alexa647 fluorescens bilden som kanal 3.
- Tröskelvärdet för ROIs.
- Klicka på analys | Place area över puncta. Välj tröskel och Delta intensitet värden så att vid visuell inspektion, diffusa fluorescens är utesluten, lämnar bara punktat signaler i bilden av kanal 1 (som företräder Synaptophysin-mOrange fluorescens). Hålla samma tröskelvärde för alla bilder.
- Överföra dessa ROIs till motsvarande kanal 2 (GFP-Rogdi/mGFP fluorescens) och 3 (Syt1-fluorescens) av varje täckglas område genom att klicka på Kör nu.
Obs: ROIs bör endast övervägas om cellen är dubbel-transfekterade. Den här metoden ska mOrange - och GFP-fluorescens synas tydligt. - Spara data i analys logg-editor genom att klicka på loggdata.
- Öppna redigeraren analys logg under fliken Windows och Kopiera värdena för varje kanal. Klistra in värden för de separata kanalerna i ett kalkylblad.
- Bestämma den genomsnittliga fluorescensintensiteten Syt1-kanal på ROIs i båda transfection villkor (GFP-Rogdi och mGFP).
- Tillämpa lämpliga statistiska tester såsom Student's t-test för att fastställa betydande skillnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett förväntat resultat av denna strategi är att lokalisera cirka 50 dubbel-transfekterade nervceller per täckglas på en densitet av 50 000 nervceller per brunn. Axonet av varje neuron förväntas visa flera hotspot-områden fluorescently-taggade Synaptophysin ackumulation, som anger kluster ofSVs. På funktionella presynaptiska platser colocalizes rekombinant Synaptophysin signalen med punktuell Syt1 fluorescens. Använda dubbel transfection, är antingen GFP-Rogdi som protein av intresse (figur 1) eller mGFP som kontroll samtidig uttryckt med rekombinant Synaptophysin.
I detta experiment analyserar vi SV återvinning på presynaptiska platser i nervceller som antingen uttrycker GFP-Rogdi eller mGFP. Om proteinet kontroll, mGFP, fördelas homogent i hela hela cellen, men dess inflytande på synaptic platser fortfarande behöver studeras, då det är nödvändigt att tillsammans transfect ett andra protein som presynaptically är berikad, taggade fluorescently Synaptophysin.
Som tidigare beskrivits, genomgår cellerna depolarisation-inducerad sändare release. Som ett resultat, ta funktionella synapser upp Syt1 antikroppar tillsätts mediet. Efter immunolabeling Syt1 antikropp med en fluorescently märkt sekundär antikropp kvantifieras omfattningen av Syt1 upptag slutligen med hjälp av immunosignal (figur 2).
Figur 1. Dubbel-transfekterade cell. Synfältet visar en dubbel-transfekterade celler uttrycker GFP-Rogdi A och Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin är en riklig synaptiskt vesikelprotein protein. Dess rekombinant variant kan användas för märkning synaptic knappar. Lokalisering mönstret av GFP-Rogdi liknar Synaptophysin-mCherry (C). Skala barer = 10 μm. Rutorna visar 2,5 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. GFP-Rogdi i funktionella synapser. Levande Syt1 upptag utfördes i dubbel-transfekterade celler som uttrycker antingen mGFP (grön) och Synaptophysin-mOrange (röd; A-D) eller GFP-Rogdi (grön) och Synaptophysin-mOrange (röd; E-H). Syt1 antikropp upptag utfördes med hjälp av en mus monoklonal antikropp riktad mot luminala domänen av Syt1. Efter PFA fixering, var celler fläckad med kanin-anti-GFP-antikropp. Sekundära antikroppar (anti-kanin Alexa 488 och antimus Alexa 647) lades till upptäcka GFP eller GFP-Rogdi och Syt1, respektive. Autofluorescens av Synaptophysin-mOrange användes för att upptäcka presynaptiska terminaler (B och F). Punktuell Syt1 immunofluorescens anger platser av vesikler återvinning (blå; C och G). Notera att majoriteten av Syt1-märkta synapser är lokaliserade till icke-transfekterade nervceller. GFP-Rogdi var riktade till aktiva synapser och ändra inte synaptiskt vesikelprotein återvinning (I). 3 oberoende kultur experimenten utfördes (N = 3). Minst 3 coverslips från varje kultur (totalt 10) användes för analys. Slutligen, 3 områden per täckglas analyserades (n = 30). Students t-test visade ingen signifikant skillnad. Skala barer = 10 μm. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (S.E.M.). ”N.s.” indikerar ingen signifikans. Denna siffra har ändrats från Riemann o.a. 9 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns tre analyser rutinmässigt för att studera synaptiskt vesikelprotein (SV) återvinning. Två första inkluderar användning av en) fluorescerande styryl färgämnen såsom FM1-43 (vilket införliva membran, tas i organeller under endocytos och frigörs efter exocytos). och b) fluorescently taggade rekombinanta SV proteiner (som vid överuttryck, införliva de proteinhaltiga återvinning maskinen). Om de bifogade fluorophores ändrar deras fluorescens beroende på pH, kan de användas för att övervaka ändringar mellan sura inredningen i en SV och pH-värdet i det extracellulära mediet. De rekombinanta proteiner med en pH-känsliga variant av GFP etiketten kallas Phluorins. De två analyser som diskuteras har båda varit med tidigare19,20, och för- och nackdelar av varje har också granskade21.
Här beskriver vi en tredje, väletablerad metod4,5,6,7,9,14. För att testa SV återvinning, utnyttjar vi det faktum att domänen luminala vesikler-associerade protein Synaptotagmin-1 (Syt1) blir utsatta för cellens yta vid exocytos. Först, vi lägger till en antikropp riktad mot luminala domänen till odlingsmediet, som sedan tas av vesikler under SV återvinning. Denna antikropp upptag är visualiseras och kvantifieras genom immunofluorescens. Alternativt, en direkt märkt Syt1-antikropp kan användas. Etiketten kan vara pH-oberoende, rapportering lokalisering av Syt1-antikroppen både inne och på den yttre ytan av SVs eller pH-beroende, rapportering lokalisering utifrån förändringar av fluorescens. Vi beskriver också kombinationen av denna SV återvinning analys med dubbel transfection av odlade nervceller att testa huruvida ett protein av intresse, GFP-Rogdi, mål funktionella synapser och påverkar SV återvinning. GFP-Rogdi är specifika för detta tillvägagångssätt; dock kan samma frågor behandlas för något protein av intresse.
Denna analys introducerades 1992 för att övervaka spontana återvinning av SVs4 och utvecklades vidare av samma grupp att övervaka evoked SV återvinning12. Deras experiment konstaterat att Syt1 upptag är känsliga för clostridier nervgifter, som blockerar SV exocytos12. De visade också att stimulering av kulturer av depolarisation vid 37 ° C ökar internalisering av Syt1 antikroppar jämfört med 1) kulturer som hålls på is, vilket förhindrar de flesta endocytos, och att 2) kulturerna inkuberas vid 37 ° C utan stimulering, som möjliggör spontana återvinning men framkalla inte återvinning12,22. Analysen kan lätt jämföra SV återvinning mellan två villkor, som med och utan en molekyl av intresse. I synnerhet fokuserar detta protokoll på att jämföra Syt1 antikropp upptag i närvaro kontra frånvaron av ett visst överuttryckt protein. Protokollet kan utökas om de relativa bidragen av surface-bindande, spontana återvinning och evoked återvinning behöver bedömas. Till exempel förhindrar ruvning nervceller på is utan stimulering endocytos, avslöjar någon yta bindning av Syt1 antikropp. Ruvning nervceller vid 37 ° C i basal lösning med Tetrodotoxin förhindrar potentiell handling förökning, avslöjar eventuella spontana återvinning. Således, ruvande nervceller vid 37 ° C under stimulerande förhållanden kan avslöja omfattningen av evoked SV återvinning.
Levande celler är känsliga för perfekt fysiologiska förhållanden; underhåll, transfection och depolarisation buffertar bör därför alltid testas för fysiologiska parametrar inklusive pH och temperatur. Medan depolarisation buffertar kan skickas genom sterila filter när pH har justerats, är transfection buffertar känsliga för steril filtrering. Därför vi justera dess pH, hålla den frysta till användning och spinna i en bordsskiva centrifug till pellet eventuella bakterier. För transfection är det viktigt att blanda bufferten tillräckligt för att säkerställa kopplingen av Plasmiden med kalciumfosfatkristaller. Kalciumfosfat transfection fungerar bäst på dagen i vitro (DIV) 2-4. Vi använder märkta Synaptophysin, ett SV transmembrane protein, som en markör för att identifiera presynaptiska terminaler i transfekterade nervceller. Tagged versioner av andra SV proteiner såsom SV2, Synapsin, och VAMP/Synaptobrevin eller aktiv zon molekyler såsom fagott, RIM, Munc13-1 och gjutna kan också användas.
Både mCherry och mOrange avger röd fluorescens. MCherry är ljusare än mOrange, har men större utsläpp på långa våglängder än mOrange. Därför för trippel fluorescens imaging med GFP, ett rött färgämne och ett färgämne avger i intervallet 700 nm, är mOrange ett bättre alternativ än mCherry. För dubbel fluorescens med GFP och ett rött färgämne, kan mCherry vara gynnsamt eftersom det är den ljusa färgen. För att garantera glesa transfection, bör transfection mixen inte inkuberas under längre än 60 minuter. Det är också viktigt att inkubation i en depolarizing buffert är det rätt tid att säkerställa exocytos av alla blåsor. Långvarig exponering för depolarizing bufferten måste dock undvikas. Under bild förvärv är det också viktigt att tillämpa samma exponeringstider och ljus intensitet att säkerställa kvantifierbara jämförelse mellan olika uppsättningar av experiment.
Slutligen under bildanalys innehåller våra protokoll flera överväganden. För ett intresseområde som visar rekombinant Synaptophysin puncta, har lägre intensitet tröskeln angetts så att diffusa fluorescens är utesluten. Därefter testas denna tröskel på andra områden och coverslips att iaktta liknande inkludering av punktuell signaler och exkludering av diffusa fluorescens. När en lämplig tröskel har identifierats visas tillämpas den på alla bilder, producera punktuell regioner av intresse (ROIs) i kanalen rekombinant Synaptophysin (märkta med mCherry eller mOrange). Slutligen bestäms Syt1 intensitet för de ROIs9.
Vår strategi är optimerad för glesa transfection. Vi analyserar presynaptiska funktion i en komplex miljö där det finns SV återvinning i axoner av transfekterade nervceller omgiven av untransfected nervceller. I denna uppsättning tillåter dubbel-transfection oss att manipulera nervcellernas funktion och leta reda på de transfekterade nervcellerna presynaptiska terminaler. Transfekterade presynaptiska neuroner som kontaktar untransfected postsynaptiska neuroner är en viktig faktor vid bedömningen av en presynaptiska neuron effekter på SV återvinning. Inställningen kan också enkelt anpassas för att testa huruvida en postsynaptiska manipulation orsakar presynaptiska förändringar. I det här fallet glesa transfection av nervceller med ett protein som är riktad mot postsynaptiska platser kommer att lokalisera de postsynaptiska platserna av de transfekterade nervcellerna och Syt1 upptag kan bestämmas på synaptic knappar av untransfected nervceller.
När glesa transfection inte är nödvändigt, kan olika transfection protokoll tillämpas. Till exempel innebär transfection med Lipofectamine på DIV 7 - 8 resultat i högre transfection priser, men det också starkare uttryck i varje transfekterade cell9. Dessutom kan viral transduktion resultera i uttrycket i nästan 100% av den odlade nervceller14,23,24. I experiment som syftar till att övervaka SV återvinning, kan transfection utföras för ett enda protein eller utelämnas helt. Till exempel när övergripande synaptic återvinning är jämförelse mellan nervceller från vildtyp och genetiskt modifierade är möss, märkning enskilda nervceller av transfection inte nödvändigt. Detta kan dessutom immunolabeling av endogena proteiner. Om transfection misslyckas, är det viktigt att testa transfection bufferten med en validerad plasmid eller använda en buffert med olika pH (se beredning av transfection buffert). Med hjälp av endotoxin gratis DNA preparat verkar också vara avgörande. Immunfärgning internaliserat Syt1 antikroppar fungerar i både PFA-fasta och metanol-fasta prover. Det bör också noteras att GFP och RFP autofluorescens förloras efter metanol fixering. Om GFP eller RFP behöver vara lokaliserade till metanol-fasta celler, måste dessa proteiner vara immunolabeled. Om Syt1 upptag misslyckas, bör depolarisation tid och K+ koncentration i depolarisation bufferten ändras i enlighet därmed. Många protokoll varianter har publicerats, med depolarisation gånger alltifrån 90 s25 till 60 min12och K+ koncentrationer av 45 mM, 50 mM, 70 mM och 110 mM6,25,26 ,27. När återkommande aktivitet måste förhindras, kan glutamat-receptorblockerare också läggas under depolarisation. Slutligen, medan hög K+ depolarisation tros vara den starkaste stimulansen, handlingspänningar kan inducera SV återvinning genom mer fysiologiska stimuli22,28. Skillnader i Syt1 antikropp upptag effekt kan uppstå i råtta och mus kulturer. I vår metod, monoklonal mus anti-Syt1 klonen 604,2 (RRID:AB_993036) producerar starkare färgning i råtta kulturer än i mus kulturer, medan den polyklonala kanin-anti-Syt1-antikroppen (RRID:AB_11042457) ger starkare färgning i mus kulturer, men flera noter av försiktighet diskuteras nedan.
Flera varningar angående användning av anti-Synaptotagmin antikroppar för upptag i SVs bör övervägas. Första, N-glycosylation av asparagin 24 av Syt1 främjar endocytotic upptaget av protein29,30. Asparagin 24 är en del av luminala domänen för Syt1. Mus och kanin antikroppar som vi använder är riktade mot aminosyror 1-12 och 1-8, respektive i Syt1. Medan deras epitoper inte överlappar med webbplatsen N-glycosylation kan inte sterisk hinder eller, omvänt, en induktion av upptag av antikropp bindande uteslutas. Mutation av N-glycosylation platsen i Syt1 ändrar inte kineticsen av endocytos och inriktningen av Syt1 till SVs. Det ökar andelen Syt1 kvar på yttre plasmamembranet ytan när endocytos framkallas av svaga stimuli. När starka stimuli, såsom hög K+ depolarisation, tillämpas, observeras ingen minskning av Syt1-upptag30. Övergripande, om antikropparna hindrat N-glycosylation webbplatsen på något sätt de kan orsaka en förändring i SV endocytos jämfört med antikropp-fria förhållanden, men denna ändring bör vara liknande för experimentet (i vårt fall överuttryck av GFP-Rogdi) och kontrollen (i vårt fall ett uttryck för god Jordbrukarsed). Dessutom kan polyklonala antikroppar vara mer benägna att inducera sterisk problem och crosslinking än monoklonala antikroppar, eftersom en större kopia antal antikroppar binder till epitop. Vi är inte medvetna om systematiska studier som jämförde de tillgängliga antikropparna med varandra; vissa studier har dock behandlat giltigheten av vissa antikroppar. Till exempel när SV återvinning kinetik var utforskad med monoklonal mus anti-Syt1 antikropp klon 604,2 och Synaptophluorin-fluorescens förändringar i en direkt jämförelse, liknande resultat erhölls, validera användningen av denna antikropp28. Lastning SVs med polyklonala kanin Syt1 antikroppar och inspelning synaptisk transmission elektrofysiologiskt avslöjade att laddade synapserna hade minskat synaptisk transmission på ett sätt som påminner om förlust-av-funktion mutanter av Syt1. Därför påverkar dessa polyklonala antikroppar synaptisk transmission. Faktiska upptaget avslöjade både spontana och evoked återvinning, vilket tyder på att en polyklonal antikropp är lämpligt att övervaka en omgång av SV återvinning, men försiktighet bör iakttas vid tolkning av resultaten efter upptag av dessa antikroppar31.
Tre analyser är rutinmässigt för att studera SV återvinning, som inkluderar membran märkning med styryl färgämnen överuttryck av Phluorins, och Syt1-antikropp upptaget utförs här. Alla tre analyser kan användas för att avgöra endocytotic och exocytotic ben SV återvinning. Medan alla tre analyser har kraftfulla fördelar, har de också en princip förbehållet. FM färgämnen etikett hela cellens yta och tas i cellen med alla återvinning membran. Phluorins måste införas av överuttryck. Syt1-antikroppar etikett det kroppsegna proteinet, men vissa antikroppar kan påverka dess funktion under vissa förutsättningar. Varje varning kan dock vara lämpligt adresserade21.
Sammantaget har Syt1 antikropp upptag analysen serveras olika ändamål. Först användes till selektivt etikett SVs som genomgår spontan eller evoked återvinning, respektive28,31,32,33. Andra, det användes för att fastställa effekten av ett läkemedel eller protein på omfattningen av SV återvinning; till exempel för att visa att BDNF ökar både spontana och evoked SV återvinning6. För det tredje, användes för att bestämma antalet synapser med återvinning SVs som en procentandel av det totala antalet morfologiskt definierade synapser34,35. Detta visade att överuttryck den postsynaptiska cell friktion molekylen Neuroligin-1 ökar andelen synapser med återvinning SVs25 och att minska den uttrycker av glutamatreceptorer AMPA-typen minskar andelen synapser med återvinning SVs, öka andelen presynaptically tyst synapser36. Analysen används dessutom var att analysera rörligheten för märkta SVs27 och bestämma localizationen av Syt1 använder nanoskopi13,22,33. Slutligen, denna metod används fortfarande att testa huruvida vissa proteiner lokalisera till funktionella synapser9. Syt1 antikroppen kan också användas för långsiktiga studier, där antikroppen förblir i nervceller i dagar efter upptag37. Detta kan kombineras med en andra omgång upptag med hjälp av en separat märkta Syt1 antikropp eller en antikropp riktad mot luminala domänen till en annan SV-protein. Detta tillåter testning av som SVs återvunnet initialt och som återvinner i slutet av ett experiment. Det skulle vara intressant att anpassa denna analys till mer intakt modellsystem, såsom akut skivor och organotypic skiva kulturer. I princip upptag analysen tillåter jämförelse av vävnad från vildtyp och genetiskt modifierad djur eller kan kombineras med viral leverans eller biolistics, dvs., en ”gen gun”, att manipulera proteinuttryck i dessa modellsystem. I sådana system, kan påverkan av vissa störningar på presynaptiska maskiner, övervakas av upptag assay och nätverk dynamics studeras samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Irmgard Weiss för teknisk experthjälp. Detta arbete stöds av DFGEN via klustret kompetenscentrum för mikroskopi på nanometer utbud och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB, B1-7, att T.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
