Summary
Vi beskriver en optisk assay for synaptic vesikel (SV) genbrug i kulturperler neuroner. Kombinere denne protokol med dobbelt Transfektion udtrykke en præsynaptiske markør og protein af interesse tillader os at lokalisere præsynaptiske websteder, deres synaptic vesikel genanvendelse kapacitet, og bestemme rollen af protein af interesse.
Abstract
På aktive præsynaptiske nerve terminaler gennemgå synaptiske vesikler cyklusser af exo- og endocytose. Under genanvendelse, bliver de luminale domæner af SV transmembrane proteiner eksponeret på cellens overflade. En af disse proteiner er Synaptotagmin-1 (Syt1). Et antistof rettet mod den luminale domæne af Syt1, når de er tilføjet til næringssubstratet, er taget i løbet af exo-endocytotic cyklus. Denne optagelse er proportional med mængden af SV genbrug og kan kvantificeres ved immunfluorescens. Her, kombinerer vi Syt1 antistof optagelse med dobbelt Transfektion af kulturperler hippocampus neuroner. Dette giver os (1) lokalisere præsynaptiske websteder baseret på udtryk for rekombinante præsynaptiske markør Synaptophysin, (2) bestemme deres funktionalitet ved hjælp af Syt1 udbredelse og (3) karakteriserer målretning og virkningerne af en protein af interesse, normal god landbrugspraksis-Rogdi.
Introduction
Studerer synaptic vesikel genanvendelse er vigtigt ved fastsættelsen, hvordan præsynaptiske egenskaber ændre, enten under synaptisk plasticitet eller svar til undertrykkelse af netbårne synaptiske funktion. At studere Synaptotagmin-1 (Syt1) giver antistof optagelse én metode til måling af mængden af SV genanvendelse. Syt1 er en SV-forbundet protein, der fungerer som en Ca2 + -sensor og er nødvendige for at exocytotic udgivelsen af neurotransmitter1,2. Det er en transmembrane protein med en C-terminale cytoplasmatisk domæne uden SV og en N-terminale luminale domæne inde SV3. Under exocytose, bliver den luminale domæne af Syt1 udsat for den eksterne medium. Til denne eksterne medium tilføje vi antistoffer rettet mod den cytoplasmatisk domæne, som bliver internaliseret under endocytose. Disse antistoffer kan være enten pre konjugeret med fluorophores eller immunostained med sekundær antistoffer4,5,6,7. Fluorescens-intensiteten af den resulterende immunosignal er proportional med mængden af SV genanvendelse. Denne fremgangsmåde kan bruges til at bestemme både konstituerende og depolarisering-induceret SV genanvendelse6,8.
Syt1 optagelse assays kan udføres efter virus-medieret genoverførsel til stort set alle celler i skålen eller sparsomme Transfektion af et lille antal celler. Vores metode kombinerer analysen med sparsom dobbelt Transfektion af primære hippocampus neuroner ved hjælp af calciumphosphat9. Vi bruger en rekombinant markør protein kendt at akkumulere på presynapses, fluorescently mærket Synaptophysin, til at finde præsynaptiske terminaler og overexpress vores protein af interesse, Rogdi. Dette giver os mulighed for at teste eller ej Rogdi mål funktionelle synapser og påvirker SV genanvendelse. Det gen, der koder Rogdi blev oprindeligt identificeret i en skærm for Drosophila mutanter karakteriseret ved nedsat hukommelse10. Hos mennesker forårsage mutationer i Rogdi genet en sjælden og ødelæggende sygdom kaldet Kohlschütter-Tönz syndrom. Patienter lider af dental emalje misdannelser, pharmacoresistant epilepsi og psykomotoriske forsinkelser; dog forblev subcellulært lokaliseringen af produktets gen undvigende11. Således givet Syt1 optagelse assay afgørende bevis for lokalisering af normal god landbrugspraksis-mærket Rogdi på funktionelle synapser9.
Denne optagelse teknik har flere fordele. Først kan SV genanvendelse observeres både i realtid ved at udføre live imaging7,12, og efter fiksering6,9 ved at måle fluorescens-intensiteten af Syt1 fluorescens etiket. Derudover er flere Syt1 antistof varianter blevet udviklet. Der er ukodede varianter, der kan være mærket med en sekundær antistof efter en standard immunfarvning protokol efter fiksering og pre konjugeret varianter med et fluorescens etiket. Endelig er-antistof-baserede fluorescens fordelagtig på grund af det store udvalg af kommercielt tilgængelige sekundære eller konjugeret farvestoffer, der kan bruges.
Når fastsættelse og immunfarvning neuroner, det er også muligt at pletten for ekstra proteiner og udføre colocalization analyse. Dette kan hjælpe med at bestemme, hvor de er placeret i forhold til genanvendelse SVs. Intensiteten af fluorescens etiket er et direkte mål for mængden af SV genanvendelse. Derudover etiket antistoffer selektivt Syt1-holdige strukturer, hvilket resulterer i høj specificitet og lidt baggrund fluorescens4. Forskellige stimulation protokoller kan også bruges som depolarisering buffere eller elektrisk stimulation protokoller9,12,13,14. Basal SV genanvendelse kan dog måles uden stimulere neuronal kulturer15.
Vores metode omhandler specifikt Syt1 antistof optagelse i dobbelt-transfekteret neuroner med sekundær antistof immunolabeling efter fiksering. Men, vi henviser til alle rutinemæssigt anvendes varianter af analysen i vores diskussion at give seerne mulighed for at tilpasse protokollen til specifikke behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ingen undersøgelser med levende dyr blev gennemført. Eksperimenter, der involverer aflivede dyr for at opnå celle kulturer blev godkendt af de lokale dyrebeskyttelse myndigheder (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) i henhold til godkendelsen nummer T10/30. Forsøgene blev udført med de godkendte protokoller.
1. primære hippocampus cellekultur
- Forberede de dissocierede cellekultur af rotte hippocampus embryonale dag 1916,17. Plade celler på 12 mm coverslips belagt med polyethyleneimine (PEI) i 24-godt retter med en tæthed på 50.000-60.000 celler/brønd. Kontrollere tætheden ved hjælp af en celle tælle kammer og fase kontrast optik.
- Kultur neuroner i 3 dage (dag i vitro (DIV) 3) i en 24-godt plade i varmeskab ved 37 ° C med 5% CO2.
- Vurdere coverslips for indikatorer for celle sundhed ved hjælp af overførte lysmikroskopi (fx fase kontrast optik på 10-20 X forstørrelse). Kontrollere, om de følgende indikatorer for god sundhed: en klar fase kontrast halo, neurites uden beaded strukturer, og ingen soma klynger eller neurite bundling.
2. Transfektion
Bemærk: Følgende protokol refererer til en dobbelt-Transfektion for 3 brønde. Dog fungerer protokollens bedst, når beløb tilstrækkeligt til 4 brønde er forberedt.
- Forberede 500 mL af Transfektion buffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 15 mM glukose, 42 mM HEPES) i en Erlenmeyerkolbe.
- Opløse 8,0 g NaCl, 0,37 g af KCl, 0,095 g Na2HPO4, 1,35 g glukose og 5.0 g af HEPES i 400 mL destilleret vand i en Erlenmeyerkolbe.
- PH indstilles til 6,95 med 1 M NaOH ved hjælp af et pH-meter.
- Justere lydstyrken med destilleret vand til 500 mL og kontrollere pH ved hjælp af et pH-meter.
- Gøre 20-30 mL alikvoter Transfektion buffer med følgende pH værdier af pipettering 1 M NaOH til Transfektion buffer: 6.96, 6,97, 6.98, 6,99, 7,00, 7,01, 7.02, 7,03, 7,04, 7,05, 7.06, 7,07, 7,08, 7,09, 7.11.
Bemærk: Transfektion buffer pH-værdi er afgørende for Transfektion effekten. - For at teste hvilken Transfektion buffer fører til det højeste antal transfekteret celler, teste hver enkelt pH værdi fra 6.96 7.11. Brug metoden Transfektion beskrevet i 2.2-2.11 og en valideret plasmid udtryk for normal god landbrugspraksis. Bestem antallet af transfekteret celler pr. coverslip for hver Transfektion buffer pH værdi til at vurdere hvilke buffer virker bedst.
- Alikvot buffer med den højeste Transfektion effektivitet i 2 mL microcentrifuge rør fryse og gemme rør ved-20 ° C.
- Pre varm nedsat serum medium, cellekulturmedium og destilleret vand til 37 ° C i vandbad.
- Forberede Transfektion mix i 1,5 mL microcentrifuge rør. Arbejde under laminar flow hood at sikre sterile arbejdsvilkår.
- Mix 7.5 µL 2 M calciumchlorid med 4 µg hver endotoxin-gratis DNA (Synaptophysin-mOrange og mGFP/normal god landbrugspraksis-Rogdi). Tilsæt vand for at nå et samlet volumen på 60 mL i 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Tilføje 60 mL af Transfektion buffer til mix. For at opnå de bedste resultater, tilføje Transfektion buffer dråbevis under omrystning DNA-blandingen forsigtigt på vortex.
- Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 20 minutter. Undgå ryster inkubation røret under inkubation tid ved at placere røret ud for laminar flow hætte.
- Under kølerhjelmen laminar flow fjerne cellekulturmedium ("konditioneret medium") fra brøndene ved hjælp af en 1000 mL pipette og gemme det i en separat beholder i rugemaskinen.
- Tilsæt 500 mL af reducerede serum medium til hver brønd. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 indtil 20 minutters inkubationsperiode (trin 2.3.3) er overstået.
- Der tilsættes 30 mL af Transfektion mix til hver brønd af pipettering flere dråber. Kassér resten i bunden af røret.
- Efter alle brøndene der er leveret med Transfektion mix, Ryst forsigtigt den 24-godt plade for at sikre distribution af Transfektion mix i medium.
- Inkubér brøndene i 60 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern og kassér Transfektion mix og vaske det tre gange med cellekulturmedium. Tilsæt 1 mL i cellekulturmedium til hver brønd og Inkuber dem i 30 sekunder på RT. fjerne 750 mL af medium og tilføje den samme mængde frisk substrat. Gentage det tre gange.
Bemærk: Vask trin er kritisk. Holde det tidspunkt, hvor hver godt har ingen mellemlang minimum (dvs., fjerne og udskifte godt af godt) og tilføje mellemlang og vask forsigtigt. - Fjern og kassér cellekulturmedium og tilføje 450 mL af konditioneret medium godt-af-brønden.
- Lad de modne i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 til DIV 10 neuroner.
3. stimulering og Syt1 optagelse
Bemærk: Følgende protokol gælder optagelsen 3 brønde. For depolarisering af nogen andre antal brønde, justere beløbene i overensstemmelse hermed.
- Forberede 50 mL 10 x depolarisering buffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukose, 200 mM HEPES, pH 7,4) i en Erlenmeyerkolbe.
Bemærk: Depolarisering buffer kan opbevares ved 4 ° C i flere uger. Hvis en ikke-depolariserende løsning bruges også, forberede en 10 x Tyrode's løsning består 1290 mm NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukose, 200 mM HEPES pH 7,4 for at sammenligne stimulation-induceret genanvendelse med spontane genbrug. Efter fortynding til 1 x, tilføje 1 µM af Tetrodotoxin før brugen for at blokere aktionspotentialet generation.- 1,87 g NaCl, 2,61 g af KCl, 0,1 g af MgCl2-6 H20, 0,15 g CaCl2-2 H2O og 3,0 g glucose-1 H2O og 2,38 g af HEPES i 50 mL destilleret vand i en Erlenmeyerkolbe opløses. PH-værdien med NaOH og steril-filter løsningen. Fortynd buffer 1:10 med destilleret vand til at opnå en 1 x koncentration.
- Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4) til fiksation efter stimulation.
- For 500 mL 4% 20 g PARAFORMALDEHYD i 450 mL destilleret H2O. opløses i PFA i 1 x PBS,
Bemærk: Varme løsningen kan fremskynde opløsning, men varme ikke løsning over 70 ° C, som PFA kan smuldre.
Forsigtig: PFA er giftige, potentielt kræftfremkaldende og fosterskadende. Brug handsker når du arbejder med PFA, arbejde under stinkskab og undgå indtagelse. - Lad løsning køle til RT og tilsættes 50 mL 10 x PBS stamopløsning. PH indstilles til 7.4 med NaOH/HCl ved hjælp af et pH-meter.
- For 500 mL 4% 20 g PARAFORMALDEHYD i 450 mL destilleret H2O. opløses i PFA i 1 x PBS,
- Pre varme 600 mL 1 x depolarisering buffer og 10 mL i cellekulturmedium til 37 ° C i vandbad.
- Der tilsættes 1 mL af musen anti-Syt1 antistof (klon 604.2) til 1 x depolarisering buffer og vortex i 10 sekunder.
- Fjern og kassér cellekulturmedium fra cellerne. Der tilsættes 200 mL depolarisering-antistof mix hver godt og Inkuber i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 i rugemaskinen.
- Fjern og kassér depolarisering-antistof mix og vaske det tre gange med cellekulturmedium. Tilsæt 1 mL i cellekulturmedium til hver brønd og Inkuber i 30 sekunder på RT. fjerne 750 mL af medium og tilføje den samme mængde frisk substrat. Gentag tre gange.
- Fjern og kassér cellekulturmedium og tilsaettes 300 mL 4% PFA i 1 x PBS. Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C.
- Vaskes tre gange i 5 minutter med 1 x PBS.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
4. immuncytokemi
- Forberede 50 mL blokerende buffer.
Bemærk: Blokerende buffer kan være opbevares ved-20 ° C i flere måneder.- 2,5 g saccharose og 1 g af bovint serumalbumin (BSA) opløses i 5 mL 10 x PBS stamopløsning. Der tilsættes 1,5 mL 10% vaskemiddel stamopløsning. Opløsningen omrøres indtil alle komponenterne er korrekt opløst og tilsæt destilleret H2O indtil nå en endelige rumfang paa 50 mL. Alikvot løsningen og fryse delprøver til opbevaring.
- Fortynd den sekundære, fluorophore-kombineret antistof (rettet mod de primære Syt1-antistof arter) i 200 mL blokerende buffer i hver brønd med en fortynding af 1:1000.
- Fjern og kassér 1 x PBS fra hver godt indeholder en coverslip.
- Der tilsættes 200 mL blokerende buffer-antistof mix til hver brønd og Inkuber i 60 minutter på RT.
Forsigtig: Fordi de sekundære antistoffer er lysfølsomt, alle trin bevæger sig fremad skal udføres i mørke. - Efter inkubationen cellerne vaskes tre gange i 5 minutter med 1 mL af 1 x PBS.
- Integrere coverslips på objektglas med indlejring medium.
- Tilføje en 7 mL dråbe indlejring medium i mikroskop diaset. Fjerne coverslip fra 24-godt pladen ved at løfte det med en sprøjte og snuppe det med pincet.
Forsigtig: Celler på overfladen af coverslip er let beskadiget, så pincet skal håndteres med omhu. - Dyppe coverslip i destilleret vand for at fjerne PBS og tør det grundigt ved at røre en kant til en blød væv.
- Vende coverslip på indlejring medium dråben, således at overfladen transporterer cellerne ansigter objektglas, dermed integrering af cellerne på indlejring medium.
- Tilføje en 7 mL dråbe indlejring medium i mikroskop diaset. Fjerne coverslip fra 24-godt pladen ved at løfte det med en sprøjte og snuppe det med pincet.
- Forlade dias til tørre under kølerhjelmen for 1-2 h (dække dem for at undgå lys eksponering) og gemme dem i et mikroskop dias boks ved 4 ° C.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
5. mikroskopisk analyse
- Efter coverslips tørre, placere dem under mikroskop med mål og kamera.
- Justere eksponeringstiden for hver kanal, så få pixels er overeksponeret for at sikre maksimal fordelingen af grå værdier.
Bemærk: Mens eksponeringstiden kan variere mellem kanalerne, bør det være konstant for en kanal for at sikre sammenlignelighed mellem coverslips. - Erhverve multi-kanal billeder til 10 områder af interesse (ROIs) pr. coverslip. Kontroller, at Investeringsafkastet indeholder cytoskeletale processer fra en transfected neuron ved at kontrollere normal god landbrugspraksis-fluorescens, som bør være punktformet.
6. den statistiske analyse
- Eksportere billederne som .tif-filer. Indlæse billeder i OpenView18 ved at klikke på fil | Ladning billedfil.
- Vælg Synaptophysin-mOrange billedet som kanal 1, Rogdi-normal god landbrugspraksis/mGFP image som kanal 2 og Alexa647 fluorescens billede som kanal 3.
- Tærskel for ROIs.
- Klik på analyse | Sted område over puncta. Vælg værdierne tærskel og Delta intensitet , så ved visuel inspektion, diffuse Fluorescens er udelukket, forlader kun punktformet signaler i billedet af kanal 1 (der repræsenterer Synaptophysin-mOrange fluorescens). Holde den samme tærskel for alle billeder.
- Overføre disse ROIs til den tilsvarende kanal 2 (normal god landbrugspraksis-Rogdi/mGFP fluorescens) og 3 (Syt1-fluorescens) af hver coverslip område ved at klikke på Udfør nu.
Bemærk: ROIs bør kun overvejes, hvis cellen er dobbelt-transfekteret. I denne metode, skal mOrange og normal god landbrugspraksis fluorescens være klart synlige. - Gemme data til analyse log editor ved at klikke på logdata.
- Åbn analyse log editor under fanen Windows og kopiere værdierne for hver kanal. Indsæt værdierne for de separate kanaler i et regneark.
- Bestemme gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af Syt1-kanalen på ROIs i begge Transfektion betingelser (normal god landbrugspraksis-Rogdi og mGFP).
- Anvende passende statistiske tests såsom Student's t-test til at bestemme betydelige forskelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forventet resultat af denne tilgang er at finde ca 50 dobbelt-transfekteret neuroner pr. coverslip med en tæthed på 50.000 neuroner pr. brønd. Axon af hvert neuron forventes at vise flere hotspots fluorescently markeret Synaptophysin akkumulering, der angiver klynger ofSVs. På funktionelle præsynaptiske websteder colocalizes den rekombinante Synaptophysin signal med punktformet Syt1 fluorescens. Brug dobbelt Transfektion, er enten normal god landbrugspraksis-Rogdi som protein af interesse (figur 1) eller mGFP som kontrolelementet Co udtrykt med rekombinant Synaptophysin.
I dette eksperiment analyserer vi SV genbrug på præsynaptiske websteder i neuroner udtryk for normal god landbrugspraksis-Rogdi eller mGFP. Hvis kontrol protein, mGFP, fordeles ensartet i hele cellen hele, men dens indflydelse på synaptic websteder stadig skal studeres, så er det nødvendigt at co transfect et andet protein, der er presynaptically beriget, markeret fluorescently Synaptophysin.
Som beskrevet tidligere, gennemgå celler depolarisering-induceret senderen frigivelse. Som et resultat, tage funktionelle synapser op Syt1 antistoffer tilføjet til medium. Efter immunolabeling af Syt1 antistoffer med en fluorescently mærket sekundær antistof kvantificeres omfanget af Syt1 optagelse endelig ved hjælp af immunosignal (figur 2).
Figur 1. Dobbelt-transfekteret celle. Synsfeltet viser en dobbelt-transfekteret celle udtryk for normal god landbrugspraksis-Rogdi (A) og Synaptophysin-mCherry (B). Synaptophysin er en rigelige synaptic vesikel protein. Dens rekombinant variant kan anvendes til mærkning synaptic boutons. Lokalisering mønster af normal god landbrugspraksis-Rogdi ligner Synaptophysin-mCherry (C). Skalere barer = 10 μm. Afkrydsningsfelterne Vis 2,5 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Normal god landbrugspraksis-Rogdi på funktionelle synapser. Live Syt1 optagelse blev udført i dobbelt-transfekteret celler, der udtrykker enten mGFP (grøn) og Synaptophysin-mOrange (rød; A-D) eller normal god landbrugspraksis-Rogdi (grøn) og Synaptophysin-mOrange (rød; E-H). Syt1 antistof optagelsen blev udført ved hjælp af en mus monoklonalt antistof rettet mod den luminale domæne af Syt1. Efter PFA fiksering, var celler plettet med kanin anti-normal god landbrugspraksis antistof. Sekundære antistoffer (anti-kanin Alexa 488 og anti-mus Alexa 647) blev føjet til at opdage normal god landbrugspraksis eller normal god landbrugspraksis-Rogdi og Syt1, henholdsvis. Autofluorescence af Synaptophysin-mOrange blev brugt til at registrere præsynaptiske terminaler (B og F). Punktformet Syt1 immunofluorescens angiver lokaliteter af vesikel genanvendelse (blå; C og G). Bemærk, at størstedelen af Syt1-mærket synapser er lokaliseret til ikke-transfekteret neuroner. Normal god landbrugspraksis-Rogdi var målrettet mod aktive synapser og ændrede ikke synaptic vesikel genanvendelse (I). 3 uafhængige kultur eksperimenter blev udført (N = 3). Mindst 3 coverslips fra hver kultur (i alt 10) blev brugt til analyse. Endelig, 3 områder pr. coverslip blev analyseret (n = 30). Student´s t-test viste ingen signifikant forskel. Skalere barer = 10 μm. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (S.E.M.). "NS" angiver ingen betydning. Dette tal er blevet ændret fra Riemann et al. 9 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er tre assays rutinemæssigt anvendes til at studere synaptic vesikel (SV) genbrug. De første to omfatter anvendelse af en) fluorescerende styryl farvestoffer såsom FM1-43 (som indarbejde membraner, tages i organeller under endocytose og frigives efter exocytose); og b) fluorescently mærkede rekombinante SV proteiner (som ved overekspression, indarbejde de proteinholdige genanvendelse maskiner). Hvis de vedhæftede fluorophores ændrer deres fluorescens afhængigt af pH, kan de bruges til at overvåge ændringer mellem de sure interiør af en SV og pH i det ekstracellulære medium. De rekombinante proteiner markeret med en pH-følsom variant af normal god landbrugspraksis er kaldet Phluorins. De to assays drøftet har begge været featured tidligere19,20, og fordele og ulemper ved hver har også været gennemgik21.
Her beskriver vi et tredje, veletableret metode4,5,6,7,9,14. For at teste SV genbrug, drage vi fordel af det faktum, at den luminale domæne vesikel-forbundet protein Synaptotagmin-1 (Syt1) bliver udsat for cellens overflade ved exocytose. Først, vi tilføje et antistof rettet mod den luminale domæne til næringssubstrat, som derefter tages op af vesikel under SV genanvendelse. Dette antistof optagelse er visualiseret og kvantificeres ved immunfluorescens. Alternativt, en direkte mærket Syt1-antistof kan bruges. Etiketten kan være pH-uafhængig, rapportering lokalisering af den Syt1-antistof både inde og på den udvendige overflade af SVs eller pH-afhængige, rapportering lokalisering baseret på fluorescens ændringer. Vi beskriver også kombinationen af denne SV genanvendelse assay med dobbelt Transfektion af kulturperler neuroner til at teste om, hvorvidt et protein af interesse, normal god landbrugspraksis-Rogdi, mål funktionelle synapser og påvirker SV genanvendelse. Normal god landbrugspraksis-Rogdi er specifikke for denne fremgangsmåde; de samme spørgsmål kan dog løses for enhver protein af interesse.
Denne analyse blev først indført i 1992 for at overvåge den spontane genanvendelse af SVs4 og blev yderligere udviklet af den samme gruppe til at overvåge evoked SV genanvendelse12. Deres eksperimenter fastslået, at Syt1 udbredelse er følsomme over for clostridier nervegifte, der blokerer SV exocytose12. De viste også, at stimulation af kulturer af depolarisering ved 37 ° C forbedrer internalisering af Syt1 antistoffer i forhold til 1) kulturer, der holdes på is, som forhindrer de fleste endocytose, og 2) kulturer inkuberes ved 37 ° C uden stimulation, som giver mulighed for spontan genbrug, men fremkalde ikke genanvendelse12,22. Analysen kan let sammenligne SV genbrug mellem to betingelser, som med og uden et molekyle af interesse. Især fokuserer denne protokol på sammenligne Syt1 antistof optagelse i tilstedeværelse versus fraværet af en bestemt overexpressed protein. Protokollen kan udvides, hvis de relative bidrag til overflade-bindende, spontane genanvendelse og genvinding af evoked skal vurderes. For eksempel forhindrer inkubere neuroner på isen uden stimulation endocytose, afslører enhver overflade bindingen af Syt1 antistof. Inkubere neuroner ved 37 ° C i basal løsning med Tetrodotoxin forhindrer aktionspotentialet formering, afslører nogen spontan genanvendelse. Dermed, kvægbruget neuroner ved 37 ° C under stimulerende betingelser kan afsløre omfanget af evoked SV genanvendelse.
Levende celler er følsomme over for ideel fysiologiske tilstande; Derfor, vedligeholdelse, Transfektion og depolarisering buffere bør altid være testet for fysiologiske parametre, herunder temperatur og pH. Mens depolarisering buffere kan videregives gennem sterile filtre, når pH er blevet justeret, er Transfektion buffere følsomme over for sterile filtrering. Derfor, vi justere dets pH, holde det frosne indtil brug, og dreje det i en tabel-top centrifuge til pellet eventuelle bakterier. For Transfektion er det afgørende at blande buffer tilstrækkeligt for at sikre foreningen af plasmidet med calcium fosfat krystaller. Calciumphosphat Transfektion fungerer bedst på dagen i vitro (DIV) 2-4. Vi bruger mærket Synaptophysin, en SV transmembrane protein, som en markør til at identificere præsynaptiske terminaler i transfected neuroner. Tagged versioner af andre SV proteiner som SV2, Synapsin, og VAMP/Synaptobrevin eller aktiv zone molekyler som fagot, RIM, Munc13-1 og CAST kan også bruges.
Både mCherry og mOrange udsender røde fluorescens. Selv om mCherry er lysere end mOrange, har det større emissioner ved lange bølgelængder end mOrange. Derfor, for triple fluorescens imaging med normal god landbrugspraksis, et rødt farvestof og et farvestof udsender i rækken 700 nm, mOrange er en bedre løsning end mCherry. For dobbelt fluorescens med normal god landbrugspraksis og en rød farve, kan mCherry være gunstig, da det er den lysere farve. For at garantere sparsomme Transfektion, bør Transfektion mix ikke være udruget i mere end 60 minutter. Det er også vigtigt at inkubation i en depolariserende buffer er den rigtige længde af tid til at sikre exocytose af alle vesikler. Imidlertid skal udvidet eksponering for depolariserende bufferen undgås. Under image erhvervelse er det også vigtigt at anvende den samme eksponering gange og lys intensiteter at sikre kvantificerbare sammenligning mellem forskellige sæt af eksperimenter.
Endelig, under billedanalyse, vores protokol omfatter flere overvejelser. Den lavere intensitet tærskel er sat til et område af interesse viser rekombinante Synaptophysin puncta, så diffus Fluorescens er udelukket. Næste, denne tærskel er testet på andre områder og coverslips at iagttage lignende integration af punktformet signaler og udelukkelse af diffuse fluorescens. Når en passende tærskel er identificeret, anvendes den på alle billeder, producerer punktformet regioner af interesse (ROIs) i den rekombinante Synaptophysin (markeret med mCherry eller mOrange) kanal. Endelig bestemmes Syt1 intensitet for ROIs9.
Vores tilgang er optimeret til sparsomme Transfektion. Vi analyserer præsynaptiske funktion i komplekse omgivelser hvor der er SV genanvendelse i axoner af transfekteret neuroner omgivet af untransfected neuroner. I dette set-up tillader dobbelt-Transfektion os at manipulere neuronal funktion og finde de præsynaptiske terminaler af transfected neuroner. Transfekteret præsynaptiske neuroner, at kontakte untransfected postsynaptiske neuroner er en vigtig faktor for vurderingen af en præsynaptiske neuron virkninger på SV genanvendelse. Indstillingen kan også tilpasses nemt for at teste en postsynaptiske manipulation forårsager præsynaptiske ændringer eller ej. I dette tilfælde sparsom Transfektion af neuroner med et protein, der er målrettet til postsynaptiske sites vil lokalisere de postsynaptiske lokaliteter af transfected neuroner, og Syt1 udbredelse kan bestemmes på synaptic boutons af untransfected neuroner.
Når sparsomme Transfektion ikke er nødvendigt, kan forskellige Transfektion protokoller anvendes. For eksempel indebærer Transfektion med Lipofectamine på DIV 7 - 8 resultater i højere Transfektion priser, men det også stærkere udtryk i hvert transfekteret celle9. Derudover kan viral transduktion resultere i udtryk i næsten 100% af kulturperler neuroner14,23,24. I eksperimenter med henblik på overvågning af SV genbrug, kan Transfektion udføres for en enkelt protein eller venstre helt. For eksempel, når samlede synaptic genanvendelse er sammenlignet mellem neuroner fra vildtype og genmodificerede er mus, mærkning individuelle neuroner ved Transfektion ikke nødvendigt. Derudover, det giver mulighed for immunolabeling af endogene proteiner. Hvis Transfektion mislykkes, er det vigtigt at teste Transfektion buffer med en valideret plasmid eller bruge en buffer med en forskellige pH (Se forberedelse af Transfektion buffer). Ved hjælp af endotoxin gratis DNA præparater også synes at være afgørende. Immunfarvning internaliseret Syt1 antistoffer værker i både PFA-fast og methanol-fast prøver. Det bør også bemærkes, at normal god landbrugspraksis og RFP autofluorescence er tabt efter metanol fiksering. Hvis normal god landbrugspraksis eller RFP skal være lokaliseret i methanol-fast celler, skal disse proteiner være immunolabeled. Hvis Syt1 optagelse mislykkes, bør depolarisering tid og K+ koncentration i depolarisering bufferen ændres i overensstemmelse hermed. Mange protokol variationer er blevet offentliggjort, med depolarisering gange spænder fra 90 s25 -60 min.12og K+ koncentrationer af 45 mM, 50 mM, 70 mM, og 110 mM6,25,26 ,27. Når tilbagevendende aktivitet skal forhindres, kan glutamat receptor blokkere også tilføjes under depolarisering. Endelig, mens høje K+ depolarisering menes at være den stærkeste stimulus, handling potentialer kan fremkalde SV genanvendelse gennem flere fysiologiske stimuli22,28. Forskelle i Syt1 antistof optagelse effektivitet kan forekomme i rotter og mus kulturer. I vores metode, monoklonale musen anti-Syt1 klon 604.2 (RRID:AB_993036) producerer stærkere farvning i rotte kulturer end mus kulturer, mens polyklonale kanin anti-Syt1 antistof (RRID:AB_11042457) producerer stærkere farvning i mus kulturer, men flere noter af forsigtighed er diskuteret nedenfor.
Flere forbehold vedrørende brug af anti-Synaptotagmin antistoffer for optagelse i SVs bør overvejes. Først, N-glykosylering af asparagin 24 af Syt1 fremmer endocytotic optagelsen af protein29,30. Asparagin 24 er en del af den luminale domæne af Syt1. Mus og kanin antistoffer, som vi bruger er rettet mod aminosyrer 1-12 og 1-8, henholdsvis, af Syt1. Mens deres epitoper ikke overlapper med webstedet N-glykosylering, kan ikke sterisk hindring eller omvendt, en induktion af optagelsen af antistof bindende udelukkes. Mutation af N-glykosylering site i Syt1 ændrer ikke kinetik af endocytose og målretning af Syt1 til SVs. Det øger den brøkdel af Syt1 tilbage på den ydre plasmamembran overflade når endocytose er foranlediget af svage stimuli. Når stærke stimuli, såsom høje K+ depolarisering, der anvendes, er ingen reduktion i Syt1-uptake observeret30. Samlet set hvis antistoffer blandede sig med N-glykosylering site i nogle måde de kan forårsage en ændring i SV endocytose i forhold til antistof-fri betingelser, men denne ændring bør være ens for eksperimentet (i vores tilfælde overekspression af normal god landbrugspraksis-Rogdi) og kontrol (i vores tilfælde udtryk for normal god landbrugspraksis). Derudover kan polyklonale antistoffer være mere tilbøjelige til at fremkalde sterisk problemer og crosslinking end monoklonale antistoffer, fordi en større kopi antal antistoffer binder sig til epitop. Vi kender ikke systematiske undersøgelser sammenligner de tilgængelige antistoffer med hinanden; Men, nogle undersøgelser har behandlet gyldigheden af visse antistoffer. For eksempel, når SV genanvendelse kinetik var probed ved hjælp af monoklonale musen anti-Syt1 antistof klon 604.2 og Synaptophluorin-fluorescens ændringer i en direkte sammenligning, blev lignende resultater opnået, validering af brugen af dette antistof28. Lastning SVs med polyklonale kanin Syt1 antistoffer og optagelse synaptisk transmission electrophysiologically afslørede at de indlæste synapser havde reduceret synaptisk transmission på en måde der minder om tab af funktion mutanter af Syt1. Derfor påvirker disse polyklonale antistoffer synaptisk transmission. Den faktiske udbredelse afslørede både spontane og evoked genbrug, tyder på, at en polyklonale antistof er velegnet til at overvåge en runde af SV genbrug, men bør udvises forsigtighed ved fortolkningen af resultaterne efter optagelsen af disse antistoffer31.
Tre assays er rutinemæssigt anvendes til at studere SV genbrug, som omfatter membran mærkning med styryl farvestoffer, overekspression af Phluorins, og Syt1-antistof optagelse udføres her. Alle tre assays kan bruges til at bestemme endocytotic og exocytotic ben af SV genanvendelse. Mens alle tre assays har kraftfulde fordele, har hver også et princip caveat. FM farvestoffer etiket hele cellens overflade og tages i cellen med alle genanvendelse membraner. Phluorins skal være indført ved overekspression. Syt1-antistoffer mærke den endogene protein, men nogle antistoffer kan påvirke dets funktion under visse betingelser. Hver caveat kan imidlertid være passende rettet21.
Samlet set har Syt1 antistof optagelse assay serveres forskellige formål. Først, det blev brugt til selektivt label SVs gennemgår spontan eller evoked genbrug, henholdsvis28,31,32,33. For det andet, det blev brugt til at bestemme virkningen af et lægemiddel eller protein på omfanget af SV genanvendelse; for eksempel, at vise at BDNF forbedrer både spontane og evoked SV genanvendelse6. For det tredje blev det brugt til at bestemme antallet af synapser med genanvendelse SVs som en procentdel af det samlede antal af morfologisk definerede synapser34,35. Dette afslørede at overekspression postsynaptiske celle-vedhæftning molekyle Neuroligin-1 øger procentdelen af synapser med genanvendelse SVs25 og at reducere udtryk af AMPA-type glutamat receptorer nedsætter procentdelen af synapser med genanvendelse SVs, øge procentdelen af presynaptically silent synapser36. Derudover var analysen bruges til at analysere mobiliteten for mærket SVs27 og bestemme lokalisering af Syt1 ved hjælp af nanoscopy13,22,33. Endelig, denne metode bruges stadig til at teste om, hvorvidt visse proteiner lokalisere til funktionelle synapser9. Syt1 antistof kan også bruges til langfristede undersøgelser, hvor antistoffet forbliver i neuroner i dage efter optagelsen37. Dette kan kombineres med en anden runde af optagelse ved hjælp af en separat mærket Syt1 antistof eller et antistof rettet mod en forskellige SV protein luminale domæne. Dette giver mulighed for afprøvning af som SVs genanvendt i første omgang, og som genbruges ved slutningen af et eksperiment. Det ville være interessant at tilpasse dette assay til mere intakt modelsystemer, som akut skiver og organotypic skive kulturer. I princippet, optagelse assay tillader sammenligning af væv fra vildtype og genetisk modificerede dyr eller kan kombineres med viral levering eller biolistics, dvs., en "gen pistol," at manipulere protein udtryk i disse modelsystemer. I sådanne systemer, kan indflydelsen af visse perturbationer på præsynaptiske maskiner, overvågning, optagelse assay, og netværket dynamics studeres samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Irmgard Weiss til teknisk ekspertbistand. Dette arbejde blev støttet af DFG via klyngen af ekspertise til mikroskopi på rækken nanometer og molekylær fysiologi af hjernen (CNMPB, B1-7, at T.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
