Summary
该协议通过同时接触近红外脉冲激光和高强度聚焦超声 (HIFU), 证明了凝胶幽灵中空化的可控成核。空化活性可用于增强 HIFU 的成像和/或治疗应用。
Abstract
在本研究中, 等离子金纳米粒子同时暴露于脉冲近红外激光光和高强度聚焦超声 (HIFU) 中, 用于组织模拟凝胶幽灵的空化成核。这项体外协议的制定, 以证明这种方法的可行性, 既增强成像和治疗应用癌症。同样的仪器可以用于成像和治疗应用, 通过改变 HIFU 系统的曝光时间。对于短时间曝光 (10 µs), 通过在金纳米粒子周围的惯性空化的控制成核, 产生宽带声发射。这些排放提供了纳米粒子的直接定位。对于未来的应用, 这些微粒可能是功能性的分子靶向抗体 (如 anti-HER2 为乳腺癌), 并可以提供精确定位癌区, 补充常规诊断超声成像。对于连续波 (CW) 曝光, 利用气蚀活性增加了高强度聚焦超声照射下的局部加热, 导致凝胶幽灵的热损伤较大。利用被动空化检测 (PCD) 系统对惯性空化活动产生的声发射进行了监测, 以提供空化活动的反馈。只有通过纳米粒子、激光光和 HIFU 的独特组合, 才能提高局部加热。在癌症的临床前模型中进一步验证这种技术是必要的。
Introduction
高强度聚焦超声 (HIFU), 或聚焦超声手术 (FUS), 是一种非电离和非侵入性技术, 用于热消融的皮下组织1。HIFU 的主要用途是治疗软组织肿瘤2, 但它已开始用于其他应用, 如治疗骨肿瘤3或神经疾病4。影响 HIFU 在临床中广泛应用的主要因素有两个: 一是治疗指导困难, 二是治疗时间长5。用该方法描述的 hifu、脉冲激光照明和等离子金纳米棒的结合, 可以为高强度聚焦超声6的当前局限性提供一种克服的方法。
在高强度聚焦超声照射下, 组织消融的主要机制是热损伤。然而, 空化活动也可以起到8的作用。在 HIFU 曝光期间发生的空化活动可以由机械和/或热介导的气蚀组成。机械介导的空化通常被称为声空化7, 它进一步分为为经历非惯性或惯性9行为的气泡。热介导的空化是从气袋的形成, 通过前溶液或汽化, 通常称为 ' 沸腾 '10。气蚀活性, 最常见的惯性空化, 已经表明, 以提高热加热率可达到通过 HIFU 曝光11 , 从而帮助解决其关键的限制之一。然而, 在高强度聚焦超声曝光过程中, 气穴的形成和活动可能是不可预知的, 并会导致诸如过度处理区域或非对称热消融12等负面影响。为了控制 HIFU 暴露过程中的空化活动, 研究了外核的引入。这些可以采取微气泡13, 相移 nanoemulsions14或等离子纳米粒子15的形式。微气泡和 nanoemulsions 都被证明可以改善成像和增强热消融的信噪比。然而, 它们的瞬态性质意味着它们的功能有限, 而重复高强度聚焦超声暴露。利用主动或被动空化检测 (分别为聚能或 PCD), 对 HIFU 曝光过程中的空化活动进行监测。PCD 是一种很受欢迎的空化检测技术, 它可以与 HIFU 曝光同时进行, 并提供光谱内容信息。然后可以进一步分析这一光谱内容, 以帮助识别发生16的空化活动类型。使用宽带声发射, 因为这些排放是唯一的存在的惯性空化10 , 并连接到增强的 HIFU 加热11。
光声成像 (排) 是一种新兴的临床成像技术17, 它结合了脉冲激光激发的光谱选择性和高分辨率的超声成像18。它以前曾被用来指导 HIFU 曝光率19, 但这种成像技术受激光穿透深度的限制。等离子金纳米粒子可作为 "对比剂", 增加激光的局部吸收, 并随后产生光声发射的振幅20。对于足够高的激光 fluences, 有可能导致产生微观蒸气气泡, 可用于高度本地化成像21。然而, 这些暴露水平通常超过使用激光光在人类22的最大允许接触限制, 因此使用有限。本研究采用的方法曾表明, 通过同时将等离子纳米粒子暴露于激光照射和 HIFU 中, 这些小气泡的核激光强度和声学压力会大大降低,成像的信噪比增加了23。本文介绍了一种将等离子纳米粒子与激光和高强度聚焦超声相结合的方法, 用于一种高度可控的汽泡成核和活性的技术。
Protocol
1. 组织仿幻制造
注: 对本研究中用于所有接触的光学透明组织仿幻体的声学特性进行深入分析, 可在崔等中找到. 24
注: 每个幻像模具包含约50毫升的解决方案, 并为每个批次共五模具填补。因此, 总共准备了250毫升的幻影溶液。
- 添加148.2 毫升 (60% 伏/五) 的去离子, 过滤和脱气水到500毫升玻璃烧杯, 并离开平衡到室温。将75毫升 40% (重量/体积) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 (30% 伏/v) 添加到玻璃烧杯中, 其次是25毫升1米三缓冲, pH 8 (10% v/v) 和2.15 毫升的10% 硫酸铵 (APS; 0.86% v/v)。
- 将玻璃烧杯放在一个位于磁搅拌器板上的真空室内, 并将40毫米长聚四氟乙烯 (PTFE) 磁性搅拌棒放在烧杯内。以中等搅拌速度 (即,确保良好的混合不形成漩涡在水中), 慢慢添加22.5 克 (9% 瓦特/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 粉。
- 一旦所有 BSA 被添加到解决方案, 关闭真空室, 打开真空泵。保持真空80毫巴, 并继续搅拌60分钟后, 释放真空。此时, 解决方案应以轻微的黄色色调清除。
- 上述方法是相同的幽灵制造的和没有纳米粒子。如果需要纳米粒子, 添加10µL (1x108 np/毫升) 的纳米棒, 其表面等离子共振 (SPR) 在 850 nm 和直径 40 nm。
- 最后, 加入125µL 的 tetramethylethylenediamine (TEMED) 催化合成幻像。再等5分钟, 允许混合, 然后将幻影溶液倒入5个单独的模具, 并等待20分钟设置。一旦设置, 把他们从持有人和储存在一个密闭的容器, 直到使用。使用24小时内的幽灵制造。
2. HIFU 传感器自由场声压标定
注意: 在每次毁损/成像实验之前, 协议的这一部分是不必要的。这是一个定期执行的校准程序, 以确保系统的声输出是正确的。
- 用4.5 升去离子和脱气水填充丙烯酸水箱 (280x141x132 毫米)。将 HIFU 传感器安装在坦克一端的固定位置柱上, 面向。平行于此, 安装一个校准 (由国家物理实验室) 膜水听器到三轴的手动千分尺阶段, 在接近焦点的 HIFU 传感器 (63 毫米)。
- 将 HIFU 传感器 (几何聚焦 63 mm) 连接到阻抗匹配电路, 然后是功率放大器 (如图 1所示)。然后将膜水听器直接连接到数据采集系统, 确保从连接到功率放大器的函数发生器中提供触发信号 (图 1)。
- 将函数发生器的输出电压设置为 30 mV, 在脉冲重复频率为100赫兹的情况下, 使用10周期 3.3 MHz 正弦波。
- 使用测量软件 (见材料表) 可视化检测到的声波信号和微米级, 定位检测到的声波脉冲在正确的飞行时间 (42.5 µm)。在微米级上一次只使用一个径向方向, 使检测到的声波信号最大化。一旦确信这一点已经实现, 关闭软件, 让膜水听器在其当前位置。
- 在 20 mv 增量中, 将函数发生器的输出电压从 20-400 mv 中改变。在每个电压电平和使用 MatLab 采集软件, 记录水听器信号。在每个级别获取100个脉冲, 并使用所提供的校准数据从压力数据中转换电压。平均数据并测量所有输出电压电平的峰值正值和负值。这给出了用于脉冲和连续波研究的自由场峰值负压的标定数据。
3. 为脉冲和连续波研究配置实验装置
- 用4.5 升去离子和脱气水填充丙烯酸水箱 (280x141x132 毫米)。将 HIFU 传感器和与之协调的宽带水听器安装在三轴的手动千分尺上。然后, 将传感器和水听器完全浸入水箱中。图 1显示了这一示意图。
- 将 HIFU 传感器连接到阻抗匹配电路, 使其能够在其第三次谐波 (3.3 MHz) 下驱动。该电路直接连接到射频功率放大器的输出。数字函数发生器连接到功率放大器的输入, 并远程编程。
- 在幻影材料曝光之前, 请使用校准的差动膜水听器来测量2中所述的函数发生器上给定输入电压产生的峰值负压。使用这些参考电压值在数字函数发生器上设置所需的压力电平。
- 将聚焦于 HIFU 传感器中心孔径的宽带水听器 (几何聚焦 63 mm) 连接到 5 MHz 高通滤波器。然后通过 40 dB 前置放大器将其连接到14位数据采集卡 (数据采集)。确保高通滤波器与正确的偏差连接。
注: 此卡安装在台式电脑中, 用于控制所有硬件 (示例此软件可以被发现为辅助文件), 并在本研究期间为离线处理保存数据。 - 将晶体管晶体管逻辑 (TTL) 数字延迟脉冲发生器与刺刀 Concelman (BNC) 电缆连接到脉冲激光系统和函数发生器中, 以确保这些系统之间的同步, 这将确保 7 ns 激光器从 HIFU 传感器的第四稀疏峰中, 脉冲与目标区域重合。
- 使用1中描述的方法, 省略 BSA 和纳米粒子, 使之对准幻影, 这是标准的幻影材料, 其中包含一个1毫米球形金属靶 (球轴承)。为了实现这一点, 将25毫升的幻像材料倒入模具中, 加入62.5 µl TEMED 催化剂, 然后等待约20分钟设置。然后将金属靶集中在幻影中, 再添加25毫升的幻像溶液, 接着是62.5 µl TEMED 催化剂, 再加20分钟等待。
- 将对准幻影放置在3维印刷支架6中, 安装在自动3维舞台上, 近似位置, 使金属靶处于 HIFU 传感器的焦距。
- 利用 HIFU 传感器发送短时间10周期突发 (3 µs) 和水听器接收 (直接连接到数据采集卡), 相对于对准目标的位置通过脉冲回波位置进行优化。实时检测到的信号将显示在计算机上。利用 HIFU 传感器和水听器安装的手动千分尺, 调整飞行时间和信号振幅。一旦飞行时间被设置为85µs (一次往返), 并且信号振幅在两个径向方向被最大化, 这个系统将被排列。
- 将 532 nm 纳秒脉冲激光泵浦的光学参量振荡器 (OPO) 的光学能量耦合到幻影中, 使用2毫米光纤束。将此光纤装入第二微米级, 并从幻像前面的声学轴的角度45˚位置 (图 1)。激光的波长被设置为680纳米, 以便对齐可见。一旦可见, 定位激光照明与千分尺阶段, 使对准目标是中心的15毫米直径激光点。
- 将20-90x 数字显微镜 (工作距离90毫米) 和与 HIFU 传感器的传播平面垂直的水箱的另一侧上的白色光源定位。显微镜安装在一个小的千分尺阶段。定位它, 这样的金属对准目标是中央和焦点在其视野 (5x6 mm)。
注: 在上述程序完成后, 该系统的所有元素 (HIFU 传感器、水听器、激光照明和显微镜) 现在都与特定位置对齐。对齐幻影现在可以用用于研究的组织模拟幽灵代替。当幻影安装在一个附着在3维定位系统的支架上时, 可以在保持对准的同时瞄准不同的区域。
4. 脉冲高强度聚焦超声暴露的空化阈值检测
注: 以下过程是相同的幽灵有或没有纳米粒子, 应重复三次。
- 确保 PCD 系统在与3.8 中概述的对准过程断开连接后, 将激光波长调整为纳米粒子的 SPR。使用自定义控制程序, 设置函数发生器产生10周期 (3 µs) HIFU 爆裂, 这是与激光系统同步。还可以使用此程序设置0.4、1.1、2.1 或3.4 兆焦耳/厘米2的激光照射, 但改变了激光系统中闪光灯点火触发和 Q 开关开启之间的时间间隔。
- 目标聚焦 HIFU 系统的焦距10毫米深进入幻影, 并在13个独特的位置, 间隔5毫米, 在垂直方向。在每个这些位置执行曝光在一个峰值负 HIFU 压力, 与四激光 fluences 说, 在4.2。
- 使用峰值负压的范围 0, 0.91, 1.19, 1.43, 1.69, 1.92, 2.13, 2.34, 2.53, 2.71, 2.83, 3.00 和 3.19 MPa 为以下曝光情况: 激光在一个纳米粒子自由幻影, 激光在纳米粒子的幻影, 激光在纳米粒子幽灵。要模拟 "假" 激光曝光, 请按照所描述的那样运行系统, 但在 OPO 的输出上关闭手动快门。这种方法将确保产生的任何射频噪声仍将存在于 PCD 系统。
- 将所有设置和曝光位置编程到控制程序中, 然后执行这些测量。PCD 数据的数字化和存储直接使用数据采集卡进行后处理。对于每一个曝光参数, 500 重复曝光被获取6。
- 利用 McLaughlan等技术详细介绍了 PCD 系统从短周期高强度聚焦超声探测到幽灵的宽带排放量。(2017)6。
5. 连续波 HIFU 暴露的热变性
注: 以下步骤是相同的幽灵有或没有纳米粒子, 并重复三次。
- 设置激光系统给出3.4 兆焦耳/cm2和函数发生器给连续波曝光 (每33万周期爆发同步到激光脉冲) 的影响。在幻影中的11个独特位置, 选择一个峰值负压 0.20, 0.62, 0.91, 1.19, 1.43, 1.69, 1.92, 2.13, 2.34, 2.53 或 2.71 MPa。
- 使用十七年代的总曝光时间, 以获取1s 的基线之前和之后的十五年代 CW HIFU 暴露在幻影。在整个曝光时间内, 数据采集系统正在记录 PCD 数据。显微镜连接到控制 PC, 并记录图像帧在这段时间提供直接可视化热损伤形成。
- 对4.4 中概述的所有不同暴露条件重复4.3 过程。
- 处理所有 PCD 数据离线, 计算每个曝光的惯性空化剂量25 。
Representative Results
脉冲高强度聚焦超声辐照的空化检测
被动空化检测系统记录了在无纳米粒子和无微粒的情况下, HIFU 和激光照射范围的电压/时间数据。图 2显示了一系列曝光的代表性结果。由于这些排放量的飞行时间, 这些地块的时间刻度被截断, 以突出显示宽带声发射预计的区域。图 2显示, 只有当纳米粒子、HIFU 曝光和激光照明相结合, 才能检测到宽带排放。然而, 这仍然是一个阈值现象, 因为在较低的声学压力图 2h宽带排放没有检测到。这些排放的持续时间通常与 HIFU 暴露的长度有关, 这项研究的µs 约为10。
连续波 HIFU 暴露的热变性
图 3显示了从通用串行总线 (USB) 摄像机中获得的一系列帧, 在一次高强度聚焦激光照射的情况下, 为三种不同的曝光类型 (带/不带激光照明和/或纳米粒子)。这个数字显示了一个例子, 形成的热损伤在凝胶幽灵为每一个这些条件。在这种情况下, HIFU 的曝光发生从左向右。如图 3所示的例子, 峰值负压为2.53 兆帕, 这是本研究所用的上边缘。
从连续波 HIFU 曝光记录惯性空化剂量 (ICD)
图 4显示了在连续波高强度聚焦超声曝光过程中记录的 ICD 计算的代表性结果。这些数据是由 PCD 系统在暴露期间所记录的排放物处理的。图4a、4c和4e显示, 在峰值负压较低的情况下, 没有检测到宽带排放量, 而4b、d和f的数字显示, 在整个曝光过程中都记录了 ICD。在含有 HIFU 和激光照射的纳米颗粒的凝胶中, 观察到最高的 ICD 信号 (图 4f)。
图1。本研究所用实验装置的示意图.为清楚起见, 省略了 USB 显微镜和光源, 但视图区域由蓝色虚线框说明。数控-计算机数控, AuNR-金纳米棒。图改编自 McLaughlan等。(2017)6.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图2。一个例子的电压跟踪记录与被动空化探测系统在短 HIFU 曝光, 与/不同时激光照明.使用时, 激光照射量为2.1 兆焦耳/厘米2 , 峰值负压为 (a-c) 3.0, (d-f) 2.13 和 (g i) 1.43 兆帕。LS-激光, NR-纳米粒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。每帧在 0, 5, 10 和十五年代的时候, 在 HIFU 曝光的 USB 显微镜记录.激光照射量为3.4 兆焦耳/厘米2 , 峰值负压为2.53 兆帕。序列 (a) 是与激光曝光和在无微粒的幻影, (b) 是没有激光曝光和在一个幻像包含微粒, 并且 (c) 有激光照明和一个幻像包含微粒。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。计算的惯性空化剂量 (ICD) 记录在暴露期间 (a、b、e、& f) 与和 (c & d) 没有激光照明.峰值负压为 (a、c、& e) 0.91 或 (b、d、& f) 2.53 兆帕。在 (a & b) 中使用的幻影不含任何纳米粒子。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
该协议分为四个单独的部分, 描述了制造的组织模仿幻影通过到 CW 暴露, 以产生热产生变性。这种幽灵的变性模拟了高强度 HIFU1的软组织所经历的热产生的凝血坏死。在制造过程中, 重要的是要确保 ap 和 TEMED 的比例是如此, 这一进程不会催化太快。由于这个过程是放热的, 速度越快, 温度达到25 , 就可以在暴露之前变性 BSA 蛋白。该协议中 APS 与 TEMED 的比值已经设定, 不应发生这种情况, 但是在凝胶聚合过程中可以将霉菌放在冰水中, 以进一步减少这种可能性。
由于该协议的重点是通过结合纳米粒子, 激光照明和 HIFU 曝光的空化成核, 在制造凝胶幽灵的关键步骤是在真空下将它们加成至少30分钟。一旦暴露在 HIFU (特别是连续波暴露), 即使热损伤不存在, 重要的是要在凝胶幽灵的一个新的位置, 以避免先前存在的细胞核。当使用计算机控制的翻译系统移动幻影时, 重要的是要确保 HIFU 聚焦 (以及由此排列的区域) 的深度保持一致。这确保了 HIFU 压力和激光照射量水平是一致的每一个特定的暴露参数。对于这个协议, 在最初放置幻影持有者之后, 它只在垂直轴中被翻译。
温度敏感的组织模拟凝胶广泛应用于 HIFU 研究社区25, 因为它们为监测热损伤的形成提供了视觉机制。这项研究是将它们与纳米粒子结合在一起的第一个例子, 通过控制空化活动来证明对病变形成的增强作用。然而, 尽管它们被归类为对温度反应的组织模仿, 但它们的光学和声学衰减都不是。由于需要可视化凝胶中的病变形成, 幽灵是接近透明的, 略带黄色的色调。由于激光的通量被调整为这一点, 它意味着照亮目标区域的激光光是准直的而不是扩散的, 就像正常组织一样。因此, 为了使临床翻译, 需要多个照明源, 以确保足够的表面上的影响。目前这项工作遵循的指导原则22为安全使用激光时暴露于皮肤。这将限制在深度可实现的最大激光照射量;因此, 这种技术最初将适合治疗浅表性癌症, 如乳房, 或头部和颈部。此外, 针对这些类型的癌症的表面受体的等离子纳米粒子可以提供更多的选择性治疗。然而, 尽管这是一个高度活跃的研究领域, 但目前还没有批准这种微粒用于临床使用。
以纳米粒子为0.7±0.2 的声波衰减率为6, 与3-4 分贝/厘米软组织的值相比, 明显降低。因此, 在这些凝胶中, 高强度聚焦超声照射的加热将比软组织中观察到的要低。已证明, 添加玻璃珠的凝胶增加的衰减水平类似软组织25。然而, 在这个应用中, 这种方法是不可能的, 因为这些珠子将扮演一个成核源的空化活动, 即使在没有纳米粒子, 从而歪曲了空蚀阈值。将加热效率与研究结果进行比较. (2013)25、热损伤发生在峰值压力范围为 14-23 兆帕 (没有说明, 如果这是峰值正或负压)。由于这是在1.1 兆赫, 幽灵的衰减比在本研究中使用的低。然而, 在这项研究中, 纳米颗粒有核的方法能够在1.19 到3.19 兆帕的压力范围内产生这些幽灵的热损伤, 从而证明提高了现有方法的效率。
这种方法的未来测试应该在体内模型中进行, 以纳入肿瘤的减少, 组织灌注, 分子靶向纳米粒子和相关的声学衰减参数。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 EPSRC 赠款 EP/J021156/1 的支持。撰文人希望感谢早期职业 Leverhulme 奖学金 (ECF-2013-247) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Single Element HIFU transducer | Sonic Concepts | H-102 | |
| 55dB Power Amplifier | E&I | A300 | |
| Function Generator | Keysight Technologies | 33250A | |
| Differential Membrane Hydrophone | Precision Acoustics Ltd | ||
| TTL Pulse Generator | Quantum Composers | 9524 | |
| Nd:YAG Pulse Laser | Continuum | Surelite I-10 | |
| OPO Plus | Continuum | Surelite | |
| Fibre Bundle | Thorlabs Inc | BF20LSMA01 | |
| Energy Sensor | Thorlabs Inc | ES145C | |
| Nanorods | Nanopartz | A12-40-850 | |
| Broadband detector | Sonic Concepts | Y-102 | |
| 5 MHz high pass filter | Allen Avionics | ||
| 40dB preamplifier | Spectrum GmbH | SPA.1411 | |
| 14-bit data acquisition card | Spectrum GmbH | M4i.4420x8 | |
| Deionised Filtered Water | MilliQ | ||
| Acrylamide/Bis-acrylamide solution | Sigma Aldrich | A9927 | |
| 1 mol/L TRIS Buffer | Sigma Aldrich | T2694 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 3D printer | CEL-UK | Robox | |
| 3-axis positioning system | Zolix | ||
| Digital Microscope | Dino-lite | AM4113TL | |
| Water Tank | Muji | Acrylic Tank | |
| Optical Components | Thorlabs Inc | Various | |
| Optomechanical Components | Thorlabs Inc | Various | |
| BNC Cables | RS | ||
| Desktop PC | Custom Made | ||
| Hotplate Stirrer | Fisher | ||
| SBench6 | Spectrum GmbH | Measurement software |
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