Summary
여기, 우리는 설립된 셀 라인의 혐 기성 장기 재배를 가능 하 게 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 테스트는 최대의 생존 시간은 17 일 이다. 이 메서드는 세포 독성 대리인의 테스트 및 anoxically 세포 복제의 생리학 탐험에 적합 합니다.
Abstract
대부분 점 막 표면 종양에 줄기 세포 벽 중간점 함께 무산 소는 신체의 지리적 영역이 있습니다. 이전 연구 결과 부 화 normoxic (5% CO2 공기에서)에 또는 hypoxic (낮은 산소 수준) 조건 제한 가능성 (2-3 일)에 무산 소 인큐베이션 (자유로운 산소의 부재) 결과 옵니다. 새로운 방법론은 (적어도 17 일, 최대 시간 테스트)에 대 한 무산 소 세포 배양을 가능 하 게 개발 되었다. 이 방법론의 가장 중요 한 측면 산소 시스템에 도입 하는 것입니다. 이 기체 제거 미디어, 그리고 세 정 튜브, 요리, 플라스 크, 및 혐 기성 가스 혼합물 (H2, CO2, N2)와 함께 펫 자료 무산 소 (산소) 환경에 equilibrate를 허용 하 여 뒤에 의해 얻어진 다 이전에 사용. 현미경 얻은 아티팩트를 포함 하지 않도록 하려면 photomicrographs 인수 하는 경우 추가 관리를 행사 해야 합니다. 산소의 부재에서 셀 형태학 크게 변경 됩니다. 두 가지 morphotypes anaerobically 성장 하는 모든 셀에 대 한 설명 되어 있습니다. 성장 하 고 산소의 부재에 포유류 세포를 유지 하는 능력의 세포 생리학, polymicrobial 상호 작용, 그리고 소설 암 약물 개발에 대 한 생 합성 통로의 특성 분석에 적용할 수 있습니다.
Introduction
고체 종양, 줄기 세포 벽 감, 안 감 점 막 표면 세포 anoxia1,2,,34를 포함 하 여 감소 산소 수준, 경험 하는 환경에 존재 한다. 정상 생리 상태에서 산소 anoxia (산소의 완전 한 부재)5,6산소 보다 다릅니다. 대기 산소는 포유류 세포 복제에 부정적인 영향을 미치는 그 체 외에서 세포 성장이 고갈된 산소 조건에서 최적화 될 수 있습니다 실현 1970 년대 초반에 보고 되었다. 리히터 외. 7 1-3% 산소 수준 (hypoxia)의 대기 산소 (20%) 도금 효율 향상을 보여주었다. 인간 2 중 세포 수명 또한 hypoxic 문화 조건8에 확장 됩니다.
Vivo에서, hypoxic 조건이 발생할 때 산소 매장 고갈 (예를 들어를 강렬한 운동 동안)와 함께 발효 (혐 기성 호흡) 호 기성 호흡에서 골격 근육에 ATP 생산은 전환 하는 점에서 젖 산9의 최종 제품. 병 적, 암 종양, 내부에에서는 종양의 질량은 산소 가난한 vascularization 인해 무산 소를10. 종양 내부에 제한 된 관류의 효과 독립적으로 유효성을 검사 하지 종양 인테리어 의무 anaerobes1에 의해 식민지에 의해. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 알파 유전자의 표현에 전적으로 종속 hypoxia에서 종양 세포 생존은 생각 하는 mechanistically, (HIF1-알파), 산소4,11 초기 자발적인 응답은 , 12. HIF1-알파 hypoxic 조건 하에서 HIF1를 바인딩할 열 충격 단백질에 의해 유도 된다-알파 발기인 및 upregulate 유전자 전사12. 이 열 충격 단백질 종양 hypoxic microenvironment에서 본 다양 한 고기의 유도에 도움으로 추정 된다. 이 고기 세포 막 포도 당 운송업의 증가 표현과 분해 (바르 부르 크 효과)13의 속도 전시 한다. 결과 발효 젖이 나올를 미토 콘 드 리아 산화 인 산화에서 스위치입니다.
무산 소 생존 또한 대안 생존 현상14,15를 지원 하기 위해 포도 당을 활용할 수 있습니다. 최고의 공부 포유류입니다 두더지 쥐과 당 구동 glycolytic 발효 통로14통해 산소 없이 거의 20 분 동안 살아남을 수 있습니다. 특정 생선에 발생 하는 다른 적응 (예를 들어, 훨씬 더 이상 살아남을 수 있는 잉어 [떡 sp.], 기간 터미널 부산물로 에탄올 분해를 사용 하 여)15. 두 경우 모두, 발효 드라이브 활성화 산소의 부재에서 생존 하는 대사. 무산 소 생존에 대 한 현재 가설은 오랫동안으로 HIF1-알파16혐 기성 조건 발생 하는 산소에 대 한 필요 없이 hypoxia, 미토 콘 드리 아 호흡 하는 동안 활성화 됩니다. 또한, 그것은 가정 하는 hypoxic/무산 소 생존을 위한 발효 경로 사용 하 여 셀 셀 생존17에 해로운 증명할 수 있는 산화 스트레스 방지 이후 종양 생존을 향상. 이 공준 cardiomyocytes에서 hypoxia 종양 세포17에 배치 하는 산화 스트레스 감소를 보여주는 최근 연구에 의해 지원 됩니다.
날짜 하려면, 무산 소 포유류 세포 생존에 대 한 발효 통로의 본질은 되었습니다에 배어 든 문학, 인해, 3 일 이상 산소의 완전 한 부재에 문화 포유류 세포의 무 능력에 큰 부분에서. 그러나, 혐 기성 생존을 위한 분해 대신 박테리아에서 발생합니다. 특정 박테리아에 질소 또는 황산 (다른 화합물) 중 산소18시 토 크롬 산화 효소 시스템 부재에 대 한 터미널 전자 수락자로 사용할 수 있습니다. 세균과 진 핵 진화 마지막 보편적인 일반적인 조상에서 분기 이후 병렬로 발생, 비록 미토 콘 드리 아 1.542 백만 년 전에 바다19의 산소 세포에 에너지를 제공 했다 추정 된다 . 연구원은 고립 된 미토 콘 드리 아 터미널 전자 수락자로 아 질산염으로 산소의 부재에서 ATP를 생성할 수 있다 나타났습니다 그것 이므로 세포 산소의 부재에 3 일 이상 기간에 대 한 기능 수를 가정 하는 합리적 20 , 21 , 22 , 23.이 연구에서 설명 하는 방법론은 수많은 셀 라인의 혐 기성 포유류 세포 성장에 대 한 유틸리티.
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Protocol
1. 다양 한 포유류 세포 라인의 혐 기성 문화에 대 한 미디어 준비
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무산 소 셀 문화25에 대 한 완전 한 PS 74656 매체를 확인 합니다.
- 아 질산염 이온 증류수 50 ml에서의 17.25 g을 용 해 하 여 살 균 아 질산염 재고 솔루션 (5 M; 100 배)를 확인 한 다음 그것을 소독 필터.
- 110 mg/l L-글루타민, 나트륨 pyruvate 그리고 10% 태아 둔감 한 혈 청의 584 mg/L의 낮은 포도 DMEM (1 g/L의 포도 당)의 50 mL 당 아 질산염 재고 솔루션의 0.5 mL을 추가 (FBS; 열 비활성화).
참고: FBS 농도 10%는 독성 보다 큰 사용 합니다. 메모의 한 암 세포 라인 테스트 아 질산염 (MDA-MB-231, 유 방 암 세포 선)와 미디어에 대 한 낮은 내성을 했 그리고, 따라서, 아 질산염의 부재에서 성장 했다. 또한, PS 74656 매체 지원 테스트 모든 셀 라인의 성장 (n = 9), 특정 셀 라인 (예를 들어, Vero 세포) 전시 높은 세포 농도 높은 포도 당 (4.5 g/L) DMEM과 PS-74656에서 더 높은 생존 능력 25. - 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 매체의 20 mL를 배치 합니다. 모자; 강화 하지 마십시오 그것은 느슨하게 해야 합니다.
- 진공 벨 항아리에 튜브를 삽입 하 여 탈 가스 매체는 약 45 ° 각도, 중간 영역을 최대화 하기 위해.
- 실 온에서 진공 펌프 또는 해당을 사용 하 여 진공을 적용 합니다. 거품은 더 이상 (24-48 h) 관찰 때까지 진공을 유지 합니다.
- 항아리에서 튜브를 제거 하 고 즉시 매체에 공기의 도입을 최소화 하기 위해 튜브 씰링 뚜껑을 닫습니다.
- 상업적인 혐 기성 챔버에 튜브를 놓습니다.
- 튜브 캡을 풉니다 하 고 적어도 24 h에 대 한 챔버에 혐 기성 가스 혼합물의 equilibrate를 튜브에 분위기를 허용 합니다.
참고: 매체 있어야 챔버에 때까지 그것 사용 합니다. 튜브 플러시 프로세스를 속도 대 한 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여 무산 소 가스 혼합물과 적어도 3 배 H2, CO2, 그리고 N 구성 된 무산 소 가스로 가득 차2. - 모든 튜브 (10-15 분) 튜브 씰링과 챔버에 배치 하기 전에 위에서 설명한 대로 혐 기성 챔버에 배치 드 사용 하기 전에, 1.5-2 mL 전송 펫을 사용 하 여 혐 기성 가스 혼합물으로 그것을 플러시 또는 무산 소를 플러시는 피 펫 팁 가스 적어도 3 배.
- 혐 기성 챔버에 살 균 degassed 마이크로 원심 관에 매체의 100 µ L을 제거 하 고 산소 프로브를 사용 하 여 챔버 내에 용 존된 산소에 대 한 테스트.
참고: 산소 전극은 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 사전 당 보정 됩니다. 제대로 degassed equilibrated 혐 기성 가스 혼합 미디어의 수치는 0입니다.
주의: 수치는 산소의 0.3 ppm 이상, 계속 equilibrate 매체에 더 많은 시간 필요 이므로 혐 기성 챔버에 미디어를 품 어.
2. 무산 소 재배 다양 한 포유류 세포 라인의
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지정 된 날-1
- T150 플라스 크에 세 24-잘 접시 (80% 합류)에 대 한 세포의 충분 한 번호를 제공 하는 무산 소 및 normoxic 문화 컨트롤에 대 한 90% 합류 (37 ° C, 5% CO2) 세포를 성장.
참고:이 연구를 위해 헬러 229과 Vero 세포 사용 되었다. 이 프로토콜은 또한 테스트 하 고 성장 및 7 다른 셀 라인25의 유지 보수에 대 한 성공을 증명 했다. - 포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 HBSS의 10 mL와 함께 그것을 씻어.
- 5 mL의 트립 신 매체를 바꿉니다. 셀은 시각적으로 플라스틱에서 분리 될 때까지 플라스 크를 교 반 하십시오. 트립 신의 대부분 발음 다음 꺼내 부착 세포를 플라스 크를 누릅니다. 높은 포도 DMEM의 10-15 mL을 추가 (4.5 g/L의 포도 당, L-글루타민, 10%의 110 mg/L FBS, gentamicin의 50 µ g/mL) 비활성화는 트립 신을.
- 모든 세포 덩어리는 중단 될 때까지 25 mL 피 펫을 사용 하 여 셀 triturate
- 셀을 계산 하 고 표준 hemocytometer 고 trypan blue 염료 제외 방법 또는 자동된에 해당 하는 사용 하 여 생존을 결정 합니다.
- 105 셀/mL x 2.24의 셀 밀도를 위에서 언급 한 대로 높은 포도 당 DMEM 셀을 일시 중단 합니다.
- 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 (105 셀/잘 x 2.24; 80% 합류). 무산 소 문화와 다른 제어 normoxic 문화에 대 한 종자 1 접시.
- 24 h에 대 한 normoxic 조건 (5% CO2) 37 ° C에서 세포를 품 어.
참고: 셀 다양 한 잘 크기의 접시에 도금 될 수 있다. 그러나, 플라스 크에서 무산 소 성장에 대 한 셀을 시드 위험을 실행 산소의 소개의 시스템으로, 치료 대기 가스를 플러시 완전히 행사 하지 않는 한.
- T150 플라스 크에 세 24-잘 접시 (80% 합류)에 대 한 세포의 충분 한 번호를 제공 하는 무산 소 및 normoxic 문화 컨트롤에 대 한 90% 합류 (37 ° C, 5% CO2) 세포를 성장.
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지정된 일 0
- Normoxic 외피의 24 h 후 혐 기성 챔버 (상업 혐 기성 챔버;에 무산 소 성장에 대 한 번호판을 배치 그림 1)입니다.
- 즉시 항생제 무료 드 기름된 PS 74656 매체는 혐 기성 챔버를 24 h에 대 한 acclimated 되었습니다 매체를 변경 합니다. 젖은 수건으로 컨테이너에 접시를 놓고 느슨하게 수 분을 유지 하기 위해 그것을 닫습니다.
참고: normoxic 성장 위한 접시는 동일 하 게 모든 치료 대기 조건 하에서 행해진다 예외 처리 됩니다.
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지정된 일 1
- 혐 기성 배양의 1 일 10% H2, 10%의 CO2, 그리고 80% N2의 표준 혐 기성 가스 혼합물을 포함 하는 상업 혐 기성 챔버에 외피의 24 시간 후 시작 합니다.
- 다양 한 기간에 대 한 셀을 품 어.
- 시간이 지남에 따라 색 변경에 대 한 혐 기성 매체를 모니터링 합니다.
참고: 마젠타 레드-오렌지에서 색상 변화 신호 매체를 변경 하는 시간. 이 발생 2 주까지 걸릴 수 있습니다. 노랑 빨강 주황색에서 매체에 색상 변화 세균 오염 물질의 존재를 나타냅니다. - 매체 마젠타 레드에서 변경 때 포부에 의해 runagate 셀을 제거 합니다.
- 장소 degassed 혐 기성 가스에서 runagate 셀 aspirated 보냈다 미디어 equilibrated microfuge 관, 인감, 안전 하 고 그들 (326 gx; 10 분 동안 실내 온도에) 원심 튜브 닫습니다. 즉시 우물에 있는 발음된 미디어를 바꿉니다 새로운 degassed PS 74656 매체의 1 mL.
- 그것을 열기 전에 혐 기성 챔버에 수송과 셀 microfuge 관을 넣습니다. 보낸된 중간 발음 하 고 신선한 degassed PS 74656 매체 microfuge 관에 1 ml의 총 볼륨을 바꿉니다.
- 튜브에서 24-잘 조직 문화 접시에 잘 셀을 반환 합니다.
3. Anaerobically 배양된 세포의 현미경에 의해 Phenotypic 세포 분화의 평가
-
혐 기성 챔버에 접시 혐 기성 가스 혼합물으로 플러시 resealable 상자에 놓고 상자를 닫습니다.
참고: 상자 습기를 제공 하 고 밖으로 건조에서 접시를 방지 젖은 종이 타월을 포함 해야 합니다. 이후 그들은 얇은 현미경 검사 법, 샌드위치 가방 최고 작동.- 현미경 세포 관찰, 완전히 가방을 봉인 하 고 상공에서 그것을 제거 합니다.
- 조심 스럽게 접시 위에 비닐 봉투를 스트레칭, 카메라 부착으로 거꾸로 단계 대조 현미경을 사용 하 여 셀을 검토 하 고 다양 한 배율에서 photomicrographs를 받아.
- 실로, 봉인된 봉투에 접시를 반환 하 고는 인큐베이션 단계 2.3.3에서에서 설명한 대로 계속.
- 별도로 runagate 세포 현 탁 액에 있는 분석, 2.3.5 단계에서 설명 하는 단계를 따릅니다.
참고: 이러한 셀 에어로빅 테스트에 사용할 수 있습니다 또는이 특정 인구의 테스트에 대 한 혐 기성 챔버에 반환 될 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 강점 장 수 및 여러 셀 라인의 성장 지원 및 깊은 변경 및 셀 형태학25에서 분기는 인식입니다. 이 연구의 가장 중요 한 요소는 전송 및 엄격한 anaerobiosis 아래 세포의 유지 보수입니다. 이 혐 기성 챔버를 프로토콜 (그림 1)을 극대화 하기 위해 조직과 셀 현미경 또는 다른 테스트에 대 한 제거 하는 보증 된 환경에서 보관 해야 합니다. 날짜 하려면, 무산 소 생존의 범위 15-17 일 불멸의 암에 대 한 셀 라인 이었고 최대 17 일 변형 셀 라인 (무산 소 성장에 대 한 검사는 9 셀 라인). 실행 가능한 세포의 수준 무산 소 조건이 셀이 이동 되 면 전에 그들이 안정 90%, 최대 10% 이상 떨어졌다. 모든 셀 라인 듀얼 고기 되 돌 (곁에 runagate) 시간이 지남에 따라 증가 하는 정지에 셀의 비율으로. 몇 주 연장된 보육, 후에 일부 곁된 세포, 남아 하지만 둥근된 runagate 형태 (그림 2)에 세포의 대부분은. 보고,이 runagate 세포는 실용적이 고 그들의 세포 주기를 통해 진행. 변수를 조정 해야 할 수 있습니다 포도 당 수준 및 아 질산염 농도 포함 하는 것을 주목 한다. 즉, 60 개 이상의 다른 미디어 공식 normoxic와 무산 소 인큐베이션을 지원 하기 위해 그들의 능력에 대 한 테스트에서 PS 74656 매체 생존 및 테스트 하는 거의 모든 셀 라인의 복제를 지 원하는 수 있었습니다.
필수적인 관찰 두 가지 고기, 곁에 runagate (그림 2)으로 테스트 셀에 무산 소 세포의 분화 했다. Normoxic 단층 셀에 유사한, 곁된 세포 조직 문화 플라스틱에 붙어 있었다. 그러나, 첨부 파일 약한, trypsinize 또는 normoxic 조건 하에서 발생 한 첨부 파일 보다 된다고 하 여 꺼내 쉽게 했다. 또한, 세포 형태학 더 많은 스핀 들 (수지상) 확장26작은 되었다. 관찰 하는 두 번째 세포 morphotype 세포 현 탁 액 (즉, runagate 세포)에 있었다. 이 세포는 저절로 작은 셀 크기와 세포질 덜 반올림 했다 조직 문화 취급 플라스틱의 부동성 단일 셀 정지도 변환. 그들은 일반적으로 효소 적응을 필요로, 성장 집계, 컨테이너 조직 문화 치료 비를 요구 하 고 그들의 normoxic 대응27보다 큰 고아 한 서 스 펜 션의 문화 세포에서 달랐다. 시간이 지남에, 무산 소 세포 인구에에서 runagate 세포의 주로 곁된 단층에서 변화 관찰 수 있었다. 이 셀에에서 가능한 되었고 복제; 따라서, 관리 행사 했다는 상쾌한을 제거 해야 합니다. 또한, 메모의 매체 전체 혐 기성 인큐베이션 기간 동안 변경 요구 하지 않았다 이다. Normoxic 제어, 달리 무산 소 외피 아래 중간 pH 지시자는 또한 변경 되지 않은 상태로 (즉, 빨간색 남아 있었다). 조사 하고자 한다 runagate 세포를 수확 하거나 매체 변경, 셀 혐 기성 챔버 내에서 밀접 하 게 혐 기성 가스 플러시 마이크로 원심 관 폐쇄는 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 곁된 세포의 세척 하는 셀에 대 한 어떤 산소 노출을 제거 하 상공에 또한 절차를 수행 합니다.
장기 재배에 대 한 최종 세포 생존 능력, 큰 범위, 사용 되는 셀과 합류는 우물 또는 플라스 크 했다 처음 시드 (그림 3 및 4)에 의존 했다. 즉, 좋은 출발점은 80%, 최적의 성장의 가장 큰 기회를 했다. 또한, 셀 라인-종속 손실의 10% ~ 60% 생존 능력의 초기 2-4 일 이내에 발생할 수 있습니다. 그러나,이 실험의 성능 동안 나머지 세포 주기를 통해 순환 하 고28를 복제. 세포 배양의 장 수에 시드 합류 효과 그림 3 과 4에서 볼 수 있습니다. 헬러 229과 Vero 세포는 40%, 60% 및 80% 초기 합류의 24-잘 접시에 시드 했다 (100% 합류 = 105 셀/잘 x 2.8) 다음 산소의 부재에서 17 일 대 한 인 큐베이 팅 하 고. 헬러 229 셀 무산 소 성장은 80%의 초기 시드 합류에 최적화 되었다. 대조적으로, 최적의 합류 시드 Vero 세포 60% 이었다. 이 처음 사용 셀 라인에 시드 밀도 최적화 하는 필요를 보여 줍니다.
그림 1 : 포유류 세포의 문화에 대 한 혐 기성 챔버 설정의 모델. 조직 문화 접시, 멸 균 전송 pipets, 생물 학적 가방, 드 기름된 미디어, 튜브는 삭제의 미디어 또는 다른 액체, resealable 봉투 현미경 플레이트의 전송에 대 한 유지 하면서에 대 한 필요 최소한의 자료 포함 혐 기성 조건입니다.
그림 2: 무산 소 HeLa 세포 형태 론 적 차별화. (A)이이 패널 표시 단계 대조 현미경 normoxic 헬러 셀 컨트롤의 4 일 후 접종, 20 X 확대와 함께. (B)이 이 패널 표시 무산 소 HeLa 세포 17 일 후 접종 (는 불변으로 하루 1 PS 74656 매체, 80% 시드 합류, 그리고 20 배 확대). (C)이이 패널 24 잘 무산 소 접시 포함 된 봉인된 된 비닐 봉투의 내부에 물방울의 현미경 아티팩트를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Normoxic 헬러 229 가능한 무산 소의 세포 게시물 17 일 보육. 이 패널은 normoxic 컨트롤에 비해 PS 74656 매체에서 헬러 229 세포 생존 능력에 시드 밀도의 효과 보여줍니다. 결과 평균 ± SEM.로 표시 됩니다.
그림 4: Normoxic 베로 가능한 무산 소의 비율 17 일 후 부 화 세포. 이 패널은 normoxic 컨트롤에 비해 PS 74656 매체에 Vero 세포 생존 능력에 시드 밀도의 효과 보여줍니다. 결과 평균 ± SEM.로 표시 됩니다.
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Discussion
이 메서드는 산소의 부재에서 시간의 연장된 기간에 대 한 교양 했다 처음 포유류 세포를 나타냅니다. 현재 관측을 바탕으로는 무산 소 성장 기능을 통해 비 발효 통로 나타납니다 포유류 세포 라인28, 사이 보편적인 혐 기성 성장 형 분기에서 결과. 이 테스트는 모든 셀 라인에 대 한 관찰 되었다. 혐 기성 경작 셀의 비율을 증가 되었다 둥근, 서 스 펜 션 같은 인구 개발과 복제할 수 있었다. 2 차 전지 타입 기판;에 연결 된 남아 그러나, 세포 형태학 스핀 들 (수지상) 모양에 복귀 했다. 이러한 연구 결과 분석 및 무산 소 조직 배양 재배에 관하여 관측에서 일반적인 오류를 지적 한다. 그것은 일반적으로 그 때 normoxic 조건 (5% CO2)에서 성장 하는 포유류 세포 모아 분리, 그들은 죽어가 고 있다 허용. 반대로 세포 성장, 어떤 경우에, 산소의 부재에서 반올림 해야 하는 셀에 대 한 정확 하 게 표시 되며 분리, 단순히 형태학 상으로 분기 셀 부분 모집단.
무산 소 성장 조건의 최적화는 종속 셀 라인 이다. 중간 PS-74656의 전반적인 지원 모든 셀의 성장 라인 normoxic와 MDA-MB-231를 제외 하 고 무산 소 성장 조건에서 유 방 암 세포 라인을 선호 하는 아 질산염의 부재에서 성장. 격려 하 여 관찰을 잘 당 세포의 98% 죽는, 함께 나머지 복제, 매우 적응 시킨된 인구 결과로 이다. 몇 가지 셀만은 직접 현미경으로 관찰 하는 경우에 문화를 유지 하는 중요 한 작업이입니다. 따라서, 신경 분리 된 세포 죽음, trypan blue 염료 배제 하거나 대체 세포 생존 탐지 방법 되도록 행사 해야 합니다. 그것은 그 같은 셀 숫자에 큰 감소로, 충분 한 우물 해야 합니다 시드할 수 후속 실험에 대 한 적절 한 요약 셀 번호를 주목 해야한다. 실행 가능한 세포의 예상된 손실 이며 모두 셀 선 시드 합류 의존; 따라서, 최적의 셀 번호, 시간이 지남에, 실험적으로 결정 되어야 하 고 다른 셀 라인 결과에서 추정 될 수 없습니다. 즉, 좋은 출발점은 최적의 성장의 가장 큰 기회는 80% 합류. 그것은 아무리 어떻게 간단한 절차의 혐 기성 단계 동안 산소에 어떤 노출 때문에 보고 된 자발적인 셀룰러 HIF 1결과 손상 됩니다 지적 해야 합니다-알파 응답11,12.
이 절차에 대 한 가장 중요 한 단계는 매체, 튜브, 그리고 모든 다른 기구와 재료 사용의 드 가스의. 심지어 매우 낮은 수준의 산소의 소개는 혐 기성 호흡에는 발효 물질 대사에서 전환을 막을 수 있습니다. 또는, 어떤 실험 결과 저 산소 증, 하지 anoxia의 측정에는 발효 대사를 연장할 수 그것. 세포 독성 화학요법 활동 측정 하 소설이 절차를 사용 하 여 단단한 종양의 치료에서 약물 실패를 설명 하기 위해 도울 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 지원에 대 한 연구의 중서부 대학 사무실 및 후원 프로그램을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
