Summary
Здесь мы опишем новый метод, позволяющий анаэробных долгосрочные культивирование установленных клеточных линий. Максимальная выживания время, которая была испытана — 17 дней. Этот метод подходит для тестирования цитотоксических агентов и изучения физиологии anoxically репликации клеток.
Abstract
Наиболее слизистой поверхности вместе с среднее положение в опухоли и ниш стволовых клеток являются географические области тела, которые аноксии. Предыдущие исследования показывают, что инкубации в нормоксические (5% CO2 в воздухе) или гипоксических условий (низкая кислорода) следуют результаты анаэробной инкубации (отсутствие свободного кислорода) в ограниченных жизнеспособности (2-3 дней). Была разработана Роман методология, позволяющая культивирования аноксии клеток (для по крайней мере 17 дней; максимальное время испытания). Наиболее важным аспектом этой методологии заключается в обеспечении, что нет кислорода вводится в систему. Это получается путем дегазации, средств массовой информации и путем промывки трубок и блюда, колбы, пипетки с анаэробной газовой смеси (H2, CO2, N2) следуют разрешительные материалы, чтобы сбалансировать в анаэробных (без кислорода) среде Перед использованием. Дополнительный уход должны осуществляться при приобретении микрофотографии чтобы убедиться, что получены микроскопии не содержат артефакты. В отсутствие кислорода морфологию клеток значительно изменены. Два отдельных Морфотипы отмечены для всех анаэробно выращенные клетки. Возможность расти и поддерживать mammalian клеток в отсутствие кислорода может применяться для анализа физиологии клетки, полимикробная взаимодействий и характеристика биосинтетических пути для развития Роман рака наркотиков.
Introduction
Клетки из солидных опухолей, ниши стволовых клеток и те подкладки слизистых поверхностей существуют в средах, которые испытывают снижение кислорода, включая гипоксия1,2,3,4. В нормальной физиологической государствах оксигенации меняется за гипоксии аноксии (полное отсутствие кислорода)5,6. Осознание что атмосферного кислорода отрицательно влияет на репликацию mammalian клетки, и что рост в пробирке клеток могут быть оптимизированы в условиях обедненного кислородом было сообщено в начале 1970-х годов. Рихтер и др. 7 показали, что 1-3% кислорода (гипоксии) повышение эффективности покрытия по сравнению с атмосферным кислородом (20%). Диплоидных клеток человека жизни также распространяется в условиях гипоксических культуры8.
В естественных условиях, гипоксических условий возникают, когда магазины кислорода обедненного (например, во время интенсивных физических упражнений), котором производства АТФ включен в скелетных мышцах от аэробного дыхания для ферментации (анаэробное дыхание) с конечный продукт молочная кислота9. Патологически, в раковой опухоли, интерьер опухоли масса гипоксических для анаэробных из-за плохой васкуляризации10. Эффект ограниченной перфузии на опухоль интерьеры независимо подтверждены опухоли интерьеры колонизирована облигатных анаэробов1. Механически, выживание клетки тумора в гипоксии считается исключительно зависит от экспрессии гена гипоксия индуцибельной фактор 1-альфа (HIF1-альфа), который является первоначальный спонтанной реакцией к гипоксии4,11 , 12. HIF1-альфа в гипоксических условиях индуцируется белков теплового шока, которые связывают HIF1-альфа-промоутер и upregulate транскрипции гена12. Предполагается, что эти белки теплового шока помощи в индукции различных фенотипов, видели в гипоксических микроокружения опухоли. Эти фенотипы exhibit выражение увеличение глюкозы транспортеров клеточной мембраны и интенсивность гликолиза (Варбург эффект)13. Результатом является переход от митохондриальной окислительного фосфорилирования в кислоты брожения.
Аноксии выживания может также использовать альтернативы глюкозы для поддержки выживания явление14,15. Наилучшим учился млекопитающих примером является землекоп, которые могут выжить в течение почти 20 минут без кислорода через фруктоза driven гликолитических ферментации путь14. Альтернативные адаптации происходит в некоторых рыб (например, карп [караси sp.], которые могут выжить в течение значительно дольше периоды времени, с использованием гликолиз с этанолом как субпродукт терминала)15. В обоих случаях ферментация диски метаболизма, позволяя выживания в отсутствие кислорода. Текущий гипотеза для анаэробных выживание является то, что так долго как HIF1-альфа активируется при гипоксии, митохондриальное дыхание, без необходимости для кислорода, происходит в анаэробных условиях16. Кроме того это постулируется, что использование ферментативным путь аноксии/гипоксии выживания улучшает выживания опухоли, поскольку клетки избежать Оксидативный стресс, который может оказаться пагубным для выживания клетки17. Этот постулат поддерживается недавнего исследования, которое показывает, что в кардиомиоцитов, гипоксия уменьшает окислительного стресса на клетки опухоли17.
На сегодняшний день, основополагающий характер ферментативным пути для выживания аноксии mammalian клетки было укоренилось в литературе, должным образом, в значительной степени, неспособность культуры mammalian клеток в условиях полного отсутствия кислорода для более чем 3 дней. Однако альтернативой гликолиз для анаэробных выживания происходит в бактерии. В некоторых бактерий азот или сульфат (среди других соединений) может служить акцепторами терминала электронов для системы цитохрома оксидазы в отсутствие кислорода18. Хотя параллельно бактерий и эукариот эволюции момента отхода от последнего общего предка универсальный, подсчитано, что митохондрии обеспечение энергии для клеток 1.542 миллионов лет до оксигенации океанов19 . Так как исследователи показали, что изолированных митохондриях может производить АТФ в отсутствие кислорода, с нитрита как терминал электрон акцептора, это разумно предположить, что клетки могут функционировать для периодов времени, более чем 3 дней в отсутствие кислорода 20 , 21 , 22 , 23. по методике, описанной в этом исследовании есть утилита для роста анаэробных mammalian клетки многочисленных клеточных линий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовьте СМИ анаэробные культуры различных линий клеток млекопитающих
-
Сделайте полный PS-74656 средство для анаэробных клетки культуры25.
- Стоковый раствор стерильной Нитритная (5 М; 100 x), растворяя 17.25 g нитрита в 50 мл дистиллированной деионизированной воды, а затем фильтр следует стерилизовать его.
- Добавить 0,5 мл Стоковый раствор нитрита в 50 мл низкий глюкозы DMEM (1 г/Л глюкозы) с 110 мг/Л L-глютамином, 584 мг/Л пируват натрия, и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС; инактивированная тепла).
Примечание: Использование FBS концентрации более чем на 10% являются токсичными. Следует отметить одна линия клетки рака испытания имели низкий допуск для СМИ с нитритов (MDA-MB-231, линии клеток рака молочной железы) и, таким образом, был выращен в отсутствие нитрита. Кроме того хотя PS-74656 среднего роста всех клеточных линий, которые были протестированы (n = 9), некоторые клеточные линии (например, клеток Веро) выставлены более высокие концентрации клеток и более высокой жизнеспособности в PS-74656 с высоким глюкозы (4,5 г/Л) DMEM 25. - Место 20 мл средства в стерильных 50 мл конические пластиковых пробирок. Не завинчивайте крышку; Она должна быть свободной.
- Де газовой среды, поставив трубку в вакуумной колпаком на примерно под углом 45 °, чтобы максимизировать средней площади поверхности.
- Применение вакуума с помощью вакуумного насоса, или его эквивалент, при комнатной температуре. Поддерживать вакуум до тех пор, пока пузырьки больше не соблюдаются (24-48 ч).
- Снять трубку из кувшина и немедленно закройте крышку, герметизации труб для сведения к минимуму введение воздуха в средних.
- Место труб в зале коммерческого анаэробных.
- Ослабьте крышку трубки и позволяют атмосферу в трубку, чтобы сбалансировать с этим анаэробных газовой смеси в камере по крайней мере 24 часа.
Примечание: Носитель должен оставаться в камере до тех пор, пока он используется. Для ускорения процесса, скрытой трубки по крайней мере 3 x с анаэробной газовой смеси с помощью пипетки стерильные передачи заполнены с анаэробной газ, который состоит из H2, CO2и N2. - Дега все трубы (10-15 мин) помещается в анаэробных камеру, как описано выше до герметизации трубки и размещение в камере. Перед использованием промойте в анаэробных газовой смеси с помощью пипетки передачи 1,5 – 2 мл или пипетки советы, которые были сброшены с анаэробной газа по крайней мере 3 x.
- Находясь в анаэробные камеры, удалить 100 мкл средне-стерильные дегазацию микро пластиковых пробирок и проверить его на растворенного кислорода с помощью датчика кислорода в камере.
Примечание: Электрод кислорода откалиброван на производителя протокол до использования. Чтений должным образом дегазации и уравновешенной анаэробных газовой смеси СМИ равны 0.
Предупреждение: Если показания находятся выше 0,3 ppm кислорода, по-прежнему инкубировать СМИ в анаэробные камеры, поскольку требуется больше времени, чтобы сбалансировать среды.
2. аноксии выращивания различных линий клеток млекопитающих
-
Назначенный день -1
- Рост клеток (37 ° C, 5% CO2) в колбе T150 до 90% слияния для анаэробных и нормоксические культуры управления предоставить достаточное количество клеток для трех 24-ну пластин (80% слияния).
Примечание: Для этого исследования, были использованы клетки HeLa 229 и Vero. Этот протокол также проверены и оказались успешными для роста и поддержания семи других клеток линии25. - Удалите носитель из колбы стремлением и мыть его с 10 мл HBSS.
- Замените носитель с 5 мл трипсина. Агитируйте колбу до тех пор, пока клетки визуально отделить от пластика. Аспирационная большинство трипсина, а затем коснитесь колбу выбить адэрентных клеток. Добавить 10-15 мл высокой глюкозы DMEM (4,5 г/Л глюкозы, 110 мг/Л Л-глутамина, 10% FBS, 50 мкг/мл гентамицина) для инактивации трипсина.
- Нарезанных клетки с помощью пипетки 25 мл до тех пор, пока все кусты клетки разрушаются.
- Подсчитать количество ячеек и определить жизнеспособность, используя стандартные Горяева и метод исключения Трипановый синий краситель или автоматизированных эквивалент.
- Приостановите клетки в высокой глюкозы DMEM, как упоминалось выше плотность клеток 2.24 x 105 клеток/мл.
- Добавить 1 мл суспензии клеток к добрам плиты 24-ну тканевые культуры (2,24 х 105 клеток/хорошо; 80% слияния). Семян 1 пластина для анаэробных культуры и другой для управления нормоксические культуры.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в нормоксические условиях (5% CO2) за 24 ч.
Примечание: Клетки можно покрытием в различных хорошо размера пластины. Однако заполнение ячейки для анаэробных роста в колбах рискует введения кислорода в систему, если это осторожно, чтобы полностью избавиться от атмосферного газа.
- Рост клеток (37 ° C, 5% CO2) в колбе T150 до 90% слияния для анаэробных и нормоксические культуры управления предоставить достаточное количество клеток для трех 24-ну пластин (80% слияния).
-
Назначенный день 0
- После 24 ч инкубации нормоксические Поместите пластины для анаэробных роста в анаэробных камеру (коммерческие анаэробные камеры; Рисунок 1).
- Немедленно измените носитель к антибиотикам бесплатно де газированные PS-74656 среда, которая была приспособиться за 24 ч до анаэробные камеры. Установите пластину в контейнер с влажным полотенцем и слабо закройте его для сохранения влаги.
Примечание: Пластины для роста нормоксические обрабатываются одинаково за исключением, что все процедуры проводятся в атмосферных условиях.
-
Назначенный день 1
- 1 день анаэробной инкубации начинается через 24 ч инкубации в коммерческих анаэробные камеры, которая содержит стандартный анаэробных газовой смеси 10% H2, 10% CO2, и 80% N2.
- Инкубируйте клетки для различных периодов времени.
- Контролировать анаэробной среды для изменения цвета со временем.
Примечание: Цвет переход от красно оранжевый Маджента сигналов время изменить средство. Это может занять до 2 недель, чтобы произойти. Цветового сдвига в среде от красно оранжевый желтый указывает на наличие бактериального загрязнения. - Когда носитель изменяется от красного до пурпурного, удалите runagate клетки путем аспирации.
- Месте аспирированных отработанного СМИ с runagate клетками в дегазации и анаэробных газах достижение равновесного уровня отцентрифугировать трубы, закройте трубы а убедившись, что печать является безопасным и затем центрифуга их (326 x g; при комнатной температуре в течение 10 мин). Немедленно замените аспирированных СМИ в колодец 1 мл новой дегазацию PS-74656 среды.
- Место отцентрифугировать трубка с гранулированных клетки в анаэробные камеры до его открытия. Аспирационная отработанного среднего и заменить его с свежими дегазацию PS-74656 средних и общим объемом 1 мл в трубке отцентрифугировать.
- Возвращение клетки из трубки в скважину на пластину 24-ну тканевые культуры.
3. Оценка фенотипические клеточная дифференцировка по микроскопии анаэробно культивируемых клеток
-
Находясь в анаэробные камеры, установите пластину закрывающейся упоенный анаэробных газовой смеси и закрыть окно.
Примечание: Поле должно содержать влажной салфеткой для влаги и предотвращения пластину от высыхания. Для микроскопии пакеты для бутербродов работают лучше всего, поскольку они тонкие.- Полностью соблюдать клетки под микроскопом, уплотнение мешок и удалить его из камеры.
- Тщательно растягивать пластину пластиковый мешок, изучить клетки с помощью инвертированного микроскопа контраст фазы с вложением камеры и занять микрофотографиями при различных увеличениях.
- Возвращение пластину в запечатанном мешке в палату и продолжать инкубацию, как описано в шаге 2.3.3.
- Чтобы отдельно анализировать runagate клетки, которые находятся во взвешенном состоянии, выполните шаги, описанные в шаге 2.3.5.
Примечание: Эти клетки затем может использоваться для тестирования аэробных или могут быть возвращены в анаэробные камеры для тестирования этой конкретной группы населения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сила настоящего Протокола заключается в своей поддержке долголетия и роста несколько клеточных линий и признания, что существуют глубокие изменения и различия в морфологии клеток25. Наиболее важным элементом данного исследования является передача и поддержания клеток под строгим anaerobiosis. Это требует анаэробные камеры организована максимально протокол (рис. 1) и заверения в том, что клетки удалены для микроскопии или другие тестирования хранятся в герметичных условиях. На сегодняшний день спектр анаэробных выживания было 15 – 17 дней для бессмертных рак клеточных линий и до 17 дней для преобразования клеточных линий (девять клеточных линий показан аноксии роста). Уровни жизнеспособных клеток, после того, как эти клетки были перемещены в анаэробных условиях, сократилась по меньшей мере 10%, максимум 90%, прежде чем они стабилизировалась. Все линии клетки reverted к двойной фенотипов (привязал и runagate) с долей клеток в суспензии, увеличение со временем. Даже после длительного инкубации несколько недель там остались некоторые привязанный клетки, но большинство из клетки были в морфологии округлые runagate (рис. 2). Как сообщалось, эти клетки runagate, жизнеспособных и продолжалась через их клеточного цикла. Следует отметить, что переменные, которые могут быть скорректированы включают уровень глюкозы и нитритов. Что сказал, из более чем 60 различных средств массовой информации формулировок, которые были протестированы на их способность поддерживать нормоксические и анаэробной инкубации, PS-74656 средний смогла поддержать выживание и репликация почти всех клеточных линий испытания.
Основные наблюдения был дифференциация аноксии клеток, независимо от того, клетки, тестирование, на два отдельных фенотипов, привязал и runagate (рис. 2). Аналогично нормоксические монослое клеток, привязанный клетки были прикреплены к пластической культуры ткани. Однако вложение был слабее, легче trypsinize или выбить соскабливания, чем вложение, которое произошло в нормоксические условиях. Кроме того морфологию клеток был меньше с более расширения шпинделя (дендритных)26. Второй сотовой морфотипа наблюдается были клеток в суспензии (то есть, runagate клетки). Эти клетки спонтанно преобразован в свободно плавающего одну ячейку подвески присутствии культуры ткани лечение пластика, которые округлены с меньшим размером ячейки и менее цитоплазмой. Они отличаются от классических подвеска культуры клеток, которые обычно требуют ферментативные адаптации, растут в агрегатах, требуют не лечить культуры ткани контейнеров и больше, чем их коллеги нормоксические27. Со временем анаэробной клеточных популяций можно наблюдать переход от преимущественно привязанный монослоя к, runagate клеток в суспензии. Эти клетки в подвески были жизнеспособными и тиражирование; Таким образом, уход должен был осуществляться следует удалить супернатант. Кроме того отметить, что носитель не требует изменения над всей анаэробных инкубационный период. Средний pH индикатор под анаэробной инкубации, в отличие от его нормоксические управления, был также без изменений (то есть, по-прежнему красный). Если следователь пожелает урожая runagate клеток, или изменить носитель, клетки можно получить с помощью анаэробного газ покраснел микро-пробирок которые закрыты плотно в пределах анаэробные камеры. Для ячейки, мытье привязанный клеток процедура должна также выполнена в камере для устранения любого воздействия кислорода.
Жизнеспособность окончательный клеток для долгосрочной выращивания был в значительной степени, зависит от ячейки используется и слияния, к которому скважин или колбу были первоначально в сеяный (рисунки 3 и 4). Что сказал, является хорошей отправной точкой является 80%, который был величайший шанс оптимального роста. Кроме того может произойти потеря линии зависимой ячейки от 10% до 60% жизнеспособности в первые дни 2 – 4. Однако во время выполнения этого эксперимента, остальные ячейки циклическое через клеточного цикла и реплицируются28. Высева эффект слияния на долговечность культивирования клеток можно увидеть в рисунки 3 и 4. Клетки HeLa 229 и Веро были посеяны в 24-ну пластины до 40%, 60% и 80% от первоначального слияния (100% слияния = 2.8 x 105 клеток/хорошо) и затем инкубируют в отсутствие кислорода в течение 17 дней. Бескислородный рост клеток HeLa 229 был оптимизирован в первоначального посева слияния 80%. В отличие от оптимального заполнения слияния клеток Vero составляла 60%. Это свидетельствует о необходимости сначала оптимизировать посева плотность зависит от линии клеток.
Рисунок 1 : Модель анаэробные камеры настройки для культуры mammalian клеток. Минимальные необходимые материалы включают в себя культуры ткани пластины, стерильные передачи пипец, биологической сумки, де газированные СМИ, трубка для отбрасывания СМИ или других жидкостей и закрывающейся Сумки для передачи плит микроскопа при сохранении анаэробные условия.
Рисунок 2: Аноксии НеЬа клетки морфологической дифференцировки. (A) Эта группа показывает фазово-контрастной микроскопии клетки HeLa контроля нормоксические 4 дня после прививки, с 20 кратным увеличением. (B) эта группа показывает аноксии клетки HeLa 17 дней после прививки (с неизменным от PS-74656 средний день 1, 80% семенами слияния и 20 кратном). (C) Эта группа показывает микроскопии артефакты капель воды на интерьер запечатанный пластиковый пакет с 24-ну аноксии пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Соотношение аноксии нормоксические HeLa 229 жизнеспособных клеток пост-17 дней инкубации. Эта панель показывает эффект густоты посева на жизнеспособность клеток HeLa 229 в PS-74656 среде по сравнению с нормоксические управления. Результаты представлены как среднее ± SEM.
Рисунок 4: Соотношение аноксии нормоксические Vero жизнеспособных клеток через 17 дней после инкубации. Эта панель показывает эффект густоты посева на жизнеспособность клеток Vero в PS-74656 среде по сравнению с нормоксические управления. Результаты представлены как среднее ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод представляет впервые mammalian клеток, которые были культивировали для длительных периодов времени в отсутствие кислорода. Основываясь на текущих наблюдениях, аноксии роста потенциала через не ферментативную путь представляется универсальный среди mammalian клеток линий28, где анаэробных рост привели к фенотипу расхождения. Это было отмечено для всех клеточных линий испытания. С анаэробного культивирования увеличения доли клеток стал округлые, разработали подвеска как населения и смогли воспроизвести. Тип средней ячейки оставались прилагаемый к подложке; Однако морфологию клеток reverted к шпинделя (дендритных) форме. Эти находки указывают, распространенная ошибка в анализ и замечания в отношении культивирования аноксии культуры ткани. Общепризнано, что когда клетки млекопитающих, выращиваемые в нормоксические условиях (5% CO2) круглый вверх и отсоедините, они умирают. Напротив, как представляется, будет правильным для клеток, выращиваемых в отсутствие кислорода, в этом случае, клетки, которые имеют округлые вверх и отсоединена, являются просто клеток морфологически различные субпопуляции.
Оптимизация условий роста анаэробных линия зависимые ячейки. Средний PS-74656 в целом поддерживает рост всех клеток линии в нормоксические и условиях аноксии роста, за исключением MDA-MB-231, линия клетки рака молочной железы, который предпочитает роста в отсутствие нитрита. Поощрения наблюдения является, что даже с 98% отмирания клеток в колодец, остальная реплицирует, что приводит к очень приспособлены населения. Критических действий заключается в поддержании культур, даже когда только несколько ячеек непосредственно наблюдаются при микроскопии. Таким образом необходимо проявлять осторожность для обеспечения, что отдельные клетки мертвы, либо путем Трипановый синий краситель исключения метод обнаружения жизнеспособность альтернативных клеток. Следует отметить, что с таким большим снижением числа клеток, достаточно скважин необходимо посеян адекватные ячейке номеров для последующих экспериментов. Ожидаемые потери жизнеспособных клеток является линия клетки и посева слияния зависимых; Таким образом число оптимальных клеток, со временем, должны быть определены экспериментально и не могут быть заимствованы из результатов с другими клеточных линий. Что сказал, является хорошей отправной точкой является 80% слияния, который имеет наибольшую вероятность оптимального роста. Необходимо отметить, что какого-либо воздействия кислорода во время анаэробного шаги процедуры, независимо от того, как краткий, поставит под угрозу результаты благодаря сообщил спонтанное сотовой HIF-1-альфа-ответ11,12.
Для выполнения этой процедуры наиболее важным этапом является де газообразования среды, трубы и все другие аппараты и используемых материалов. Введение даже при очень низких уровнях кислорода может остановить переход от брожения метаболизм анаэробного дыхания. Кроме того она может продлить ферментативным метаболизм так, что любые эксперименты приводят в измерении гипоксии, не гипоксия. Использование этого романа процедуры измерения цитотоксичности и химиотерапевтических деятельность может помочь объяснить наркотиков неудачи в лечении солидных опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Midwestern университета Управление по исследованиям и поддержке программ за их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
