Summary
在这里, 我们描述了一种新的方法, 使厌氧长期培养已建立的细胞系。测试的最大生存时间是17天。该方法适用于细胞毒性药物的检测和 anoxically 复制细胞的生理学研究。
Abstract
大多数黏膜表面连同中点在肿瘤和干细胞龛位是身体的地理区域缺氧。先前的研究表明, 在常氧 (5% CO2的空气) 或缺氧 (低氧水平) 条件下, 缺氧孵化 (缺乏自由氧) 的孵化导致生存能力有限 (2–3天)。开发了一种新的方法, 使缺氧细胞培养 (至少17天; 测试的最大时间)。这一方法最关键的方面是确保不将氧气引入系统。这是由介质的脱气, 并通过冲洗管, 盘子, 烧瓶和吸管与厌氧气体混合物 (H2, CO2, N2) 后, 允许材料平衡缺氧 (非氧气) 环境在使用之前。在获取显微照片时必须进行额外的护理, 以确保所获得的显微照片不包含工件。在缺乏氧气的情况下, 细胞形态明显改变。所有厌氧细胞都有两种截然不同的 morphotypes。在缺乏氧气的情况下, 培养和维持哺乳动物细胞的能力可以应用于细胞生理学、polymicrobial 相互作用的分析以及新型癌症药物开发的生物合成途径的表征。
Introduction
细胞从固体肿瘤, 干细胞的利基, 和那些衬里的粘膜表面存在的环境中, 有氧水平降低, 包括缺氧1,2,3,4。在正常的生理状态下, 氧合不同于缺氧的缺氧 (完全没有氧气)5,6。在二十世纪七十年代代初, 发现大气氧对哺乳动物细胞复制产生不利影响, 并且在耗尽的氧气条件下可以优化体外细胞生长。里氏等。7表明, 1–3% 氧水平 (缺氧) 提高电镀效率与大气氧 (20%)。在缺氧培养条件下, 人类双倍细胞寿命也在8。
在体内, 缺氧条件发生时, 氧储存耗尽 (例如, 在激烈的运动期间), 其中 ATP 生产从骨骼肌切换到有氧呼吸到发酵 (厌氧呼吸) 与乳酸的末端产品9。病理上, 在癌性肿瘤中, 肿瘤肿块的内部是缺氧的, 因为血管化10的不良。有限灌注对肿瘤内部的影响是独立的, 由强制厌氧1所殖民的肿瘤内部进行验证。机械化, 在缺氧的肿瘤细胞生存被认为完全依赖于缺氧诱导因子1α基因 (HIF1) 的表达, 这是最初自发反应缺氧4,11,12. HIF1在缺氧条件下诱发的热休克蛋白结合HIF1启动子和 upregulate 基因转录12。这些热休克蛋白被认为有助于诱导的各种表型在肿瘤缺氧微环境。这些表型表现了细胞膜葡萄糖转运体的增加的表示和糖酵解的率 (华宝效应)13。其结果是从线粒体氧化磷酸化转变为乳酸发酵。
缺氧生存也可以利用替代葡萄糖来支持生存现象14,15。最好的研究哺乳动物的例子是鼹鼠, 它可以生存近20分钟没有氧气通过果糖驱动的酵发酵途径14。另一种适应发生在某些鱼类 (如鲤鱼 (鲫鱼 ), 它可以存活明显较长的时间, 使用糖酵解与乙醇作为终端副产品)15。在这两种情况下, 发酵驱动新陈代谢使生存在缺乏氧气。目前的缺氧生存假说是, 只要HIF1在缺氧期间激活, 线粒体呼吸, 不需要氧气, 发生在厌氧条件下16。此外, 据推测, 使用发酵途径的缺氧/缺氧生存, 提高肿瘤生存, 因为细胞避免氧化应激, 可能证明是有害的细胞生存17。最近的一项研究表明, 在心肌细胞中, 缺氧会降低肿瘤细胞17的氧化应激, 这一假说得到了证实。
到目前为止, 缺氧哺乳动物细胞生存的发酵通路的本质是在文献中根深蒂固的, 这在很大程度上是由于无法在完全没有氧气的情况下培养哺乳动物细胞3天以上。然而, 在细菌中, 厌氧生存的一种替代糖酵解。在某些细菌中, 氮或硫酸盐 (在其他化合物中) 可以作为细胞色素氧化酶系统的终端电子受体, 在没有氧18的情况下。虽然细菌和真核进化发生在平行的, 因为从最后一个普遍的共同祖先, 估计线粒体是提供能量的细胞在154.2万年前的氧合的海洋19.由于研究人员已经表明, 孤立的线粒体可以在没有氧气的情况下产生 ATP, 以亚硝酸盐作为终端电子受体, 假设细胞在没有氧气的情况下可以在3天的时间内正常工作。20,21,22,23. 本研究所述的方法对许多细胞系的厌氧哺乳动物细胞生长有效用。
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Protocol
1. 制备各种哺乳动物细胞系厌氧培养培养基
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为缺氧细胞培养制作完整的 PS-74656 培养基25。
- 在50毫升蒸馏去离子水中溶解17.25 克亚硝酸根, 使无菌亚硝酸盐库存溶液 (5 米; 100x), 然后过滤消毒。
- 添加0.5 毫升的亚硝酸盐库存溶液每50毫升低葡萄糖 DMEM (1 克/升葡萄糖) 与110毫克/升的 l-谷氨酰胺, 584 毫克/升的丙酮酸钠, 10% 胎牛血清 (血清; 热灭活)。
注: 使用血清浓度大于10% 是有毒的。值得注意的是, 一条癌细胞线对亚硝酸盐 (MDA-MB-231, 乳腺癌细胞系) 的培养基耐受性低, 因此在没有亚硝酸盐的情况下生长。此外, 虽然 PS-74656 培养基支持所有经测试的细胞系的生长 (n = 9), 某些细胞系 (例如, 细胞) 表现出较高的细胞浓度和较高的生存能力 PS-74656 高葡萄糖 (4.5 克/升) DMEM25。 - 在无菌50毫升圆锥离心管中放置20毫升培养基。不要拧紧盖子;它应该是松散的。
- 将管子放在真空钟罐中, 用近似45°角将其脱气, 使介质表面积最大化。
- 在室温下使用真空泵或其等效的真空。保持真空, 直到气泡不再被观察 (24–48 h)。
- 把管子从罐子里取下, 然后立即关上瓶盖, 封好管子, 尽量减少空气进入介质中的引入。
- 把管子放在商业厌氧室里。
- 松开管帽, 允许管内的空气与燃烧室中的厌氧气体混合物平衡至少24小时。
注: 介质应留在会议厅内, 直至用完为止。为加快工艺速度, 用缺氧气体混合液将管至少3x 冲洗, 用无菌转移吸管填充缺氧气, 由 H2、CO2和 N2 组成. - 将所有管 (10–15分钟) 放置在厌氧腔内, 如上文所述, 在密封管和放置在室内。使用前, 使用1.5–2毫升转移吸管或吸管提示, 冲洗它与厌氧气体混合物, 已冲洗的缺氧气体至少3x。
- 在厌氧室中, 将介质中的100µL 移除无菌脱气微离心管, 并在腔内使用氧气探针对溶解氧进行测试。
注: 氧电极在使用前按制造商的协议进行校准。正确脱气和平衡厌氧气体混合介质的读数为0。
注意: 如果读数超过 0.3 ppm 的氧气, 继续在厌氧室孵化介质, 因为有更多的时间平衡培养基是必需的。
2. 各种哺乳动物细胞系的缺氧培养
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指定的天-1
- 生长细胞 (37 °c, 5% CO2) 在 T150 瓶到90% 汇合为缺氧和常氧文化控制提供足够数量的细胞为三 24-井板材 (80% 汇合)。
注意: 对于这项研究, 使用了 HeLa 229 和维罗细胞。该议定书也经过测试, 并证明成功的增长和维护七其他细胞线25。 - 从烧瓶中取出培养基, 吸入10毫升的 HBSS。
- 用5毫升的胰蛋白酶取代培养基。搅动烧瓶, 直到细胞从塑料中分离出来。吸入大部分的胰蛋白酶, 然后轻敲烧瓶以去除黏附细胞。添加10–15毫升的高葡萄糖 DMEM (4.5 克/升葡萄糖, 110 毫克 l-谷氨酰胺, 10% 血清, 50 µg/毫升的庆大霉素), 以灭活胰蛋白酶。
- Triturate 细胞使用25毫升的吸管, 直到所有细胞团簇被破坏。
- 用标准 hemocytometer 和台盼蓝染料排除法或自动当量测定细胞数并确定其可行性。
- 悬浮在高葡萄糖 DMEM 的细胞, 如上所述, 细胞密度为 2.24 x 105细胞/毫升。
- 将1毫升的细胞悬浮液添加到24井组织培养板 (2.24 x 105细胞/井; 80% 汇流) 井中。种子1板为缺氧培养和另一个控制常氧文化。
- 孵化细胞在37°c 在常氧条件 (5% CO2) 为 24 h。
注: 这些细胞可以在各种大小的板材中电镀。然而, 种子细胞为缺氧生长的烧瓶, 有风险, 引入氧气进入系统, 除非采取谨慎, 以彻底冲洗出大气气体。
- 生长细胞 (37 °c, 5% CO2) 在 T150 瓶到90% 汇合为缺氧和常氧文化控制提供足够数量的细胞为三 24-井板材 (80% 汇合)。
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指定的天0
- 常氧孵化24小时后, 将板块用于缺氧生长进入厌氧室 (商业厌氧室;图 1)。
- 立即将培养基改为无抗生素的脱气 PS-74656 培养基, 并将其驯化为24小时至厌氧室。将盘子放在一个带有湿巾的容器里, 并松散地关闭以保持湿气。
注: 常氧生长板的处理方式相同, 例外的是所有的治疗都是在大气条件下进行的。
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指定的天1
- 1天的厌氧孵化开始后24小时的孵化在商业厌氧室, 其中包含标准的厌氧气体混合物10% 小时2, 10% CO2, 80% N2。
- 在不同的时间段孵化细胞。
- 监测厌氧介质的颜色变化随着时间的推移。
注意: 从红橙到洋红色的颜色转换信号的时间改变媒介。这可能需要长达2周的时间才能发生。从红色橙色到黄色的培养基中的颜色变化表明存在细菌污染。 - 当介质从红色变为洋红时, 通过吸移去除 runagate 细胞。
- 将吸气用过的介质放在脱气和厌氧气体平衡离心管中的 runagate 细胞中, 关闭管, 同时确保密封安全, 然后将其离心 (326 x克; 室温为10分钟)。立即用1毫升新的脱气 PS-74656 培养基替换井中的吸气介质。
- 在打开它之前, 将离心管放在厌氧室中的颗粒细胞。吸入所用的培养基, 并用新鲜的脱气 PS-74656 培养基替换离心管中的总容积1毫升。
- 将细胞从管中返回到24井组织培养板中的井中。
3. 厌氧培养细胞的显微观察对表型细胞分化的评价
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在厌氧室中, 将盘子放在一个密封盒中, 用厌氧气体混合物冲洗, 然后关闭盒子。
注: 盒内必须装有湿纸巾, 以提供防潮, 防止板材干燥。对于显微镜, 三明治袋的工作最好, 因为他们是薄的。- 观察显微镜下的细胞, 完全密封袋并将其从腔内取出。
- 仔细拉伸塑料袋在盘子上, 检查细胞使用倒置相对比显微镜与相机附件, 并采取显微照片在各种放大。
- 将密封袋中的盘子退回到房间, 并按照步骤2.3.3 中的描述继续孵化。
- 要单独分析处于悬浮中的 runagate 细胞, 请按照步骤2.3.5 中概述的步骤进行操作。
注: 这些细胞可以用来进行有氧测试, 也可以被送回厌氧室, 用于测试这个特定的人群。
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Representative Results
这个协议的力量在于它支持的长寿和多细胞系的生长, 并承认有深刻的变化和分化的细胞形态学25。这项研究最关键的因素是在严格的 anaerobiosis 下细胞的转移和维持。这就需要组织一个厌氧室来最大化该协议 (图 1), 并保证在密封的环境中保存用于显微镜或其他测试的细胞。到目前为止, 缺氧生存的范围是15–17天为不朽的癌细胞系和17天的转化细胞系 (九细胞线筛为缺氧生长)。一旦这些细胞迁移到缺氧条件下, 存活细胞的水平在稳定前至少下降了 10%, 达到了90%。所有细胞系恢复为双表型 (栓和 runagate), 随着时间的推移, 悬浮细胞的比例增加。即使在延长几个星期的潜伏期后, 仍然有一些栓细胞, 但大多数细胞是在圆形 runagate 形态学 (图 2)。据报道, 这些 runagate 细胞是可行的, 并进行了他们的细胞周期。应该指出的是, 可能需要调整的变量包括葡萄糖水平和亚硝酸盐浓度。这表明, 从60多个不同的媒体配方, 测试他们的能力, 以支持常氧和缺氧孵化, PS-74656 培养基能够支持生存和复制几乎所有的细胞系测试。
一个重要的观察是缺氧细胞的分化, 无论细胞测试, 成两个不同的表型, 栓和 runagate (图 2)。与常氧单层细胞类似, 栓系细胞附着在组织培养塑料上。然而, 附件是较弱的, 更容易胰蛋白酶处理或刮擦, 比在常氧条件下发生的附件。另外, 细胞形态学是小的与更多纺锤 (树突状) 引伸26。观察到的第二个细胞 morphotype 是悬浮细胞 (即runagate 细胞)。这些细胞自发地转化为游离漂浮的单细胞悬浮液, 在组织培养处理的塑料存在, 这是圆形的细胞规模较小, 细胞质较少。它们不同于传统的悬浮培养细胞, 通常需要酶的适应, 生长在骨料, 要求非组织培养处理容器, 并大于其常氧对应27。随着时间的推移, 缺氧细胞的数量可以观察到从一个主要拴系的单层转移到 runagate 细胞的悬浮。这些悬浮细胞是可行的和复制的;因此, 如果清除上清液, 就必须进行护理。另外, 值得注意的是, 培养基不需要改变整个厌氧孵化期。与常氧控制相比, 缺氧孵化下的培养基 pH 值也不变 (即保持红色)。如果研究者希望收获 runagate 细胞, 或者改变培养基, 这些细胞可以使用厌氧气体冲洗的微离心管在厌氧腔内紧密闭合。对于栓细胞的细胞冲洗, 也必须在腔内进行, 以消除任何氧气暴露。
长期耕作的最终细胞生存能力在很大程度上取决于所使用的细胞和水井或烧瓶最初播种的汇流 (图 3和4)。也就是说, 一个好的出发点是 80%, 这是最佳增长的最大机会。此外, 在最初的2–4天内, 细胞系依赖于10% 到60% 的生存能力的损失可能会发生。然而, 在这个实验的表现, 其余的细胞循环通过细胞周期和复制28。在图 3和4中可以看出播种汇流对细胞培养寿命的影响。HeLa 229 和维罗细胞在24井板中播种到40%、60% 和80% 的初始汇流 (100% 汇流 = 2.8 x 105细胞/井), 然后在没有氧气的情况下孵化17天。HeLa 229 细胞缺氧生长优化在初始播种汇合80%。与此相反, 该细胞的最佳播种汇流为60%。这表明需要最初优化的播种密度依赖于细胞线所使用的。
图 1: 哺乳动物细胞培养的厌氧室建立模型.所需的最低材料包括组织培养板、无菌转移滴管、生物危害袋、脱毒气介质、用于丢弃介质或其他液体的管, 以及密封袋, 用于将板材转移到显微镜, 同时保持厌氧条件。
图 2:缺氧 HeLa 细胞形态分化.(A) 这个小组显示了常氧 HeLa 细胞控制4天后接种后的相位对比显微镜, 其放大率为20X。(B)本小组显示缺氧 HeLa 细胞接种后17天 (不变的天 1 PS-74656 培养基, 80% 种子汇合, 和20X 放大)。(C) 本小组展示了一个密封塑料袋内部含有24井缺氧板的水滴的显微制品。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:缺氧对常氧 HeLa 229 活细胞的比率 post-17 天孵化.该面板显示了播种密度对 PS-74656 培养基中 HeLa 229 细胞生存能力的影响, 与常氧控制相比。结果显示为 "均值" 扫描电镜。
图 4:缺氧对常氧的存活细胞比率17天后孵化.该面板显示了播种密度对 PS-74656 培养基中的细胞生存能力的影响, 与常氧控制相比。结果显示为 "均值" 扫描电镜。
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Discussion
这种方法代表第一次哺乳动物细胞, 在没有氧气的情况下长时间培养。根据目前的观察,通过非发酵途径的缺氧生长能力似乎是普遍的哺乳动物细胞28, 其中厌氧生长导致表型发散。这是观察到所有细胞系测试。以厌氧耕种, 细胞的增加的比例变得四舍五入, 开发了悬浮象人口, 并且能复制。次级细胞类型仍然附着在基板上;然而, 细胞形态学恢复到主轴 (树突状) 形状。这些发现指出了在分析和观察缺氧组织培养的一个常见的错误。人们普遍认为, 当哺乳动物细胞生长在常氧条件下 (5% CO2) 轮和分离时, 它们就会死亡。相反, 对于在缺氧情况下生长的细胞来说是正确的, 在这种情况下, 细胞被四舍五入和分离, 只是一种形态上发散的细胞亚群。
缺氧生长条件的优化是细胞系依赖。中 PS-74656 整体支持在常氧和缺氧生长条件下的所有细胞系的生长, 除 MDA-MB-231 外, 乳腺癌细胞系在没有亚硝酸盐的情况下更喜欢生长。令人鼓舞的观察是, 即使每井有98% 的细胞死亡, 剩下的人也会复制, 导致高度适应的人群。关键的行动是保持文化, 即使只有少数细胞是直接观察显微镜。因此, 必须谨慎, 以确保分离的细胞是死的, 无论是通过台盼蓝染料排除或其他细胞生存能力检测方法。应该指出的是, 由于细胞数量的大幅减少, 必须将足够的水井播种, 以便在随后的实验中有足够的总细胞数。存活细胞的预期损失是细胞系和播种汇流依赖性;因此, 随着时间的推移, 最佳细胞数必须经过实验确定, 不能从与其他细胞系的发现中推断出来。也就是说, 一个好的出发点是80% 汇流, 这是最大的机会, 最好的增长。必须指出的是, 在程序的厌氧步骤中, 任何接触氧气, 无论多么短暂, 都将会由于报告的自发性细胞HIF-1-α反应11,12而危及结果。
对于这个过程, 最关键的步骤是对介质, 管, 和所有其他设备和材料的脱气。即使非常低的氧气水平的引入, 也可以阻止从发酵代谢到厌氧呼吸的转变。另外, 它还可以延长发酵代谢, 使任何实验结果, 以测量缺氧, 而不是缺氧。使用这一新的程序来测量细胞毒性和化疗活动, 可以帮助解释药物衰竭治疗实体肿瘤。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢中西部大学的研究和赞助项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
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