Summary
Hier beschreiben wir eine neue Methode, die den anaeroben langfristige Anbau von etablierten Zelllinien ermöglicht. Die maximale Überlebenszeit, die getestet wurde ist 17 Tage. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von Zytostatika und Erforschung der Physiologie der anoxically Zellen repliziert.
Abstract
Die meisten Schleimhaut-Oberflächen zusammen mit den Mittelpunkten in Tumoren und Stammzell-Nischen sind geographische Bereiche des Körpers, die anoxischen sind. Bisherige Studien zeigen, dass die Inkubation in Inklusieve (5 % CO2 in Luft) oder hypoxischen Bedingungen (niedrige Sauerstoffniveaus) gefolgt von einer anoxischen Inkubation (fehlender freier Sauerstoff) Ergebnisse in begrenzte Lebensfähigkeit (2 – 3 Tage). Eine neuartige Methode wurde entwickelt, eine anoxische Zellkultivierung (für mindestens 17 Tage, die maximale Zeit getestet). Der wichtigste Aspekt dieser Methodik soll sicherstellen, dass kein Sauerstoff in das System eingeführt wird. Dies ergibt sich durch das Ausgasen von Medien und durch Spülung Röhren, Gerichte, Fläschchen und Pipetten mit einem anaeroben Gasgemisch (H2, CO2, N2) gefolgt von schönem zu equilibrate der anoxischen (Sauerstoff) Umwelt Materialien vor dem Gebrauch. Zusätzliche Sorgfalt muss beim Erwerb von Mikrofotos um sicherzustellen, dass die Aufnahmen erhalten keine Artefakte enthalten. In Abwesenheit von Sauerstoff ist Zellmorphologie erheblich verändert. Zwei unterschiedliche morphotypen sind für alle anaerob wachsen Zellen festgestellt. Die Fähigkeit zu wachsen und zu pflegen Säugerzellen in Abwesenheit von Sauerstoff kann zur Analyse der Zellphysiologie, Biofilm-Interaktionen und die Charakterisierung von biosynthetischen Bahnen für neuartige Wirkstoffforschung angewendet werden.
Introduction
Zellen von soliden Tumoren, Stammzell-Nischen und die Auskleidung der Schleimhaut-Oberflächen gibt es in Umgebungen, in denen geringere Sauerstoffgehalt, darunter Anoxie1,2,3,4erleben. In normalen physiologischen Staaten variiert Sauerstoffversorgung jenseits der Hypoxie, Sauerstoffmangel (das völlige Fehlen von Sauerstoff)5,6. Die Erkenntnis, dass Luftsauerstoff säugerzelle Replikation beeinträchtigt und das Zellwachstum in-vitro- Bedingungen abgereichertem Sauerstoff optimiert werden kann wurde in den frühen 1970er Jahren berichtet. Richter Et al. 7 zeigten, dass 1 – 3 % der Sauerstoffsättigung (Hypoxie) Beschichtung gegenüber Luftsauerstoff (20 %) gesteigert. Die menschliche diploide Zelle Lebensdauer ist auch in der Kultur hypoxischen Bedingungen8verlängert.
In Vivo, hypoxische Bedingungen auftreten, wenn Sauerstoff speichert abgereichertem (z. B.bei intensivem Training), wobei die ATP-Produktion in der Skelettmuskulatur von Atmung auf Gärung (anaerobe Atmung) mit ausgeschaltetem der Endprodukt Milchsäure-9. Pathologisch, in Krebstumoren, das Innere des Tumors Masse ist, aufgrund der schlechten Vaskularisation anoxischen hypoxischen10. Die Wirkung der begrenzten Durchblutung auf Tumor Innenräume wird unabhängig vom Tumor Innenräume kolonisiert durch obligat Anaerobier1überprüft. Mechanistisch, Tumor Zelle Überleben in Hypoxie wird angenommen, dass die Expression des Gens Hypoxie-induzierbare Faktor 1-Alpha allein abhängig (HIF1-Alpha), das ist die erste spontane Reaktion auf Hypoxie4,11 , 12. HIF1-Alpha wird durch HITZESCHOCKPROTEINE, die HIF1binden unter hypoxischen Bedingungen induziert-alpha Promoter und Upregulate gen Transkription12. Diese HITZESCHOCKPROTEINE werden geglaubt, um die Induktion der verschiedenen Phänotypen gesehen in den Tumor hypoxischen Mikroumgebung zu unterstützen. Diese Phänotypen weisen einen erhöhten Ausdruck der Zellmembran Glukose-Transporter und die Rate der Glykolyse (Warburg-Effekt)13. Das Ergebnis ist ein Wechsel von Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung zu Laktat-Gärung.
Anoxischen überleben kann auch Alternativen zu Glukose zu überleben Phänomen14,15Unterstützung nutzen. Die untersuchte Säugetiere Beispiel ist der Maulwurf Ratte, die für fast 20 Minuten ohne Sauerstoff durch eine Fruktose-driven glykolytischen Gärung Weg14überleben können. Eine alternative Anpassung tritt in bestimmten Fisch (z.B.Karpfen [Carassius SP.], die deutlich länger überleben können Zeiträume mit Glykolyse mit Ethanol als das terminal Nebenprodukt)15. In beiden Fällen treibt die Gärung den Stoffwechsel, so dass das Überleben in der Abwesenheit von Sauerstoff. Die aktuelle Hypothese anoxischen überlebenswichtig ist, dass so lange als HIF1-Alpha ist bei Hypoxie, mitochondriale Atmung aktiviert, ohne die Notwendigkeit für Sauerstoff, tritt unter anaeroben Bedingungen16. Darüber hinaus wird postuliert, dass die Verwendung von fermentative Weg für hypoxische/anoxischen überleben Tumor überleben verbessert, da die Zellen oxidativen Stress, die könnte vermeiden sich nachteilig auf die Zelle überleben17. Dieses Postulat wird unterstützt durch eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass in Kardiomyozyten, Hypoxie den oxidativen Stress auf den Tumor Zelle17platziert senkt.
Bis heute hat die essentielle Natur eines fermentative Signalwegs für anoxischen Säugetier-Zelle Überleben in der Literatur, im großen Teil auf die Unfähigkeit, Kultur Säugerzellen in das völlige Fehlen von Sauerstoff für mehr als 3 Tage schon tief verwurzelt. Allerdings tritt eine Alternative zum Überlebenskampf der anaeroben Glykolyse in Bakterien. In bestimmten Bakterien dient Stickstoff oder Sulfat (unter anderen Verbindungen) als terminal Elektronen Akzeptoren für das Cytochrom-Oxidase-System in der Abwesenheit von Sauerstoff-18. Obwohl die bakterielle und Eukaryotische Evolution parallel seit der letzte universelle gemeinsame Vorfahr abweichende aufgetreten, wird geschätzt, dass Mitochondrien Energie Zellen 1,542 Millionen Jahre bevor die Sauerstoffversorgung der Ozeane19 bereitstellten . Da Forscher haben gezeigt, dass die isolierte Mitochondrien ATP in der Abwesenheit von Sauerstoff zu Nitrit als das terminal Elektron Akzeptor produzieren können, ist es vernünftig anzunehmen, dass Zellen über einen Zeitraum länger als 3 Tage in der Abwesenheit von Sauerstoff funktionieren könnte 20 , 21 , 22 , 23. in dieser Studie beschriebene Methode hat ein Dienstprogramm für die anaerobe Säugetier-Zelle Wachstum von zahlreichen Zelllinien.
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Protocol
1. bereiten Sie Medien für anaerobe Kultur von verschiedenen Säugetieren Zelllinien
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Das komplette PS-74656 Medium für eine anoxische Zelle Kultur25zu machen.
- Die sterile Nitrit-Stammlösung (5 M; 100 X) durch 17,25 g Nitrit in 50 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen und dann Filtern Sie, um sie zu sterilisieren.
- 0,5 mL der Nitrit-Stammlösung pro 50 mL niedrige Glukose DMEM (1 g/L Glukose) mit 110 mg/L von L-Glutamin, 584 mg/L Natrium Pyruvat und 10 % fötalen Rinderserum hinzufügen (FBS; Hitze-inaktivierten).
Hinweis: Die Verwendung von FBS-Konzentrationen größer als 10 % giftig sind. Der Hinweis ein Krebs-Zell-Linie getestet hatte eine geringe Toleranz für Medien mit Nitrit (MDA-MB-231, Brust-Krebs-Zell-Linie) und wurde somit in das Fehlen von Nitrit angebaut. Darüber hinaus obwohl PS-74656 Medium unterstützt das Wachstum von allen Zelllinien, die getestet wurden (n = 9), bestimmte Zelllinien (z.B. Vero-Zellen) ausgestellt, höhere Konzentrationen der Zelle und eine höhere Rentabilität im PS-74656 mit hoher Glucose (4,5 g/L) DMEM 25. - Platz 20 mL des Mediums in einem sterilen 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Ziehen Sie die Kappe nicht; Es sollte locker sein.
- De-Gas das Medium indem man den Schlauch in ein Vakuum Glasglocke auf einem ca. 45° Winkel, um die mittlere Fläche zu maximieren.
- Wenden Sie ein Vakuum, das mit einer Vakuum-Pumpe oder eines gleichwertigen Dokuments bei Raumtemperatur. Behalten Sie das Vakuum bis Bläschen (24 – 48 h) nicht mehr eingehalten werden.
- Entfernen Sie den Schlauch aus dem Glas und sofort schließen Sie die Kappe Abdichtung der Röhre um das Eindringen von Luft in das Medium zu minimieren.
- Legen Sie das Rohr in der anaeroben Handelskammer.
- Lösen Sie die Rohr-Kappe und ermöglichen Sie die Atmosphäre in der Röhre, mit der der anaeroben Gasgemisch in die Kammer für mindestens 24 h equilibrate.
Hinweis: Das Medium sollte in der Kammer verbleiben, bis es aufgebraucht ist. Für die Beschleunigung des Prozesses, bündig des Rohrs mindestens 3 X mit der anoxischen Gasgemisch mit einer sterilen transferpipette gefüllt mit anoxischen Gas, bestehend aus H2, CO2und N2. - Entgasen Sie alle Rohre (10-15 min) in den anaeroben Raum gelegt, wie oben beschrieben, bevor das Rohr Abdichten und Platzierung in der Kammer. Vor dem Gebrauch spülen Sie es mit der anaeroben Gasgemisch mit 1,5-2 mL Transfer Pipetten oder Pipettenspitzen, die mit anoxischen geleert wurden gas-mindestens 3 X.
- Während in der anaeroben Kammer entfernen Sie 100 µL des Mediums in ein steriles Röhrchen für entgastes Mikro-Zentrifuge und testen Sie es für den gelösten Sauerstoff mit einer Sauerstoff-Sonde innerhalb der Kammer.
Hinweis: Die Sauerstoff-Elektrode ist pro des Herstellers Protokoll vor dem Gebrauch kalibriert. Lesungen der richtig entgast und ausgewogenen anaeroben Gas Mischung Medien sind 0.
Achtung: Wenn die Messwerte über 0,3 ppm Sauerstoff sind, weiterhin die Medien in der anaeroben Kammer inkubieren, da mehr Zeit für das Medium equilibrate erforderlich ist.
(2) anoxischen Anbau von verschiedenen Säugetieren Zelllinien
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Bestimmten Tag-1
- Zellen (37 ° C, 5 % CO2) in einem T150 Kolben bis 90 % Zusammenfluss zur anoxischen und Inklusieve Kultur Steuerung für drei 24-Well-Platten (80 % Zusammenfluss) eine ausreichende Anzahl von Zellen zu wachsen.
Hinweis: Für diese Studie wurden HeLa 229 und Vero-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde auch getestet und erwies sich als erfolgreich für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der sieben anderen Zelle Linien25. - Entfernen Sie das Medium aus der Flasche durch Absaugen und waschen Sie es mit 10 mL HBSS.
- Ersetzen Sie das Medium mit 5 mL Trypsin. Schütteln Sie die Flasche bis die Zellen aus dem Kunststoff optisch trennen. Aspirieren Sie die meisten der Trypsin, tippen Sie auf die Flasche um adhärenten Zellen verdrängen. Fügen Sie 10 – 15 mL hohe Glukose DMEM (4,5 g/L Glukose, 110 mg/L von L-Glutamin, 10 % FBS, 50 µg/mL von Gentamicin), die Trypsin zu inaktivieren.
- Genannte die Zellen mit einen 25-mL-Pipette, bis alle Klumpen der Zelle gestört werden.
- Zählen der Zellen und die Lebensfähigkeit der standard Hemocytometer und die Trypan blauen Farbstoff Ausgrenzung Methode oder das automatisierte Äquivalent zu bestimmen.
- Aussetzen Sie die Zellen in der hohen Glukose DMEM, wie bereits erwähnt, eine Zelldichte von 2,24 x 105 Zellen/mL.
- Fügen Sie 1 mL Zellsuspension in die Vertiefungen einer Gewebekultur 24-Well-Platte (2,24 x 105 Zellen/Well; 80 % Zusammenfluss). Samen 1 Platte für die anoxischen Kultur und eine andere für eine Kontrollkultur Inklusieve.
- Inkubation der Zellen bei 37 ° C in Inklusieve Bedingungen (5 % CO2) für 24 h.
Hinweis: Die Zellen können in verschiedenen gut dimensionierte Platten beschichtet. Jedoch läuft die Zellen für anoxischen Wachstum in Korbflaschen Aussaat das Risiko einer Einschleppung von Sauerstoff in das System, es sei denn Vorsicht geboten ist, um atmosphärische Gas komplett ausspülen.
- Zellen (37 ° C, 5 % CO2) in einem T150 Kolben bis 90 % Zusammenfluss zur anoxischen und Inklusieve Kultur Steuerung für drei 24-Well-Platten (80 % Zusammenfluss) eine ausreichende Anzahl von Zellen zu wachsen.
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Bestimmten Tag 0
- Legen Sie nach 24 h Inkubation Inklusieve die Platten für den anoxischen Wachstum in der anaeroben Kammer (eine anaerobe Handelskammer; ( Abbildung 1).
- Sofort ändern Sie das Medium in antibiotikafreien de vergast PS-74656 Medium, welches für 24 h zur anaeroben Kammer gewöhnt worden. Legen Sie die Platte in einen Behälter mit einem feuchten Tuch und schließen Sie locker zu, um die Feuchtigkeit zu halten.
Hinweis: Die Platten für Inklusieve Wachstum sind identisch mit der Ausnahme behandelt, die alle Behandlungen unter atmosphärischen Bedingungen durchgeführt werden.
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Bestimmten Tag 1
- Tag1 der anaerobe Bebrütung beginnt nach 24 h Inkubation in der kommerziellen anaeroben Kammer enthält die standard anaeroben Gasgemisch von 10 % H2, 10 % CO2und 80 % N2.
- Inkubieren Sie die Zellen für verschiedene Zeiträume.
- Überwachung der anaeroben Mediums für die farbliche Veränderung im Laufe der Zeit.
Hinweis: Eine Farbverschiebung von rot-Orange, Magenta signalisiert die Zeit, um das Medium zu ändern. Dies kann auftreten, bis zu 2 Wochen dauern. Eine Farbverschiebung im Medium von rot-Orange bis gelb zeigt das Vorhandensein der bakteriellen Kontamination. - Wenn das Medium von rot, Magenta wechselt, entfernen Sie Runagate Zellen durch Aspiration.
- Ort der angesaugten abgebrannten Medien mit den Runagate Zellen in entgast und anaerobe Gas equilibriert Microfuge Röhren, in der Nähe der Rohre gleichzeitig sicherstellen, dass die Dichtung sicher ist, und anschließend sie (326 x g; bei Raumtemperatur für 10 min zentrifugieren). Sofort ersetzen Sie die angesaugten Medien im Brunnen mit 1 mL des neuen entgast PS-74656 Medium.
- Legen Sie das Microfuge Rohr mit gebeizte Zellen in der anaeroben Kammer vor dem Öffnen. Aspirieren der abgebrannten Mediums und ersetzen Sie es mit frischen entgast PS-74656 Medium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml in der Tube Microfuge.
- Die Zellen aus der Tube zu einem Brunnen in der Gewebekultur 24-Well-Platte zurück.
3. Bewertung der phänotypischen Zelldifferenzierung Mikroskopie von anaerob kultivierten Zellen
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Während in der anaeroben Kammer, die Platte in einer wiederverschließbaren Box mit der anaeroben Gasgemisch gespült und schließen Sie die Box.
Hinweis: Das Feld muss einem feuchten Papiertuch um Spenden Feuchtigkeit und verhindern das Austrocknen der Plattenrandes enthalten. Für die Mikroskopie Arbeit brötchentüten die beste, da sie dünn sind.- Um die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, komplett verschließen der Tasche und aus der Kammer zu entfernen.
- Sorgfältig die Plastiktüte über die Platte zu dehnen, Zellen mit einem inversen Phase-Kontrast-Mikroskop mit Kamera-Anlage und trifft Vergößerung bei verschiedenen Vergrößerungen.
- Die Platte in den versiegelten Beutel an die Kammer zurück, und weiter die Inkubation, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben.
- Separat die Runagate Zellen zu analysieren, die in der Schwebe sind, führen Sie die Schritte in Schritt 2.3.5.
Hinweis: Diese Zellen können dann aerobic zu Testzwecken verwendet werden oder zur anaeroben Kammer für die Prüfung dieser spezifischen Bevölkerung zurückgegeben werden können.
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Representative Results
Die Stärke dieses Protokolls unterstützt die Langlebigkeit und das Wachstum von mehreren Zelllinien und in der Erkenntnis, dass es eine tiefgreifende Veränderung und Divergenz in der Zelle Morphologie25. Das wichtigste Element dieser Studie ist die Übertragung und die Pflege der Zellen unter strenger anaerobiose. Dies erfordert eine anaerobe Kammer organisiert, um das Protokoll (Abbildung 1) zu maximieren und die Gewissheit, dass die Zellen für die Mikroskopie oder andere Tests entfernt befinden sich in einer geschlossenen Umgebung. Bis heute die Palette der anoxischen überleben waren 15 – 17 Tage für unsterbliche Krebs Zell-Linien und bis zu 17 Tagen verwandelt Zelllinien (neun Zelllinien für anoxischen Wachstum gezeigt). Die Ebenen der lebensfähigen Zellen, sank sobald diese Zellen auf anoxische Bedingungen verschoben wurden um mindestens 10 % bis maximal 90 %, bevor sie stabilisiert. Alle Zell-Linien auf die dual Phänotypen zurückgesetzt (angebunden und Runagate) mit dem Anteil der Zellen in der Suspension im Laufe der Zeit erhöhen. Auch nach einer erweiterten Inkubation von mehreren Wochen es blieben einige gefesselten Zellen, aber die Mehrheit der Zellen wurden in die abgerundeten Runagate Morphologie (Abbildung 2). Wie berichtet, sind diese Runagate Zellen lebensfähig und ging durch den Zellzyklus. Es sei darauf hingewiesen, dass die Variablen, die angepasst werden müssen, können der Blutzuckerspiegel und die Nitrit-Konzentration enthalten. Das heißt, aus der mehr als 60 verschiedene Medien-Formulierungen, die für ihre Fähigkeit, Inklusieve und anoxischen Inkubation unterstützen getestet wurden, konnte das PS-74656 Medium unterstützen das Überleben und die Replikation von fast allen Zelllinien getestet.
Eine wichtige Beobachtung war die Differenzierung der anoxischen Zellen, unabhängig von der Zelle getestet, in zwei verschiedene Phänotypen, angebunden und Runagate (Abbildung 2). Analog zu den Inklusieve Monolage Zellen, wurden die gefesselten Zellen der Gewebekultur Kunststoff angebracht. Die Anlage war jedoch schwächer, leichter zu trypsinize oder verdrängen durch Schaben, als die Anlage, die unter den Bedingungen der Inklusieve aufgetreten ist. Darüber hinaus wurde die Zellmorphologie mit mehr Spindel (dendritische) Erweiterungen26kleiner. Die zweite zellulären morphotyp beobachtet wurden Zellen in Suspension (d.h., Runagate Zellen). Diese Zellen umgewandelt spontan frei schwebenden einzelligen Suspensionen in Anwesenheit von Gewebekultur behandelt Kunststoff, die mit einer kleineren Zellengröße und weniger Zytoplasma gerundet wurden. Sie unterschieden sich von den klassischen Aufhängung Kultur Zellen, die in der Regel erfordern eine enzymatische Anpassung, wachsen in Aggregaten, Gewebekultur-unbehandelte Container benötigen und sind größer als ihre Inklusieve Pendants27. Im Laufe der Zeit konnte der anoxischen Zell-Populationen beobachtet werden, von überwiegend gefesselte Monolage mit derjenigen der Runagate Zellen in Suspension zu verlagern. Diese Zellen in Suspension wurden praktikable und replizieren; Pflege musste somit ausgeübt werden sollte der Überstand entfernt werden. Bemerkenswert ist auch, dass das Medium nicht verlangen, die Umstellung der gesamten anaeroben Inkubationszeit. Die mittleren pH-Indikator unter anoxischen Inkubation, im Gegensatz zu seiner Inklusieve Kontrolle war auch unverändert (d.h., blieb rot). Der Prüfer möchte die Runagate Zellen zu ernten, oder ändern Sie das Medium, die Zellen erhalten Sie mit anaeroben Gas gespült Mikro-Zentrifuge Röhren, die geschlossen sind fest in der anaeroben Kammer. Für die Zelle der gefesselte Zellen waschen muss das Verfahren auch in der Kammer keine Sauerstoff-Exposition zu beseitigen durchgeführt werden.
Die endgültige Zellviabilität für eine langfristige Bewirtschaftung wurde zu einem großen Teil abhängig von der Zelle verwendet wird und dem Zusammenfluss, der Brunnen oder die Kolben waren ursprünglich gesäten (Abbildungen 3 und 4). Das heißt, ein guter Ausgangspunkt ist 80 %, die die größte Chance für optimales Wachstum hatte. Darüber hinaus kann ein Zelle Zeile-abhängige Verlust von 10 % bis 60 % der Tragfähigkeit in den ersten 2 – 4 Tagen auftreten. Jedoch während der Aufführung dieses Experiments, die verbleibenden Zellen radelte durch den Zellzyklus und28repliziert. Die Aussaat Zusammenfluss Wirkung auf die Langlebigkeit der Zellkultivierung ist in den Abbildungen 3 und 4ersichtlich. HeLa 229 und Vero-Zellen wurden in 24-Well-Platten, 40 %, 60 % und 80 % der ursprünglichen Zusammenfluss ausgesät (100 % Zusammenfluss = 2,8 x 105 Zellen/gut) und dann in der Abwesenheit von Sauerstoff für 17 Tage inkubiert. Das HeLa 229 anoxische Zellwachstum wurde bei einer anfänglichen Aussaat Zusammenfluss von 80 % optimiert. Im Gegensatz dazu die optimale Aussaat Zusammenfluss Vero-Zellen lag bei 60 %. Dies zeigt die Notwendigkeit, zunächst die Aussaatdichte abhängig von der Zell-Linie verwendet zu optimieren.
Abbildung 1 : Modell der anaeroben Kammer-Set-up für die Kultur von Säugerzellen. Die minimalen benötigten Materialien umfassen Gewebekultur Platten, ein Rohr für das Verwerfen von Medien oder andere Flüssigkeiten und wiederverschließbaren Beutel für die Übertragung der Platten auf dem Mikroskop unter Beibehaltung steriler Transfer mehrkanalpipette, Biohazard Taschen, de-vergast Medien anaeroben Bedingungen.
Abbildung 2: Anoxischen HeLa Zellen morphologischen Differenzierung. (A) dieses Panel zeigt die Phasenkontrastmikroskopie Inklusieve HeLa-Zelle Steuerelemente 4 Tage nach Impfung mit 20 X Vergrößerung. (B) dieses Panel zeigt der anoxischen HeLa-Zellen 17 Tage nach dem Beimpfen (mit der unverändert von Tag 1 PS-74656 Medium, 80 % ausgesät Zusammenfluss und ein 20 X Vergrößerung). (C) dieses Panel zeigt Mikroskopie Artefakte von Wassertropfen auf der Innenseite von einem verschlossenen Plastikbeutel mit einer anoxischen 24-Well Platte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Verhältnis von anoxischen, Inklusieve HeLa 229 lebensfähige Zellen Post-17 Tagen Inkubation. Dieses Fenster zeigt die Auswirkungen der die Aussaatdichte auf der HeLa 229 Zellviabilität im PS-74656 Medium im Vergleich zu den Inklusieve Kontrolle. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ± SEM
Abbildung 4: Verhältnis von anoxischen, Inklusieve Vero lebensfähige Zellen nach Inkubation 17 Tage. Dieses Fenster zeigt die Auswirkungen der die Aussaatdichte auf die Vero Zellviabilität im PS-74656 Medium im Vergleich zu den Inklusieve Kontrolle. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ± SEM
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Discussion
Diese Methode stellt erstmals Säugetier-Zellen, die für längere Zeit in Abwesenheit von Sauerstoff gezüchtet wurden. Basierend auf aktuellen Beobachtungen, scheint der anoxischen Wachstum Fähigkeit über einen nicht fermentative Weg universal unter Säugerzellen Linien28, wo führte die anaerobe Wachstum Phänotyp Divergenz. Dies war für alle Zelllinien getestet beobachtet. Mit dem anaeroben Anbau wachsenden Ausmaßes der Zellen wurde abgerundet, entwickelt eine Aussetzung-wie Bevölkerung und waren in der Lage zu replizieren. Die sekundäre Zelle Art blieb mit dem Substrat verbunden; Allerdings kehrten die Zellmorphologie zu einer Spindel (dendritische) Form. Diese Ergebnisse weisen darauf hin ein häufiger Fehler in Analysen und Beobachtungen in Bezug auf anoxischen Gewebekultur Anbau. Es ist allgemein anerkannt, dass bei Säugerzellen Inklusieve Bedingungen (5 % CO2) angebaut Aufrunden und lösen, sie sterben. Im Gegenteil scheint korrekt für Zellen, Zellen, die aufgerundet haben in Abwesenheit von Sauerstoff, in welchem Fall gewachsen zu sein und getrennt, sind einfach eine Subpopulation morphologisch unterschiedliche Zelle.
Es ist die Optimierung der anoxischen Wachstumsbedingungen Zelllinie angewiesen. Mittlere PS-74656 insgesamt unterstützt das Wachstum der Zelle alle Linien unter Inklusieve und anoxischen Wachstumsbedingungen, mit Ausnahme von MDA-MB-231, eine Brust-Krebs-Zell-Linie das Wachstum in der Abwesenheit von Nitrit bevorzugt. Eine erfreuliche Beobachtung ist, dass sogar mit einer 98 % Absterben von Zellen pro Bohrloch, der Rest repliziert wird wiederum eine hoch angepasste Bevölkerung. Die kritische Aktion soll Kulturen zu erhalten, auch wenn nur wenige Zellen direkt von Mikroskopie eingehalten werden. Pflege muss so ausgeübt werden, um sicherzustellen, dass die freistehenden Zellen tot, Trypan blauen Farbstoff Ausschluss oder durch eine alternative Zelle Lebensfähigkeit Nachweisverfahren sind. Es sei darauf hingewiesen, dass mit solch einer großen Abnahme Zellzahlen, genügende Brunnen ausgesät werden müssen, um ausreichende total Zellzahlen für spätere Experimente haben. Der erwartete Verlust der lebensfähigen Zellen ist Zell-Linie und Aussaat Zusammenfluss angewiesen; somit optimale Zellzahlen im Laufe der Zeit müssen experimentell ermittelt werden und nicht von Erkenntnisse mit anderen Zelllinien extrapoliert werden. Das heißt, ein guter Ausgangspunkt ist eine 80 %-Zusammenfluss, hat die größte Chance für optimales Wachstum. Es ist darauf hinzuweisen, dass jede Einwirkung von Sauerstoff während der anaeroben Verfahrensschritte, egal wie kurz die Ergebnisse aufgrund der gemeldeten spontane zelluläre HIF-1gefährdet-alpha Antwort11,12.
Für dieses Verfahren ist die wichtigste Schritt die Entgasung des Mediums, Röhren, und alle anderen Apparate und Materialien verwendet. Die Einführung von auch sehr geringe Mengen an Sauerstoff könnte den Übergang von der Gärung Stoffwechsel in die anaerobe Atmung stoppen. Alternativ könnte es den fermentativen Stoffwechsel verlängern, damit keine Experimente bei der Messung der Hypoxie, nicht Sauerstoffmangel führen. Die Verwendung dieses neuartige Verfahren zur Messung der Zytotoxizität und chemotherapeutischen Aktivität könnte dazu beitragen, Medikament bei der Behandlung von soliden Tumoren erklären.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Midwestern University Office of Research und geförderte Programme für ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
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