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Biology

Anaerobic विकास और स्तनधारी सेल लाइनों के रखरखाव

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/58049
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

Summary

यहाँ, हम एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो anaerobic की स्थापित कोशिका रेखाओं की दीर्घकालिक खेती को सक्षम बनाती है. परीक्षण किया गया था कि अधिकतम अस्तित्व समय 17 दिन है । इस विधि साइटोटोक्सिक एजेंटों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है और anoxically नकल कोशिकाओं के फिजियोलॉजी की खोज ।

Abstract

अधिकांश श्लैष्मिक ट्यूमर और स्टेम सेल niches में midpoints के साथ सतहों शरीर के भौगोलिक क्षेत्रों है कि anoxic हैं । पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि normoxic में मशीन (5% हवा में सह2 ) या hypoxic (कम ऑक्सीजन का स्तर) एक anoxic मशीन द्वारा पीछा शर्तों (नि: शुल्क ऑक्सीजन की अनुपस्थिति) सीमित व्यवहार्यता में परिणाम (2-3 दिन) । एक उपंयास पद्धति विकसित की है कि एक anoxic सेल की खेती में सक्षम बनाता है (कम से 17 दिनों के लिए, अधिकतम समय परीक्षण) । इस कार्यप्रणाली का सबसे अहम पहलू यह सुनिश्चित करना है कि कोई ऑक्सीजन सिस्टम में पेश न हो । यह मीडिया के degassing द्वारा प्राप्त की है, और ट्यूब, बर्तन, कुप्पी, और पिपेट एक anaerobic गैस मिश्रण (एच2, CO2, N2) के साथ निस्तब्धता द्वारा anoxic (गैर ऑक्सीजन) पर्यावरण के लिए equilibrate करने के लिए सामग्री की अनुमति के बाद उपयोग करने से पहले । अतिरिक्त देखभाल जब photomicrographs प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें कि माइक्रोग्राफ कलाकृतियों शामिल नहीं प्राप्त करने का प्रयोग किया जाना चाहिए । ऑक्सीजन के अभाव में सेल आकृति विज्ञान काफी बदल जाता है । दो अलग morphotypes सभी anaerobically विकसित कोशिकाओं के लिए विख्यात हैं । वृद्धि और ऑक्सीजन के अभाव में स्तनधारी कोशिकाओं को बनाए रखने की क्षमता कोशिका शरीर विज्ञान के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता, polymicrobial बातचीत, और उपंयास कैंसर दवा विकास के लिए कृत्रिम रास्ते के लक्षण वर्णन ।

Introduction

ठोस ट्यूमर से कोशिकाओं, स्टेम सेल niches, और उन अस्तर श्लैष्मिक सतहों वातावरण में मौजूद है कि अनुभव कम ऑक्सीजन का स्तर, anoxia सहित1,2,3,4। सामांय शारीरिक राज्यों में, ऑक्सीजन हाइपोक्सिया के anoxia (ऑक्सीजन की पूरी अनुपस्थिति)5,6से परे बदलता है । बोध है कि वायुमंडलीय ऑक्सीजन प्रतिकूल स्तनधारी सेल प्रतिकृति को प्रभावित करता है और है कि इन विट्रो सेल विकास में समाप्त ऑक्सीजन शर्तों के तहत अनुकूलित किया जा सकता 1970 के दशक में सूचित किया गया था । रिक्टर एट अल. 7 से पता चला कि 1 – 3% ऑक्सीजन का स्तर (हाइपोक्सिया) बढ़ाया चढ़ाना दक्षता के रूप में वायुमंडलीय ऑक्सीजन की तुलना में (20%). मानवी द्विगुणित कोशिका आयुष्यात८hypoxic संस्कृति की स्थिति में भी विस्तारित है.

vivo में, hypoxic स्थितियों जब ऑक्सीजन भंडार (जैसे, तीव्र व्यायाम के दौरान) समाप्त हो रहे हैं, जिसमें एटीपी उत्पादन एरोबिक श्वसन से किण्वन के लिए कंकाल की मांसपेशी में बंद है (anaerobic श्वसन) के साथ अंत-लैक्टिक एसिड9के उत्पाद । रोग, कैंसर ट्यूमर में, ट्यूमर मास के इंटीरियर गरीब vascularization10के कारण anoxic करने के लिए hypoxic है । ट्यूमर अंदरूनी पर सीमित छिड़काव का प्रभाव स्वतंत्र रूप से ट्यूमर1बाध्य anaerobes द्वारा बृहदांत्र अंदरूनी द्वारा मान्य है । Mechanistically, हाइपोक्सिया में ट्यूमर सेल अस्तित्व हाइपोक्सिया की अभिव्यक्ति पर पूरी तरह निर्भर होने लगा है-inducible फैक्टर 1-अल्फा जीन (HIF1-अल्फा), जो हाइपोक्सिया4,11 के लिए प्रारंभिक सहज प्रतिक्रिया है , 12. HIF1-अल्फा गर्मी सदमे प्रोटीन कि बांध HIF1-अल्फा प्रमोटर और जीन प्रतिलेखन12को विनियमित द्वारा hypoxic शर्तों के तहत प्रेरित है । ये गर्मी सदमे प्रोटीन विभिंन ट्यूमर hypoxic microenvironment में देखा phenotypes की प्रेरण में सहायता करने के लिए माना जाता है । ये phenotypes कोशिका झिल्ली ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन और glycolysis की दर (Warburg प्रभाव)13. परिणाम mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण से एक स्विच करने के लिए स्तनपान किण्वन है ।

Anoxic अस्तित्व भी ग्लूकोज के लिए विकल्प का उपयोग करने के अस्तित्व की घटना14,15का समर्थन कर सकते हैं । सबसे अच्छा अध्ययन किया स्तनधारी उदाहरण तिल चूहे, जो एक फ्रुक्टोज संचालित glycolytic किण्वन मार्ग14के माध्यम से ऑक्सीजन के बिना लगभग 20 मिनट के लिए जीवित रह सकते है । एक वैकल्पिक अनुकूलन कुछ मछली में होता है (जैसे, कार्प [Carassius सपा.], जो काफी लंबे समय तक के लिए जीवित रह सकते है अवधि के लिए टर्मिनल के रूप में इथेनॉल के साथ glycolysis का उपयोग कर उत्पाद)15। दोनों ही मामलों में, किण्वन ऑक्सीजन के अभाव में अस्तित्व को सक्षम करने चयापचय ड्राइव । anoxic अस्तित्व के लिए वर्तमान परिकल्पना है कि इतनी देर के रूप में HIF1-अल्फा हाइपोक्सिया के दौरान सक्रिय है, mitochondrial श्वसन, ऑक्सीजन की आवश्यकता के बिना, anaerobic शर्तों के तहत होता है16. इसके अलावा, यह माने है कि hypoxic/anoxic अस्तित्व के लिए एक fermentative मार्ग का उपयोग ट्यूमर अस्तित्व को बढ़ाता है क्योंकि कोशिकाओं ऑक्सीडेटिव तनाव से बचने के जो कोशिका अस्तित्व17के लिए हानिकारक साबित हो सकता है । यह मांगना हाल के एक अध्ययन द्वारा समर्थित है जो दिखाता है कि cardiomyocytes में, हाइपोक्सिया ट्यूमर सेल17पर रखा ऑक्सीडेटिव तनाव कम कर देता है ।

तिथि करने के लिए, anoxic स्तनधारी सेल अस्तित्व के लिए एक fermentative मार्ग की अनिवार्य प्रकृति साहित्य में दिया गया है, कारण, बड़े हिस्से में, अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए ऑक्सीजन की पूरी अनुपस्थिति में संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अक्षमता । हालांकि, anaerobic अस्तित्व के लिए glycolysis के लिए एक विकल्प बैक्टीरिया में होता है । कुछ बैक्टीरिया, नाइट्रोजन या सल्फेट (अन्य यौगिकों के बीच) में ऑक्सीजन के अभाव में cytochrome oxidase प्रणाली के लिए टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकार्यता के रूप में सेवा कर सकते हैं18. हालांकि जीवाणु और eukaryotic विकास समानांतर पिछले सार्वभौमिक आम पूर्वज से हट कर के बाद से हुई, यह अनुमान है कि mitochondria कोशिकाओं को ऊर्जा प्रदान कर रहे थे १,५४२,००० साल के लिए 19 महासागरों की ऑक्सीजन से पहले . शोधकर्ताओं के बाद से पता चला है कि अलग mitochondria ऑक्सीजन के अभाव में एटीपी का उत्पादन कर सकते हैं, टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में नाइट्राइट के साथ, यह मान लेना उचित है कि कोशिकाओं को समय की अवधि के लिए 3 दिन से अधिक ऑक्सीजन के अभाव में कार्य कर सकता है 20 , 21 , 22 , 23. इस अध्ययन में वर्णित कार्यप्रणाली कई कोशिका रेखाओं के anaerobic स्तनधारी सेल वृद्धि के लिए एक उपयोगिता है ।

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Protocol

1. विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों के Anaerobic कल्चर के लिए मीडिया तैयार करें

  1. एक anoxic सेल संस्कृति25के लिए पूरा PS-७४६५६ मध्यम बनाओ ।
    1. आसुत नाइट्राइट स्टॉक समाधान (5 M; 100x) को भंग करके नाइट्राइट के १७.२५ ग्राम के ५० मिलीलीटर में आसवन जल, फिर इसे निष्फल करने के लिए फ़िल्टर करें ।
    2. कम ग्लूकोज DMEM के ५० मिलीलीटर प्रति नाइट्राइट स्टॉक समाधान की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें (1 g/l के साथ ११० मिलीग्राम/l के एल-glutamine, ५८४ मिलीग्राम/l of सोडियम पाइरूवेट, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS; हीट-निष्क्रिय).
      नोट: 10% से अधिक FBS सांद्रता के उपयोग विषाक्त कर रहे हैं । नोट की, एक कैंसर सेल लाइन का परीक्षण किया नाइट्राइट के साथ मीडिया के लिए एक कम सहिष्णुता था (एमडीए-एमबी-२३१, स्तन कैंसर सेल लाइन) और, इस प्रकार, नाइट्राइट के अभाव में उगाया गया था । इसके अलावा, हालांकि ps-७४६५६ मध्यम सभी सेल लाइनों है कि (n = 9), कुछ सेल लाइनों (जैसे, वीरो कोशिकाओं) उच्च कोशिका सांद्रता और पी एस-७४६५६ उच्च ग्लूकोज के साथ में एक उच्च व्यवहार्यता का प्रदर्शन का परीक्षण किया गया के विकास का समर्थन (४.५ g/DMEM 25.
    3. एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में मध्यम के 20 मिलीलीटर रखें । टोपी कस मत करो; यह ढीला होना चाहिए ।
    4. De-गैस मध्यम सतह क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए एक लगभग ४५ डिग्री कोण पर एक वैक्यूम बेल जार में ट्यूब रखकर माध्यम, ।
    5. एक वैक्यूम पंप, या उसके समकक्ष, कमरे के तापमान पर का उपयोग कर एक निर्वात लागू करें । वैक्यूम बनाए रखें जब तक बुलबुले अब नहीं मनाया जाता है (24-48 एच) ।
    6. जार से ट्यूब निकालें और तुरंत टोपी बंद करने के लिए, मध्यम में हवा की शुरूआत को कम करने के लिए ट्यूब सील ।
    7. कमर्शियल anaerobic चैंबर में ट्यूब प्लेस ।
    8. ट्यूब कैप को ढीला और ट्यूब में वातावरण की अनुमति देने के लिए चैंबर में anaerobic गैस के मिश्रण के साथ कम से equilibrate के लिए 24 ज ।
      नोट: मध्यम कक्ष में तब तक रहना चाहिए जब तक इसका उपयोग नहीं किया जाता । इस प्रक्रिया को तेज करने के लिए, ट्यूब फ्लश anoxic गैस मिश्रण है, जो एच2, सीओ2, और एन 2 के होते हैं, जो anoxic गैस से भरा पिपेट एक बाँझ हस्तांतरण का उपयोग कर के साथ कम से 3x।
    9. Degas सभी ट्यूबों (10-15 मिनट) anaerobic चैंबर में रखा के रूप में ट्यूब सील और चैंबर में रखने से पहले ऊपर वर्णित है । उपयोग करने से पहले, यह anaerobic गैस 1.5-2 मिलीलीटर हस्तांतरण पिपेट या पिपेट सुझाव है कि anoxic गैस के साथ कम से फ्लश किया गया है का उपयोग मिश्रण के साथ फ्लश ।
    10. जबकि anaerobic चैंबर में, एक बाँझ degassed माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए मध्यम के १०० µ एल निकालें और यह भंग ऑक्सीजन चैंबर के भीतर एक ऑक्सीजन जांच का उपयोग करने के लिए परीक्षण ।
      नोट: ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड निर्माता का उपयोग करने से पहले प्रोटोकॉल प्रति तुले है । ठीक से degassed और equilibrated anaerobic गैस मिश्रण मीडिया के रीडिंग 0 रहे हैं ।
      चेतावनी: यदि रीडिंग ऑक्सीजन के ०.३ पीपीएम से ऊपर हैं, anaerobic चैंबर में मीडिया की मशीन के लिए अधिक समय के बाद से मध्यम equilibrate की आवश्यकता है जारी है ।

2. विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों की Anoxic खेती

  1. नामित दिवस-1
    1. anoxic और normoxic संस्कृति नियंत्रण के लिए ९०% संगम के लिए एक T150 कुप्पी में कोशिकाओं (३७ ° c, 5% सह2) बढ़ाएँ ३ २४-well प्लेट्स के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं (८०% संगम) प्रदान करने के लिए ।
      नोट: इस अध्ययन के लिए हेला २२९ और वीरो कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल भी परीक्षण किया गया था और विकास और सात अंय सेल लाइनों के रखरखाव के लिए सफल साबित25।
    2. आकांक्षा के द्वारा कुप्पी से मध्यम निकालकर उसे 10 मिलीलीटर HBSS से धो लें ।
    3. trypsin के 5 मिलीलीटर के साथ मध्यम बदलें । जब तक कोशिकाओं नेत्रहीन प्लास्टिक से अलग कुप्पी आंदोलन । महाप्राण अधिकांश trypsin, तो अनुयाई कोशिकाओं को उखाड़ फेंक करने के लिए कुप्पी नल । gentamicin को निष्क्रिय करने के लिए उच्च ग्लूकोज DMEM के 10 मिलीलीटर (४.५ g/l के ग्लूकोज, ११० मिलीग्राम/l के एल-glutamine, 10% FBS, ५० µ g/trypsin के एमएल) जोड़ें ।
    4. सभी कोशिका झुरमुट के बाधित होने तक एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को Triturate ।
    5. कोशिकाओं गिनती और व्यवहार्यता का निर्धारण मानक hemocytometer और trypan नीले रंग अपवर्जन विधि या स्वचालित समकक्ष का उपयोग कर ।
    6. उच्च ग्लूकोज DMEM में कोशिकाओं २.२४ एक्स 105 कोशिकाओं की एक कोशिका घनत्व के लिए ऊपर उल्लेख के रूप में निलंबित/
    7. एक 24-well टिशू कल्चर प्लेट के कुओं के लिए सेल सस्पेंशन की 1 मिलीलीटर जोड़ें (२.२४ x 105 कोशिकाओं/वेल; ८०% संगम). anoxic संस्कृति और एक नियंत्रण normoxic संस्कृति के लिए एक दूसरे के लिए बीज 1 थाली ।
    8. normoxic स्थितियों में ३७ ° c (5% सह2) के लिए 24 एच के लिए कोशिकाओं को मशीन ।
      नोट: कोशिकाओं को विभिंन अच्छी तरह से आकार प्लेटों में चढ़ाया जा सकता है । हालांकि, कुप्पी में anoxic वृद्धि के लिए कोशिकाओं बोने प्रणाली में ऑक्सीजन की शुरूआत के जोखिम को चलाता है, जब तक देखभाल के लिए पूरी तरह से वायुमंडलीय गैस बाहर फ्लश करने का प्रयोग है ।
  2. 0 दिन निर्दिष्ट
    1. normoxic की मशीन के 24 घंटे के बाद, anoxic वृद्धि के लिए anaerobic चैंबर (एक वाणिज्यिक anaerobic कक्ष में प्लेटें रखें; चित्रा 1) ।
    2. तुरंत एंटीबायोटिक मुक्त de-मार डाला PS-७४६५६ माध्यम है जो anaerobic चैंबर के लिए 24 ज के लिए आदत किया गया है के लिए माध्यम बदल जाते हैं । एक स्पंज तौलिया के साथ एक कंटेनर में थाली प्लेस और ढीला इसे बंद नमी बनाए रखने के लिए ।
      नोट: normoxic विकास के लिए प्लेटें हूबहू एक अपवाद है कि सभी उपचार वायुमंडलीय परिस्थितियों में किया जाता है के साथ नियंत्रित कर रहे हैं ।
  3. निर्दिष्ट दिवस 1
    1. anaerobic की मशीन के दिन 1 वाणिज्यिक anaerobic कक्ष जो 10% एच2, 10% सह2, और ८०% N2के मानक anaerobic गैस मिश्रण शामिल है में मशीन के 24 घंटे के बाद शुरू होता है ।
    2. विभिंन समय अवधि के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    3. समय के साथ रंग बदलने के लिए anaerobic माध्यम की निगरानी करें ।
      नोट: लाल-नारंगी से रानी तक का एक रंग बदलाव माध्यम को बदलने के लिए समय का संकेत है । इसके होने में 2 सप्ताह तक का समय लग सकता है । लाल-नारंगी से लेकर पीले से मध्यम में एक रंग का बदलाव जीवाणु संदूषण की उपस्थिति का संकेत देता है ।
    4. जब मध्यम लाल से लेकर रानी तक बदलता है तो आकांक्षा द्वारा runagate कोशिकाओं को हटा दें ।
    5. degassed और anaerobic गैस equilibrated microfuge ट्यूबों में runagate कोशिकाओं के साथ aspirated खर्च मीडिया प्लेस, ट्यूब बंद करते हुए सुनिश्चित करें कि सील सुरक्षित है बनाने, और फिर उंहें (३२६ x g, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर) केंद्रापसारक । तुरंत aspirated मीडिया में अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर नए degassed PS-७४६५६ मध्यम के साथ बदलें ।
    6. यह खोलने से पहले anaerobic कक्ष में छर्रों कोशिकाओं के साथ microfuge ट्यूब रखें । महाप्राण खर्च मध्यम और ताजा degassed PS-७४६५६ मध्यम के साथ microfuge ट्यूब में 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए प्रतिस्थापित करें ।
    7. ट्यूब से 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को लौटें ।

3. Anaerobically प्रसंस्कृत कोशिकाओं की माइक्रोस्कोप द्वारा Phenotypic कोशिका विभेद का मूल्यांकन

  1. जबकि anaerobic चैंबर में, प्लेट एक सील बॉक्स में anaerobic गैस मिश्रण के साथ फ्लश और बॉक्स को बंद रखें ।
    नोट: बॉक्स नमी प्रदान करने के लिए और बाहर सुखाने से प्लेट को रोकने के लिए एक नम कागज तौलिया शामिल होना चाहिए । माइक्रोस्कोपी के लिए, सैंडविच बैग सबसे अच्छा काम के बाद से वे पतले हैं ।
    1. माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए, पूरी तरह से बैग सील और चैंबर से हटा दें ।
    2. ध्यान से प्लेट पर प्लास्टिक की थैली खिंचाव, कैमरा लगाव के साथ एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की जांच और विभिंन आवर्धन पर photomicrographs ले लो ।
    3. कक्ष के लिए सील बैग में थाली लौटें, और कदम 2.3.3 में वर्णित के रूप में गर्मी जारी है ।
    4. निलंबन में हैं जो runagate कक्षों को अलग से विश्लेषण करने के लिए, चरण -6 में उल्लिखित चरणों का पालन करें ।
      नोट: इन कोशिकाओं को तो एरोबिक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या इस विशिष्ट जनसंख्या के परीक्षण के लिए anaerobic चैंबर को लौटाया जा सकता है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल की ताकत लंबी उंर के अपने समर्थन में है और कई सेल लाइनों के विकास और मांयता है कि वहां एक गहरा परिवर्तन और विचलन25आकृति विज्ञान में है । इस अध्ययन का सबसे महत्वपूर्ण तत्व सख्त anaerobiosis के तहत कोशिकाओं के हस्तांतरण और रखरखाव है । यह एक anaerobic के लिए प्रोटोकॉल (1 चित्रा) और आश्वासन दिया है कि या तो माइक्रोस्कोपी या अंय परीक्षण के लिए हटा कोशिकाओं को एक सील वातावरण में रखा जाता है अधिकतम संगठित चैंबर की आवश्यकता है । तारीख करने के लिए, anoxic अस्तित्व की सीमा 15-अमर कैंसर सेल लाइनों के लिए 17 दिन और परिवर्तित सेल लाइनों के लिए 17 दिनों के लिए (नौ सेल लाइनों anoxic वृद्धि के लिए जांच) था । व्यवहार्य कोशिकाओं के स्तर पर, एक बार इन कोशिकाओं anoxic शर्तों को स्थानांतरित कर रहे थे, कम से 10% गिरावट आई, ९०% की एक अधिकतम करने के लिए, इससे पहले कि वे स्थिर । सभी कक्ष पंक्तियाँ समय के साथ वृद्धि निलंबन में कक्षों के अनुपात के साथ दोहरी phenotypes (सीमित और runagate) करने के लिए वापस आ । यहां तक कि कई हफ्तों की एक विस्तारित मशीन के बाद, वहां कुछ सीमित कोशिकाओं बनी रही है, लेकिन कोशिकाओं के बहुमत गोल runagate आकृति विज्ञान (चित्रा 2) में थे । रिपोर्ट के रूप में, इन runagate कोशिकाओं व्यवहार्य और अपने सेल चक्र के माध्यम से रवाना हो रहे हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ग्लूकोज का स्तर और नाइट्राइट एकाग्रता शामिल हैं । उस ने कहा, पर ६० विभिंन मीडिया योगों कि उनके दोनों normoxic और anoxic मशीन, PS-७४६५६ माध्यम का समर्थन करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया से अस्तित्व और लगभग सभी सेल लाइनों की प्रतिकृति का समर्थन कर रहा था परीक्षण किया ।

एक आवश्यक अवलोकन anoxic कोशिकाओं के भेदभाव, सेल की परवाह किए बिना परीक्षण किया गया था, दो अलग phenotypes, सीमित और runagate (चित्रा 2) में । normoxic monolayer कोशिकाओं के अनुरूप, सीमित कोशिकाओं ऊतक संस्कृति प्लास्टिक से जुड़े थे । हालांकि, लगाव कमजोर था, trypsinize करने के लिए आसान या परिमार्जन से बेदखल करना, normoxic शर्तों के तहत हुई लगाव से । इसके अतिरिक्त, कक्ष आकृति विज्ञान अधिक धुरी (वृक्ष) एक्सटेंशन26के साथ छोटा था । दूसरा सेलुलर morphotype मनाया निलंबन में कोशिकाओं थे (यानी, runagate कोशिकाओं) । इन कोशिकाओं को सहज ऊतक संस्कृति का इलाज प्लास्टिक, जो एक छोटे सेल आकार और कम कोशिका द्रव्य के साथ गोल थे की उपस्थिति में मुक्त अस्थायी एकल सेल निलंबन में परिवर्तित । वे शास्त्रीय निलंबन संस्कृति कोशिकाओं है, जो आम तौर पर एक एंजाइमी अनुकूलन की आवश्यकता होती है, समुच्चय में बढ़ने से भिंन है, गैर ऊतक संस्कृति का इलाज कंटेनरों की आवश्यकता है, और अपने normoxic समकक्षों27से भी बड़ा है । समय के साथ, anoxic कोशिका आबादी निलंबन में runagate कोशिकाओं की है कि करने के लिए एक मुख्य रूप से सीमित monolayer से शिफ्ट करने के लिए मनाया जा सकता है । निलंबन में इन कोशिकाओं को व्यवहार्य और नकल कर रहे थे; इस प्रकार, देखभाल के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए supernatant हटा दिया जाना चाहिए । इसके अलावा, ध्यान दें की है कि मध्यम पूरे anaerobic गर्मी की अवधि में बदलने की आवश्यकता नहीं थी । anoxic की मशीन के नीचे मध्यम पीएच संकेतक, इसके normoxic नियंत्रण के विपरीत, यह भी अपरिवर्तित (यानी, लाल रह गया था) । अन्वेषक runagate कोशिकाओं फसल के लिए चाहते हैं, या माध्यम बदलने के लिए, कोशिकाओं को anaerobic चैंबर के भीतर कसकर बंद कर रहे हैं कि anaerobic गैस फ्लश माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । tethered कोशिकाओं के सेल धोने के लिए, प्रक्रिया भी किसी भी ऑक्सीजन जोखिम को खत्म करने के लिए चैंबर में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

एक दीर्घकालिक खेती के लिए अंतिम कोशिका व्यवहार्यता था, काफी हद तक, इस्तेमाल किया जा रहा सेल पर निर्भर है और संगम जो कुओं या कुप्पी शुरू में वरीयता प्राप्त थे (आंकड़े 3 और 4) । उस ने कहा, एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु ८०% है, जो इष्टतम विकास का सबसे बड़ा मौका था । इसके अतिरिक्त, 10% की व्यवहार्यता के ६०% के लिए एक सेल लाइन पर निर्भर नुकसान प्रारंभिक 2 में हो सकता है-4 दिन । हालांकि, इस प्रयोग की कार्यक्षमता के दौरान, शेष कक्षों को कक्ष चक्र के माध्यम से सायकल की गई और28को दोहराया गया । सेल की खेती के दीर्घायु होने पर सीडिंग संगम प्रभाव के आंकड़े 3 और 4में देखे जा सकते हैं । दोनों हेला २२९ और वीरो कोशिकाओं को 24 अच्छी तरह से प्लेटों में ४०%, ६०%, और ८०% प्रारंभिक संगम (१००% संगम = २.८ x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) और फिर 17 दिनों के लिए ऑक्सीजन के अभाव में मशीन वरीयता दी गई । हेला २२९ सेल anoxic वृद्धि ८०% की एक प्रारंभिक सीडिंग संगम पर अनुकूलित किया गया था । इसके विपरीत, वीरो कोशिकाओं इष्टतम सीडिंग संगम ६०% था । यह शुरू में इस्तेमाल किया सेल लाइन पर निर्भर बोने की सघनता को अनुकूलित करने की आवश्यकता को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : स्तनधारी कोशिकाओं की संस्कृति के लिए anaerobic चैंबर सेट-अप का मॉडल । न्यूनतम सामग्री की आवश्यकता ऊतक संस्कृति प्लेटें, बाँझ हस्तांतरण pipets, एक खतरा बैग, de-मार डाला मीडिया, मीडिया या अन्य तरल पदार्थ के त्याग के लिए एक ट्यूब, और को बनाए रखने जबकि माइक्रोस्कोप करने के लिए प्लेटों के हस्तांतरण के लिए सील बैग शामिल anaerobic अटी आहेत.

Figure 2
चित्रा 2: Anoxic हेला कोशिकाओं सुघड़ विभेद. (क) इस पैनल से पता चलता है normoxic हेला सेल के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी नियंत्रण 4 दिन के बाद टीका, एक 20X इज़ाफ़ा के साथ । (ख) यह पैनल anoxic हेला कोशिकाओं 17 दिनों के बाद टीका (दिन 1 PS-७४६५६ मध्यम, ८०% वरीयता प्राप्त संगम, और एक 20X इज़ाफ़ा) से अपरिवर्तित के साथ दिखाता है । (ग) इस पैनल के एक सील प्लास्टिक बैग के इंटीरियर पर पानी की बूंदों की सूक्ष्म कलाकृतियों से पता चलता है जिसमें एक 24 अच्छी तरह से anoxic प्लेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: anoxic का अनुपात normoxic हेला २२९ व्यवहार्य कोशिकाओं के बाद-17 दिनों की मशीन । इस पैनल normoxic नियंत्रण की तुलना में PS-७४६५६ माध्यम में हेला २२९ कोशिका व्यवहार्यता पर बीज घनत्व के प्रभाव को दर्शाता है । परिणाम मतलब ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं ।

Figure 4
चित्रा 4: anoxic के normoxic वीरो व्यवहार्य कोशिकाओं 17 दिनों के बाद की मशीन का अनुपात । इस पैनल normoxic नियंत्रण की तुलना में पीएस-७४६५६ माध्यम में वीरो कोशिका व्यवहार्यता पर बीज घनत्व के प्रभाव को दर्शाता है । परिणाम मतलब ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं ।

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Discussion

यह विधि पहली बार स्तनधारी कोशिकाओं है कि ऑक्सीजन के अभाव में समय की विस्तारित अवधि के लिए कल्चरित थे का प्रतिनिधित्व करता है । वर्तमान टिप्पणियों के आधार पर, एक गैर fermentative मार्ग के माध्यम से anoxic वृद्धि की क्षमता स्तनधारी कोशिकाओं लाइनों28, जहां anaerobic वृद्धि phenotype विचलन के परिणामस्वरूप के बीच सार्वभौमिक प्रतीत होता है । यह परीक्षण किया सभी कक्ष लाइनों के लिए मनाया गया । anaerobic खेती के साथ, कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि गोल बन गया, एक निलंबन की तरह जनसंख्या विकसित, और दोहराने के लिए सक्षम थे । माध्यमिक कोशिका प्रकार सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न रहे; हालांकि, कक्ष आकृति विज्ञान धुरी (वृक्ष) आकार करने के लिए वापस आ गया । इन निष्कर्षों anoxic ऊतक संस्कृति की खेती के संबंध में विश्लेषण और टिप्पणियों में एक आम त्रुटि बिंदु । यह आम तौर पर स्वीकार किए जाते है कि जब स्तनधारी कोशिकाओं normoxic शर्तों के तहत हो (5% सह2) दौर और अलग, वे मर रहे हैं । इसके विपरीत ऑक्सीजन के अभाव में हो कोशिकाओं के लिए सही प्रतीत होता है, जो मामले में, कोशिकाओं है कि ऊपर गोल है और अलग, बस एक आकृति विज्ञान अलग सेल उपजनसंख्या हैं ।

anoxic विकास की स्थिति का अनुकूलन सेल लाइन निर्भर है । मध्यम PS-७४६५६ कुल मिलाकर normoxic और anoxic वृद्धि की स्थिति के तहत सभी सेल लाइनों के विकास का समर्थन किया, एमडीए के अपवाद के साथ एमबी-२३१, एक स्तन कैंसर कोशिका लाइन जो नाइट्राइट के अभाव में विकास को प्राथमिकता दी । एक उत्साहजनक अवलोकन है कि एक ९८% के साथ भी प्रति कोशिकाओं के बंद मर-ठीक है, शेष प्रतिकृति, एक उच्च अनुकूलित जनसंख्या में जिसके परिणामस्वरूप । महत्वपूर्ण कार्रवाई भी जब केवल कुछ ही कोशिकाओं को सीधे माइक्रोस्कोप से मनाया जाता है संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए है । इस प्रकार, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि अलग कोशिकाओं मर रहे हैं, या तो trypan नीले रंग अपवर्जन या एक वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता का पता लगाने विधि द्वारा प्रयोग किया जाना चाहिए । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेल की संख्या में इतनी बड़ी कमी के साथ, पर्याप्त कुओं के बाद के प्रयोगों के लिए पर्याप्त कुल सेल संख्या है वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए । व्यवहार्य कोशिकाओं की हानि की उंमीद सेल लाइन और सीडिंग संगम निर्भर है; इस प्रकार, इष्टतम सेल संख्या, समय के साथ, प्रयोग किया जाना चाहिए और अंय सेल लाइनों के साथ निष्कर्षों से extrapolated नहीं किया जा सकता है । उस ने कहा, एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एक ८०% संगम है, जो इष्टतम विकास का सबसे बड़ा मौका है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रक्रिया में anaerobic कदम के दौरान ऑक्सीजन के लिए किसी भी जोखिम, कोई फर्क नहीं पड़ता कैसे संक्षिप्त, रिपोर्ट सहज सेलुलर HIF-1-अल्फा प्रतिक्रिया11,12के कारण निष्कर्षों समझौता करेंगे ।

इस प्रक्रिया के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम है कि de-बक के माध्यम से, ट्यूबों, और अंय सभी उपकरणों और सामग्री का इस्तेमाल किया । ऑक्सीजन के भी बहुत कम स्तर का परिचय किण्वन चयापचय से संक्रमण anaerobic श्वसन को रोक सकता है । वैकल्पिक रूप से, यह fermentative चयापचय इतना लंबा है कि किसी भी प्रयोग हाइपोक्सिया की माप में परिणाम, नहीं anoxia सकता है । cytotoxicity और कीमोथेरेपी गतिविधि को मापने के लिए इस उपंयास प्रक्रिया का उपयोग ठोस ट्यूमर के उपचार में दवा की विफलता को समझाने में मदद कर सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक अपने समर्थन के लिए अनुसंधान और प्रायोजित कार्यक्रमों के Midwestern विश्वविद्यालय के कार्यालय का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whitney A35 anaerobic chamber Don Whitley Scientific  Microbiology International The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator Fisher Scientific 3531
Tissue Culture Hood Labconco DO55735
pipet aid Drummond 4-000-100
sterile transfer pipets Santa Cruz sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes DOT 451-PG
vaccum jar Nalgene 111410862889 BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L) CellGro 10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L) CellGro 10-014-CV
FBS VWR 1500-500
HBSS VWR 20-021-CV
trypsin VWR 25-052-CI
gentamicin Gibco 15750-060
sterile pipets CellTreat 229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150) Santa Cruz sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes DOT 667124
glad ziplock sandwich bags Ziploc Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) Nikon Eclipse TS100
trypan blue Invitrogen T10282
hemocytometer Invitrogen C10283
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000
Rainin microtiter pipets Mettler Toledo Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips Santa Cruz Biotechnology sc-213233 & sc-201717 
test tube rack (50cc tubes) The Lab Depot HS29050A
sodium nitrite Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids Rosti Mepal Rubber maid
paper towels In House
cell scraper CellTreat 229310
PBS In house prepared
70% Ethanol Fisher Scientific 64-17-5
microcentrifuge tubes sterile Santa Cruz sc-200273
biohazard bags with holder (desktop) Heathrow Scientific HS10320
Nitrile Gloves VWR 89428
oxygen electrode eDAQ EPO354
pH meter Jenway 3510
pH paper/ pHydrion Sigma Aldich Z111813

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जीव विज्ञान अंक १३७ anoxia anaerobiosis phenotypic रूपांतर स्तनधारी सेल लाइंस हेला कोशिकाओं वीरो कोशिकाओं दीर्घकालिक संस्कृति
Anaerobic विकास और स्तनधारी सेल लाइनों के रखरखाव
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines. J. Vis. Exp. (137), e58049, doi:10.3791/58049 (2018).

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