Summary
Burada, kurulan hücre hatları anaerobik uzun vadeli ekimi sağlar yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Test edildi en fazla yaşam süresi 17 gün var. Bu yöntem sitotoksik ajanlar test ve anoxically hücreleri çoğaltma Fizyoloji keşfetmek için uygundur.
Abstract
En mukozal yüzeyler tümörler ve kök hücre nişler degradelerin yanı sıra, anoksik vücudun coğrafi alanlardır. Önceki çalışmalar gösteriyor ki kuluçka normoxic (%5 CO2 havada) içinde veya hipoksik (düşük oksijen düzeyleri) koşulları takip bir anoksik kuluçka (ücretsiz oksijen yokluğu) sonuçlarına göre sınırlı canlılık (2-3 gün). Roman bir metodoloji sağlayan bir anoksik hücre ekimi (en az 17 gün; en uzun süre test için) geliştirilmiştir. En önemli bir özelliği Bu metodoloji, oksijensiz sisteme giriliyor sağlamaktır. Bu medya ve reçeteye göre sarf tüpler, yemekler, şişeler ve pipetler bir anaerobik gaz karışımı (H2, CO2, N2) ile malzeme anoksik (oksijen olmayan) ortamına equilibrate izin vererek takip gaz giderme tarafından elde edilir kullanım öncesinde. Ne zaman elde photomicrographs elde edilen filmler eserler içermediğinden emin olmak için ek bakım uygulanmalıdır. Oksijen yokluğunda, hücre morfolojisi önemli ölçüde değişmiş. İki farklı morphotypes tüm hücreler için anaerobik yetiştirilen belirtilmiştir. Yeteneği büyümeye ve oksijen yokluğu memeli hücreleri korumak için Hücre fizyolojisi, polymicrobial etkileşimleri ve Roman kanser ilaç geliştirme biyosentetik yollar karakterizasyonu analizlerine uygulanabilir.
Introduction
Solid tümör, kök hücre nişler ve bu mukozal yüzeylerde astar hücrelerden düşük oksijen düzeylerinde, kanda oksijen azlığı1,2,3,4de dahil olmak üzere ortamlarda adlı biri yok. Normal fizyolojik Birleşik Devletleri, hipoksi, kanda oksijen azlığı (oksijen olmaması)5,6ötesinde oksijenasyonu değişir. Atmosferik oksijen olumsuz memeli hücre çoğaltma etkiler ve o vitro hücre büyümesini tükenmiş oksijen koşullar altında optimize edilebilir gerçekleşme 1970'lerde bildirildi. Richter vd. 7 1-%3 oksijen düzeyleri (hipoksi) kaplama verimliliği ile karşılaştırıldığında atmosferik oksijen (% 20) gelişmiş gösterdi. İnsan diploit hücre ömrü hipoksik kültür koşulları8' de genişletilir.
Vivo, hipoksik koşullar ortaya oksijen depoları tükenmiş (Örneğin, yoğun egzersiz sırasında), olduğunda neyin ATP üretimi fermantasyon (anaerobik solunum) için gelen aerobik solunum kas iskelet ile açık olduğundan laktik asit9son ürünü. Patolojik olarak, kanserli tümörleri, iç içinde kitle için zavallı vaskülarizasyon nedeniyle anoksik hipoksik10tümördür. Tümör iç sınırlı perfüzyon etkisi bağımsız olarak zorunlu anaerobik1tarafından kolonize tümör iç tarafından doğrulanır. Mechanistically, tümör hücre hayatta hipoksi hipoksi-indüklenebilir faktörü 1-alfa Gen ifadesinin yalnızca bağımlı olduğu düşünülmektedir (HIF1-alfa), ilk spontan yanıt hipoksi4,11 olduğu , 12. HIF1-Alfa HIF1bağlamak Isı şok proteinleri tarafından hipoksik koşullarda indüklenen-Alfa organizatörü ve upregulate Gen transkripsiyonu12. Bu ısı şok proteinleri tümör hipoksik microenvironment görülen çeşitli fenotipleri indüksiyon yardım inanılıyor. Bu fenotipleri hücre zarı Glikoz taşıyıcı artan bir ifadesidir ve glikoliz (Warburg etkisi)13oranı sergi. Mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon fermantasyon laktat anahtarından sonucudur.
Anoksik hayatta kalma glikoz hayatta kalma fenomen14,15desteklemek için alternatifler de kullanabilir. En iyi okudu memeli yaklaşık 20 dakika oksijen ile fruktoz tahrik glycolytic fermantasyon yolu14olmadan yaşayabilir kör fare örnektir. Alternatif bir uyum içinde belirli balık oluşur (Örneğin,'önemli ölçüde daha uzun hayatta kalabileceği sazan [Carassius sp.], zaman glikoliz etanol ile terminal yan ürün kullanarak dönemleri)15. Her iki durumda da, fermantasyon oksijen yokluğunda yaşama etkinleştirme metabolizma kullanıyor. Geçerli anoksik hayatta kalmak için bu kadar uzun HIF1hipotezdir-Alfa hipoksi, mitokondrial solunum sırasında aktif oksijen ihtiyacını ortaya çıkar olmadan anaerobik16altında. Ayrıca, hücreleri hücre hayatta kalma17' ye zararlı olarak kanıtlamak olabilir oksidatif stres önlemek bu yana fermantatif bir yol kullanımı hipoksik/anoksik hayatta kalmak için tümör hayatta kalma artırır öne ise. Bu postülatı cardiomyocytes, hipoksi tümör hücre17tarihinde yerleştirilen oksidatif stresi azaltır gösteren bir çalışmada tarafından desteklenmektedir.
Bugüne kadar bir fermantatif yol anoksik memeli hücre hayatta kalmak için temel doğası literatürde, kusura bakma ama, bir yetersizlik kültür memeli hücreleri oksijen 3 günden uzun olmaması için büyük ölçüde kökleşmiş. Ancak, bakteriler glikoliz anaerobik hayatta kalmak için bir alternatif oluşur. Bazı bakteriler, azot veya sülfat (arasında diğer bileşikleri) yokluğunda sitokrom oksidaz sistemi oksijen18elektron alıcısı olarak hizmet verebilir. Her ne kadar son evrensel ortak atadan uzaklaşan beri paralel olarak bakteriyel ve ökaryotik evrim oluştu, bu mitokondri 1.542 milyon yıl önce okyanuslarda19 oxygenation hücrelere enerji sunuyorlardı tahmin edilmektedir . Hücreler zaman oksijen yokluğu 3 gün daha uzun süreler için işlev olabilir varsaymak makul çünkü araştırmacılar izole mitokondri elektron alıcısı olarak nitrit ile oksijen yokluğu ATP üretebilir göstermiştir 20 , 21 , 22 , 23. Bu çalışmada açıklanan metodoloji anaerobik memeli hücre büyüme çok sayıda hücre hatları için bir yardımcı program vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çeşitli memeli hücre satırlarını anaerobik kültür için ortam hazırlamak
-
Anoksik hücre kültür25tam PS-74656 orta yapmak.
- 17.25 g nitrit 50 ml distile deiyonize su ile çözülerek steril nitrit hisse senedi çözüm (5 M; 100 x) yaptıktan sonra bu sterilize etmek için filtre.
- Nitrit hisse senedi çözüm düşük glikoz DMEM (glikoz 1 g/L) 50 mL başına 0.5 mL 110 mg/L L-glutamine, 584 mg/L sodyum pyruvate ve % 10 fetal Sığır serum ile ekleyin (FBS; ısı-inaktive olur).
Not: FBS konsantrasyonu % 10 toksik büyük kullanımı. Not, bir kanser hücre satır test nitrit (MDA-MB-231, meme kanseri hücre satır) ile media için düşük tolerans vardı ve böylece, nitrit, yokluğunda büyüdü. Buna ek olarak, PS-74656 orta test edildi tüm hücre satırlarını büyüme desteklenen rağmen (n = 9), belirli hücre hatları (Örneğin, Vero hücreleri) sergilenen daha yüksek hücre konsantrasyonları ve yüksek glikoz (4,5 g/L) DMEM ile daha yüksek bir canlılık içinde PS-74656 25. - Orta 20 mL steril 50 mL konik santrifüj tüpü yerleştirin. Kap sıkın değil; gevşek olmalıdır.
- Orta de-gaz tüp bir vakum çan kavanoza koyarak bir yaklaşık 45 ° açılı orta yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için.
- Bir vakum pompası veya eşdeğeri, oda sıcaklığında kullanarak bir vakum uygulanır. Kabarcıklar artık (24-48 h) gözlenir kadar vakum korumak.
- Kavanozdan tüpü çıkarması ve mühürleme hava giriş Orta içine en aza indirmek için tüp kap, hemen kapatın.
- Tüp ticari anaerobik odasına koyun.
- Tüp kapağı gevşetin ve atmosfer bu en az 24 saat için odasında anaerobik gaz karışımı ile equilibrate için tüp izin vermek.
Not: Bu kullanılana kadar orta odasında kalır. Tüp işleminizi, floş hızlandırmak için steril transfer pipet kullanarak anoksik gaz karışımı ile en az 3 x H2, CO2ve N oluşan anoksik gazı ile doldurulmuş2. - Tüm borular (10-15 dk) tüp mühürleme ve odasında yerleştirmeden önce yukarıda açıklandığı gibi anaerobik odasında yerleştirilen degas. Kullanmadan, 1.5-2 mL transfer pipetler kullanarak anaerobik gaz karışımı ile temizleme veya en az 3 x ile anoksik temizlenen pipet İpuçları gaz.
- Odasında anaerobik iken, steril degassed mikro-santrifüj tüpü için orta 100 µL kaldırmak ve bir oksijen sondası odası içinde kullanarak çözünmüş oksijen için test edin.
Not: Oksijen elektrot kullanmadan üreticinin Protokolü önce kalibre edilmiş. Düzgün bir şekilde degassed ve denge anaerobik gaz karışımı medya okumaları 0.
Dikkat: 0.3 ppm oksijen okumaları, orta equilibrate için daha fazla zaman gerekli olduğundan anaerobik odası medyada kuluçkaya devam.
2. anoksik çeşitli memeli hücre satırlarını tarımı
-
Belirlenen gün -1
- Hücreler (37 ° C, % 5 CO2) % 90 izdiham hücreleri yeterli sayıda üç 24-şey tabak (% 80 izdiham) sağlamak anoksik ve normoxic kültür kontrolü için bir T150 şişeye büyümeye.
Not: Bu çalışma için HeLa 229 ve Vero hücreleri kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı ayrıca test ve büyüme ve yedi diğer hücre hatları25bakımı için başarılı oldu. - Orta balonun aspirasyon tarafından kaldırmak ve HBSS 10 mL ile yıkayın.
- Orta tripsin 5 mL ile değiştirin. Hücreleri görsel olarak plastik ayırmak kadar şişeye kışkırtmak. Tripsin çoğunu Aspire edin sonra şişeye yapışık hücreleri çıkarmak için dokunun. Yüksek glikoz DMEM 10-15 mL ekleyin (4,5 g/M glikoz, 110 mg/L L-glutamine, % 10 FBS, gentamisin 50 µg/mL) tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için.
- Tüm hücre kümeleri bozulduğu kadar 25 mL pipet kullanarak hücreleri triturate.
- Hücreleri saymak ve standart hemasitometre ve trypan mavi boya hariç tutma yöntemini veya otomatik eşdeğer kullanarak canlılığı belirlemek.
- Yüksek glikoz DMEM hücrelerde askıya alma 105 hücre/mL x 2,24 hücre yoğunluğu için yukarıda belirtildiği gibi.
- 24-iyi doku kültürü plaka wells için hücre süspansiyon 1 mL ekleyin (2,24 x 105 hücreleri/iyi; % 80 izdiham). Anoksik kültür ve başka bir denetim normoxic kültür için tohum 1 plaka.
- Normoxic koşulları (%5 CO2) için 24 saat içinde 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
Not: Hücreleri çeşitli iyi ölçekli levha kaplama. Bakım tamamen atmosferik gaz temizlemek için icra sürece ancak hücreleri şişeler anoksik büyüme için tohum oksijen getirilmesi riskini sisteme çalışır.
- Hücreler (37 ° C, % 5 CO2) % 90 izdiham hücreleri yeterli sayıda üç 24-şey tabak (% 80 izdiham) sağlamak anoksik ve normoxic kültür kontrolü için bir T150 şişeye büyümeye.
-
Belirlenen gün 0
- Normoxic kuluçka 24 saat sonra plakaları anoksik büyüme için anaerobik odasına (ticari anaerobik odası; yerleştirin. Şekil 1).
- Hemen hangi anaerobik odasına 24 h için iklime alıştırılacağı antibiyotik ücretsiz de-gazla PS-74656 orta orta değiştirin. Nemli bir havlu ile bir kapta plaka yerleştirin ve gevşek nem korumak için kapatın.
Not: Tabakları normoxic büyüme için aynı şekilde tüm tedaviler atmosferik koşullar altında yapılır özel durum ele alınır.
-
Belirlenen gün 1
- Gün 1, anaerobik Kuluçka kuluçka %10 H2, % 10 CO2ve % 80'i N2standart anaerobik gaz karışımı içeren ticari anaerobik odasında 24 saat sonra başlar.
- Hücreleri çeşitli süreler için kuluçkaya.
- Zaman içindeki renk değişimi için anaerobik orta izlemek.
Not: Kırmızı-turuncu pembe bir renk kayması zaman orta değiştirmek için sinyal gönderir. Bu gerçekleşmesi için 2 hafta sürebilir. Bir renk vardiya orta kırmızı-turuncu sarı bir bakteriyel kontaminasyon varlığını gösterir. - Orta için pembe kırmızıdan değiştiğinde, runagate hücreleri tarafından aspirasyon kaldırın.
- Yer degassed ve anaerobik gaz runagate hücrelerde emişli harcanan ortamıyla microfuge tüpler equilibrated, tüpler mühür güvenli ve sonra onları (326 gx; 10 dakika oda sıcaklığında) santrifüj kapasitesi emin yaparken yakın. Hemen iyi emişli ortamı yeni degassed PS-74656 orta 1 mL ile değiştirin.
- Microfuge tüp pelleted hücrelerle açmadan önce anaerobik odası yerleştirin. Harcanan orta Aspire edin ve taze degassed PS-74656 orta ve 1 ml microfuge tüp toplam hacmi ile değiştirin.
- Hücreleri tüm tüpünden 24-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda dönün.
3. fenotipik hücre farklılaşması anaerobik kültürlü hücrelerinin mikroskopisi tarafından değerlendirilmesi
-
Anaerobik odası ise, plaka anaerobik gaz karışımı ile boşaltılan resealable kutusuna yerleştirin ve kutusunu kapatın.
Not: Nem ve plaka kurumasını önlemek için nemli kağıt havlu kutusu içermelidir. Onlar ince olduğundan Mikroskopi için sandviç paketi en iyi iş.- Hücreleri mikroskop altında gözlemlemek için tamamen çanta mühür ve odasından kaldırın.
- Dikkatle plastik torba plaka üzerinde streç, bir ters faz kontrast mikroskobu ile fotoğraf makinesi eki kullanarak hücreleri incelemek ve photomicrographs farklı büyütme oranlarında al.
- Plaka mühürlü çantada odasına dönün ve kuluçka 2.3.3. adımda anlatıldığı gibi devam etmemiz gerekiyor.
- Süspansiyon içinde olan runagate hücreler ayrı ayrı analiz için 2.3.5. adımda anlatılan adımları izleyin.
Not: Bu hücreler daha sonra aerobik test etmek için kullanılabilir veya bu belirli nüfusu testleri için anaerobik odasına döndü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı gücünü verdiği destek, uzun ömürlü ve birden çok hücre satırı büyüme ve bir derin değiştirme ve ıraksak evrim süreçleri sonucu hücre morfolojisi25vardır tanıma yatıyor. Bu çalışmanın en önemli unsuru transfer ve sıkı anaerobiosis altında hücrelerin bakımı sağlamaktır. Bu bir anaerobik odası (Şekil 1) iletişim kuralının en üst düzeye çıkarmak için düzenlenen ve hücreleri mikroskopi veya diğer sınama için kaldırıldı güvence kapalı bir ortamda tutulur gerektirir. Bugüne kadar anoksik hayatta kalma aralığını 15-17 gündü ölümsüz kanser hücre satırları ve yukarı 17 gün boyunca hücre hatları (dokuz hücre hatları için anoksik büyüme ekranlı) ölçülere. Bu hücreler anoksik koşulların için taşınan bir kez onlar stabilize önce hücrelerin, düzeyde en az % 10, en fazla % 90, reddetti. Tüm hücre satırları çift fenotipleri döndürülmesi (kaşif balonlu keşif ve runagate) zaman içinde artan süspansiyon hücrelerde oranı ile. Genişletilmiş bir kuluçka birkaç hafta sonra bile gergin bazı hücreler kaldı ama yuvarlak runagate morfoloji (Şekil 2) hücreleri çoğunluğu vardı. Bildirildiği gibi bu runagate uygun ve onların hücre döngüsü boyunca devam hücrelerdir. Bu ayarlanması gerekebilir değişkenleri glikoz düzeyleri ve nitrit toplama dahil olması gerekmektedir. Dedi, normoxic ve anoksik kuluçka destekleme yeteneklerini test edildi 60'ın üzerinde farklı medya formülasyonları, PS-74656 orta hayatta kalma ve test neredeyse tüm hücre satırların çoğaltma desteği başardı.
Anoksik hücreleri, ne olursa olsun, iki ayrı fenotipleri hayvan zinciri ve runagate (Şekil 2) test hücre farklılaşma temel bir gözlem oldu. Normoxic monolayer hücrelere benzer, hayvan zinciri hücreleri doku kültürü plastik bağlanmıştır. Ancak, ek zayıf, trypsinize ya da, daha normoxic koşullar altında oluştu eki kazıma çıkarmak daha kolay. Buna ek olarak, hücre morfolojisi ile daha fazla iğ (dendritik) uzantıları26daha küçük. Gözlenen ikinci hücresel morphotype süspansiyon (yani, runagate hücreleri) hücrelerde vardı. Bu hücreler daha küçük bir hücre boyutu ve daha az sitoplazma yuvarlak plastik, doku kültürü tedavi varlığında serbest yüzer tek hücre süspansiyonlar kendiliğinden dönüştürülmüştür. Onlar genellikle enzimatik bir adaptasyon gerektirir, toplamları büyümek, konteyner doku kültürü tedavi gerektiren ve onların normoxic meslektaşları27büyük olan klasik süspansiyon kültür hücrelerden farklıydı. Zaman içinde ağırlıklı olarak gergin monolayer bu süspansiyon runagate hücrelerinin kaymak için anoksik hücre popülasyonlarının gözlenen. Süspansiyon bu hücreler uygun ve çoğaltma vardı; Böylece, bakım olunması gerektiğini süpernatant kaldırılmalıdır. Ayrıca, Not orta tüm anaerobik inkübasyon döneminde değişen gerektirmeyen değildir. Aynı zamanda kendi normoxic kontrolü aksine anoksik kuluçka altında orta pH göstergesi oldu (kırmızı kaldıyani) değişmeden. Araştırmacı runagate hücre hasat veya orta değiştirmek isterseniz, hücreleri kapatılan anaerobik gaz temizlenen mikro-santrifüj tüpleri sıkıca anaerobik odası içinde kullanılarak elde edilebilir. Hayvan zinciri hücrelerinin yıkama hücre için yordam herhangi bir oksijen pozlama ortadan kaldırmak için odasında gerçekleştirilmelidir.
Uzun vadeli bir ekimi için son hücre canlılığı, büyük ölçüde, kullanılan hücre ve hangi kuyu veya şişeye vardı başlangıçta seeded (Şekil 3 ve 4) izdiham bağımlı oldu. Yani, en uygun büyüme en büyük şansı vardı % 80, iyi bir başlangıç noktası olduğunu söyledi. Buna ek olarak, bir hücre satırı bağımlı kaybı canlılığı % %10 60, ilk 2-4 gün içinde ortaya çıkabilir. Ancak, performans bu deneyin sırasında kalan hücreleri hücre döngüsünün cycled ve28çoğaltılır. Şekil 3 ve 4hücre ekimi uzun ömürlü tohumlama izdiham etkisi görülebilir. HeLa 229 ve Vero hücreleri içinde % 40, % 60 ve ilk izdiham % 80'i 24-şey plaka numaralı seribaşı (% 100 izdiham 2.8 x 105 hücreleri/iyi =) ve oksijen yokluğunda 17 gün boyunca inkübe. HeLa 229 hücre anoksik büyüme % 80'i ilk bir tohumlama izdiham optimize edildi. Buna ek olarak, Vero hücreleri izdiham tohum en iyi %60 idi. Bu ilk tohum yoğunluğu kullanılan hücre kültürünü bağımlı optimize etmek için gerek gösterilmektedir.
Resim 1 : Anaerobik odası kurulum için kültür memeli hücre modeli. Gerekli en az malzemeler dahil doku kültürü plakaları, steril transferi pipets, biohazard çanta, de-gazla medya, medya veya diğer sıvılar ve resealable çanta tabakları transfer için mikroskop koruyarak atmanın bir tüp anaerobik koşullar.
Resim 2: Anoksik HeLa hücreleri morfolojik farklılaşma. (A) Bu panel 20 X büyütme ile sonrası aşılama, 4 gün faz kontrast mikroskobu normoxic HeLa hücre denetimleri gösterir. (B) Bu panel anoksik HeLa hücreleri 17 gün sonrası aşılama gösterir (değişmeden ile gün 1 PS-74656 orta, % 80'i numaralı seribaşı izdiham ve 20 X büyütme). (C) Bu panel mikroskobu eserler su damlacıkları mühürlü bir plastik torba 24-şey anoksik plaka içeren iç üzerinde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Oranı normoxic HeLa 229 uygun anoksik hücreleri post-17 gün kuluçka. Bu panel HeLa 229 hücre canlılığı PS-74656 orta normoxic kontrolü ile karşılaştırıldığında tohumlama yoğunluğu etkisini gösterir. Sonuçlar ortalama ± SEM gösterilir
Şekil 4: Oranı normoxic Vero uygun anoksik hücreleri 17 gün sonrası kuluçka. Bu panel Vero hücre canlılığı PS-74656 orta normoxic kontrolü ile karşılaştırıldığında tohumlama yoğunluğu etkisini gösterir. Sonuçlar ortalama ± SEM gösterilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem için uzun bir süre oksijen yokluğu kültürlü ilk memeli hücreleri temsil eder. Geçerli gözlem dayalı, anoksik büyüme özelliği üzerinden fermantatif olmayan bir yol nereye fenotip sapma anaerobik büyüme sonuçlandı memeli hücre hatları28arasında evrensel gibi görünüyor. Bu test tüm hücre hatlarında gözlendi. Anaerobik ekimi ile artan oranlarda hücreleri yuvarlak oldu, süspansiyon gibi nüfus geliştirilen ve çoğaltmak başardık. Orta hücre tipi için belgili tanımlık substrate ekli kaldı; Ancak, hücre morfolojisi spindle (dendritik) şekle döndürülmesi. Bu bulgular analizleri ve gözlemler anoksik doku kültürü ekimi konusunda ortak bir hata işaret. Ne zaman normoxic koşulları (%5 CO2) altında yetiştirilen memeli hücreleri yuvarlak yukarıya ve ayırmak, ölüyorlar genellikle kabul edilir. Aksine yukarı yuvarlamak hücreleri oksijen, bu durumda, yokluğunda yetiştirilen hücrelerin doğru görünüyor ve müstakil, sadece bir morfolojik farklı hücre subpopulation vardır.
Anoksik büyüme koşullarına getirilmesi hücre bağımlı çizgidir. Orta PS-74656 genel olarak desteklenen tüm hücre büyüme normoxic ve anoksik büyüme koşullarında, MDA-MB-231 dışında nitrit yokluğunda büyüme tercih edilen bir meme kanseri hücre satır satır. Cesaret verici bir gözlem bile hücre başına iyi bir % 98 die-off ile geri kalan, son derece adapte Vaha'da kaynaklanan çoğaltır olmasıdır. Kritik eylem bile yalnızca birkaç hücreleri mikroskobu tarafından doğrudan gözlendiğinde kültürler muhafaza etmektir. Böylece, bakım müstakil hücreleri öldü, trypan mavi boya dışlama veya bir alternatif hücre canlılığı algılama yöntemi olduğundan emin olmak için uygulanmalıdır. Böyle bir büyük düşüş ile cep numaraları, yeterli wells sonraki deneyler için yeterli toplam cep numaraları tek olacak şekilde numaralı seribaşı gerekir olduğunu belirtmek gerekir. Beklenen hücrelerin hücre kültürünü ve izdiham bağımlı tohum kayıptır; Bu nedenle, en iyi cep numaraları, zaman içinde deneysel olarak belirlenmelidir ve bulguları ile diğer hücre hatları üzerinden yaygınlaştırılması olamaz. Yani, iyi bir başlangıç noktası optimum büyüme en büyük şansı bir % 80 izdiham olduğunu söyledi. Oksijen ne kadar kısa olursa olsun yordamdaki anaerobik adımları sırasında herhangi bir maruz bulgular bildirilen spontane hücresel kurulan-1nedeniyle uzlaşma olacak belirtmek gerekir-Alfa yanıt11,12.
Bu yordam için en önemli adım orta, tüpler ve tüm diğer aygıtlar ve kullanılan malzemeler de-gazla ki. Oksijen bile çok düşük düzeyine getirilmesi fermantasyon metabolizma geçiş anaerobik solunum için durdurabilir. Alternatif olarak, böylece herhangi bir deney hipoksi, kanda oksijen azlığı değil ölçüm sonucu fermantatif metabolizma uzatmak. Sitotoksisite ve kemoterapötik etkinliğini ölçmek için roman bu yordamı kullanımı solid tümör tedavisinde ilaç başarısızlık açıklamaya yardımcı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Midwestern Üniversitesi araştırma Office ve sponsorlu programlar onların destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
