Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Crecimiento anaerobio y mantenimiento de líneas de células de mamífero

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/58049

Summary

Aquí, describimos un nuevo método que permite el cultivo anaerobio a largo plazo de las líneas celulares establecidas. El tiempo máximo de supervivencia que fue probado es de 17 días. Este método es adecuado para las pruebas de agentes citotóxicos y explorar la fisiología de la anoxically replicación de las células.

Abstract

Más superficies de la mucosa junto con los puntos medios en tumores y nichos de células madre son las zonas geográficas del cuerpo que son anóxicas. Estudios previos muestran que la incubación en normoxic (5% CO2 en aire) o hipóxica condiciones (niveles bajos de oxígeno) seguido de un resultados de incubación anóxico (ausencia de oxígeno libre) en la viabilidad limitada (2-3 días). Se desarrolló una metodología novedosa que permite un cultivo celular anóxico (de al menos 17 días, el tiempo máximo de prueba). El aspecto más crítico de esta metodología es asegurar que no hay oxígeno se introduce en el sistema. Esto se obtiene por la desgasificación de los medios de comunicación y por lavado de tubos, platos, matraces y pipetas con una mezcla de gas anaerobio (H2, CO2, N2) seguido por permitir que los materiales a que se equilibren al ambiente anóxico (sin oxígeno) antes de su uso. Debe tener cuidado adicional al adquirir fotomicrografías a garantizar que las micrografías obtenidas no contienen artefactos. En ausencia de oxígeno, morfología de la célula se altera significativamente. Se observan dos morfotipos diferentes para todas las células cultivadas anaeróbicamente. La capacidad de crecer y mantener las células de mamíferas en ausencia de oxígeno puede aplicarse al análisis de la fisiología celular, interacciones de naturaleza polimicrobiana y la caracterización de vías biosintéticas para desarrollo de medicamentos nuevos de cáncer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Las células de tumores sólidos, nichos de células madre y los recubren las superficies de la mucosa existen en ambientes que experimentan niveles de reducción de oxígeno, como anoxia1,2,3,4. En Estados fisiológicos normales, oxigenación varía más allá de hipoxia anoxia (ausencia completa de oxígeno)5,6. La realización que el oxígeno atmosférico afecta la replicación de células de mamífero y ese crecimiento de la célula en vitro puede ser optimizado en condiciones de oxígeno empobrecido se reportó en la década de 1970. Richter et al. 7 demostró que 1 – 3% de los niveles de oxígeno (hipoxia) mayor eficiencia chapado en comparación con el oxígeno atmosférico (20%). La vida de la célula diploide humana se extiende también en la cultura hipóxico condiciones8.

In vivo, se producen condiciones hipóxicas cuando tiendas de oxígeno empobrecido (por ejemplo, durante el ejercicio intenso), en donde se conecta la producción de ATP en el músculo esquelético de respiración aerobia, fermentación (respiración anaerobia) con la producto final ácido láctico9. Patológico, en los tumores cancerosos, el interior del tumor masa es hipóxico a anoxia debido a la pobre vascularización10. El efecto de la perfusión limitada en interiores de tumor es validado independientemente por interiores de tumor colonizados por anaerobios obliga1. Mecánico, supervivencia de la célula del tumor en hipoxia se piensa que es únicamente dependiente de la expresión del gene de alfa 1 del factor inducible por la hipoxia (HIF1-alfa), que es la respuesta espontánea inicial a hipoxia4,11 , 12. HIF1-alfa es inducida bajo condiciones hipóxicas por proteínas de choque térmico que se unen HIF1-alfa promotor y alza la transcripción génica del12. Estas proteínas de choque térmico se creen que ayuda en la inducción de los diferentes fenotipos en el microambiente hipóxico del tumor. Estos fenotipos muestran un incremento en la expresión de los transportadores de glucosa de la membrana celular y la tasa de glucólisis (efecto Warburg)13. El resultado es un interruptor de la fosforilación oxidativa mitocondrial de lactato fermentación.

Supervivencia anóxica también puede utilizar alternativas a la glucosa para apoyar la supervivencia fenómeno14,15. El mejor ejemplo mamífero estudiado es la rata topo, que puede sobrevivir durante casi 20 minutos sin oxígeno a través de una vía basada en fructosa glucolisis fermentación del14. Una adaptación alternativa ocurre en ciertos pescados (por ejemplo, carpa [Carassius SP.], que puede sobrevivir mucho más de largo periodos de tiempo mediante glucólisis con etanol como subproducto terminal)15. En ambos casos, la fermentación impulsa el metabolismo lo que permite la supervivencia en ausencia de oxígeno. La hipótesis actual para la supervivencia poste-anóxica es que tanto tiempo como HIF1-alfa se activa durante la hipoxia, la respiración mitocondrial, sin la necesidad de oxígeno, ocurre bajo condiciones anaeróbicas16. Además, se postula que el uso de una vía fermentativa de supervivencia hipóxica/anóxica mejora supervivencia del tumor ya que las células de evitar el estrés oxidativo que podría para ser perjudicial para la supervivencia celular del17. Este postulado es apoyado por un estudio reciente que muestra que en los cardiomiocitos, la hipoxia reduce el estrés oxidativo que se colocan en el tumor de la célula17.

Hasta la fecha, la naturaleza esencial de una vía fermentativa para la supervivencia de células de mamífero anóxico ha sido inculcada en la literatura, debido, en gran parte, a la incapacidad de las células mamíferas de la cultura en la ausencia completa de oxígeno durante más de 3 días. Sin embargo, una alternativa a la glucólisis para la supervivencia anaerobia ocurre en las bacterias. En ciertas bacterias, nitrógeno o sulfato (entre otros compuestos) puede servir como aceptores de electrones terminal para el sistema de la citocromo oxidasa en ausencia de oxígeno18. Aunque la evolución de bacterias y eucariota ocurrió paralelamente desde divergentes desde el último antepasado común universal, se estima que las mitocondrias fueron proporcionando energía a las células de 1,542 millones años antes de la oxigenación de los océanos19 . Puesto que los investigadores han demostrado que la mitocondria aislada puede producir ATP en ausencia de oxígeno, con nitrito como aceptor terminal de electrones, es razonable asumir que las células podrían funcionar durante períodos de tiempo más de 3 días en ausencia de oxígeno 20 , 21 , 22 , 23. la metodología descrita en este estudio tiene una utilidad para el crecimiento de células de mamífero anaerobio de numerosas líneas celulares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. preparar los medios para el cultivo anaerobio de varias líneas celulares mamíferos

  1. Hacer el medio PS-74656 completo para una anoxia de la célula cultura25.
    1. Asegúrese de la solución stock de nitrito estéril (5 M; 100 x) disolviendo 17,25 g de nitrito en 50 mL de agua destilada desionizada y filtrar para esterilizarlo.
    2. Agregar 0,5 mL de la solución madre de nitrito por cada 50 mL de glucosa baja DMEM (1 g/L de glucosa) con 110 mg/L de L-glutamina, 584 mg/L piruvato de sodio y 10% suero bovino fetal (FBS; inactivado con calor).
      Nota: El uso de FBS concentraciones superiores a 10% son tóxicos. De nota, una línea celular de cáncer probada tenía baja tolerancia a los medios de comunicación con nitrito (MDA-MB-231, línea de células de cáncer de mama) y, por lo tanto, se cultivaba en la ausencia de nitritos. Además, aunque medio PS-74656 apoyó el crecimiento de todas las líneas celulares que fueron probados (n = 9), ciertas líneas celulares (p. ej., células Vero) exhibieron altas concentraciones de células y una mayor viabilidad en PS-74656 con glucosa alta (4,5 g/L) DMEM 25.
    3. Colocar 20 mL de medio en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL estéril. No apriete el tapón. debe ser holgada.
    4. De gas el medio colocando el tubo en una campana de vacío en un ángulo aproximado de 45 °, para maximizar el área de superficie mediano.
    5. Aplicar un vacío usando una bomba de vacío, o su equivalente, a temperatura ambiente. Mantener el vacío hasta que las burbujas ya no se observan (24 – 48 h).
    6. Retire el tubo del frasco y cerrar inmediatamente la tapa, sellado el tubo para minimizar la introducción de aire en el medio.
    7. Coloque el tubo en la cámara comercial de anaerobia.
    8. Afloje el tapón del tubo y deje que el ambiente en el tubo se equilibren con la de la mezcla de gas anaerobio en la cámara durante al menos 24 h.
      Nota: El medio debe permanecer en la cámara hasta que se agote. Para acelerar el proceso, al ras del tubo por lo menos 3 veces con la mezcla de gas anóxico con una pipeta de transferencia estéril llenan de gas anóxico, que consiste en H2, CO2y N2.
    9. Degas todos los tubos (10 – 15 min) colocados en la cámara anaerobia descrita antes de sellar el tubo y colocar en la cámara. Antes de su uso, lavarlo con la mezcla de gas anaerobio utilizando pipetas de transferencia de 1.5-2 mL o pipetas que han sido volcadas con anoxia de gas por lo menos 3 x.
    10. Mientras que en la cámara anaerobia, saque 100 μl de medio a un tubo de microcentrífuga estéril desgasificado y prueba para el oxígeno disuelto mediante una sonda de oxígeno dentro de la cámara.
      Nota: El electrodo de oxígeno está calibrado por antes protocolo del fabricante. Las lecturas de los medios de la mezcla de gas anaerobio debidamente desgasificada y equilibrado son 0.
      PRECAUCIÓN: Si las lecturas están por encima de 0,3 ppm de oxígeno, continúan incubar los medios de comunicación en la cámara anaerobia ya que se requiere más tiempo para equilibrar el medio.

2. anoxia cultivo de varias líneas celulares mamíferos

  1. Día designado -1
    1. Cultivar células (37 ° C, 5% CO2) en un matraz T150 a 90% de confluencia para el control de cultivo anóxico y normoxic prever un número suficiente de células de tres placas de 24 pocillos (confluencia del 80%).
      Nota: Para este estudio, se utilizaron células HeLa 229 y Vero. Este protocolo también fue probado y demostrado ser eficaz para el crecimiento y el mantenimiento de siete otras célula líneas25.
    2. Retire el medio del frasco por la aspiración y lavar con 10 mL de HBSS.
    3. Reemplazar el medio con 5 mL de tripsina. Agitar el matraz hasta que las células separan visualmente de plástico. Aspirar la mayor parte de la tripsina, entonces golpee el frasco para desalojar las células adherentes. Añadir 10-15 mL de glucosa alta DMEM (4,5 g/L de glucosa, 110 mg/L de L-glutamina, 10% FBS, 50 μg/mL de gentamicina) inactivación de la tripsina.
    4. Triturate las células usando una pipeta de 25 mL hasta que todos grupos de células se interrumpen.
    5. Contar las células y determinar la viabilidad mediante hemocitómetro estándar y el método de exclusión de colorante azul de trypan o el equivalente automatizado.
    6. Suspender las células en la glucosa alta DMEM como se mencionó anteriormente a una densidad celular de 2.24 x 105 células/mL.
    7. Añadir 1 mL de la suspensión de células en los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (2.24 x 105 células/pozo; 80% confluencia). 1 placa para el cultivo anóxico y otro para una cultura normoxic del control de la semilla.
    8. Incube las células a 37 ° C en condiciones de normoxic (5% CO2) durante 24 h.
      Nota: Las células se pueden platear en varias placas amplias. Sin embargo, sembrar las células para el crecimiento anóxico en frascos corre el riesgo de la introducción de oxígeno en el sistema, a no ser que es cuidado para purgar completamente el gas atmosférico.
  2. Designado día 0
    1. Después de 24 h de incubación normoxic, coloque las placas de crecimiento anóxico en la cámara anaerobia (una cámara anaeróbica comercial; Figura 1).
    2. Cambiar inmediatamente el medio sin antibióticos-gaseados 74656 PS medio que ha sido aclimatada durante 24 horas a la cámara anaerobia. Colocar la placa en un recipiente con una toalla húmeda y ligeramente cierre para mantener la humedad.
      Nota: Las placas de crecimiento normoxic se tratan idénticamente con la excepción de que todos los tratamientos se realizan bajo las condiciones atmosféricas.
  3. Designado día 1
    1. 1 día de la incubación anaeróbica comienza después de 24 h de incubación en la cámara anaerobia comercial que contiene la mezcla de gas anaerobio estándar de 80% N2, 10% H2y 10% CO2.
    2. Incube las células durante varios períodos de tiempo.
    3. Monitorear el medio anaerobio para el cambio de color con el tiempo.
      Nota: Un cambio de color de rojo naranja a magenta señala el momento de cambiar el medio. Esto puede tomar hasta 2 semanas para ocurrir. Un cambio de color en el medio de rojo-naranja a amarillo indica la presencia de una contaminación bacteriana.
    4. Cuando el medio cambia de rojo a magenta, eliminar las células runagate por aspiración.
    5. Lugar los medios de comunicación pasó aspirado con las células runagate desgasificada y anaerobia gas había equilibrado los tubos del microfuge, cerrar los tubos mientras se asegura que el sello es seguro y luego centrifugarles (326 g, a temperatura ambiente durante 10 min). Reemplace inmediatamente los medios aspirados en el pozo con 1 mL de nuevo medio PS-74656 desgasificada.
    6. Coloque el tubo de microcentrífuga con células sedimentados en la cámara anaeróbica antes de abrirlo. Aspire el medio gastado y sustituirla por medio de PS-74656 desgasificada fresco para un volumen total de 1 ml en el tubo de microcentrífuga.
    7. Retomar las células del tubo de un pozo en la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos.

3. evaluación de la diferenciación fenotípica de la célula por microscopio de las células cultivadas anaeróbicamente

  1. Mientras que en la cámara anaerobia, colocar la placa en una caja resellable con la mezcla de gas anaerobio y cerrar el cuadro.
    Nota: El cuadro debe contener una toalla de papel húmeda para proporcionar humedad y evitar que la placa se seque. Para microscopia, bolsas de sándwich funcionan mejor ya que son delgadas.
    1. Para observar las células bajo el microscopio, totalmente selle la bolsa y retire de la cámara.
    2. Cuidadosamente estirar la bolsa de plástico sobre la placa, examinar las células utilizando un microscopio invertido de contraste de fase con el accesorio de cámara y tomar microfotografías con diferentes aumentos.
    3. Devolver la placa en la bolsa sellada a la cámara y continuar la incubación como se describe en el paso 2.3.3.
    4. Para analizar por separado las células runagate en suspensión, siga los pasos descritos en el paso 2.3.5.
      Nota: Estas células pueden utilizarse para pruebas aeróbicas o pueden ser devuelto a la cámara de anaerobia para la prueba de esta población específica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La fuerza de este protocolo radica en su apoyo, la longevidad y el crecimiento de múltiples líneas celulares y en el reconocimiento de que hay una alteración profunda y divergencia en la morfología celular del25. El elemento más crítico de este estudio es la transferencia y el mantenimiento de las células bajo anaerobiosis estricta. Esto requiere una cámara anaeróbica organizado para maximizar el protocolo (figura 1) y la garantía de que las células quitado para microscopía u otras pruebas se mantienen en un ambiente sellado. Hasta la fecha, el rango de supervivencia anóxico fue de 15 – 17 días cáncer inmortal de líneas celulares y hasta a 17 días para transforma líneas celulares (nueve líneas de celulares para crecimiento anóxico). Los niveles de células viables, una vez que estas células fueron trasladadas a las condiciones anóxicas, disminuyeron menos de 10%, hasta un máximo de 90%, antes de que se estabilizaron. Todas las líneas de celular volvieron a los dos fenotipos (tethered y runagate) con la proporción de células en suspensión aumentando con el tiempo. Incluso después de una prolongada incubación de varias semanas, quedaban algunas células atadas, pero la mayoría de las células estaba en la morfología runagate redondeados (figura 2). Como se informó, estas células runagate son viables y procedió a través de su ciclo celular. Cabe señalar que las variables que pueden ser necesario ajustar son los niveles de glucosa y la concentración de nitrito. Dicho esto, de las formulaciones de más de 60 diferentes medios que se han probado para que su capacidad para apoyar a normoxic y anóxico incubación, el medio PS-74656 fue capaz de apoyar la supervivencia y reproducción de casi todas las líneas celulares probadas.

Una observación fundamental fue la diferenciación de las células anóxicas, independientemente de la célula de prueba, en dos fenotipos distintos, atados y runagate (figura 2). Análogo a las células de la monocapa de normoxic, las células atadas fueron Unidas al plástico de cultivo de tejidos. Sin embargo, el apego fue más débil, más fáciles de trypsinize o desprenderse por raspado, que adjunto que ocurrió bajo condiciones normoxic. Además, la morfología de la célula era más pequeña con más extensiones de eje (dendríticas)26. El segundo morfotipo celular observado fueron las células en suspensión (es decir, runagate células). Estas células convierten espontáneamente en suspensiones unicelular flotante en presencia de plástico Tratado de cultivo de tejidos, que se redondearon con un tamaño de célula más pequeño y menos citoplasma. Difieren de las células de cultura clásica de la suspensión, que normalmente requieren una adaptación enzimática, crecen en agregados, requieren envases no tratadas por cultivo de tejidos y son más grandes que sus contrapartes normoxic del27. Con el tiempo, se pudieran observar las poblaciones de anoxia de la célula a cambio de una monocapa predominante atada a la de las células runagate en suspensión. Estas células en suspensión fueron viables y replicación; por lo tanto, cuidado debía ejercerse debe quitar el sobrenadante. También, es de destacar que el medio no requieren cambiar durante el período de incubación anaerobia todo. El indicador de pH del medio en la incubación anóxica, en contraste con su control normoxic, era también sin cambios (es decir, seguía siendo rojo). Si el investigador desea cosechar las células runagate, o cambiar el medio, pueden obtenerse las células utilizando anaerobio lavado de gas micro-tubos de centrífuga que se cierran firmemente dentro de la cámara anaerobia. Para la célula de células ancladas, el procedimiento debe realizarse también en la cámara para eliminar cualquier exposición al oxígeno.

La viabilidad de la célula final de un cultivo a largo plazo fue, en gran medida, depende de la célula se utiliza y la confluencia a la que los pozos o el frasco fueron inicialmente sembradas (figuras 3 y 4). Dicho esto, un buen punto de partida es el 80%, que tuvo la mayor oportunidad de crecimiento óptimo. Además, puede ocurrir una pérdida dependiente de la línea de celular de 10% a 60% de viabilidad en los primeros días de 2 – 4. Sin embargo, durante la realización de este experimento, las células restantes un ciclo a través del ciclo celular y replican el28. El efecto siembra de confluencia sobre la longevidad del cultivo celular puede verse en las figuras 3 y 4. Las células HeLa 229 y Vero fueron sembradas en placas de 24 pocillos a 40%, 60% y 80% de confluencia inicial (confluencia 100% = 2.8 x 105 células/pocillo) y luego se incubaron en ausencia de oxígeno durante 17 días. El crecimiento anóxico de la célula HeLa 229 fue optimizado en una confluencia de siembra inicial de 80%. En contraste, las células Vero óptimas siembra confluencia fue 60%. Esto demuestra la necesidad de optimizar inicialmente la densidad de siembra depende de la línea celular utilizada.

Figure 1
Figura 1 : Modelo de configuración de cámara anaeróbicos para el cultivo de células de mamífero. Los materiales mínimos necesarios son las placas de cultivo de tejidos, mide con una pipeta de transferencia estéril, bolsas de riesgo biológico, el gaseado de los medios de comunicación, un tubo para el descarte de los medios de comunicación o de otros líquidos y bolsas resellables para la transferencia de las placas al microscopio manteniendo condiciones anaeróbicas.

Figure 2
Figura 2: Diferenciación morfológica de las células HeLa anóxico. (A) este panel muestra el microscopio de contraste de fase de los controles de células HeLa normoxic 4 días post-inoculación, con 20 aumentos. (B) este panel muestra las células HeLa anóxicas 17 días post-inoculación (con el sin cambios desde el día 1 PS-74656 medio, sembrado el 80% de confluencia y un aumento de X 20). (C) este panel muestra artefactos de la microscopía de las gotas de agua en el interior de una bolsa plástica sellada que contiene una placa de 24 pocillos anóxica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Relación de anoxia a normoxic HeLa 229 viables las células post-17 días de incubación en. Este panel muestra el efecto de la densidad de siembra sobre la viabilidad de las células HeLa 229 en el medio PS-74656 en comparación con el control normoxic. Los resultados se muestran como la media ± SEM.

Figure 4
Figura 4: Relación de anoxia a normoxic Vero viable las células después de 17 días de incubación. Este panel muestra el efecto de la densidad de siembra sobre la viabilidad de células de Vero en el medio PS-74656 en comparación con el control normoxic. Los resultados se muestran como la media ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este método representa la primera vez de células de mamífero que fueron cultivadas durante largos períodos de tiempo en ausencia de oxígeno. Basado en observaciones actuales, el crecimiento anóxico capacidad a través de una vía no fermentante parece ser universal entre las células mamíferas líneas28, donde el crecimiento anaerobio dio lugar a la divergencia de fenotipo. Esto se observó para todas las líneas celulares probadas. Con el cultivo anaeróbico, aumentando la proporción de las células se convirtieron en redondeado, desarrolló una población de suspensión-como y fueron capaces de replicar. El tipo de célula secundaria permanecido unido al sustrato; sin embargo, la morfología de la célula vuelve a una forma de huso (dendríticas). Estos hallazgos señalan un error común en los análisis y observaciones con respecto a cultivo de cultivo de tejidos anóxicos. Generalmente se acepta que cuando las células de mamífero cultivadas bajo condiciones normoxic (5% CO2) reunir y separan, están muriendo. Por el contrario parece ser correcta para las células cultivadas en ausencia de oxígeno, en cuyo caso, las células que han redondeado para arriba y separadas, son simplemente una subpoblación de células morfológicamente divergentes.

La optimización de las condiciones de crecimiento anóxico es línea celular dependiente. PS-74656 medio apoyado en general el crecimiento de toda célula líneas normoxic y condiciones de crecimiento anóxico, con la excepción de MDA-MB-231, una línea de células de cáncer de mama que prefirió crecimiento en ausencia de nitrito. Una observación alentadora es que incluso con un decrecimiento del 98% de las células por pozo, el resto se replica, resultando en una población altamente adaptada. La acción fundamental es mantener culturas incluso cuando sólo unas pocas células son directamente observadas por microscopía. Por lo tanto, se debe tener cuidado para asegurarse de que las células separadas están muertas, por la exclusión de colorante azul de trypan o por un método de detección de viabilidad celular alternativo. Cabe señalar que con tal una gran disminución en el número de células, deben ser sembradas pozos suficientes para tener un número adecuado de células total para experimentos posteriores. La pérdida esperada de células viables es la línea celular y siembra confluencia dependiente; así, un número óptimo de células, con el tiempo, debe ser determinado experimentalmente y no se pueden extrapolar de los resultados con otras líneas celulares. Dicho esto, un buen punto de partida es una confluencia del 80%, que tiene la mayor oportunidad de crecimiento óptimo. Debe ser observado que cualquier exposición al oxígeno durante los pasos de anaerobios en el procedimiento, no importa lo breve, pondrá en peligro los resultados debido a la celular espontánea divulgado HIF-1-alfa respuesta11,12.

Para este procedimiento, el paso más crítico es el de la desgasificación del medio, tubos y otros aparatos y materiales utilizados. La introducción de niveles incluso muy bajos de oxígeno podría parar la transición del metabolismo de la fermentación de la respiración anaerobia. Alternativamente, podría prolongar el metabolismo fermentativo que experimentos de cualquier resultan en la medición de la hipoxia, anoxia no. El uso de este novedoso procedimiento para medir la citotoxicidad y actividad quimioterapéutica podría ayudar a explicar la falta de medicamentos en el tratamiento de tumores sólidos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a la oficina de investigación de la Universidad de Midwestern y programas patrocinados por su apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whitney A35 anaerobic chamber Don Whitley Scientific  Microbiology International The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator Fisher Scientific 3531
Tissue Culture Hood Labconco DO55735
pipet aid Drummond 4-000-100
sterile transfer pipets Santa Cruz sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes DOT 451-PG
vaccum jar Nalgene 111410862889 BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L) CellGro 10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L) CellGro 10-014-CV
FBS VWR 1500-500
HBSS VWR 20-021-CV
trypsin VWR 25-052-CI
gentamicin Gibco 15750-060
sterile pipets CellTreat 229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150) Santa Cruz sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes DOT 667124
glad ziplock sandwich bags Ziploc Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) Nikon Eclipse TS100
trypan blue Invitrogen T10282
hemocytometer Invitrogen C10283
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000
Rainin microtiter pipets Mettler Toledo Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips Santa Cruz Biotechnology sc-213233 & sc-201717 
test tube rack (50cc tubes) The Lab Depot HS29050A
sodium nitrite Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids Rosti Mepal Rubber maid
paper towels In House
cell scraper CellTreat 229310
PBS In house prepared
70% Ethanol Fisher Scientific 64-17-5
microcentrifuge tubes sterile Santa Cruz sc-200273
biohazard bags with holder (desktop) Heathrow Scientific HS10320
Nitrile Gloves VWR 89428
oxygen electrode eDAQ EPO354
pH meter Jenway 3510
pH paper/ pHydrion Sigma Aldich Z111813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8, (1), 11 (2013).
  2. Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18, (5), 600-603 (2008).
  3. Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3, (7), 1180-1186 (2008).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88, (4), 1474-1480 (2000).
  5. Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174, (2), 151-167 (2015).
  6. Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51, (3), 177-184 (2013).
  7. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49, (6), 1705-1712 (1972).
  8. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
  9. Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123, (3191), 309-314 (1956).
  10. Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170, (1), 1-15 (2007).
  11. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15, (7), 1312-1314 (2001).
  12. Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36, (1), 1-12 (2004).
  13. Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
  14. Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356, (6335), 307 (2017).
  15. Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104, (1), 73 (1983).
  16. Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306, (4), C334-C342 (2014).
  17. Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70, (5), 287-291 (2014).
  18. Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62, (10), 1995-1999 (1998).
  19. Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76, (2), 444-495 (2012).
  20. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11, (4), 537-543 (2011).
  21. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, (369), (2016).
  22. Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454, (1-2), 127-130 (1999).
  23. Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10, (6), 281-286 (2005).
  24. Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118, (2), 241-254 (2009).
  25. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, (Supplement C), 59-68 (2018).
  26. Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8, (5), 607-621 (2012).
  27. Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270, (5635), 347-349 (1977).
  28. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
Crecimiento anaerobio y mantenimiento de líneas de células de mamífero
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines. J. Vis. Exp. (137), e58049, doi:10.3791/58049 (2018).More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines. J. Vis. Exp. (137), e58049, doi:10.3791/58049 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter