Summary
Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet la culture anaérobie à long terme de lignées cellulaires établies. Le temps de survie maximale qui a été testé est de 17 jours. Cette méthode convient pour les essais des agents cytotoxiques et explorer la physiologie de réplication des cellules anoxically.
Abstract
Plus les surfaces muqueuses ainsi que les milieux dans les tumeurs et les cellules souches niches sont des régions géographiques du corps qui sont anoxiques. Les études précédentes montrent que l’incubation dans normoxique (5 % CO2 dans l’air) ou hypoxique conditions (faibles teneurs en oxygène) suivies par une incubation anoxiques (l’absence d’oxygène libre) des résultats en viabilité limitée (2 à 3 jours). Une nouvelle méthodologie a été développée qui permet une culture de cellules anoxiques (au moins 17 jours ; durée maximale testée). L’aspect le plus important de cette méthodologie est de s’assurer qu’aucun oxygène n’est introduit dans le système. Ceci est obtenu par le dégazage des médias et de tubes de chasse d’eau, vaisselle, flacons et pipettes avec un mélange de gaz anaérobie (H2, CO2, N2) suivie en autorisant les matériaux s’équilibrer à l’environnement anoxique de la (non-oxygène) avant son utilisation. Soins supplémentaires doivent être exercé lorsque les photomicrographies acquérir pour s’assurer que les micrographies obtenus ne contiennent pas d’artefacts. En l’absence d’oxygène, la morphologie des cellules est significativement altérée. Deux types morphologiques distincts sont remarquables pour toutes les cellules cultivées en anaérobiose. La capacité de développer et maintenir des cellules de mammifères en l’absence d’oxygène peut être appliquée à l’analyse de la physiologie cellulaire, les interactions polymicrobienne et la caractérisation des voies biosynthétiques pour le développement de médicaments nouveaux de cancer.
Introduction
Il existe des cellules de tumeurs solides, les niches de cellules souches et les revêtement des surfaces muqueuses dans les environnements qui connaissent les teneurs en oxygène réduite, y compris l’anoxie1,2,3,4. Dans les États physiologiques normales, oxygénation varie en outre de l’hypoxie d’anoxie (l’absence totale d’oxygène)5,6. La réalisation que l’oxygène atmosphérique affecte négativement la réplication des cellules de mammifères et que la croissance cellulaire in vitro peut être optimisée sous conditions appauvri en oxygène a été signalée dans les années 1970. Richter et al. 7 a montré que 1 à 3 % du taux d’oxygène (hypoxie) amélioré placage à l’efficacité par rapport à l’oxygène atmosphérique (20 %). La durée de vie de cellules diploïdes humaines est également prolongée dans les conditions de culture hypoxique8.
In vivo, des conditions hypoxiques surviennent lorsque les réserves d’oxygène sont épuisés (par exemple, pendant l’exercice intense), dans laquelle la production d’ATP est activée dans le muscle squelettique de la respiration aérobie de fermentation (respiration anaérobie) avec la produit de l’acide lactique,9. Pathologiquement, dans les tumeurs cancéreuses, l’intérieur de la tumeur, la masse est hypoxique à anoxiques en raison de la mauvaise vascularisation10. L’effet de la perfusion limitée sur les intérieurs de la tumeur est indépendamment validé par des intérieurs de tumeur colonisées par des bactéries anaérobies obligatoires1. Mécaniquement, la survie des cellules tumorales en hypoxie est considérée comme dépendant uniquement de l’expression du gène alpha-1 facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF1-alpha), qui est la première réponse spontanée à une hypoxie4,11 , 12. HIF1-alpha est induite dans des conditions hypoxiques par des protéines de choc thermique qui lient la HIF1-promoteur alpha et réguler positivement la transcription de gène12. Ces protéines de choc thermique sont soupçonnés d’aide dans l’induction des phénotypes différents dans le microenvironnement hypoxique de la tumeur. Ces phénotypes présentent une expression accrue des membrane cellulaire des transporteurs de glucose et le taux de glycolyse (l’effet Warburg)13. Il en résulte une commutation de la phosphorylation oxydative mitochondriale de lactate fermentation.
Survie anoxique peut utiliser également des solutions de rechange au glucose pour soutenir la survie phénomène14,15. Le meilleur exemple de mammifères étudié est le rat-taupe, qui peuvent survivre pendant presque 20 minutes sans oxygène par une voie de fermentation glycolytique pilotée par le fructose14. Une autre adaptation se produit dans certains poissons (p. ex., carpe [Carassius SP.], qui peut survivre pendant nettement plus longtemps périodes à l’aide de glycolyse avec de l’éthanol comme le sous-produit terminal)15. Dans les deux cas, la fermentation lecteurs le métabolisme qui permet la survie en l’absence d’oxygène. L’hypothèse actuelle pour la survie anoxique est que si longtemps HIF1-alpha est activé pendant l’hypoxie, la respiration mitochondriale, sans le besoin d’oxygène, se produit dans des conditions anaérobies,16. En outre, il est postulé que l’utilisation d’une voie fermentaire pour la survie hypoxique/anoxique améliore la survie de la tumeur puisque les cellules éviter le stress oxydatif qui pourrait s’avérer préjudiciable à la survie de cellule17. Ce postulat est supporté par une étude récente qui montre que dans les cardiomyocytes, hypoxie réduit le stress oxydatif, placé sur la cellule de tumeur17.
A ce jour, la nature essentielle d’une voie fermentaire pour la survie des cellules de mammifères anoxique a été enracinée dans la littérature, sont dus, en grande partie, à une incapacité de cellules de mammifères en culture en l’absence totale d’oxygène pendant plus de 3 jours. Toutefois, une alternative à la glycolyse pour la survie anaérobie se produit chez les bactéries. Dans certaines bactéries, l’azote ou sulfate (parmi d’autres composés) peut servir comme accepteurs d’électrons pour le système cytochrome oxydase en l’absence de l’oxygène18. Bien que l’évolution des bactéries et des eucaryote ont eu lieu en parallèle depuis divergeant du dernier ancêtre commun universel, on estime que les mitochondries ont été fournir l’énergie aux cellules 1,542 millions d’années avant l’oxygénation des Océans19 . Étant donné que les chercheurs ont montré que les mitochondries isolées peuvent produire de l’ATP en l’absence d’oxygène, avec nitrite comme accepteur terminal d’électron, il est raisonnable de supposer que les cellules pouvaient fonctionner pendant une période supérieure à 3 jours en l’absence d’oxygène 20 , 21 , 22 , 23. la méthodologie décrite dans la présente étude a une utilité pour la croissance des cellules de mammifères anaérobie de nombreuses lignées cellulaires.
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Protocol
1. préparer les milieux pour Culture anaérobie de diverses lignées cellulaires de mammifères
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Rendre le milieu PS-74656 complet pour une culture de cellules anoxiques25.
- Faire la solution stérile de nitrite (5 M ; x 100) en dissolvant 17,25 g de nitrite dans 50 mL d’eau distillée désionisée, puis filtrer pour stériliser.
- Ajouter 0,5 mL de la solution mère de nitrite par 50 mL de faible concentration de glucose DMEM (1 g/L de glucose) avec 110 mg/L de L-glutamine, 584 mg/L de pyruvate de sodium et 10 % sérum de veau fœtal (SVF ; inactivés par la chaleur).
Remarque : L’utilisation de FBS concentrations supérieures à 10 % sont toxiques. À noter, une lignée de cellules cancéreuses testée avait une faible tolérance pour les médias avec nitrite (MDA-MB-231, lignée cellulaire de cancer du sein) et, ainsi, a été cultivée en l’absence de nitrite. En outre, bien que le PS-74656 milieu a permis la croissance de toutes les lignées cellulaires qui ont été testées (n = 9), certaines lignées de cellules (par exemple, les cellules Vero) présentaient des concentrations plus élevées de cellule et une viabilité supérieure en PS-74656 avec hyperglycémie (4,5 g/L) DMEM 25. - Dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 mL, placer 20 mL de milieu. Ne pas serrer le bouchon ; Il devrait être lâche.
- Dé-gaz le milieu en plaçant le tube dans une cloche de verre sous vide à un angle d’environ 45 °, pour maximiser la surface moyenne.
- Appliquer le vide à l’aide d’une pompe à vide, ou son équivalent, à température ambiante. Maintenir le vide jusqu'à ce que les bulles sont observées n’est plus (24 à 48 h).
- Enlever le tube du pot et fermer immédiatement le bouchon, étanchéité du tube afin de minimiser l’introduction d’air dans le milieu.
- Placer le tube dans la chambre de commerce anaérobie.
- Desserrer le bouchon du tube et laisser l’atmosphère dans le tube s’équilibrer avec celle du mélange gaz anaérobie dans la chambre pendant au moins 24 h.
NOTE : Le support doit rester dans la chambre jusqu'à ce qu’il est épuisé. Pour accélérer le processus, ras du tube au moins 3 x avec le mélange de gaz anoxiques à l’aide d’une pipette stérile rempli de gaz anoxique, qui consiste H2, CO2et N2. - Une solution contenant tous les tubes (10 à 15 min) placés dans la chambre anaérobie comme décrit ci-dessus avant de sceller le tube et en introduisant dans la chambre. Avant utilisation, rincer avec le mélange de gaz anaérobie à l’aide de pipettes de transfert de 1,5 à 2 mL ou pointes de pipette qui ont été rincées avec anoxique de gaz au moins 3 x.
- Alors que dans la chambre anaérobie, enlever 100 µL de milieu dans un tube stérile de micro-centrifugeuse dégazé et testez-le pour l’oxygène dissous à l’aide d’une sonde d’oxygène dans la chambre.
Remarque : La sonde à oxygène est calibrée par protocole avant toute du fabricant utilisation. Lectures des médias mélange gaz anaérobie correctement dégazée et équilibré sont des 0.
ATTENTION : Si les lectures sont supérieure à 0,3 ppm d’oxygène, continuer à incuber les médias dans la chambre anaérobie car il faut plus de temps pour équilibrer le milieu.
2. anoxique culture de diverses lignées cellulaires de mammifères
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Jour désigné -1
- La croissance de cellules (37 ° C, 5 % de CO2) dans une fiole de T150 au confluent de 90 % pour le contrôle de la culture anoxique et normoxique fournir un nombre suffisant de cellules pour trois plaques 24 puits (confluence de 80 %).
Remarque : Pour cette étude, les cellules HeLa 229 et Vero ont été utilisés. Ce protocole a été aussi testé et s’est révélé fructueux pour la croissance et le maintien de sept autres lignées cellulaires25. - Retirer le support de la fiole par aspiration et lavez-le avec 10 mL de HBSS.
- Remplacez le support par 5 mL de trypsine. Agiter le ballon jusqu'à ce que les cellules se détachent visuellement de la matière plastique. Aspirer la majeure partie de la trypsine, puis appuyez sur le flacon pour déloger les cellules adhérentes. Ajouter 10 à 15 mL d’hyperglycémie DMEM (4,5 g/L de glucose, de 110 mg/L de L-glutamine, 10 % FBS, 50 µg/mL de gentamicine) pour inactiver la trypsine.
- Triturer les cellules à l’aide d’une pipette 25 mL jusqu'à ce que tous les amas de cellules sont perturbées.
- Compter les cellules et déterminer la viabilité à l’aide de l’hémocytomètre standard et la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan ou l’équivalent automatisé.
- Suspendre les cellules dans l’hyperglycémie DMEM comme mentionné ci-dessus, à une densité de 2,24 x 105 cellules/mL.
- Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de culture de tissus de 24 puits (2,24 x 105 cellules/puits ; confluence de 80 %). 1 assiette pour la culture anoxique et l’autre pour une culture de normoxique contrôle les semences.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans des conditions normoxiques (5 % CO2) pendant 24 h.
Remarque : Les cellules peuvent être plaqués dans diverses plaques de bonne tailles. Cependant, les cellules anoxiques croissance dans des flacons de l’ensemencement risque de l’introduction d’oxygène dans le système, sauf si les précautions nécessaires sont prises pour éliminer complètement les gaz atmosphérique.
- La croissance de cellules (37 ° C, 5 % de CO2) dans une fiole de T150 au confluent de 90 % pour le contrôle de la culture anoxique et normoxique fournir un nombre suffisant de cellules pour trois plaques 24 puits (confluence de 80 %).
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Désigné jour 0
- Après 24h de l’incubation normoxique, placer les plaques de croissance anoxique dans la chambre anaérobie (une chambre anaérobie commerciale ; La figure 1).
- Remplacez immédiatement le milieu antibiotique hors gazés PS-74656 milieu libre qui a été acclimaté pendant 24 h à la chambre anaérobie. Placer la plaque dans un récipient avec un linge humide et fermer vaguement pour maintenir l’humidité.
Remarque : Les plaques de croissance normoxique sont gérées identique sauf que tous les traitements sont réalisés dans des conditions atmosphériques.
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Désigné jour 1
- 1 jour de l’incubation anaérobie commence après 24 h de l’incubation dans la chambre de commerce anaérobie qui contient le mélange de gaz anaérobie standard de 10 % H2, 10 % CO2et 80 % N2.
- Incuber les cellules pendant diverses périodes de temps.
- Surveiller le milieu anaérobie pour le changement de couleur au fil du temps.
Notez : Un changement de couleur de rouge-orange à magenta indique le temps de changer le support. Cela peut prendre jusqu'à 2 semaines à se produire. Un changement de couleur dans le milieu du rouge-orangé au jaune indique la présence d’une contamination bactérienne. - Lorsque le milieu passe du rouge au magenta, supprimer les cellules fléau par aspiration.
- Place les médias usés aspirés avec les cellules de fléau en gaz dégazé et anaérobie équilibrés de microtubes, fermer les tubes tout en s’assurant que le joint est sécurisé et puis centrifuger eux (326 x g; à température ambiante pendant 10 min). Remplacez immédiatement les médias aspirés dans le puits avec 1 mL de milieu de PS-74656 dégazé nouvelle.
- Placer le tube à centrifuger avec cellules de granulés dans la chambre anaérobie avant de l’ouvrir. Aspirer le milieu usé et le remplacer par un milieu PS-74656 dégazé frais pour un volume total de 1 ml dans le tube à centrifuger.
- Retourner les cellules du tube dans un puits de la plaque de culture de tissus de 24 puits.
3. évaluation de la différenciation phénotypique cellulaire au microscope des cellules cultivées en anaérobiose
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Alors que dans la chambre anaérobie, placer la plaque dans une boîte refermable rincée avec le mélange de gaz anaérobie et fermer la boîte.
Remarque : La boîte doit contenir une serviette de papier humide pour fournir l’humidité et empêcher le plat ne se dessèchent pas. Pour la microscopie, les sacs à sandwich fonctionnent le mieux car ils sont minces.- Pour observer les cellules au microscope, complètement sceller le sac et retirez-la de la chambre.
- Étirer le sac en plastique sur la plaque, examiner soigneusement les cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé avec l’accessoire pour appareil photo et prendre photomicrographies à différents grossissements.
- Retourner la plaque dans le sac scellé à la chambre et poursuivre l’incubation comme indiqué au point 2.3.3.
- Pour analyser séparément les cellules fléau qui sont en suspension, suivez la procédure décrite à l’étape 2.3.5.
Remarque : Ces cellules peuvent ensuite être utilisés pour le test aérobie ou peuvent être retournés à la chambre anaérobie pour les essais de cette population spécifique.
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Representative Results
La force du présent protocole réside dans sa prise en charge de la longévité et la croissance de plusieurs lignées cellulaires et dans la reconnaissance qu’il y a une altération profonde et la divergence dans la morphologie de cellules25. L’élément le plus critique de cette étude est le transfert et l’entretien des cellules dans des conditions anaérobies strictes. Cela exige une chambre anaérobie organisés pour maximiser le protocole (Figure 1) et l’assurance que les cellules supprimées pour microscopie ou d’autres tests sont conservés dans un environnement fermé. A ce jour, la gamme de survie anoxique a été 15 à 17 jours du cancer immortel lignées cellulaires et place à 17 jours pour transformé lignées cellulaires (neuf lignées de cellules criblées pour croissance anoxique). Les niveaux de cellules viables, une fois que ces cellules ont été transférées dans des conditions anoxiques, a diminué au moins de 10 %, jusqu'à concurrence de 90 %, avant ils ont stabilisé. Toutes les lignées cellulaires est revenue aux doubles phénotypes (attachés et fléau) avec la proportion de cellules dans la suspension augmente avec le temps. Même après une incubation prolongée de plusieurs semaines, il restait quelques cellules captifs, mais la majorité des cellules à la morphologie du fléau arrondis (Figure 2). Comme indiqué, ces cellules du fléau sont viables et s’est rendu à travers leur cycle cellulaire. Il est à noter que les variables qui doivent être ajustés incluent les niveaux de glucose et de la concentration de nitrites. Cela dit, les formulations de plus de 60 différents médias qui ont été testées pour leur capacité à prendre en charge normoxiques et anoxique incubation, le support PS-74656 pouvait soutenir la survie et la réplication de presque toutes les lignées cellulaires testées.
Une observation essentielle était la différenciation des cellules anoxiques, quelle que soit la cellule testés, en deux phénotypes distincts, attachés et fléau (Figure 2). Analogue aux cellules normoxiques monocouche, les cellules captifs ont été rattachées à la plastique de culture de tissus. Toutefois, la pièce jointe a été plus faible, plus facile à trypsinize ou déloger par grattage, que la pièce jointe qui a eu lieu dans les conditions normoxiques. En outre, la morphologie cellulaire était plus petite avec plus d’extensions broche (dendritiques)26. Le deuxième morphotype cellulaire observé étaient les cellules en suspension (p. ex., fléau des cellules). Ces cellules converties spontanément dans les suspensions de cellules unique flottant en présence de plastique imprégnées de culture de tissus, qui ont été arrondies avec une taille de cellule plus petite et moins de cytoplasme. Ils diffèrent des cellules de culture de suspension classique, qui généralement nécessitent une adaptation enzymatique, grandissent en agrégats, nécessitent des récipients de culture de tissus non traitées et sont plus grandes que leurs homologues de normoxique27. Au fil du temps, les populations de cellules anoxiques pourraient être observées à passer d’une monocouche principalement attachée à celle des cellules en suspension fléau. Ces cellules en suspension sont viables et de réplication ; ainsi, le soin doit être exercé si le liquide surnageant doit être retiré. Aussi, de la note est que le médium ne nécessitait pas changé au cours de la période d’incubation anaérobie ensemble. L’indicateur de pH du milieu sous l’incubation anoxique, contrairement à son contrôle normoxique, était également inchangé (c.-à-d., est resté rouge). L’enquêteur veuille récolter les cellules fléau ou modifier le milieu, les cellules peuvent être obtenus en utilisant des anaérobies tubes micro-centrifugeuse rinçage à gaz qui sont fermés hermétiquement dans le réacteur anaérobie. Pour la cellule de lavage des cellules captifs, la procédure doit également être effectuée dans la chambre afin d’éliminer toute exposition à l’oxygène.
La viabilité cellulaire finale pour une culture à long terme a été, dans une large mesure, dépend de la cellule utilisée et le confluent à laquelle le ballon ou les puits ont été initialement ensemencé (Figures 3 et 4). Cela dit, un bon point de départ est de 80 %, ce qui avait le plus de chance de croissance optimale. En outre, une perte de ligne dépendante de cellules de 10 à 60 % de la viabilité peut se produire dans les 2 à 4 jours. Cependant, au cours de l’exercice de cette expérience, les cellules restantes pédalé à travers le cycle cellulaire et répliquées28. L’effet de confluence ensemencement sur la longévité de la culture de cellules sont visibles dans les Figures 3 et 4. Les cellules HeLa 229 tant Vero ont été ensemencées en plaques 24 puits à 40 %, 60 % et 80 % de confluence initiale (confluent 100 % = 2,8 x 105 cellules/puits) et puis incubé en l’absence d’oxygène pendant 17 jours. La croissance anoxique des cellules HeLa 229 a été optimisée à une confluence de semis initiale de 80 %. En revanche, les cellules Vero confluence de semis optimales était de 60 %. Cela démontre la nécessité d’abord optimiser la densité de semis dépend de la lignée cellulaire utilisée.
Figure 1 : Modèle de mise en place de chambre anaérobie pour culture de cellules de mammifères. Le matériel minimal requis comprendre des plaques de culture de tissus, sacs biorisques, médias hors gazés, pipettes de transfert stérile, un tube pour la mise au rebut des médias ou autres liquides et sacs pour le transfert des plaques à la loupe tout en conservant conditions anaérobies.
Figure 2 : Différenciation morphologique des cellules HeLa anoxiques. (A), ce panneau affiche la microscopie en contraste de phase des cellules HeLa contrôles normoxique 4 jours après l’inoculation, avec un grossissement X 20. (B) ce panneau montre les cellules HeLa anoxiques 17 jours après l’inoculation (avec les mêmes de jour 1 PS-74656 moyenne, 80 % graines confluence et un grossissement de X 20). (C), ce panneau montre les artefacts de microscopie de gouttelettes d’eau à l’intérieur d’un sac de plastique scellé contenant une plaque 24 puits anoxique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Ratio d’anoxiques à normoxique HeLa 229 viable de cellules post-17 jours d’incubation. Ce tableau montre l’effet de la densité de semis sur la viabilité des cellules HeLa 229 dans le milieu de PS-74656 par rapport à la commande normoxiques. Les résultats s’affichent sous la moyenne ± SEM
Figure 4 : Ratio d’anoxiques à normoxique Vero viable de cellules 17 jours après incubation. Ce tableau montre l’effet de la densité de semis sur la viabilité des cellules Vero dans le milieu de PS-74656 par rapport à la commande normoxiques. Les résultats s’affichent sous la moyenne ± SEM
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Discussion
Cette méthode représente la première fois des cellules de mammifères qui ont été cultivés pendant une période prolongée de temps en l’absence d’oxygène. Se fondant sur les observations actuelles, la croissance anoxique capacité via une voie non fermentatif semble être universelle parmi les cellules de mammifères lignes28, où la croissance anaérobie entraîné divergence de phénotype. Cela a été observée pour toutes les lignées cellulaires testées. Avec la culture anaérobie, augmentant les proportions des cellules est devenu arrondi, développé une population de suspension semblable et ont été en mesure de reproduire. Le type de cellule secondaire était resté attaché au substrat ; Cependant, la morphologie des cellules est revenue à une forme (dendritiques) broche. Ces résultats soulignent une erreur courante dans les analyses et observations en ce qui concerne la culture de vitroplants anoxique. Il est généralement admis que lorsque les cellules de mammifères cultivées dans des conditions normoxiques (5 % CO2) arrondir et détachement, ils meurent. Le contraire semble correct pour les cellules cultivées en l’absence d’oxygène, auquel cas, les cellules qui ont arrondi et détaché, sont simplement une sous-population de cellules morphologiquement divergentes.
L’optimisation des conditions de croissance anoxique est dépendante de la lignée cellulaire. PS-74656 moyen globalement soutenu la croissance de cellule toutes les lignes dans des conditions de croissance anoxique, à l’exception de la MDA-MB-231, normoxique et une lignée de cellules cancéreuses du sein qui a préféré la croissance en l’absence de nitrite. Un constat encourageant est que même avec une mortalité de 98 % des cellules par puits, le reste se réplique, ayant pour résultat une population hautement adaptée. L’action critique consiste à maintenir les cultures même si seules quelques cellules sont directement observés au microscope. Ainsi, doit être attentif pour s’assurer que les cellules individuelles sont morts, soit par exclusion du colorant bleu trypan ou par une méthode de détection de viabilité cellulaire alternatif. Il est à noter qu’avec une telle grande diminution dans le nombre de cellules, puits suffisants doivent être semées pour avoir les numéros de cellulaire totale suffisante pour des expériences ultérieures. La perte prévue de cellules viables est lignée cellulaire et ensemencement confluence dépendant ; ainsi, un nombre optimal de cellules, au fil du temps, doit être déterminé expérimentalement et ne peut être extrapolé de conclusions avec d’autres lignées cellulaires. Cela dit, un bon point de départ est une confluence de 80 %, qui a les meilleures chances de croissance optimale. Il convient de noter que toute exposition à l’oxygène au cours des étapes anaérobies dans la procédure, peu importe comment bref, va compromettre les résultats en raison de la décision publiée cellulaire spontanée HIF-1-réponse alpha11,12.
Pour cette procédure, l’étape la plus importante est celle du dégazage de la moyenne, tubes et tous les autres appareils et matériaux utilisés. L’introduction de même de très faibles niveaux d’oxygène ne pouvait arrêter la transition entre le métabolisme de la fermentation et la respiration anaérobie. Sinon, il pourrait prolonger le métabolisme fermentatif afin que toutes les expériences dans la mesure de l’hypoxie, pas d’anoxie. L’utilisation de cette nouvelle procédure pour mesurer la cytotoxicité et activité chimiothérapeutique pourrait aider à expliquer l’échec thérapeutique dans le traitement des tumeurs solides.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Bureau de recherche de l’Université du Midwest et parrainé des programmes pour leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
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