Summary
Her, beskriver vi en ny metode, der giver mulighed for anaerobe langsigtede dyrkning af etablerede cellelinier. Den maksimale overlevelsestid, der blev testet er 17 dage. Denne metode er velegnet til afprøvning af cytotoksiske agenter og udforske fysiologi anoxically kopiere celler.
Abstract
Mest slimhindeinfektioner sammen med midtpunkter i tumorer og stamcelle nicher er geografiske områder af kroppen, der er iltfrit. Tidligere undersøgelser viser, at inkubationen i normoxic (5% CO2 i luft) eller hypoksiske (lavt iltindhold) betingelser efterfulgt af en anoxiske inkubation (fravær af fri ilt) resultater i begrænset levedygtighed (2-3 dage). En roman metode blev udviklet som gør det muligt for en anoxiske celle dyrkning (for mindst 17 dage, den maksimale tid testet). Det mest kritiske aspekt af denne metode er at sikre, at ingen ilt tilføres systemet. Dette opnås ved den afgasning af medier, og rødmen rør, retter, kolber og pipetter med en anaerob gasblandingen (H2, CO2, N2) efterfulgt af tillade materialer til Reagensglasset anoxiske (ikke-ilt) miljøet før brug. Skal udvises ekstra forsigtighed, når erhvervelse af mikrofotografier til at sikre, at micrographs opnåede ikke indeholder artefakter. I mangel af ilt, er celle morfologi væsentligt ændret. To særskilte morphotypes er kendt for alle anaerobt vokset celler. Evnen til at vokse og vedligeholder mammale celler i mangel af ilt kan anvendes til analyse af celle fysiologi, polymicrobial interaktioner og karakterisering af biosyntetiske veje for romanen kræft narkotika udvikling.
Introduction
Celler fra solide tumorer, stamcelle nicher og dem foring de slimhindeinfektioner findes i miljøer, der oplever nedsat iltindhold, herunder iltmangel1,2,3,4. I normale fysiologiske stater varierer iltning ud over det af hypoxi til iltmangel (den fuldstændige mangel på ilt)5,6. Den erkendelse, at atmosfæriske ilt negativt påvirker pattedyr celle replikering og at in vitro- cellevækst kan optimeres forarmet ilt betingelser blev rapporteret i begyndelsen af 1970erne. Richter et al. 7 viste, at 1-3% af iltindhold (hypoksi) forbedret plating effektivitet i forhold til atmosfærisk ilt (20%). Den humane diploide celle levetid er også udvidet i hypoksiske kultur betingelser8.
In vivo, hypoksiske forhold forekommer når ilt butikker er forarmet (f.eks.under intens træning), hvori ATP produktion er tændt i skeletmuskulaturen fra aerob respiration og gæring (anaerob respiration) med den slutproduktet af mælkesyre9. Patologisk, i kræfttumorer, indre af tumor masse er hypoksiske til anoxiske på grund af dårlig vascularization10. Effekten af den begrænsede perfusion på tumor interiør er selvstændigt valideret af tumor interiør koloniseret af obligat anaerober1. Mekanisk, tumor celle overlevelse i hypoxi menes at være udelukkende afhænger af ekspressionen af hypoxi-inducerbar faktor 1-alpha-genet (HIF1-alpha), som er den første spontane reaktion hypoxi4,11 , 12. HIF1-alpha er induceret hypoksiske betingelser af heat shock proteiner der binder HIF1-alpha promotor og upregulate gen transskription12. Disse heat shock proteiner menes at støtte i induktion af de forskellige fænotyper set i tumor hypoksiske mikromiljø. Disse fænotyper udviser øget udtryk for cellemembranen glukose transportvirksomheder og hastigheden af glycolysen (Warburg virkning)13. Resultatet er et skift fra mitokondrie oxidativ fosforylering til laktat gæring.
Anoxiske overlevelse kan også benytte alternativer til glucose til støtte for overlevelse fænomen14,15. De bedst undersøgte pattedyr eksempel er mole-rat, som kan overleve i næsten 20 min. uden ilt gennem en fruktose-drevet glycolytic gæring vej14. En alternativ tilpasning sker i visse fisk (fxkarper [Carassius sp.], som kan overleve betydeligt længere tid perioder ved hjælp af glykolyse med ethanol som den terminal biprodukt)15. I begge tilfælde drev gæring stofskiftet muliggør overlevelse i mangel af ilt. Den nuværende hypotese for anoxiske overlevelse er, at så længe som HIF1-alpha er aktiveret under hypoxi, mitokondrie respiration, uden behov for ilt, opstår under anaerobe betingelser16. Derudover er det postuleret at brugen af et Fermentativ pathway for hypoksiske/anoxiske overlevelse forbedrer tumor overlevelse, da cellerne undgå oxidativ stress, som kan vise sig for at være til skade for celle overlevelse17. Dette postulat er støttet af en nylig undersøgelse, som viser, at iltsvind i cardiomyocytes, reducerer den oxidative stress placeret på tumor celle17.
Til dato, har de væsentlige karakter af et Fermentativ vej for anoxiske pattedyr celle overlevelse været indgroet i litteraturen, grund, i vid udstrækning, at en manglende evne til at kultur mammale celler i den fuldstændige mangel på ilt til mere end 3 dage. Men et alternativ til glykolyse for anaerob overlevelse forekommer i bakterier. I visse bakterier, kan kvælstof eller sulfat (blandt andre forbindelser) tjene som terminal elektronacceptorer for cytokrom oxidase system i mangel af ilt18. Selv om bakteriel og eukaryote udviklingen skete parallelt siden afviger fra den sidste universal fælles forfader, anslås det, at mitokondrier leverer energi til celler 1.542 millioner år før iltningen af havene19 . Da forskere har vist, at de isolerede mitochondrier kan producere ATP i mangel af ilt, med nitrit som terminal elektron acceptor, er det rimeligt at antage, at celler kunne fungere for perioder længere end 3 dage i mangel af ilt 20 , 21 , 22 , 23. den metode, der beskrives i denne undersøgelse har et hjælpeprogram for de anaerobe pattedyr cellevækst af talrige cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberede medier for anaerob kultur af forskellige pattedyr cellelinjer
-
Gøre det komplette PS-74656 medium for en anoxiske celle kultur25.
- Gøre steril nitrit stamopløsningen (5 M, 100 x) ved at opløse 17.25 g af nitrit i 50 mL deioniseret vand og derefter filtrere for at sterilisere det.
- Tilføje 0,5 mL af nitrit stamopløsningen per 50 mL af lav glucose DMEM (1 g/L med glucose) med 110 mg/L L-glutamin, 584 mg/L af natrium pyruvat, og 10% føtal bovint serum (FBS; varme-inaktiveret).
Bemærk: Brug af FBS koncentrationer større end 10% er giftige. Af note, en cancer cellelinie testet havde en lav tolerance for medier med nitrit (MDA-MB-231, breast cancer cellelinie), og således blev dyrket i mangel af nitrit. Desuden, selv om PS-74656 medium støttede væksten i alle cellelinjer, der blev testet (n = 9), visse cellelinjer (fx, Vero celler) udstillet højere celle koncentrationer og en højere levedygtighed i PS-74656 med høje glukose (4,5 g/L) DMEM 25. - Anbringes 20 mL medium i en steril 50 mL konisk centrifugeglas. Ikke stramme fælles landbrugspolitik; Det bør være løs.
- Nedtrapning gas medium ved at placere røret i en vakuum bell jar på en cirka 45 ° vinkel, at maksimere det medium overflade område.
- Anvende et vakuum ved hjælp af en vakuumpumpe, eller tilsvarende, ved stuetemperatur. Opretholde vakuum, indtil boblerne overholdes ikke længere (24 – 48 h).
- Fjerne røret fra krukken og straks lukke fælles landbrugspolitik, forsegling røret for at minimere indførelsen af luft i mediet.
- Glasset anbringes i den kommercielle anaerob kammer.
- Løsne rør cap og tillade atmosfæren i røret til Reagensglasset med de anaerobe gasblandingen i kammer i mindst 24 timer.
Bemærk: Medium bør forblive i salen, indtil det er opbrugt. For at fremskynde processen, flush røret mindst 3 x med anoxiske gasblandingen ved hjælp af en steril overførsel pipette fyldt med anoxiske gas, som består af H2, CO2og N2. - Degas alle rør (10-15 min) placeret i det anaerobe kammeret som beskrevet ovenfor før forsegling røret og markedsføring i salen. Før brug, skyl det med anaerob gasblandingen ved hjælp af 1,5-2 mL overførsel pipetter eller pipette tips, der har været skyllet med anoxiske gas mindst 3 x.
- Mens i den anaerobe kammer, fjerne 100 µL af medium til et sterilt afgassede micro-centrifugerør og teste det for opløst ilt ved hjælp af en ilt sonde inden for sal.
Bemærk: Ilt elektrode er kalibreret pr fabrikantens protokol før brug. Aflæsninger af korrekt afgassede og afbalancerede anaerob gas blandingen medier er 0.
Forsigtig: Hvis aflæsningerne er over 0,3 ppm af ilt, fortsat at udruge medierne i den anaerobe kammer da mere tid til Reagensglasset mediet er påkrævet.
2. anoxiske dyrkning af forskellige pattedyr cellelinjer
-
Udpegede dag -1
- Vokse celler (37 ° C, 5% CO2) i en T150 kolbe til 90% sammenløbet til anoxiske og normoxic kultur kontrol til at give et tilstrækkeligt antal celler for tre 24-godt plader (80% sammenløbet).
Bemærk: For denne undersøgelse, HeLa 229 og Vero celler blev brugt. Denne protokol blev også testet og bevist succes for vækst og vedligeholdelse af syv andre celle linjer25. - Fjern mediet fra kolben ved aspiration og vaske det med 10 mL af HBSS.
- Udskift mediet med 5 mL trypsin. Agitere kolben, indtil cellerne visuelt løsnes fra plasten. Opsug de fleste af trypsin, så tryk på kolben for at løsne de vedhængende celler. Tilføje 10-15 mL af høje glukose DMEM (4,5 g/L af glukose, 110 mg/L L-glutamin, 10% FBS, 50 µg/mL af gentamicin) til at inaktivere trypsin.
- Hakkede celler ved hjælp af en 25 mL pipette, indtil alle celle klumper er forstyrret.
- Tælle cellerne og bestemme levedygtighed ved hjælp af de standard hemocytometer og metoden trypan blå farvestof udstødelse eller automatiseret tilsvarende.
- Suspendere celler i den høje glukose DMEM, som nævnt ovenfor at en celle tæthed af 2.24 x 105 celler/mL.
- Der tilsættes 1 mL af cellesuspension brønde af en 24-godt vævskultur plade (2.24 x 105 celler/brønd; 80% sammenløbet). Frø 1 plade for den anoxiske kultur og en anden for en kontrol normoxic kultur.
- Inkuber celler ved 37 ° C i normoxic betingelser (5% CO2) i 24 timer.
Bemærk: Cellerne kan blive belagt i forskellige inventar plader. Dog løber såning celler for anoxiske vækst i kolber risikoen for indslæbning af ilt ind i systemet, medmindre omsorg udøves for at helt skylle ud atmosfærisk gas.
- Vokse celler (37 ° C, 5% CO2) i en T150 kolbe til 90% sammenløbet til anoxiske og normoxic kultur kontrol til at give et tilstrækkeligt antal celler for tre 24-godt plader (80% sammenløbet).
-
Udpegede dag 0
- Efter 24 h normoxic inkubation, placere plader til den anoxiske vækst i den anaerobe kammer (en kommerciel anaerob afdeling; Figur 1).
- Straks ændre mediet til antibiotika-fri de gasset PS-74656 medium, som har været akklimatiseret til 24 h til anaerob kammer. Pladen anbringes i en beholder med et fugtigt håndklæde og løst lukke den for at bevare fugt.
Bemærk: Plader til normoxic vækst håndteres identisk med den undtagelse, at alle behandlinger udføres atmosfæriske betingelser.
-
Udpegede dag 1
- Dag 1 af den anaerobe fordøjelsesprocessen starter efter 24 timers inkubation i den kommercielle anaerob kammer, som indeholder standard anaerob gasblandingen af 10% H2, 10% CO2og 80% N2.
- Inkuber cellerne i forskellige tidsperioder.
- Overvåge den anaerobe medium til farveændring over tid.
Bemærk: Et farveskift fra rød-orange til magenta signaler tid til at ændre mediet. Dette kan tage op til 2 uger at forekomme. Et farveskift i medium fra rød-orange til gul indikerer tilstedeværelsen af en bakteriel forurening. - Når mediet ændres fra rød til magenta, fjerne runagate cellerne ved aspiration.
- Sted indsugning brugt medierne med runagate cellerne i afgassede og anaerob gas ekvilibreres mikrofuge rør, lukke rør samtidig med at sikre, at seglet er sikker, og derefter centrifugeres dem (326 x g; ved stuetemperatur i 10 min). Umiddelbart erstatte indsugning medierne i brønden med 1 mL af nye afgassede PS-74656 medium.
- Placer mikrofuge tube med pelleted celler i den anaerobe salen før du åbner den. Opsug den brugte medium og erstatte det med friske afgassede PS-74656 medium til et volumen på 1 ml i mikrofuge røret.
- Returnere cellerne fra røret til en brønd i 24-godt vævskultur plade.
3. vurdering af fænotypiske Celledifferentiering af mikroskopi af anaerobt kulturperler celler
-
Mens i den anaerobe kammer, pladen anbringes i en genlukkelig box skylles med anaerob gasblandingen og lukke boksen.
Bemærk: Boksen skal indeholde et fugtigt stykke køkkenrulle for at give fugt og beskytter pladen mod udtørring. Til mikroskopi fungerer sandwich poser bedst, da de er tynde.- For at overholde cellerne under mikroskop, helt Forsegl posen og fjerne det fra salen.
- Forsigtigt strække plasticpose over pladen, undersøge celler ved hjælp af en omvendt fase kontrast mikroskop med kamera udlæg og tage mikrofotografier ved forskellige forstørrelser.
- Returnere pladen i den forseglede pose til kammeret, og fortsætte inkubation, som beskrevet i trin 2.3.3.
- For særskilt at analysere de runagate celler i suspension, skal du følge trinene i trin 2.3.5.
Bemærk: Disse celler kan derefter bruges for aerobe test eller kan returneres til den anaerobe kammer til afprøvning af denne bestemte population.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol styrke ligger i dens understøttelse af levetiden og vækst af flere cellelinjer og i erkendelse af, at der er en dybtgående ændring og divergens i celle morfologi25. Det mest afgørende element i denne undersøgelse er overførsel og vedligeholdelse af celler under strenge anaerobiosis. Dette kræver en anaerob kammer organiseret til at maksimere protokol (figur 1) og sikkerhed for at cellerne fjernet for enten mikroskopi eller andre test er holdt i et lukket miljø. Til dato, vifte af anoxiske overlevelse var 15-17 dage til udødelige kræft cellelinjer og op til 17 dage til omdannet cellelinjer (ni cellelinjer screenet for anoxiske vækst). Niveauer af levedygtige celler, faldt når disse celler blev flyttet til iltfattige forhold, mindst 10% til maksimalt 90%, inden de stabiliseres. Alle cellelinjer hjemfalde til den dobbelte fænotyper (tøjret og runagate) med andelen af celler i suspension stigende over tid. Selv efter en forlænget inkubering i flere uger, der forblev nogle tøjret celler, men hovedparten af cellerne var i afrundede runagate morfologi (figur 2). Som rapporteret, er disse runagate celler levedygtig og fortsatte gennem deres celle cyklus. Det skal bemærkes, at de variabler, der skal måske justeres omfatter glucose niveauer og nitrit koncentration. At sagde, fra de over 60 forskellige medier formuleringer, der blev testet for deres evne til at støtte både normoxic og anoxiske inkubation, PS-74656 medium var købedygtig opbakning overlevelse og replikeringsdata af næsten alle cellelinjer testet.
En vigtig observation var differentiering af anoxiske celler, uanset cellen testet, ind i to forskellige fænotyper, tøjrede og runagate (figur 2). Svarende til normoxic éncellelag cellerne, de tøjrede celler blev knyttet til vævskultur plast. Den vedhæftede fil var imidlertid svagere, nemmere at trypsinize eller løsne ved skrabning, end den vedhæftede fil, der er opstået under normoxic forhold. Derudover var celle morfologi mindre med flere spindel (dendritiske) udvidelser26. Den anden cellulære morphotype observeret var celler i suspension (dvs, runagate celler). Disse celler spontant omdannes til frit svævende enkelt celle suspensioner i vævskultur-behandlet plast, som blev afrundet med en mindre Cellestørrelse og mindre cytoplasma. De adskilte sig fra klassisk suspension kultur celler, som typisk kræver en enzymatisk tilpasning, vokse i aggregater, kræver ikke behandlet vævskultur containere og er større end deres normoxic modparter27. Over tid, kunne de anoxiske cellepopulationer konstateres for at skifte fra en overvejende tøjret éncellelag end runagate cellerne i suspension. Disse celler i suspension var levedygtige og replicerer; pleje skulle således udøves bør supernatanten fjernes. Også er at bemærke, at mediet ikke kræver ændring over hele anaerob inkubationstiden. Medium pH-indikator under iltfattige inkubation, i modsætning til sin normoxic kontrol, var også uændret (dvs., forblev rød). Hvis investigator ønsker at høste runagate cellerne eller ændre mediet, kan cellerne opnås ved hjælp af anaerobe gas varetræk mikro-centrifuge rør, der er lukket stramt i den anaerobe kammer. For cellen vask af tøjret celler, skal proceduren også udføres i salen til at fjerne ilt eksponering.
Den endelige cellernes levedygtighed for en langsigtet dyrkning var for en stor dels vedkommende afhængig af cellen bliver brugt og sammenløbet som brøndene eller kolben blev oprindeligt seedede (figur 3 og 4). Når det er sagt, et godt udgangspunkt er 80%, som havde den største chance for optimal vækst. Derudover kan en celle linje-afhængige tab på 10% til 60% af levedygtighed forekomme i de første 2-4 dage. Dog under udførelsen af dette eksperiment, de resterende celler cyklet gennem cellecyklus og replikeret28. Seeding sammenløbet effekten på levetiden af celle dyrkning kan ses i figur 3 og 4. Både HeLa 229 og Vero celler var seedede i 24-godt plader til 40%, 60% og 80% af første sammenløbet (100% sammenløbet = 2,8 x 105 celler/brønd) og derefter inkuberes i mangel af ilt i 17 dage. HeLa 229 celle anoxiske vækst var optimeret ved en indledende seeding sammenløbet af 80%. Derimod Vero celler optimal såning sammenløbet var 60%. Dette viser behovet for at i første omgang optimere seeding tætheden afhængig af cellelinje bruges.
Figur 1 : Model af anaerobe kammer set-up for kulturen i pattedyrsceller. Minimal materialeudgiften omfatter vævskultur plader, sterile overførsel pipets, biohazard tasker, de-gasset media, en tube for kassering af medier eller andre væsker og resealable poser til overførsel af pladerne til mikroskop fastholdes anaerobe forhold.
Figur 2: Anoxiske HeLa celler morfologiske differentiering. (A) dette panel viser fase kontrast mikroskopi af normoxic HeLa celle kontrol 4 dage efter podning, med en 20 X forstørrelse. (B) dette panel viser de anoxiske HeLa celler 17 dage efter podning (med den uændrede fra dag 1 PS-74656 medium, 80% seedede sammenløbet og en 20 X forstørrelse). (C) dette panel viser mikroskopi artefakter af vanddråber på interiøret i en forseglet plasticpose der indeholder et 24-godt anoxiske plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forholdet mellem anoxiske til normoxic HeLa 229 levedygtige celler post-17 dages inkubation. Dette panel viser effekten af seeding massefylde på HeLa 229 cellernes levedygtighed i PS-74656 medium i forhold til kontrolelementet normoxic. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SEM.
Figur 4: Forholdet mellem anoxiske til normoxic Vero levedygtige celler 17 dage efter inkubation. Dette panel viser effekten af seeding massefylde på Vero cellernes levedygtighed i PS-74656 medium i forhold til kontrolelementet normoxic. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode repræsenterer første gang pattedyrceller, der var kulturperler for længere perioder i mangel af ilt. Baseret på aktuelle observationer, synes den anoxiske vækst evne via en ikke-Fermentativ vej at være universelle blandt pattedyrceller linjer28, hvor de anaerobe vækst resulterede i fænotype divergens. Dette blev observeret for alle cellelinjer testet. Med anaerob dyrkning, øge proportioner af celler blev afrundet, udviklet en suspension-lignende befolkning og var i stand til at replikere. Secondary celletype forblev fastgjort til underlaget; dog vendt celle morfologi til en spindel (dendritiske) form. Disse resultater udpege en fælles fejl i analyser og iagttagelser med hensyn til anoxiske vævskultur dyrkning. Det er generelt accepteret, at når mammale celler dyrkes på normoxic betingelser (5% CO2) runde op og afmontere, de døende. Modsat synes at være korrekt for celler dyrkes i mangel af ilt, i hvilket tilfælde celler, der har rundet op og parcelhus, er simpelthen en morfologisk divergerende celle delpopulation.
Optimering af anoxiske vækstbetingelser er cellelinie afhængige. Medium PS-74656 samlede støttede væksten af alle celle linjer under normoxic og anoxiske vækstbetingelser, med undtagelse af MDA-MB-231, en breast cancer cellelinie, som foretrak vækst i mangel af nitrit. En opmuntrende bemærkning er, at selv med en 98% die-off celler pr. brønd, resten replikater, hvilket resulterer i en meget tilpasset befolkning. Den kritiske handling er at opretholde kulturer, selv når kun få celler er direkte observeret ved mikroskopi. Derfor skal der udvises forsigtighed for at sikre, at de fritliggende celler er døde, enten af trypan blå farvestof udstødelse eller ved en alternativ celle levedygtighed påvisningsmetode. Det skal bemærkes, skal seedede for at have tilstrækkelig samlede celle numre for efterfølgende eksperimenter med sådan et stort fald i celle numre, tilstrækkelig brønde. De forventede tab af levedygtige celler er både cellelinie og såning sammenløbet afhængige; således optimal celle numre, over tid, skal bestemmes eksperimentelt og ikke kan ekstrapoleres fra resultaterne med andre cellelinjer. Når det er sagt, et godt udgangspunkt er en 80% sammenløb, som har den største chance for optimal vækst. Det skal bemærkes, at eksponering for ilt under de anaerobe trin i proceduren, uanset hvor kort, vil kompromittere resultater på grund af den rapporterede spontan cellulære HIF-1-alpha svar11,12.
For denne procedure er den mest kritiske trin af den de-gasning af medium, rør, og alle andre apparater og materialer, der anvendes. Indførelsen af selv meget lave niveauer af ilt kunne stoppe overgangen fra gæringen stofskifte til den anaerobe respiration. Alternativt kunne det forlænge Fermentativ metabolisme, så at enhver eksperimenter resultere i måling af hypoxi, ikke iltmangel. Brugen af denne nye procedure til måling af cytotoksicitet og kemoterapeutiske aktivitet kunne bidrage til at forklare drug svigt i behandlingen af solide tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Midwestern Universitet Office of Research og sponsorerede programmer for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
