Summary
Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente la coltivazione anaerobica a lungo termine di linee cellulari stabilizzate. Il tempo di sopravvivenza massima che è stato testato è di 17 giorni. Questo metodo è adatto per la sperimentazione di agenti citotossici ed esplorare la fisiologia di replicare anoxically cellule.
Abstract
Più superfici mucose insieme i punti medi in tumori e nicchie staminali sono aree geografiche del corpo che sono anossiche. Gli studi precedenti indicano che l'incubazione in condizioni di normossia (5% CO2 nell'aria) o hypoxic condizioni (bassi livelli di ossigeno) seguirono da un risultati di incubazione anossico (un'assenza di ossigeno libero) nell'attuabilità limitato (2 – 3 giorni). Una nuova metodologia è stata sviluppata che consente una coltura cellulare anossica (per almeno 17 giorni; il tempo massimo testato). L'aspetto più critico di questa metodologia è quello di garantire che nessun ossigeno è stato introdotto nel sistema. Ciò si ottiene il degassamento dei media e di lavaggio tubi, piatti, boccette e le pipette con una miscela di gas anaerobico (H2, CO2, N2) seguita da permettendo i materiali per equilibrare l'ambiente anossico (non-ossigeno) prima dell'uso. Maggiore cura deve essere esercitato quando l'acquisizione di microfotografie per garantire che le micrografie ottenute non contengono artefatti. In assenza di ossigeno, la morfologia delle cellule è alterata significativamente. Due morfotipi distinti sono noti per tutte le cellule coltivate in condizioni aerobiche. La capacità di crescere e mantenere le cellule di mammiferi in assenza di ossigeno può essere applicata all'analisi della fisiologia cellulare, interazioni polimicrobica e la caratterizzazione delle vie biosintetiche per lo sviluppo di farmaci innovarici del cancro.
Introduction
Le cellule dai tumori solidi, nicchie di cellule staminali e quelle rivestimento superfici mucose presenti in ambienti che sperimentano livelli di ossigeno ridotto, tra cui anossia1,2,3,4. In condizioni fisiologiche normali, ossigenazione varia oltre quello di ipossia per anossia (la completa assenza di ossigeno)5,6. La realizzazione che ossigeno atmosferico influisce negativamente sulla replica delle cellule dei mammiferi e tale crescita in vitro delle cellule può essere ottimizzata in condizioni impoverito di ossigeno è stata segnalata nei primi anni 1970. Richter et al. 7 ha mostrato che 1 – 3% dei livelli di ossigeno (ipossia) migliorare l'efficienza della placcatura rispetto ad ossigeno atmosferico (20%). La durata della vita umana cellula diploide è esteso anche in condizioni ipossiche cultura8.
In vivo, condizioni di ipossia si verificano quando i negozi di ossigeno sono impoverito (ad es., durante l'esercizio intenso), in cui la produzione di ATP è inserita nel muscolo scheletrico da respirazione aerobica alla fermentazione (respirazione anaerobica) con la prodotto finale di acido lattico9. Patologico, in tumori cancerosi, all'interno del tumore massa è ipossica a anossico a causa della scarsa vascolarizzazione10. L'effetto della perfusione limitata all'interno del tumore viene convalidato indipendentemente da interni di tumore colonizzati da anaerobi1. Meccanicistico, sopravvivenza delle cellule del tumore nell'ipossia è pensata per essere dipendente unicamente sull'espressione del gene di 1 alfa fattore ipossia-inducibile (HIF1-alfa), che è la prima risposta spontanea alla ipossia4,11 , 12. HIF1-alfa è indotta in condizioni di ipossia da proteine dello shock termico che legano il HIF1-alfa promotore e aumentano la trascrizione genica12. Si ritiene che queste proteine di scossa di calore aiuto nell'induzione dei vari fenotipi visto nel microambiente tumorale ipossica. Questi fenotipi mostrano un incremento dell'espressione dei trasportatori del glucosio della membrana cellulare e il tasso di glicolisi (l'effetto Warburg)13. Il risultato è un interruttore da fosforilazione ossidativa mitocondriale di lattato fermentazione.
Anossico sopravvivenza possa anche utilizzare delle alternative a glucosio per sostenere la sopravvivenza fenomeno14,15. Il miglior esempio di mammiferi studiato è il Ratto talpa, che possono sopravvivere per quasi 20 minuti senza ossigeno attraverso una fermentazione glicolitico fruttosio-driven via14. Un adattamento alternativo si verifica in alcuni pesci (ad es., carpa [Carassius SP.], che possa sopravvivere per significativamente più lungamente periodi utilizzando glicolisi con etanolo come il sottoprodotto terminale di tempo)15. In entrambi i casi, fermentazione unità il metabolismo consentendo la sopravvivenza in assenza di ossigeno. L'ipotesi corrente per la sopravvivenza anossico è che così a lungo come HIF1-alfa è attivato durante l'ipossia, la respirazione mitocondriale, senza la necessità di ossigeno, si verifica in condizioni anaerobiche16. Inoltre, è postulato che l'uso di una via fermentativa per sopravvivenza ipossico/anossico migliora la sopravvivenza del tumore dal momento che le cellule evitare stress ossidativo che potrebbe rivelarsi dannosa per la sopravvivenza delle cellule17. Questo postulato è supportato da uno studio recente che mostra che in cardiomiociti, ipossia riduce lo stress ossidativo collocato sul tumore cella17.
Fin qui, la natura essenziale di una via fermentativa per la sopravvivenza della cellula di mammiferi anossico è stata radicata nella letteratura, dovute, in gran parte, ad un'incapacità di cellule di mammifero di cultura in completa assenza di ossigeno per più di 3 giorni. Tuttavia, un'alternativa alla glicolisi per la sopravvivenza anaerobica si verifica nei batteri. In alcuni batteri, azoto o solfato (tra altri composti) può servire come accettori terminali per il sistema del citocromo ossidasi in assenza di ossigeno18. Sebbene l'evoluzione batterica ed eucariotica è avvenuta in parallelo dal divergenti dall'ultimo antenato comune universale, si stima che i mitocondri sono state fornendo energia alle cellule per 1,542 milioni anni prima l'ossigenazione degli oceani19 . Poiché i ricercatori hanno indicato che i mitocondri isolati possono produrre ATP in assenza di ossigeno, con nitrito come accettore terminale di elettroni, è ragionevole supporre che le cellule potrebbero funzionare per periodi di tempo più lungo di 3 giorni in assenza di ossigeno 20 , 21 , 22 , 23. la metodologia descritta in questo studio è un programma di utilità per la crescita di cellule di mammifero anaerobica di numerose linee cellulari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparare supporti per coltura anaerobica di varie linee cellulari di mammifero
-
Rendere il completo supporto di PS-74656 per un cellulare anossica cultura25.
- Rendere la soluzione madre di nitrito sterile (5m; 100 x) sciogliendo 17,25 g di nitrito in 50 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi filtrare per sterilizzarlo.
- Aggiungere 0,5 mL della soluzione madre nitrito per 50 mL di glucosio basso DMEM (1 g/L di glucosio) con 110 mg/L di L-Glutammina, 584 mg/L di sodio piruvato e 10% siero bovino fetale (FBS; inattivati al calore).
Nota: L'uso di FBS concentrazioni superiore a 10% sono tossici. Della nota, una linea cellulare di cancro testata aveva una bassa tolleranza per i media con il nitrito (MDA-MB-231, linea di cellule di cancro al seno) e, quindi, è stata coltivata in assenza di nitrito. Inoltre, anche se PS-74656 medio sostenuto la crescita di tutte le linee cellulari che sono stati testati (n = 9), alcune linee cellulari (ad es., cellule Vero) hanno esibito le più alte concentrazioni di cellule e una redditività superiore in PS-74656 con alto glucosio (4,5 g/L) DMEM 25. - Posto 20 mL di terreno in una provetta conica sterile 50 mL. Non serrare il tappo; esso dovrebbe essere sciolto.
- De-gas medio inserendo il tubo in una campana di vetro vuoto a un angolo di circa 45 °, per massimizzare l'area di superficie media.
- Applicare un vuoto utilizzando una pompa a vuoto, o il suo equivalente, a temperatura ambiente. Mantenere il vuoto fino a quando le bolle non sono non più osservate (24-48 h).
- Rimuovere il tubo dalla vaschetta e chiudere immediatamente il tappo, il tubo per ridurre al minimo l'introduzione di aria nel mezzo di tenuta.
- Inserire il tubo nella camera anaerobica commerciale.
- Svitare il tappo del tubo e consentire l'atmosfera nel tubo da equilibrare con quello della miscela gas anaerobico nella camera per almeno 24 h.
Nota: Il mezzo dovrebbe rimanere nella camera fino ad esaurimento. Per accelerare il processo, a filo il tubo almeno 3 volte con la miscela di gas anossico utilizzando una pipetta sterile riempita di gas anossico, che consiste di N, CO2e H22. - Degassare tutte le provette (10 – 15 min) collocate nella camera anaerobica come descritto in precedenza prima di sigillare il tubo e immissione nella camera. Prima dell'uso, lavare con la miscela di gas anaerobica utilizzando pipette di trasferimento di 1,5 – 2 mL o puntali che sono state svuotate con anossico gas almeno 3 volte.
- Mentre nella camera anaerobica, rimuovere 100 µ l del mezzo in una provetta sterile da micro-centrifuga degassato e testarlo per l'ossigeno disciolto utilizzando una sonda di ossigeno all'interno della camera.
Nota: L'elettrodo di ossigeno è calibrato per prima del protocollo del produttore utilizzare. Letture dei media miscela gas anaerobico correttamente degassato ed equilibrato sono 0.
Attenzione: Se le letture sono superiori a 0,3 ppm di ossigeno, continua a incubare i media nella camera anaerobica poiché è necessario più tempo per equilibrare il medium.
2. anossico coltivazione di varie linee cellulari di mammifero
-
Area giorno -1
- Crescere le cellule (37 ° C, 5% CO2) in un matraccio da T150 alla confluenza del 90% per il controllo di cultura anossico e normoxic fornire un numero sufficiente di cellule per tre piastre da 24 pozzetti (80% confluenza).
Nota: Per questo studio, le cellule HeLa 229 e Vero sono state usate. Questo protocollo è stato anche testato e ha dimostrato riuscito per la crescita e la manutenzione di sette altre linee cellulari25. - Rimuovere il supporto dal pallone di aspirazione e lavarlo con 10 mL di HBSS.
- Sostituire il mezzo con 5 mL di tripsina. Agitare il pallone fino a quando le cellule visivamente staccano dalla plastica. Aspirare la maggior parte della tripsina, quindi tocca il pallone per sloggiare le celle aderenti. Aggiungere 10 – 15 mL di alto glucosio DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di L-Glutammina, 10% FBS, 50 µ g/mL di gentamicina) per inattivare la tripsina.
- Triturare le celle utilizzando una pipetta da 25 mL, fino a quando tutti i grumi di cellule sono interrotti.
- Contare le celle e determinare la fattibilità utilizzando l'emocitometro standard e il metodo di esclusione del colorante blu di trypan o l'equivalente automatizzato.
- Sospendere le cellule nell'alto glucosio DMEM come accennato in precedenza ad una densità di cella di 2,24 x 105 cellule/mL.
- Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (2,24 x 105 cellule/pozzetto; 80% confluenza). 1 piastra per la cultura anossica e un altro per una cultura di normoxic controllo del seme.
- Incubare le cellule a 37 ° C in condizioni di normossia (5% CO2) per 24 h.
Nota: Le celle possono essere placcate in varie piastre ben dimensionati. Tuttavia, semina le cellule per una crescita anossica in boccette corre il rischio dell'introduzione di ossigeno nel sistema, a meno che la cura è esercitata per scovare completamente gas atmosferici.
- Crescere le cellule (37 ° C, 5% CO2) in un matraccio da T150 alla confluenza del 90% per il controllo di cultura anossico e normoxic fornire un numero sufficiente di cellule per tre piastre da 24 pozzetti (80% confluenza).
-
Giorno designato 0
- Dopo 24 h di incubazione normoxic, posizionare le piastre per la crescita anossica nella camera anaerobica (un alloggiamento anaerobico commerciale; Figura 1).
- Cambiare immediatamente il mezzo privo di antibiotico de-gasati PS-74656 medio che ha stati acclimatati per 24 h alla camera anaerobica. Posizionare la piastra in un contenitore con un panno umido e chiuderlo senza bloccare per mantenere l'umidità.
Nota: Le piastre per la crescita in condizioni di normossia sono gestite in modo identico con l'eccezione che tutti i trattamenti avvengono in condizioni atmosferiche.
-
1 ° giorno designato
- 1 ° giorno di incubazione anaerobica inizia dopo 24 h di incubazione nella camera anaerobica commerciale che contiene la miscela di gas anaerobico standard di 10% H2, 10% CO2e 80% N2.
- Incubare le cellule per vari periodi di tempo.
- Monitorare il mezzo anaerobico per il cambiamento di colore nel tempo.
Nota: Un cambiamento di colore da rosso-arancio al magenta segnala il momento di cambiare il mezzo. Questo può richiedere fino a 2 settimane per verificarsi. Un cambiamento di colore nel mezzo da rosso-arancio al giallo indica la presenza di una contaminazione batterica. - Quando il mezzo cambia da rosso a magenta, rimuovere le cellule di runagate dall'aspirazione.
- Posizionare il supporto di speso aspirato con le cellule di runagate a gas degassato e anaerobica equilibrato microfuge tubi, chiudere i tubi mentre assicurandosi che la guarnizione è sicura e poi centrifugare li (326 x g; a temperatura ambiente per 10 min). Sostituire immediatamente i media aspirati nel pozzo con 1 mL di nuovo mezzo di PS-74656 degassato.
- Posizionare il tubo di microfuge con pellettate cellule nella camera anaerobica prima di aprirlo. Aspirare il mezzo esaurito e sostituirlo con mezzo PS-74656 degassato fresco per un volume totale di 1 ml nel tubo del microfuge.
- Restituire le cellule dal tubo ad un pozzo nella piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti.
3. valutazione di differenziazione fenotipica delle cellule mediante microscopia di cellule coltivate in condizioni aerobiche
-
Mentre nella camera anaerobica, posizionare la piastra in una scatola richiudibile lavata con la miscela di gas anaerobico e chiudere la finestra.
Nota: La casella deve contenere un tovagliolo di carta umido per fornire umidità e prevenire la piastra dall'asciugarsi. Per microscopia, sacchetti per sandwich funzionano al meglio, dal momento che sono sottili.- Per osservare le cellule al microscopio, completamente sigillare il sacchetto e rimuoverlo dalla camera.
- Con attenzione allungare il sacchetto di plastica sopra la piastra, esaminare cellule utilizzando un microscopio di contrasto di fase invertito con l'allegato di fotocamera e prendere microfotografie a vari ingrandimenti.
- Restituire la lastra nel sacchetto sigillato alla camera e continuare l'incubazione come descritto al punto 2.3.3.
- Per analizzare separatamente le cellule runagate che sono in sospensione, attenersi alla procedura descritta al punto 2.3.5.
Nota: Queste cellule possono quindi essere utilizzate per il test aerobico o possono essere restituite alla camera anaerobica per la sperimentazione di questa specifica popolazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La forza di questo protocollo sta nel suo sostegno la longevità e la crescita di linee cellulari multiple e nel riconoscimento che ci sono una profonda alterazione e la divergenza nella morfologia delle cellule25. L'elemento più critico di questo studio è il trasferimento e la manutenzione delle cellule sotto rigorosa anaerobiosi. Ciò richiede una camera anaerobica organizzato per massimizzare il protocollo (Figura 1) e l'assicurazione che le cellule rimosse per microscopia o altri test sono conservati in un ambiente sigillato. Ad oggi, la gamma di sopravvivenza anossico era 15 – 17 giorni per cancro immortale linee cellulari e fino a 17 giorni per trasformato linee cellulari (nove linee cellulari sottoposti a screening per crescita anossico). I livelli di cellule vitali, una volta che queste cellule sono state spostate in condizioni anossiche, rifiutato almeno il 10%, per un massimo di 90%, prima hanno stabilizzato. Tutte le linee cellulari ritornò con i fenotipi dual (tethered e runagate) con la proporzione di cellule in sospensione aumenta nel tempo. Anche dopo un'incubazione estesa di parecchie settimane, rimanevano alcune cellule legati, ma la maggior parte delle cellule erano nella morfologia arrotondata runagate (Figura 2). Come riportato, queste cellule runagate sono vitali e sono arrivato attraverso il loro ciclo cellulare. Si noti che le variabili che potrebbero dover essere regolato includono i livelli di glucosio e la concentrazione di nitriti. Detto questo, dalle formulazioni oltre 60 diversi media che sono state testate per la loro capacità di sostenere sia condizioni di normossia e incubazione anossico, il mezzo di PS-74656 era in grado di sostenere la sopravvivenza e la replica di quasi tutte le linee cellulari testati.
Un'osservazione fondamentale era la differenziazione delle cellule anossiche, indipendentemente dalla cella testato, in due fenotipi distinti, legati e runagate (Figura 2). Analoga per le cellule dello strato monomolecolare normoxic, le cellule tethered sono state fissate alla plastica della coltura del tessuto. Tuttavia, l'allegato era più debole, più facile da tripsinizzano o sloggiare da raschiare, rispetto all'allegato che si è verificato in presenza delle condizioni di normossia. Inoltre, la morfologia delle cellule era più piccola con più estensioni di mandrino (dendritiche)26. Il secondo cellulare morfotipo osservato erano cellule in sospensione (cioè, cellule runagate). Queste cellule spontaneamente convertito in sospensioni digalleggiante singola cellula in presenza di coltura del tessuto-trattati di plastica, che sono state arrotondate con una dimensione di cella più piccola e meno citoplasma. Essi differiscono dalle cellule di cultura classica sospensione, che in genere richiedono un adattamento enzimatico, crescono in aggregati, richiedono contenitori di coltura del tessuto non trattato e sono più grandi di loro normoxic controparti27. Nel corso del tempo, le popolazioni delle cellule anossici potrebbero essere osservate per spostare da un monostrato prevalentemente legato a quella delle cellule runagate in sospensione. Queste cellule in sospensione erano vitali e replicanti; così, cura ha dovuto essere esercitato deve rimuovere il surnatante. Inoltre della nota è che il mezzo non richiedono sostituzione durante il periodo di incubazione anaerobica intero. L'indicatore di pH medio sotto l'incubazione anossica, in contrasto con il suo controllo normoxic, era anche invariato (cioè, è rimasto rosso). Se lo sperimentatore desidera raccogliere le cellule runagate, o cambiare il mezzo, le cellule possono essere ottenute utilizzando anaerobiche flussaggio gas tubi micro-centrifuga che sono chiuse ermeticamente all'interno della camera anaerobica. Per la cella di lavaggio delle cellule tethered, la procedura deve essere eseguita anche in aula per eliminare qualsiasi esposizione all'ossigeno.
L'attuabilità delle cellule finale per una coltura a lungo termine è stata, in gran parte, dipende la cella viene utilizzato e la confluenza a cui i pozzi o il pallone sono stati inizialmente seminato (figure 3 e 4). Detto questo, un buon punto di partenza è 80%, che ha avuto le maggiori possibilità di crescita ottimale. Inoltre, può verificarsi una perdita di linea-dipendente delle cellule di 10% al 60% della redditività nei giorni iniziali di 2 – 4. Tuttavia, durante l'esecuzione di questo esperimento, le cellule restanti pedalato attraverso il ciclo cellulare e replicati28. L'effetto di confluenza semina sulla longevità della coltura delle cellule può essere visto nelle figure 3 e 4. Cellule HeLa 229 sia Vero sono state seminate in piastre da 24 pozzetti al 40%, 60% e 80% di confluenza iniziale (100% confluenza = 2,8 x 105 cellule/pozzetto) e poi incubati in assenza di ossigeno per 17 giorni. La crescita di anossia delle cellule HeLa 229 è stata ottimizzata una confluenza di semina iniziale dell'80%. Al contrario, le cellule di Vero ottimale semina confluenza era 60%. Questo dimostra la necessità di ottimizzare inizialmente la densità di semina dipenda la linea cellulare utilizzata.
Figura 1 : Modello di set-up camera anaerobica per la coltura di cellule di mammifero. I materiali minimi richiesti includono piastre di coltura del tessuto, pipette di trasferimento sterile, sacchetti di biohazard, media de-gasati, un tubo per il rigetto della media o altri liquidi e sacchetti richiudibili per il trasferimento delle piastre al microscopio pur mantenendo condizioni anaerobiche.
Figura 2: Cellule HeLa anossico differenziazione morfologica. (A), questo pannello mostra la microscopia di contrasto di fase dei controlli delle cellule HeLa normoxic 4 giorni post-inoculazione, con un ingrandimento di X 20. (B) questo pannello mostra le cellule HeLa anossiche 17 giorni post-inoculazione (con l'immutata da giorno 1 PS-74656 medie, confluenza seminato l'80% e un ingrandimento X 20). (C), questo pannello mostra artefatti di microscopia di goccioline d'acqua all'interno di un sacchetto di plastica contenente una piastra 24 pozzetti anossica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rapporto di anossico a normoxic HeLa 229 vitali cellule post-17 giorni di incubazione. Questo pannello mostra l'effetto della densità di semina sull'attuabilità delle cellule HeLa 229 nel PS-74656 medio rispetto al controllo di normossia. I risultati sono mostrati come la media ± SEM
Figura 4: Rapporto di anossico a normoxic Vero vitale cellule 17 giorni di post-incubazione. Questo pannello mostra l'effetto della densità di semina sulla vitalità cellulare Vero nel PS-74656 medio rispetto al controllo normoxic. I risultati sono mostrati come la media ± SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo metodo rappresenta la prima volta le cellule di mammiferi che sono state coltivate per lunghi periodi di tempo in assenza di ossigeno. Sulla base di osservazioni attuale la crescita anossico capacità tramite una via non-fermentativo sembra essere universale tra le cellule di mammiferi linee28, dove la crescita anaerobica ha provocato la divergenza di fenotipo. Questo è stato osservato per tutte le linee cellulari testate. Con la coltura anaerobica, aumentando le proporzioni delle cellule è diventato arrotondato, sviluppato una popolazione di sospensione-come e sono stati in grado di replicare. Il tipo di cella secondaria è rimasto attaccato al substrato; Tuttavia, la morfologia cellulare ritornato a una forma di mandrino (dendritiche). Questi risultati indicano un errore comune nelle analisi e osservazioni per quanto riguarda la coltivazione di coltura del tessuto anossico. È generalmente accettato che quando cellule di mammifero coltivate in condizioni di normossia (5% CO2) arricchiscono e scollegare, stanno morendo. Al contrario sembra essere corretto per le cellule coltivate in assenza di ossigeno, nel qual caso, le cellule che hanno arrotondato e distaccato, sono semplicemente una sottopopolazione di cellule morfologicamente divergenti.
L'ottimizzazione delle condizioni di crescita anossico è linea cellulare dipendente. PS-74656 medio complessivo sostenuto la crescita della cellula tutte le linee sotto condizioni di normossia e crescita anossico, ad eccezione di MDA-MB-231, una linea di cellule di cancro al seno che ha preferito la crescita in assenza di nitrito. Un'osservazione incoraggia è che anche con una diminuzione di 98% di cellule per pozzetto, il resto viene replicato, risultante in una popolazione altamente adattata. L'azione critica è di mantenere culture anche quando solo poche cellule sono osservate direttamente da microscopia. Così, si deve prestare attenzione per assicurare che le cellule indipendenti sono morte, o dall'esclusione del colorante blu di trypan o di un metodo di rilevamento di vitalità cellulare alternativo. Si deve osservare che con una grande diminuzione nei numeri delle cellule, pozzi sufficiente devono essere seminati per avere numeri di cellulare totale adeguata per esperimenti successivi. La perdita attesa di cellule vitali è sia la linea cellulare e la semina confluenza dipendente; così, i numeri di cellulare ottimale, nel tempo, devono essere determinati sperimentalmente e non possono essere estrapolati dai risultati con altre linee cellulari. Detto questo, un buon punto di partenza è una confluenza di 80%, che ha le maggiori possibilità di crescita ottimale. Deve essere notato che qualsiasi esposizione all'ossigeno durante la procedura anaerobica nella procedura, non importa quanto breve, comprometterà i risultati dovuto il cellulare spontanea segnalati HIF-1-alpha risposta11,12.
Per questa procedura, la fase più critica è quella del degassamento di medium, tubi e tutti gli altri apparecchi e materiali utilizzati. L'introduzione di anche molto bassi livelli di ossigeno potrebbe interrompere il passaggio dal metabolismo fermentazione alla respirazione anaerobica. In alternativa, potrebbe prolungare il metabolismo fermentativo modo che eventuali esperimenti comporta la misurazione di ipossia, non anossia. L'utilizzo di questa procedura innovativa per misurare la citotossicità e attività chemioterapeutica potrebbe contribuire a spiegare il fallimento di droga nel trattamento dei tumori solidi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Midwestern University ufficio di ricerca e programmi sponsorizzati per il loro sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
