Summary
Her beskriver vi en ny metode som gjør at anaerobe langsiktige dyrking av etablerte linjer. Maksimal overlevelse tidspunktet ble testet er 17 dager. Denne metoden er egnet for testing av cytotoksiske agenter og utforske fysiologi av anoxically kopierer celler.
Abstract
Mest mucosal overflater med midtpunktene i svulster og stamcelleforskningen nisjer er geografiske områder av kroppen som er anoksisk. Tidligere studier viser at inkubasjon i normoxic (5% CO2 i luften) eller hypoxic (lav oksygen) forhold etterfulgt av en anoksisk inkubering (et fravær av fritt oksygen) resultater i begrenset levedyktighet (2-3 dager). En ny metode ble utviklet som gjør en anoksisk celle dyrking (for minst 17 dager, maksimal tid testet). Det viktigste aspektet ved denne metoden er å sikre at uten oksygen er innført i systemet. Dette oppnås med avgassing av media, og rødme rør, retter, flasker og Pipetter med en anaerob gassblanding (H2, CO2N2) etterfulgt av tillater materialet til equilibrate på anoksisk (ikke-oksygen)-miljøet før bruk. Ytterligere omsorg må utøves da anskaffe photomicrographs for å sikre at micrographs fikk ikke inneholder gjenstander. I fravær av oksygen endres betydelig celle morfologi. To forskjellige morphotypes er kjent for alle anaerob dyrket celler. Muligheten til å vokse og opprettholde pattedyrceller i fravær av oksygen kan brukes til analyse av cellen fysiologi og polymicrobial vekselsvirkningene karakterisering av biosyntetiske trasé for romanen kreft narkotika utvikling.
Introduction
Det finnes celler fra solide svulster, Stamcelle nisjer og de fôr mucosal overflater i miljøer som opplever reduserte oksygennivået, inkludert anoxia1,2,3,4. I normale fysiologiske stater varierer oksygenering enn av hypoksi anoxia (den komplette fraværet av oksygen)5,6. Realisering at atmosfærisk oksygen negativt påvirker pattedyr celle replikering og at i vitro cellevekst kan optimaliseres under utarmet oksygen forhold ble rapportert i 1970. Richter et al. 7 viste at 1-3% av oksygen (hypoksi) forbedret plating effektivitet sammenlignet med atmosfærisk oksygen (20%). Human diploide celle levetiden er også utvidet i hypoxic kultur forhold8.
I vivo, hypoxic forhold oppstår når oksygen butikker er oppbrukt (f.eksunder intens trening), der ATP produksjonen er slått i skjelettmuskulatur fra aerobic åndedrett til gjæring (bruke karbohydrater respirasjon) med den sluttproduktet av melkesyre9. Patologisk, i kreftsvulster, interiøret av svulsten er hypoxic til anoksisk på grunn av dårlig endometrial blodkar10. Effekten av den begrensede perfusjonen på svulst interiør valideres uavhengig av svulst interiør kolonisert av forplikte anaerobes1. Mechanistically, svulst celle overlevelse i hypoksi antas å være utelukkende avhengig uttrykket av hypoksi-induserbart faktor 1 alfa-genet (HIF1-alfa), som er første spontane reaksjon hypoksi4,11 , 12. HIF1-alpha er indusert under hypoxic forhold av varme sjokk proteiner som binder HIF1-alpha arrangøren og upregulate gene transkripsjon12. Disse varme sjokk proteinene antas å hjelpe induksjon av de ulike fenotyper i svulst hypoxic microenvironment. Disse fenotyper utstilling det økt uttrykket for cellemembranen glukose transportører og frekvensen av Glykolysen (Warburg effekt)13. Resultatet er en bryter fra Mitokondrielt oxidative fosforylering til laktat gjæring.
Anoksisk overlevelse kan også bruke alternativer til glukose for å støtte den overlevelse fenomen14,15. Det best studerte pattedyr eksemplet er mole rotte, som kan overleve i nesten 20 minutter uten oksygen gjennom en fruktose-drevet glycolytic gjæring veien14. En alternativ tilpasning oppstår i enkelte fisk (f.ekskarpe [Carassius sp.], som kan overleve for betydelig lenger tid perioder med Glykolysen med etanol som terminal biprodukt)15. I begge tilfeller stasjoner gjæring stoffskiftet slik at overlevelse i fravær av oksygen. Gjeldende hypotesen for anoksisk overlevelse er at så lenge HIF1-alpha blir aktivert hypoksi, mitokondrie åndedrett, uten behov for oksygen, oppstår under anaerobe forholdene16. Videre er det postulerte at bruk av en fermentative sti for hypoxic/anoksisk overlevelse forbedrer svulst overlevelse siden cellene unngå oksidativt stress som kan vise seg for å være skadelig for cellen overlevelse17. Denne postulatet støttes av en fersk studie som viser at i cardiomyocytes, hypoksi reduserer oksidativt stress på svulst celle17.
Hittil er vesentlig vesen en fermentative sti for anoksisk pattedyr celle overlevelse inngrodd i litteraturen, grunn, i stor grad, en manglende evne til å kultur pattedyrceller i den komplette fraværet av oksygen i mer enn 3 dager. Et alternativ til Glykolysen for anaerob overlevelsen skjer imidlertid i bakterier. I visse bakterier, kan nitrogen eller sulfate (blant andre forbindelser) tjene som terminal elektron acceptors på cytochrome oxidase systemet i fravær av oksygen18. Selv om bakteriell og eukaryotic utviklingen skjedde i parallell siden avviker fra siste universell felles stamfar, er det anslått at mitokondrier var å gi energi til celler for 1.542 millioner år før oksygenering av havene19 . Siden forskere har vist at kan de isolerte mitokondriene produserer ATP i fravær av oksygen, med nitritt som terminal elektron acceptor, er det rimelig å anta at cellene kan fungere for perioder lengre enn 3 dager i fravær av oksygen 20 , 21 , 22 , 23. metodikk beskrevet i denne studien har et verktøy for anaerob pattedyr cellevekst i mange linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør Media for anaerob kultur av ulike pattedyr linjer
-
Foreta fullstendig PS-74656 mediet for en anoksisk celle kultur25.
- Gjøre sterilt nitritt lager løsningen (5 M, 100 x) ved oppløsning 17.25 g nitritt i 50 mL destillert deionisert vann, deretter filtrere for å steriliseres.
- Legg til 0,5 mL av nitritt lager løsningen per 50 mL av lav glukose DMEM (1 g/L av glukose) med 110 mg/L av L-glutamin, 584 mg/L av natrium pyruvate, og 10% fosterets bovin serum (FBS; inaktivert).
Merk: Bruk av FBS konsentrasjoner større enn 10% er giftig. Av notatet, en kreft cellen linje testet hadde en lav toleranse for media med nitritt (MDA-MB-231, bryst kreft cellen linje) og dermed ble dyrket i fravær av nitritt. Dessuten, selv om PS-74656 medium støtte veksten av alle linjer som ble testet (n = 9), bestemte linjer (f.eks, Vero celler) viste høyere celle konsentrasjoner og en høyere levedyktighet i PS-74656 med høy glukose (4.5 g/L) DMEM 25. - Plass 20 mL medium i et sterilt 50 mL konisk sentrifuge rør. Ikke trekk hetten; Det bør være løs.
- De gass medium ved å plassere røret i et vakuum bell jar på en ca 45 ° vinkel, maksimere middels areal.
- Bruke et vakuum med en vakuumpumpe eller tilsvarende, ved romtemperatur. Opprettholde vakuum før bobler ikke er observert (24 48 h).
- Fjern røret fra glasset og umiddelbart lukke lokket, tetting røret for å minimere innføring av luft i mediet.
- Sett røret i kommersielle anaerob kammeret.
- Løsne hetten rør og la atmosfæren i røret for å equilibrate at det anaerob gassblanding i kammeret for minst 24 timer.
Merk: Medium bør forbli i kammeret til det er oppbrukt. For å påskynde prosessen, flush røret minst 3 x med anoksisk gass blandingen med en bakteriefri overføring pipette fylt med anoksisk gass, som består av H2og CO2N2. - Degas alle rør (10-15 min) plassert i det anaerobe kammeret som beskrevet ovenfor før tetting røret og plassere i kammeret. Før bruk, skylle den med det anaerob gassblanding bruke 1,5-2 mL overføring Pipetter eller pipette-spisser som har blitt tømt med anoksisk gass minst 3 x.
- Mens i det anaerob kammeret, fjerne 100 µL av mediet som et sterilt degassed mikro-sentrifuge rør og teste den for oppløst oksygen bruke en oksygen sonde i kammeret.
Merk: Oksygen elektroden er kalibrert per produsentens protokollen før bruk. Målinger av riktig degassed og equilibrated anaerob gass blanding media er 0.
Advarsel: Hvis avlesningene er over 0,3 ppm oksygen, fortsette å ruge media i det anaerobe kammeret siden mer tid til å equilibrate mediet er nødvendig.
2. anoksisk dyrking av ulike pattedyr linjer
-
Angitt dag -1
- Vokse celler (37 ° C, 5% CO2) i en T150 bolle til 90% samløpet for anoksisk og normoxic kultur kontrollen å skaffe et tilstrekkelig antall celler for tre 24-vel plater (80% samløpet).
Merk: For denne studien HeLa 229 og Vero celler ble brukt. Denne protokollen ble også testet og bevist vellykket for vekst og vedlikehold av syv andre cellen linjer25. - Fjerne mediet fra flasken av aspirasjon og vask det med 10 mL av HBSS.
- Erstatt medium med 5 mL av trypsin. Agitere kolbe til cellene visuelt koble fra plasten. Sug opp mesteparten av trypsin og trykker kolbe å dislodge tilhenger cellene. Legge til 10-15 mL av høy glukose DMEM (4,5 finans av glukose, 110 mg/L av L-glutamin, 10% FBS, 50 µg/mL av gentamicin) å deaktivere trypsin.
- Triturate cellene med en 25 mL pipette til alle cellen klumper er avbrutt.
- Telle celler og bestemme levedyktigheten til standard hemocytometer og metoden trypan blå fargestoff utelukkelse eller automatisert tilsvarende.
- Suspendere cellene i høy glukose DMEM som nevnt ovenfor til en celle tetthet av 2.24 x 105 celler/mL.
- Legge 1 mL av cellen suspensjon fordelt av en 24-og vev kultur plate (2.24 x 105 celler/Vel, 80% samløpet). Frø 1 plate for anoksisk kultur og en annen for en kontroll normoxic kultur.
- Inkuber cellene på 37 ° C i normoxic forhold (5% CO2) for 24 timer.
Merk: Cellene kan være belagt i ulike store plater. Imidlertid løper seeding celler for anoksisk vekst i flasker risikoen for innføring av oksygen inn i systemet, med mindre omsorg utøves å helt skylle ut atmosfærisk gass.
- Vokse celler (37 ° C, 5% CO2) i en T150 bolle til 90% samløpet for anoksisk og normoxic kultur kontrollen å skaffe et tilstrekkelig antall celler for tre 24-vel plater (80% samløpet).
-
Angitt dag 0
- Etter 24 timer av den normoxic inkubering, plassere plater for anoksisk vekst i det anaerobe kammeret (en kommersiell anaerob kammer; Figur 1).
- Umiddelbart endre mediet til antibiotika-fri de gasset PS-74656 medium som har blitt brukt for 24 h til det anaerobe kammeret. Plasser platen i en beholder med et fuktig håndkle og løst lukke det for å opprettholde fuktighet.
Merk: Platene for normoxic vekst behandles likt med unntak som alle behandlinger er utført under atmosfæriske forhold.
-
Angitt dag 1
- Dag 1 av det anaerob inkubasjon starter etter 24 timer med inkubering i kommersielle anaerob kammeret som inneholder standard anaerob gassblanding av 10% H2, 10% CO2og 80% N2.
- Inkuber cellene for ulike tidsperioder.
- Overvåke det anaerobe mediet for fargeendring over tid.
Merk: En farge endring fra rød-oransje til magenta signaler tid for å endre medium. Dette kan ta opptil 2 uker å skje. En farge endring i medium fra rød-oransje gult indikerer tilstedeværelse av en bakteriell forurensning. - Når mediet endres fra rød til magenta, fjerne runagate celler av aspirasjon.
- Sted aspirerede brukt media med runagate cellene i degassed og anaerob gass equilibrated microfuge rør, nær rør samtidig sørge for at forseglingen er sikker, og deretter virvel dem (326 x g; ved romtemperatur for 10 min). Umiddelbart erstatte aspirerede media i brønnen med 1 mL av nye degassed PS-74656 medium.
- Sett microfuge røret med pelleted celler i det anaerobe kammeret før du åpner den. Sug opp den brukte mediet og erstatte den med ferske degassed PS-74656 medium til et totalt volum på 1 ml i microfuge røret.
- Returnere cellene fra tuben til et godt i 24-og vev kultur plate.
3. vurdering av fenotypiske celledifferensiering av mikroskopi anaerob kulturperler celler
-
Mens i det anaerob kammeret, Plasser platen i en gjenlukkbare rødmer med det anaerob gassblanding og lukke.
Merk: Boksen må inneholde en fuktig papirhåndkle å gi fuktighet og forhindre platen fra uttørking. Til mikroskopi fungerer sandwich poser best ettersom de er tynne.- For å observere cellene under mikroskopet, helt tett sekken og fjerne det fra chamber.
- Forsiktig strekke plastposen over platen, undersøke celler med en invertert fase kontrast mikroskop med kameraet vedlegg og ta photomicrographs ved ulike forstørrelser.
- Returnere platen i forseglede posen til kammeret, og fortsette inkubering som beskrevet i trinn 2.3.3.
- Separat analysere runagate cellene i suspensjon, kan du følge fremgangsmåten i trinn 2.3.5.
Merk: Disse cellene kan brukes for aerobic tester eller kan returneres til det anaerob kammeret for testing av denne bestemte befolkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Styrken i denne protokollen ligger i sin støtte til levetiden og vekst av flere linjer og erkjennelsen av at det er en dyp endring og divergens i cellen morfologi25. Det mest kritiske elementet i denne studien er overføring og vedlikehold av cellene under strenge anaerobiosis. Dette krever en anaerob chamber organisert for å maksimere protokollen (figur 1) og forsikring om at cellene fjernet for mikroskopi eller andre testing er holdt i et lukket miljø. Hittil rekke anoksisk overlevelse var 15-17 dager for udødelig kreft linjer og opp til 17 dager for forvandlet cellelinjer (ni cellelinjer vist for anoksisk vekst). Nivåene av levedyktige cellers, avslo når disse cellene var flyttet anoksisk forhold, minst 10%, opptil 90%, før de stabilisert. Alle linjer tilbake til av dobbelt fenotyper (bundet og runagate) med andelen celler i suspensjon øker over tid. Selv etter en utvidet inkubasjonstiden for flere uker, det var noen bundet celler, men fleste cellene i avrundet runagate morfologi (figur 2). Som rapportert, er disse runagate cellene levedyktig og fortsatte gjennom syklusen sin celle. Det bør bemerkes at variabler som må justeres inkluderer glucose høyder og nitritt konsentrasjonen. Det sagt, fra over 60 forskjellige medier formuleringer som ble testet for deres evne til å støtte både normoxic og anoksisk inkubering, PS-74656 mediet kunne støtte overlevelse og replikering av nesten alle cellelinjer testet.
En viktig observasjon var differensiering av anoksisk celler, uavhengig av cellen testet, i to forskjellige fenotyper, bundet og runagate (figur 2). Analoge til normoxic monolayer cellene, bundet cellene var knyttet til vev kultur plast. Vedlegget ble imidlertid svakere, enklere å trypsinize eller fjerne ved skraping, enn vedlegget som skjedde under normoxic forhold. I tillegg var cellen morfologi mindre med mer spindel (dendrittiske) utvidelser26. Den andre cellulære morphotype observert var celler i suspensjon (dvs., runagate celler). Disse cellene spontant konvertert til frittflytende enkeltcelle suspensjoner i nærvær av vev kultur-behandlet plast, som var avrundet med en mindre Cellestørrelse og mindre cytoplasma. De skilte seg fra klassisk suspensjon kultur celler som vanligvis krever en enzymatisk tilpasning, vokse i aggregat, krever ikke-vev kultur-behandlet beholdere og større enn deres normoxic kolleger27. Over tid, kunne anoksisk celle populasjoner observeres for å skifte fra en overveiende bundet monolayer som runagate cellene i suspensjon. Disse cellene i suspensjon var levedyktig og etterligner; Dermed måtte omsorg utøves bør nedbryting fjernes. Også er å merke at mediet ikke krever endring over hele anaerob inkubasjonstiden. Indikatoren middels pH under den anoksisk inkubering, i motsetning til sin normoxic kontroll, var uendret (dvs., forble rød). Hvis etterforskeren ønsker å høste runagate cellene, eller endre medium, kan cellene oppnås ved hjelp anaerob gass-spyles mikro-sentrifuge rør som er lukket tett innen det anaerobe kammeret. For cellen vaske bundet celleområde, må også prosedyren utføres i kammeret å eliminere noen oksygen eksponering.
Den siste celle levedyktigheten for en langsiktig dyrking var i stor grad avhengig av cellen brukes og elvene som brønnene eller kolbe var opprinnelig seeded (tall 3 og 4). Når det er sagt, et godt utgangspunkt er 80%, som hadde størst sjanse for optimal vekst. I tillegg kan cellen linje-avhengige tap av 10% til 60% av levedyktighet oppstå i første 2-4 dager. Men under utførelsen av dette eksperimentet, gjenværende cellene syklet gjennom cellen syklus og replikeres28. Seeding samløpet effekten på levetiden til celle dyrking kan sees i tallene 3 og 4. Både HeLa 229 og Vero celler var frø inne 24-vel platene til 40%, 60% og 80% av første samløpet (100% samløpet = 2.8 x 105 celler/godt) og deretter ruges i fravær av oksygen i 17 dager. Anoksisk cellevekst HeLa 229 var optimalisert på en innledende seeding samløpet av 80%. I kontrast, Vero cellene optimal seeding samløpet var 60%. Dette viser måtte først optimalisere seeding tetthet avhengig av den celle linjen brukes.
Figur 1 : Modell av anaerob kammer oppsett for kultur pattedyrceller. Minimal materialer som kreves inkluderer vev kultur plater, sterile overføring Pipetter for flergangsbruk, biohazard poser, de gasset media, et rør for å forkaste medier eller andre væsker og gjenlukkbare poser for overføring av platene til mikroskopet samtidig anaerobe forholdene.
Figur 2: Anoksisk HeLa celler morfologiske differensiering. (A) dette panelet viser fase kontrast mikroskopi normoxic HeLa celle kontrollene 4 dager etter vaksinasjon, med en 20 X forstørrelse. (B) dette panelet viser anoksisk HeLa cellene 17 dager etter vaksinering (med den uendret fra dag 1 PS-74656 medium, 80% seeded samløpet og en 20 X forstørrelse). (C) dette panelet viser mikroskopi gjenstander av vanndråper på indre av en forseglet plastpose som inneholder en 24-vel anoksisk plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Forholdet mellom anoksisk til normoxic HeLa 229 levedyktig celler innlegg-17 dager inkubasjon. Dette panelet viser effekten av seeding tettheten på HeLa 229 celle levedyktigheten i PS-74656 medium i forhold til kontrollen normoxic. Resultatene vises som den gjennomsnittlig ± SEM.
Figur 4: Forholdet mellom anoksisk til normoxic Vero levedyktig celler 17 dager etter inkubasjon. Dette panelet viser effekten av seeding tetthet Vero celle levedyktigheten i PS-74656 medium i forhold til kontrollen normoxic. Resultatene vises som den gjennomsnittlig ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden representerer første gang pattedyrceller som ble kultivert for lengre perioder i fravær av oksygen. Basert på dagens observasjoner, synes den anoksisk vekst evne via en ikke-fermentative sti å være universell blant pattedyrceller linjer28, hvor den anaerob veksten resulterte i fenotypen divergens. Dette ble observert for alle linjer testet. Med det anaerob dyrking, øke andelen cellene ble avrundet, utviklet en suspensjon som befolkning, og klarte å gjenskape. Sekundær celle type var knyttet til underlaget; men tilbake cellen morfologi til en spindel (dendrittiske) form. Disse funnene peker ut en vanlig feil i analyser og observasjoner med hensyn til anoksisk vev kultur dyrking. Det er generelt akseptert at når pattedyrceller dyrket under normoxic betingelser (5% CO2) runde opp og koble, de er døende. Tvert imot er riktig for celler dyrket i fravær av oksygen, i så fall, celler som har rundet opp og enebolig, er bare en morphologically divergerende celle subpopulasjon.
Optimalisering av anoksisk vekst forhold er cellen linje avhengige. Middels PS-74656 samlet støtte veksten av alle cellen linjer under normoxic og anoksisk vekst forhold, med unntak av MDA-MB-231, en bryst kreft cellen linje som veksten i fravær av nitritt. En oppmuntrende observasjon er at selv med en 98% die-off celler per brønn, resten replikerer, noe som resulterer i en svært tilpasset befolkning. Kritisk handlingen er å opprettholde kulturer selv når bare noen celler er direkte observert av mikroskopi. Dermed må varsomhet utøves for å sikre at frittliggende cellene død, ved trypan blå fargestoff utelukkelse eller en alternativ celle levedyktighet gjenkjennings-metoden. Det bør bemerkes at med slik en stor nedgang i cellen tallene, tilstrekkelig brønner må bli sådd for å ha tilstrekkelig total-celle tall for etterfølgende eksperimenter. Forventet tap av levedyktige cellers er både celle linje og seeding samløpet avhengige; dermed optimal celle tall, over tid, må avgjøres eksperimentelt og ekstrapolert ikke fra funn med andre linjer. Når det er sagt, et godt utgangspunkt er en 80% samløpet, som har størst sjanse for optimal vekst. Det må bemerkes at noen eksponering for oksygen under anaerob trinnene i prosedyren, uansett hvor kort, vil invadere resultatene skyldes rapportert spontane mobilnettet HIF-1-alpha svar11,12.
Til dette er det mest kritiske trinnet av de gassing av mediet, rør, og alle andre apparatene og materialer. Innføring av selv svært lave nivåer av oksygen kunne stoppe overgangen fra gjæring metabolismen til det anaerob åndedrett. Det kan også forlenge fermentative stoffskiftet slik at eksperimenter føre måling av hypoksi, anoxia ikke. Bruk av denne romanen prosedyre for å måle cytotoksisitet og chemotherapeutic aktivitet kan bidra til å forklare narkotika svikt i behandlingen av solide svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke Midwestern University Office for forskning og støttede programmer for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
